Summary
מיקרוסקופ יריעות אור פותח כדי לצלם ולהפוך שבלול שלם לדיגיטלי.
Abstract
חירשות היא הליקוי החושי הנפוץ ביותר, המשפיע על כ -5% או 430 מיליון אנשים ברחבי העולם על פי ארגון הבריאות העולמי1. הזדקנות או פרסביקוזיס היא הגורם העיקרי לאובדן שמיעה תחושתי-עצבי והיא מאופיינת בנזק לתאי שיער, נוירוני גנגליון ספירליים (SGNs) והסטריה וסקולריס. מבנים אלה שוכנים בתוך השבלול, שיש לו אנטומיה מורכבת בצורת ספירלה של רקמות קרומיות המרחפים בנוזל ומוקפים בעצם. תכונות אלה מקשות מבחינה טכנית לחקור ולכמת שינויים היסטופתולוגיים. כדי לענות על צורך זה, פיתחנו מיקרוסקופ גיליון אור (TSLIM) שיכול לצלם ולהפוך את השבלול כולו לדיגיטלי כדי להקל על חקר יחסי מבנה-תפקוד באוזן הפנימית. מקטעים טוריים מיושרים היטב של השבלול כולו יוצרים ערימה של תמונות לעיבוד נפח תלת-ממדי (תלת-ממדי) ופילוח של מבנים בודדים לצורך הדמיה תלת-ממדית וניתוח כמותי (כלומר, אורך, רוחב, משטח, נפח ומספר). שבלול דורש שלבי עיבוד מינימליים (קיבוע, הסתיידות, התייבשות, צביעה וניקוי אופטי), שכולם תואמים לדימות ברזולוציה גבוהה לאחר מכן על ידי סריקה ומיקרוסקופ אלקטרונים שידור. מכיוון שכל הרקמות נמצאות בערימות, ניתן להעריך כל מבנה בנפרד או ביחס למבנים אחרים. בנוסף, מאחר שההדמיה משתמשת בבדיקות פלואורסצנטיות, ניתן להשתמש באימונוהיסטוכימיה ובקשירת ליגנדים כדי לזהות מבנים ספציפיים ואת נפחם או פיזורם התלת-ממדי בתוך השבלול. כאן השתמשנו ב-TSLIM כדי לבחון שבלול מעכברים מזדקנים כדי לכמת את אובדן תאי השערה ותאי העצב בגנגליון ספירלי. בנוסף, נעשה שימוש באנליזות מתקדמות (למשל, ניתוח אשכולות) כדי להמחיש הפחתה מקומית של נוירוני גנגליון ספירליים בתעלה של רוזנטל לאורך נפחה התלת-ממדי. גישות אלה מדגימות את יכולתו של מיקרוסקופ TSLIM לכמת יחסי מבנה-פונקציה בתוך שבלול ובין שבלול.
Introduction
השבלול הוא איבר החישה ההיקפי לשמיעה אצל יונקים. יש לו אנטומיה ספירלית מורכבת של תאים חושיים ותומכים חוזרים המתמחים אנטומית כדי לזהות תנודות קול ולהעבירם למוח לתפיסת השמיעה. מרכיבי החישה העיקריים הם תאי השערה הפנימיים והחיצוניים וסיבי העצב המעצבבים שלהם, שגופם התא מרכיב את הגנגליון הספירלי, השוכן בתוך התעלה של רוזנטל (איור 1). מבנים חושיים ועצביים אלה מסודרים באופן טונוטופי כך שצלילים בתדר גבוה מומרים בבסיס השבלול וצלילים בתדר נמוך מומרים בקודקודהשבלול 2. מפה אנטומית של התפלגות תאים חושיים זו לאורך הספירלי של הממברנה הבזילארית התומכת נקראת ציטוקוכלאוגרמה3 וניתן להשוות אותה עם ליקוי שמיעה כפונקציה של תדר כפי שמתואר באודיוגרמה.
המבוך הקרומי של השבלול, המוקף בעצם צפופה, מקשה מבחינה טכנית לבחון יותר ממבנה שבלול אחד בכל פעם. לכן, הרציונל לפיתוח מיקרוסקופ יריעות אור הוא לייצר מקטעים טוריים מיושרים היטב של השבלול השלם, כך שניתן יהיה לבחון את כל מבני השבלול ביחס זה לזה בשחזורים תלת-ממדיים. Voie et al.4 ו-Voie and Spelman5 תכננו את המיקרוסקופ הראשון של יריעות אור, שנקרא מיקרוסקופ חתך אופטי פלואורסצנטי מישורי אורתוגונלי (OPFOS), כדי לחתוך אופטית את כל השבלול. עם זאת, מיקרוסקופ זה מעולם לא פותח מסחרית; לכן, מטרתנו הייתה לבנות מיקרוסקופ גיליון אור שנקרא מיקרוסקופ הדמיה לייזר דק (TSLIM; איור 2). פרטי התכנון והבנייה של TSLIM פורסמו בעבר8. TSLIM ביצעה מספר שיפורים לעומת OPFOS, כולל שימוש במצלמה דיגיטלית בתאורה חלשה לעומת מצלמת CCD לאיסוף תמונות, מיקרופוזיציות מקודדות אופטית לתנועה מדויקת וניתנת לשחזור של הדגימה דרך יריעת האור, שימוש בתא דגימה זמין מסחרית ושקוף אופטית, וצביעת רודמין באתנול במקום בתמיסת הניקוי למניעת משקעים של כתמים בתוך הרקמה. הפיתוח המסחרי של מיקרוסקופים קלילים כגון SPIM6 התמקד בהדמיה ברזולוציה גבוהה של דגימות חיות ושקופות קטנות, אך הם אינם מתאימים לדימות שבלול שלם מכיוון שאין להם מרחק עבודה מספיק. סקירה של התפתחות מיקרוסקופים אחרים של יריעות אור פורסמה על ידי Santi7. היתרון העיקרי של TSLIM על פני שיטות היסטולוגיות אחרות לבדיקת השבלול הוא חתך רקמות אופטיות לשחזור תלת ממדי תוך שמירה על שלמות הדגימה, כך שניתן יהיה להשתמש בה בשיטות היסטולוגיות אחרות. יתרון נוסף של הדמיית TSLIM הוא שרק יריעת אור דקה המיוצרת על ידי לייזר נחשפת לרקמה, לעומת חשיפה לעובי רקמה שלמה ללייזר כמו במיקרוסקופ קונפוקלי. ניקוי רקמות כדי למזער את פיזור האור והעובדה שרק חלק קטן מהרקמה חשוף ללייזר מביא לדעיכה מינימלית של פלואורוכרום (פוטו-הלבנה) באמצעות הדמיית לייזר של יריעות אור. עם זאת, תהליך הקיבוע, ההתייבשות והניקוי משנה את המורפולוגיה של מבני השבלול וגורם להתכווצות הרקמה בהשוואה לרקמה חיה. כמות התכווצות הרקמה המתרחשת בפועל לא נקבעה.
TSLIM פותחה על ידי שיין ג'ונסון ושמונה סטודנטים גרמנים להנדסה אופטית (ראו תודות). פרטי הבנייה של TSLIM סופקו על ידי Santi et al.8 וגרסת סריקה (sTSLIM) על ידי Schröter et al.9. TSLIM מתפקד כמיקרוטום לא הרסני לחיתוך אופטי של דגימות וכמיקרוסקופ לאיסוף מקטעים טוריים דו-ממדיים דרך מלוא רוחב ועובי השבלול. TSLIM יכול לצלם דגימות קטנות (מ"מ) וגדולות (ס"מ), עבות. העדשות מותקנות באוויר כדי לאפשר מרחקי עבודה ארוכים עם יעדי איסוף של 1x ו-2x במיקרוסקופ דיסקציה. למיקרוסקופ הדיסקציה יש גם אופטיקת זום המאפשרת ל-TSLIM לפתור מבנים תת-תאיים וסינפטיים בתאים. TSLIM מצויד בלייזר כחול (473 ננומטר) וירוק (532 ננומטר) להארה המאפשרת שימוש במגוון בדיקות פלורסנט להדמיה. המטרה של TSLIM היא לייצר מקטעים אופטיים דו-ממדיים מיושרים היטב דרך שבלול שלם לשחזור דיגיטלי מלא של רקמות השבלול. מכיוון שמדובר בשיטה פלואורסצנטית, ליגנדות ואימונוהיסטוכימיה יכולות לשמש גם לזיהוי מבני שבלול ספציפיים.
בתחילה, עדשה גלילית שימשה לייצור שתי יריעות אור גאוסיאניות מנוגדות, אך היא הפיקה ממצאי דימות בליעה. בשל עבודתם של קלר ואחרים 10, העדשה הגלילית הקבועה הוחלפה במראה גלוונומטר סורקת כדי לייצר את גיליון האור9. נוסף על כך, מאחר שמרכז היריעה הבהירה הוא הדק ביותר במותני הקרן, תמונות sTSLIM 2D מופקות על-ידי איסוף קומפוזיט של עמודות נתונים על ציר X לרוחב הדגימה (איור 3). שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Buytaert ו Dircks11. תוכנת TSLIM מותאמת אישית לנהיגה ואיסוף תמונות פותחה באמצעות תוכנה גרפית לבקרת מכשירים. יריעת האור עוברת דרך הדגימה ומאירה מישור פלואורסצנטי בתוך הרקמה. מישור פלואורסצנטי זה מוקרן באופן אורתוגונלי דרך הדגימה השקופה ונאסף על ידי מיקרוסקופ דיסקציה. מיקרופוזיציות מקודדות אופטית מאפשרות סריקה דרך מותני הקרן בציר X כדי לאסוף תמונה דו-ממדית מורכבת אחת, ולאחר מכן, המיקרופוזיציה של ציר Z מעבירה את הדגימה למישור עמוק יותר בתוך הרקמה כדי לקבל ערימה של תמונות דו-ממדיות טוריות חתוכות (וידאו 1, איור 4). ערימה של תמונות תרגום נאספת לכל רוחב, עובי ואורך השבלול, ואין צורך בתפירת תמונות (סרטון 2). מחסנית התמונות מועברת למחשב אחר ונטענת לתוכנית עיבוד תלת ממדית לשחזור וכימות תלת מימדי. ערימות התמונות מכילות את כל המידע הדיגיטלי על המורפולוגיה של שבלול ברזולוציה של המיקרוסקופ. עם זאת, אם נדרשת רזולוציה גבוהה יותר, השבלול השלם יכול להיות מעובד עוד יותר על ידי שיטות היסטולוגיות הרסניות כגון חתך מיקרוטום, סריקה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.
תוכנית העיבוד התלת-ממדית משמשת לפלח מבני שבלול שונים עבור עיבוד תלת-ממדי וניתוח כמותי. לצורך סגמנטציה, כל מבנה בכל תמונה דו-ממדית של הערימה מתבצע באמצעות צבע שונה באמצעות לוח ועט גרפיים (איור 5). עד כה חולקו 20 מבני שבלול שונים (איור 6). לאחר הפילוח ניתן לבצע מגוון ניתוחים תלת ממדיים. לדוגמה, תוכנת עיבוד תלת-ממדית יכולה למעשה לכרות מחדש את השבלול בכל מישור לאורך הצנטרואיד של המבנה. סרטון 3 מראה חתך משיק לאיבר של קורטי, אשר חושף את תאי השערה לאורך הקרום הבזילרי. תהליך זה דורש תחילה פילוח ידני של מבנה העניין. לאחר מכן, הצנטרויד של המבנה מחושב על פי התאמת הריבועים הפחותים של נקודות הספליין הממוקמות לאורך מרכז המבנה מבסיסו ועד קודקודו, ובכך מאפשר קירוב של אורך המבנה (סרטון 4). תהליך דומה שנקרא שלד יכול לשמש כדי להמחיש את הרוחב הרדיאלי של המבנה לאורכו באמצעות מפת צבע (וידאו 4). הנפח הכולל של כל מבנה מחושב על-ידי התוכנית לאחר הסגמנטציה, אך ניתן גם לכמת מרחקים יחסיים ולהמחיש אותם באמצעות מפות צבע בתוכנת עיבוד תלת-ממדית (איור 7). ניתן גם לייצא מבנים מפולחים כדי לייצר הדמיות מודל מוגדלות מפלסטיק מוצק (איור 8). נוסף על כך, ספירת תאים חצי-אוטומטית יכולה להתבצע גם באמצעות תוכנת עיבוד תלת-ממדית (איור 9). אימונוהיסטוכימיה וקשירת ליגנדים יכולות לשמש להכתמת מבנים ספציפיים של השבלול, וניתן לבודד את המבנים האלה ממבני שבלול אחרים לצורך הערכה מורפומטרית, כגון הפקת ציטוקוכלאוגרמה (איור 10). ניתן לקבוע אורך, רוחב, משטח, נפח ומספר של כל מבני השבלול מהמודלים התלת-ממדיים, מה שהופך גישה זו לאידיאלית למיפוי נזקי שבלול לליקויים תפקודיים. באופן ספציפי, ניתן להראות ולכמת נזק לשבלול כתוצאה מהזדקנות, טראומה כתוצאה מרעש או עלבונות אחרים בשחזורים תלת-ממדיים של שבלול ממקטעים אופטיים דו-ממדיים. לאחר דיגיטציה של שבלול שבלול, ישנם אלגוריתמי הדמיה רבים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך נזק לשבלול של כל רקמה בתוך השבלול ברישום האנטומי לרקמות שבלול אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים והשימוש בבעלי חיים נבדקו ואושרו (מזהה פרוטוקול #2010-38573A) על ידי ועדת הטיפול והשימוש המוסדי של אוניברסיטת מינסוטה (IACUC) וחוקרים המשתמשים בבעלי חיים אלה הוכשרו ונבדקו ביסודיות על ידי וטרינרים של משאבי חיות מחקר (RAR) לפני שיש להם גישה למתקני בעלי החיים. במחקר זה נעשה שימוש הן בעכברים זכרים והן בנקבות.
1. הסרת שבלול לצורך קיבוע ועיבוד רקמות לצורך הדמיה
- הרדימו עכבר באמצעות שאיפת CO2 . ערפו את ראשו של העכבר במספריים ובצעו חתך גבי-גחוני דרך המוח כדי לחצות את הגולגולת. הסר את המוח, זהה את הבולה העגולה בחלק הבאסו-גחוני של הגולגולת, פתח את הבולה עם רונגורים, ודמיין והסר את השבלול.
- קיבוע: בצע הליך זה תחת מכסה אדים ובאמצעות מיקרוסקופ דיסקציה בהגדלה פי 5. יש ללבוש כפפות וביגוד מגן. נקב את החלון הסגלגל והסר את הרצועות עם פיק חד. הכנס פיק לחלון העגול כדי לנקב את הממברנה.
- מכסים את החלון העגול הפתוח בקצה החתוך של ערכת עירוי המחוברת למזרק 1 מ"ל מלא 2 מ"ל פורמלין. יש להחדיר פורמלין באיטיות דרך החללים הפרילימפטיים של השבלול במשך 2 דקות, תוך ציון העובדה שהפורמלין יוצא מהשבלול דרך החלון הסגלגל הפתוח. חתכו את עודפי הרקמה מהשבלול וטבלו בבקבוק המכיל 10% פורמלין, והניחו על מסובב למשך הלילה.
- הסתיידות: יש לשטוף את השבלול ב-PBS 3x למשך 5 דקות כל אחד ולטבול בבקבוק המכיל 10% תמיסה של חומצה דיסודיום אתילאנדיאמין-טטראצטית (EDTA) עם סיבוב במשך 4 ימים, תוך החלפת התמיסה מדי יום.
- התייבשות: יש לערבב את השבלול עם PBS 3x ולשקוע במשך 15 דקות בין החלפה. לייבש את השבלול עם ריכוזים עולים של אתנול 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; במשך 30 דקות בכל ריכוז.
הערה: חשוב להסיר את כל ה-EDTA לפני התייבשות מכיוון ש-EDTA מזרז אתנול. כמו כן, ניתן להשאיר שבלול בכל ריכוז אתנול הגדול מ-70% למשך הלילה. - צביעה: יש להכתים את השבלול כולו על ידי טבילה בתמיסה של רודאמין B איזותיוצינאט (5 מק"ג/מ"ל ב-100% אתנול) למשך לילה עם סיבוב. הסירו את עודפי הצבע מהשבלול בעזרת שני שינויים של 100% אתנול, 5 דקות כל שינוי.
- ניקוי: מעבירים את השבלול המוכתם לשני שינויים של תמיסת Spalteholz12 (5:3 מתיל סליצילאט:בנזיל בנזואט), 30 דקות כל שינוי ומשאירים לילה בתמיסת הניקוי עם סיבוב. ניתן להשאיר שבלול בתמיסת Spalteholz ללא הגבלת זמן.
2. הדמיה של שבלול
- חברו את השבלול למוט דגימה בקצה קרום החלון הסגלגל והעגול כך שתמיסת הניקוי תישאר בתוך השבלול ולא ייווצרו בועות (איור 2). יש להקפיד לא לתת לבועות להיווצר בתוך השבלול מכיוון שקשה להסיר אותן ואם הן נשארות ברקמה, הן יגרמו לממצאי הדמיה.
- השתמשו בדבק מפעיל UV כדי לחבר את השבלול הרטוב למוט הדגימה היבש (איור 2). חברו את השבלול בקצה החלון הסגלגל והעגול. רפא את דבק UV במשך 10 שניות על ידי תנועה סביב השבלול עם אור UV.
הערה: חיבור רופף של השבלול למוט הדגימה יגרום לפגמים בהדמיה. מוט זה מיוצר במיוחד עבור פרוטוקול זה (ראה Santi et al.8 לפרטים) והוא ספציפי למיקרוסקופ יריעות האור שלנו. - השהה את השבלול לתוך תא הדמיה מלא בתמיסת Spalteholz להדמיה. תא הדגימה הוא תא פלואורומטר קוורץ שקוף אופטית (וידאו 1).
- חבר את מוט הדגימה למחזיק מסתובב המחובר גם לשלב התרגום XZ. רוב הערימות מתקבלות על ידי תרגום הדגימה במישורי XZ, אך ניתן להשיג גם ערימות סיבוביות.
- חתך אופטי TSL: השתמש בלייזר כחול או ירוק לעירור בהתאם לסוג הצביעה הפלואורוכרום. מקמו את יריעת האור במרכז הרקמה לצורך מיקוד וקבעו את ההגדלה שתשמש להארה לכל רוחב השבלול. לאחר מכן, השתמש בתוכנית מותאמת אישית כדי להעביר את הדגימה דרך גיליון האור על פני הדגימה בציר X (תפירת התמונה) ובשלבי Z כדי ליצור ערימה של תמונות דו-ממדיות ברחבי השבלול.
- עבור התמונה הראשונה, מותני הקרן של גיליון האור ממוקמים בקצה הדגימה והתוכנית סורקת את מלוא רוחב הדגימה ואוספת עמודות של נתונים (ראה תפירת תמונה; Santi et al.8) שהם רוחב הפרמטר הקונפוקלי (איור 3) כדי לייצר תמונה דו-ממדית מורכבת ברזולוציה מקסימלית לרוחב הדגימה. התוכנית הופכת את תפירת התמונה לאוטומטית עבור כל שלב Z עד לתמונה מלאה.
- עיבוד תמונה: העבירו את אוסף התמונות למחשב אחר וטענו אותו לתוכנית עיבוד תלת-ממדית לצורך שחזור וכימות תלת-ממדיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מכיוון שהנושא של גיליון מיוחד זה הוא הדמיה של השפעות ההזדקנות בשבלול, שבלול צעיר (בן 3 חודשים, HS2479, עכבר זן CBA) ובגיל (בן 23 חודשים, HS2521, עכבר זן C57) ישמשו כדוגמאות. יש לציין כי TSLIM מסוגל להדמיה של מגוון דגימות, כולל שבלול מבני אדם, יונקים, מכרסמים אחרים ודגים, כמו גם איברים אחרים כגון המוח.
Johnson et al. 13 פרסמו מאמר על SGNs בעכברי CBA צעירים (בני 3 שבועות) המשתמשים ב-TSLIM. כל ה-SGNs נספרו בחמישה עכברים והיה טווח של 8,408-8,912 SGNs עם אורך ממוצע של רוזנטל של 2.0 מ"מ. במחקר הנוכחי ספרנו את ה-SGNs בעכבר CBA בן 3 חודשים שהכיל 7,913 SGNs באורך תעלה של רוזנטל של 2.0 מ"מ. עכבר C57BL6 בן 23 חודשים הכיל 6,521 SGN עם אורך רוזנטל של 2.11 מ"מ. עיבוד נפח מראה את כל ה-SGNs בשני השבלול, אך אובדן SGN לא התגלה בעכבר הישן יותר. אולם ספירת תאי SGN כפונקציה של מרחק התעלה של רוזנטל, המתוארת בתרשים ליניארי, הראתה SGNs גדולים יותר בחיה הצעירה יותר באמצע ובקצוות האפיקליים של השבלול בהשוואה לחיה המבוגרת יותר (איור 11). אובדן לכאורה זה של SGNs הודגם עוד יותר על ידי שימוש בניתוח אשכולות בתוכנת עיבוד תלת-ממד. כאן, הבדלי צפיפות SGN תוארו בסקאלת צבעים שבה אשכולות בצפיפות גבוהה הם צהובים, וכחול מייצג אזורים בעלי צפיפות נמוכה יותר (איור 12). אף על פי שלא ניתן לזהות תאים ספציפיים שאבדו, ניתוח הצביר ממחיש בבירור אזורים בעלי צפיפות תאים נמוכה יותר לאורך התעלה של רוזנטל (איור 12).
איור 1: עיבוד נפח ישיר של שבלול. דמות מורכבת מעיבוד נפח של שבלול עכבר המציג את החלונות הסגלגלים (O) והעגולים (R), איבר קורטי עם תאי שיער (קו כחול, OC) והתעלה של רוזנטל שפוצלה ונפח מעובד המכיל נוירוני גנגליון ספירליים (SGNs). בר = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מחזיק הדגימה. אב טיפוס מעץ של מחזיק דגימה מותאם אישית לחיבור השבלול (ראש החץ) למוט דגימה (חץ) באמצעות דבק המופעל על ידי UV תוך שמירה על פתרון הניקוי בתוך השבלול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: חתך יריעות אור. חתך רוחב דרך יריעת אור סרוקה בציר X המציגה את מותני הקרן במרכז יריעת האור ואת הפרמטר הקונפוקלי (CP), שהוא אזור בו עובי הקרן קבוע יחסית. הרינדור המוצק העליון מציג את רוחב הקרן ללא סריקה והרינדור המוצק התחתון מציג את רוחב הקרן הסרוקה שנשארת דקה לכל רוחב השבלול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: חתך דו-ממדי באמצע דרך שבלול עכבר. ארבעה סיבובי שבלול מחולקים. ניתן לראות את הסיבוב הבסיסי של התעלה של רוזנטל המכיל נוירונים של גנגליון ספירלי בצורת כדורית. בר = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שני חתכי רוחב של השבלול. משמאל חתך דו-ממדי ומימין אותו קטע עם מספר מבנים שחולקו באמצעות עקיבה צבעונית שונה. בר = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מבני שבלול מפולחים. (A) איור זה מראה שבלול מקוטע עם הקפסולה האופטית שמסביב. (ב-ק) אלה מראים כמה מבני שבלול שונים שחולקו והצנטרואידים (הקו הלבן) נקבעים עבור רוב המבנים. מבני השבלול חולקו בצבעים שונים לצורך זיהויים: (A) דמות מורכבת עם עצם (לבן), (B) טורקיז (רצועה ספירלית), (C) חום (stria vascularis), (D) צהוב (קרום בזילרי), (E) אדום (איבר של קורטי), (F) צהוב-ירוק (תעלת רוזנטל), (G) כחול (scala tympani), זהב (stapes footplate), (H) לבן (scala media), ירוק (ductus reuniens), (I) אדום (scala vestibuli), סגול (קרום חלון עגול), זהב (אמת שבלול), (J) ירוק (קרום טקטוריאלי), (K) סגול (לימבוס ספירלי). בר = 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: השוואה של אותו מבנה שבלול בשני שבלולים שונים. באמצעות שיטת Procrustus בתוכנת עיבוד תלת מימד, הושוו מדיית Scala משני עכברים שונים. החלונית השמאלית מציגה התאמה של לפחות ריבועים של שני מבנים, והחלונית הימנית מציגה את ההבדלים הכמותיים ביניהם באמצעות מפת צבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: מודל פלסטיק תלת-ממדי מוצק של השבלול. הפאנל השמאלי מראה את סקאלה טימפאני של שבלול עכבר עם קרום בזילרי, איבר של קורטי והליקוטרמה מקוטעים. הלוח הימני מציג מודל פלסטיק מוצק של המבנים משמאל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: ספירת נוירונים של גנגליון ספירלי. SGNs זוהו וסומנו על ידי תוכנת עיבוד תלת-ממדית על חתך רוחב של מדיית Scala של שבלול העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: תיוג אימונוהיסטוכימי של תאי השערה החיצוניים. נוגדנים אנטי-פרסטין ונוגדנים משניים פלואורסצנטיים שחדרו דרך סקאלה פרי-לימפטית של שבלול עכבר תייגו את כל תאי השערה החיצוניים שעובדו בנפח באמצעות תוכנת עיבוד תלת-ממדית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: צפיפות SGNs לאורך תעלת רוזנטל. נראה כי האובדן הגדול ביותר של SGNs הוא באמצע ובקצוות האפיים של התעלה של רוזנטל בעכבר בן 23 החודשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 12: ניתוח אשכולות של צפיפות תאי SGN. הפאנל השמאלי מציג ניתוח אשכולות של SGNs בעכבר שומע רגיל בן 3 חודשים. מפת צבעים מראה כי צפיפות התאים הגדולה ביותר בצביר בגודל נתון היא במרכז תעלת רוזנטל, שם ספי השמיעה של עכברים הם הנמוכים ביותר. הפאנל הימני מראה את אובדן ה-SGNs לאורך התעלה של רוזנטל עם האובדן הגדול ביותר של SGNs באמצע התעלה של רוזנטל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
סרטון 1: סרטון סריקת ציר X של השבלול. סריקת ציר X של הדגימה דרך יריעת האור המראה את השבלול התלוי על ידי מוט הדגימה בתמיסת הניקוי הכלולה בתוך תא זכוכית. חתך פלואורסצנטי דו-ממדי אורתוגונלי של השבלול מוצג עקב הארה על ידי יריעת האור. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 2: ערימה של חלקים טוריים של השבלול. ערימה קצרה של חתכים דו-ממדיים מתקבלת על ידי סריקת ציר X וצעדי Z של 10 מיקרומטר דרך השבלול. שימו לב לקיומם של קווים אופקיים לאורך הערימה, שהם תוצרי בליעה עקב שימוש בעדשה גלילית לייצור יריעת האור. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 3: כריתה של שבלול במישור אחר. ערימה שנטענה לתוך תוכנת הרינדור התלת-ממדית וכריתה וירטואלית במישור המשיק לאיבר קורטי המראה את תאי השערה לאורך הממברנה הבזילרית. סרטון זה שונה מ- 8. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 4: שלד של מדיית סקאלה. הלוח השמאלי מציג את חישוב הצנטרויד במדיית סקאלה של שבלול עכבר. החלונית הימנית מציגה מפת צבע של המידות הרדיאליות של מדיית Scala לאורכה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חתך אופטי במיקרוסקופ יריעות אור לבחינת מבני שבלול אינו הרסני מבחינה מכנית כמו שיטות היסטולוגיות מסורתיות אחרות, והוא מספק תצוגה דיגיטלית מלאה של מבני השבלול ביחס זה לזה. שיטות קודמות כגון תכשירים על פני השטח של האיבר של קורטי14 סיפקו מפה של נשירת תאי שיער לאורך הקרום הבזילרי, אך לא ניתן היה להעריך אובדן SGN מכיוון שהרקמה נותחה משם כדי לחשוף את האיבר של קורטי. לחילופין, מקטעי מיקרוטומה בינוניים של השבלול מספקים רק מדגם קטן מאוד של מצב ה-SGNs לכל אורך התעלה של רוזנטל. עם TSLIM, כל מבני השבלול עוברים דיגיטציה ברמת הרזולוציה של המכשיר (כלומר, תת-תאי). ערימות תמונות שלמות של השבלול מאפשרות כימות והדמיה של מבני שבלול מרובים, המוצגים כאן, שלא ניתן היה להשיגם בשיטות היסטולוגיות מסורתיות. לדוגמה, באמצעות אלגוריתם אשכולות, המחקר הנוכחי הראה דרך חדשה לחלוטין לראות ולכמת את צפיפות תאי SGN בתוך התעלה של רוזנטל ולאפיין אובדן תאים עקב הזדקנות (איור 12).
TSLIM הוא פיתוח מוקדם8 של מיקרוסקופ גיליון אור בהשראת עבודתם של Voie ועמיתיו 4,5. מפרטים לבניית TSLIM נכללו במאמר על ידי Santi et al.8. למעשה, בראון ואחרים 15 הצהירו כי הם בנו מיקרוסקופ אור דומה להדמיית השבלול בהתבסס על העיצוב של TSLIM. כפי שהוזכר במבוא ונסקר על ידי Santi7, פיתוח מיקרוסקופים אחרים של יריעות אור (למשל, SPIM) היה מכוון לחקר התפתחות תאים חיים והשיג רזולוציה טובה יותר על ידי טבילה של מטרות N.A גבוהות בתוך תא הדגימה, אשר דרש מרחקי עבודה קטנים ואינו מתאים לדימות שבלול שלם. הפיתוח המסחרי של מיקרוסקופ יריעות אור נמשך, וסוג זה של הדמיה שימושי ביותר להכנת חלקים סדרתיים מיושרים היטב של רקמות ובעלי חיים שנעשו שקופים בשיטות ניקוי כימיות.
עבור כל יישום של מיקרוסקופ יריעות אור, קריטי שהדגימה תהיה שקופה כדי למנוע פיזור ובליעה של אור. הסתיידות היא הצעד הראשון בתהליך להסרת סידן מהשבלול לצורך שקיפות. אם EDTA אינו נשטף לחלוטין מתוך הרקמה לפני התייבשות, זה יהיה לזרז בתוך הרקמה הדמיה טובה לא יהיה אפשרי. התייבשות על ידי אתנול נחוצה לחדירה של תמיסת ניקוי Spalteholz. אם הדגימה היא בעלת פיגמנט כבד, הלבנה של הפיגמנט עשויה לעזור להפוך את הדגימה לשקופה יותר. ישנם כימיקלים ושיטות רבות אחרות שניתן להשתמש בהן כדי להפוך דגימה לשקופה ומשתמשים עשויים לרצות לנסות שיטות שונות כדי לקבוע איזו שיטה מתאימה ביותר לדגימה שלהם. למרות שמיקרוסקופ גיליון אור מייצר תמונות דו-ממדיות של רקמות, הרזולוציה שלו אינה גדולה כפי שניתן לקבל מקטעים מכניים דקים של רקמה (במיוחד קטעי פלסטיק) ומיקרוסקופ שדה בהיר. היתרון העיקרי שלה הוא לייצר קטעי רקמה סדרתיים מיושרים היטב לשחזור תלת ממדי של מבנים.
שני עכברי השבלול שאנו מראים כדוגמאות לאובדן SGN עקב הזדקנות חושפים אובדן נוירונים עקב הזדקנות. ממצא בלתי צפוי היה אובדן של SGNs בקצוות האמצעיים והאפיים של השבלול ולא אובדן בסיסי שיתאים לאובדן תאי שיער בבסיס. עם זאת, לא הערכנו את נשירת תאי השערה בשבלול הזה, ושתי הדגימות הן פשוט דוגמאות ולא חקירה של השפעות ההזדקנות על SGNs. במאמר של White et al.16, הם תיארו אובדן SGN בעכברי C57 בני 18 חודשים, אך לא קבעו את התפלגות האובדן לאורך התעלה של רוזנטל. במאמר אחר של Grierson et al.17, באמצעות עכברים בני 24-28 חודשים הם תיארו ניוון מסיבי של OHC efferents, במיוחד במחצית האפיקלית של השבלול, שם היה גם אובדן משמעותי של OHCs. ואכן, העתיד טומן בחובו אפשרויות רבות לחילוץ נתונים חדשים ולהשגת הבנה טובה יותר של תהליכים פתולוגיים בתוך השבלול עקב הזדקנות ועלבונות אחרים. יתר על כן, ערימות תמונות שבלול סופקו לחוקרים רבים אחרים ויהיה מעניין לראות כיצד חוקרים אלה כורים נתונים כדי לענות על שאלות המחקר שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות של המכונים הלאומיים לבריאות, קרן קלוג, ותרומות פרטיות של ברידג'ט ספרל וג'ון מקורמיק. TSLIM פותחה בעזרתם המצוינת של מתיאס הילנברנד, קרסטין ג'ון, מייק לוין, מישל לייהר, טוביאס שרוטר, פיטר שאכט, אוליבר דנברג וג'וליאן ווסטר מהאוניברסיטה הטכנית של אילמנאו, גרמניה, בפיקוח המנטורים שלהם (סטפן סינזינגר ורנה תסקה) וג'יימס לגר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
- Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021).
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J.
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).
- Voie, A. H., Spelman, S. A. Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Santi, P. A., et al. Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues. BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).
- Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection. Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039 (2007).
- Spalteholz, W. On making human and animal preparations transparent. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).
- Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion. Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).
- Santi, P. A. Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry. Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).
- Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model. Hearing Research. 339, 112-124 (2016).
- White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse. Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).
- Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy. Hearing Research. 422, 108533 (2022).
