Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע ניסוי סימון קרבה (PL) במלפפון (Cucumis sativus L.) באמצעות חלבון AT4G18020 (APRR2)-AirID כמודל. השיטה מתארת בניית וקטור, טרנספורמציה של מבנה באמצעות חדירת אגרו-אין, חדירת ביוטין, מיצוי חלבונים וטיהור חלבונים המסומנים בביוטין באמצעות טכניקת טיהור זיקה.
Abstract
בתאים ובצמחים של יונקים, גישות סימון קרבה (PL) המשתמשות באסקורבט פרוקסידאז מעובד (APEX) או Escherichia coli biotin ligase BirA (הידוע בשם BioID) הוכיחו הצלחה בזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs). APEX, BioID ו- TurboID, גרסה מתוקנת של BioID יש כמה מגבלות בנוסף להיותן טכנולוגיות יקרות ערך. AirID שפותח לאחרונה, גרסה חדשה של BioID לזיהוי קרבה באינטראקציות חלבון-חלבון, התגבר על מגבלות אלה. בעבר, AirID שימש במודלים של בעלי חיים, ואילו המחקר הנוכחי מדגים את השימוש ב- AirID בצמחים, והתוצאות אישרו כי AirID מתפקד טוב יותר במערכות צמחיות בהשוואה לאנזימי PL אחרים כגון BioID ו- TurboID לסימון חלבונים הקרובים לחלבוני המטרה. להלן פרוטוקול שלב אחר שלב לזיהוי שותפים לאינטראקציה עם חלבונים באמצעות חלבון AT4G18020 (APRR2) כמודל. השיטות מתארות בניית וקטור, טרנספורמציה של מבנה באמצעות חדירה חקלאית, טרנספורמציה של ביוטין, מיצוי חלבונים, והעשרה של חלבונים המסומנים בביוטין באמצעות טכניקת טיהור זיקה. התוצאות מסיקות כי AirID הוא אנזים חדשני ואידיאלי לניתוח PPIs בצמחים. השיטה יכולה להיות מיושמת לחקר חלבונים אחרים בצמחים.
Introduction
חלבונים תאיים שונים פועלים תחת מערכת הבקרה הביולוגית, ואינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) הן חלק ממערכת זו והבסיס לתהליכים תאיים רבים. מלבד PPIs, הפונקציה של חלבונים טבעיים מקודמת לאחר התרגום באמצעות שינויים שונים כגון היווצרות של מורכבות, ubiquitination, ו phosphorylation. לכן, חקר PPIs הוא משמעותי להבנת הפונקציה האפשרית של חלבוני מטרה. PPIs בוצעו באמצעות טכנולוגיות שונות כגון ניתוח ספקטרומטריית מסה לאחר משקעים חיסוניים (ניתוח IP-MS)1, מערכת שמרים דו-היברידית (Y2H)2, גם מערכים מבוססי תאים3. שיטות אלה בחנו ממצאים חיוניים שונים בתחום המחקר. עם זאת, שיטות אלה יש כמה חסרונות; לדוגמה, Y2H היא אסטרטגיה יקרה שגוזלת זמן רב ומחייבת בניית ספריית Y2H של זן היעד.
בנוסף, טכניקת Y2H משתמשת בשמרים, אורגניזם אאוקריוטי חד-תאי הטרולוגי, שלא יכול היה לשקף במדויק את המצב התאי של תאים איקריוטים גבוהים יותר. ה- IP-MS אינו מתאים לחלבונים הידרופוביים גבוהים ומראה יעילות נמוכה בלכידת PPI חלש. חלבונים חיוניים שונים בצמחים כגון תחום קשירת נוקלאוטידים וחלבונים עשירים בלאוצין המכילים חזרה (NLR) וקינאזות דמויות קולטן (RLKs) באים לידי ביטוי ברמה נמוכה ולרוב מתקשרים עם חלבונים אחרים באופן ארעי; לכן, השימוש בשיטות אלה אינו מספיק להבנת המנגנונים העומדים בבסיס הבקרה של חלבונים אלה3.
שיטה חדשה הנקראת ביוטינילציה של קרבה (PB) מסייעת לחוקרים לזהות PPIs. PB תלוי באנזימי PL, אשר נצמדים לחלבון המעניין (POI), וכאשר חלבון שותף מתקרב לנקודת עניין, PL מצמיד תג ביוטין כימי לחלבון השותף. יתר על כן, ניתן לזהות את החלבון המתויג ויכול לדעת במהירות איזה חלבון שותף מתחבר לחלבון היעד5. מחקרים קודמים הוכיחו כי BioID ו- TurboID הם כלים מוצלחים עבור PPIs, במיוחד בצמחים, אך יש להם מגבלות מסוימות4. BioID זקוק לרמה גבוהה של ביוטין לתיוג חלבונים שותפים, תהליך שלוקח יותר מ-16 שעות. בהשוואה ל- BioID, TurboID מועיל יותר מכיוון שהוא מסמן חלבון תוך 10 דקות ויכול לתייג את החלבון השותף בטמפרטורת החדר (RT). זה גם רעיל לתאים בתנאים מסוימים ותיוג אלה חלבונים שאינם מראים אינטראקציה עם החלבון של עניין.
כדי להתגבר על בעיות אלה, AirID, שפותח על ידי Kido et al., יעיל יותר משאר אנזימי התיוג, אם כי דמיון הרצף הוא 82% בין BioID ו- AirID5. כדי לבדוק את היעילות של AirID, ערכנו ניסוי באמצעות POI עם שותפים ידועים. ניסוי זה אישר כי AirID יכול ללא ספק לתייג חלבונים הקשורים בתאי צמחים. AirID הוא אנזים רב ערך לניתוח PPIs במבחנה ובתאים. זה יוצר פחות רעילות והוא פחות שגוי בתהליכים שלוקח זמן מאשר TurboID לתייג שאינם שותפים, מה שמוביל להרג התא. הוא מדגים כי AirID תחרותי יותר מאנזימי תיוג אחרים עבור ביוטינילציה של קרבה. הוא מדויק יותר, בעל פוטנציאל רב יותר בתהליכי גזילת זמן, ופחות רעיל במבחנה ובתאים חיים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר זיהוי חלבונים באינטראקציה של APRR2 באמצעות AirID כאנזים PL; יתר על כן, השיטה יכולה להיות מיושמת על חלבונים אחרים כדי לחקור PPIs במיני צמחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת חומר צמחי
- Cucumis sativus (מלפפון) משמש לניתוח ניסיוני. שים את הזרעים במים, לדגור ב 50 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, ולאחר מכן מניחים את הזרעים על נייר סינון על צלחת פטרי במשך 12-16 שעות.
- לאחר מכן, העבירו את הזרעים לעציצים המכילים אדמה (שנרכשו באופן מסחרי) וגדלו בתא אקלימי בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס ו-16 שעות אור ו-8 שעות כהות.
- שמרו על הצמחים בתא האקלים במשך 3-4 שבועות עד שהצמחים מגיעים ל-3 או 4 שלבי עלים לחדירה מוצלחת.
2. ביצוע בניית AirID
- השתמש ב- APRR2 כחלבון מטרה ובנה APRR2-AirID תחת מקדם וירוס פסיפס הכרובית 35S (p35S: APRR2-AirID). הכנס אותו לווקטור הבינארי pEarleyGate1006 תואם השער (מסופק על ידי ד"ר קתרין שריק, אוניברסיטת קנזס סטייט), וסנתז את האנזים PL ישירות בהתאם לרצף המסופק בקובץ משלים 1.
3. הכנת תאים מוסמכים
- הכנת תאים מוכשרים DH5α
- חסן את 2 מ"ל של LB (10 גרם / ליטר של טריפטון, 5 גרם / ליטר של תמצית שמרים, ו 10 גרם / ליטר של NaCl; pH = 7.0.) עם תאי E.Coli DH5α (ישירות מן המלאי הקפוא ללא הפשרה) ולגדול לילה (O/N) ב 37 ° C.
- לחסן טרי 0.1%-0.5% חיסון מתרבית O/N לתוך 100 מ"ל של LB בינוני ולגדל את התאים עד OD600 מגיע בין 0.4-0.6, ולאחר מכן לדגור על התרבית ב 4 ° C במשך 30 דקות.
- קח את התרבית לתוך שני צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל ולהסתובב ב 2500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים ב-10 מ"ל של CaCl2 קר כקרח ב-0.1 מ"ל, והניחו על קרח למשך 15 דקות. גלולה את התאים עם 2500 x גרם ספין במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של קר כקרח 0.1 M CaCl2 + 20% גליצרול, aliquot 100 μL לתוך כל צינור 1.5 מ"ל, ולאחסן אותם מיד ב -80 ° C.
- הכנת תאים מוסמכים GV3101
- חסן 2 מ"ל של LB (המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ו-25 מיקרוגרם/מ"ל ריפמפיצין) במושבת GV3101 יחידה. יש לדגור על תרבית O/N בטמפרטורה של 28°C תוך כדי רעידות ב-250 סל"ד.
- חסן 200 מ"ל של LB עם 1 מ"ל של תרבית לילה רוויה. נערו את התרבית ב-250 סל"ד תוך כדי דגירה ב-28°C עד שה-OD600 יהיה שווה ל-0.5.
- מעבירים את התרבית לארבעה צינורות צנטריפוגות סטריליות של 50 מ"ל מקוררים מראש ומניחים על קרח למשך 30 דקות.
- גלולה את התאים ב 2500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C. השליכו את הסופרנאטנט והניחו את הכדוריות על קרח.
- להשעות מחדש את התאים ב 10 מ"ל של 0.1 M קר כקרח CaCl2 פתרון. אסוף את התאים יחד לתוך צינור אחד מצונן מראש 50 מ"ל אוקרידג '.
- גלול את התאים ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים בתמיסת CaCl2 קרה כקרח של 10 מ"ל. מניחים על קרח למשך 30 דקות.
- גלול את התאים ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים בתמיסת CaCl2 קרה כקרח של 0.1 M.
- מוציאים את התאים לתוך אליקוט 50 μL בצינורות פוליפרופילן סטריליים מקוררים מראש. אחסן את התאים ב -80 °C.
4. חדירה חקלאית
- ראשית, להעביר את פלסמיד אגרובקטריום
- להעביר 2.5 μL של פלסמיד שנוצר משלב 2.1 לתאים המוסמכים של זן אגרובקטריום tumefaciens GV3101 ולדגור על קרח במשך 30 דקות.
- מעבירים את הצינור המכיל את הפלסמיד ואת התאים המוסמכים לחנקן נוזלי למשך 3 דקות.
- הלם חום ב 37 ° C במשך 5 דקות באינקובטור, ולאחר מכן לשים את הצינור על קרח במשך 2 דקות.
- הוסף 1,000 μLof LB בינוני (10 גרם / ליטר של טריפטון, 5 גרם / ליטר של תמצית שמרים, ו 10 גרם / ליטר של NaCl; pH = 7.0) לאגרובקטריום ודגור ב 30 ° C ו 118 סל"ד במשך 1 שעות.
- צנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 2 דקות ב-4°C.
- השליכו את 800 μL העליונים של התמיסה וערבבו את התמיסה הנותרת. לאחר מכן, צלחת אותו על LB (כפי שהוזכר בשלב 4.1.4 הוסיף עם אגר ו 50 מיקרוגרם / מ"ל Kanamycin עבור פלסמיד ו 50 מיקרוגרם / מ"ל gentamycin ו 25 מיקרוגרם / מ"ל rifampicin עבור GV3010 תאים מוסמכים). לדגור את הצלחות ב 30 ° C במשך 48 שעות.
הערה: עדיף לבחור כמה מושבות ולבצע PCR כדי לאשר את הגן של עניין7.
- הרימו כמה מושבות חיידקים מהצלחות והכניסו אותן למצעי LB בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה (ראו שלב 4.1.6). יש לדגור ב-30°C וב-218 סל"ד למשך 36-48 שעות.
- צנטריפוגה את התאים ב 3,000 x גרם עבור 2 minat 4 ° C. השהה מחדש את התאים ל- OD600 = 1.0 במאגר Agroinfiltration (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5.6, 250 μM אצטוסירינגון).
- להחדיר את החיסון (שנוצר משלב 4.3) לאפידרמיס (abaxial) באמצעות מזרק 1 מ"ל ללא מחט.
הערה: עדיף לחדור לכל העלה ולבחור לשכפל. עבור 4-5 צמחים, השתמש במבנה אחד. עבור כל עלה, 1.5 מ"ל של אגרובקטריה resuspended מספיק. - שמור על הצמחים במשך 36 שעות בתא האקלים עם אור של 16 שעות (כ -75 μmol·m-2·s-1) ו 8 שעות פוטופריוד כהה ב 23 ° C.
- לאחר 36 שעות של חדירת מבנה, לחדור 1 מ"ל של 5 מיקרומטר ביוטין (בתמיסת 10 מ"מ MgCl2 ) לתוך העלים שכבר לא מסוננים של המבנה.
- שמור על הצמחים המטופלים במשך 4-12 שעות נוספות לפני קצירת רקמת העלה.
הערה: על פי המחקר הקודם, חלבון המטרה מגיע לשיא של 36 שעות, לכן בחר 36 חדירות ביוטיןHPI 4,6. משך הדגירה של ביוטין תלוי במחקר המטרה, אך על פי הניסוי הנוכחי, תקופת דגירה של 8 שעות מתאימה יותר לתיוג חלבונים.
5. איסוף דוגמאות
הערה: כל החומרים לאיסוף דגימות צריכים להיות סטריליים כדי למנוע זיהום קרטין, וכל שלבי הפרוטוקול צריכים להתבצע בסביבה נטולת זיהום.
- חותכים את העלים המסתננים ומעבירים אותם במהירות לחנקן נוזלי כדי למנוע פירוק חלבון.
- לבצע זיהוי מראש של חלבון באמצעות ניתוח immunoblot6; זה מומלץ מאוד לפני Co-immunoprecipitation (Co-IP).
6. מיצוי חלבון כולל מהעלה
- טוחנים את העלים באמצעות מזיק וטיט, מוסיפים במהירות 2 מ"ל של 1x PBS-BSA PH 7.4 וטוחנים לאט.
- קחו צינור חרוטי בנפח 15 מ"ל, הניחו מסנן חומר סינון מהיר על גבי הצינור החרוטי, העבירו את תערובת הדגימות לצינור דרך מסנן חומרי הסינון המהיר, ושמרו אותו על קרח.
- מעבירים את הדגימות לצינור של 2 מ"ל ומוסיפים קוקטייל מעכב חלבון 1%.
- מערבבים את התוכן על ידי סיבוב כלפי מעלה ומטה 7-8 פעמים וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את הממס העליון של הדגימות לצינורות חדשים של 2 מ"ל, מוסיפים 10% β-D-מלטוזיד (β-D.M) ומניחים על קרח למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
7. איזון עמודת ההתפלה
- צנטריפוגה את העמוד ב 1,000 x גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C.
הערה: סמן צד אחד של העמודה וודא שהצד המסומן פונה כלפי חוץ במהלך כל תהליכי הצנטריפוגה. - הסר את הכיסוי העליון והתחתון של העמוד והצנטריפוגה ב- 1,000 x גרם למשך 2 דקות ב- 4 ° C.
- השליכו את התמיסה הנוזלית מצינור האיסוף של העמוד והוסיפו 5 מ"ל של חיץ PBS 1x לשטיפה.
- צנטריפוגה את העמוד ב 1,000 x גרם למשך 2 דקות ב 4 ° C.
- חזור על שלבים 7.3 ו- 7.4 לפחות חמש פעמים.
8. שטיפת חרוזים מגנטיים
- קח צינור 1.5 מ"ל והוסף 50 μL של חרוזים מגנטיים מצומדים סטרפטווידין-C1.
- הוסיפו 1 מ"ל של 1x PBS-BSA לשטיפה, ערבבו היטב והניחו על מעמד המגנט למשך 3 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
- חזור על שלב 8.2 לפחות שלוש פעמים.
- לאחר כל כביסה, הניחו את הצינור על המדף המגנטי כדי לספוח את החרוזים לצד אחד של הצינור כדי להסיר את מאגר הכביסה.
9. העשרה של חלבונים biotinylated
- הוסף 2 מ"ל של הדגימות לעמודה וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 8 דקות ב 4 ° C.
- הוסף 1 מ"ל של תמצית חלבון מותפל ל 50 μL של חרוזים מגנטיים מצומדים סטרפטווידין-C1 כדי לאזן אותם.
- הניחו את הצינור על המסובב במהירות רגילה כך שהתמיסה תתערבב היטב ותדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות.
- הניחו את החרוזים על המדף המגנטי למשך 3 דקות ב-RT, או עד שהם נאספים בצד אחד של הצינור, כדי להסיר בעדינות את הסופרנטנט.
- הוסף 1 מ"ל של חיץ כביסה I (2% SDS במים), סובב ב- RT במשך 2 דקות על מסובב וחזור על שלב 9.4.
- הניחו את הצינור על המסובב ב-RT למשך 2 דקות לאחר הוספת 1 מ"ל של חיץ כביסה II (50 mM HEPES: pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% חומצה דאוקסיקולית [w/v], ו-1% Triton X-100). חזור על שלב 9.4.
- הוסף 1 מ"ל של חיץ כביסה III (10 mM Tris-HCl: pH = 7.4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% חומצה דאוקסיקולית [w/v], 1% NP40 [v/v]), וסובב באמצעות שייקר במשך 2 דקות ב- RT. לאחר מכן, חזור על שלב 9.4.
- כדי להסיר את חומר הניקוי, הוסף 1.7 מ"ל של 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5) וחזור על שלב 9.4. חזור על שלב זה פעם נוספת.
- שטפו את החרוזים שש פעמים במשך 2 דקות כל אחד ב-1 מ"ל של מאגר אמוניום ביקרבונט 50 מילימטר ב-RT וחזרו על שלב 9.4.
- הוסף 50 μL של תמצית חלבון המכיל 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 12% (w/v) סוכרוז (Suc), 2% (w/v) ליתיום lauryl סולפט, ו 1.5% (w/v) dithiothreitol לחרוזים, הלם חום באינקובטור ב 100 ° C במשך 5 דקות ובצע את שלב 9.4. אחסן את הסופרנאטנט בטמפרטורה של -80°C לצורך ניתוח LC-MS/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על פי מחקרים קודמים, גן המלפפון APRR2 הוא הגן המועמד השולט בצבע פרי לבן לא בוגר8. כאן, פותח פרוטוקול באמצעות AirID כאנזים סימון קרבה כדי למצוא את חלבון השותף של APRR2 במלפפון. המבנה הועבר לעלי המלפפון, ולאחר 36 שעות לאחר החדירה, הועבר ביוטין. לאחר 48 שעות נלקחו הדגימות לניתוח כתמים מערביים כדי לאשר את השינוי המוצלח. החלבונים הופקו כאמור לעיל בפרוטוקול לכתם המערבי. הנתונים המייצגים באיור 1 הצביעו על ביטוי החלבונים והביוטינילציה בעלי המלפפון שהסתננו, שהיו הממצאים הצפויים בהתבסס על הטכניקה החדשה ששונתה. התוצאות הראו רמת ביטוי גבוהה יותר של חלבונים מסומנים ופסים נוספים בהשוואה לקבוצת הביקורת. זה מאשר כי AirID בהצלחה תייג את חלבוני המטרה של הגן של עניין (GOI). יתר על כן, התוצאות אושרו גם באמצעות נוגדנים נגד דגל ונגד עכבר, אשר הראו בהצלחה את רצועת המטרה עם נוגדן נגד דגל (איור 2). לאחר אישור באמצעות ניתוח כתמים מערביים, ביצענו Co-IP באמצעות הפרוטוקול שהוזכר לעיל, והחלבונים הביוטיניליים של העלים החודרים הועשרו בהצלחה לניתוח ספקטרומטריית מסות, כפי שמוצג באיור 3. לאחר העשרת חלבונים ביוטינילטים בחרוזים מגנטיים מצומדים מסוג סטרפטאבידין C1, נצפו חלבונים רבים בגדלים שונים, וניתוח כתמים מערביים גילה פסים מרוחים (איור 3).
איור 1: ניתוח כתמים מערביים של חלבונים לאחר טרנספורמציה לעלים כדי לאשר את תפקוד AirID באמצעות סטרפטווידין-HRP. האיור מאשר כי חלבונים biotinylated יש ארבעה עותקים עצמאיים עבור בניית דגימות מותמרות. עלים מסוג בר שימשו כבקרה. עבור כל העתק, 10 μL מהדגימות הועמסו לניתוח כתמים מערביים. Streptavidin-HRP (דילול 1:6000) שימש לניתוח חלבונים ביוטיניליים בדגימות שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח כתמים מערביים של חלבונים לאחר טרנספורמציה לעלים כדי לזהות את רצף ה-Taq. רצף התגים 3x-Flag אוחד עם הגן המעניין כדי לאשר את השינוי המוצלח. רצף הטאק זוהה באמצעות ניתוח כתמים מערביים בכל הדגימות שעברו טרנספורמציה. דגימות עלי מלפפון מסוג בר שימשו כבקרה. בסך הכל 10 μL מהדגימות הועמסו לניתוח כתמים מערביים, והתוצאות אושרו באמצעות אנטי-פלאג כנוגדן ראשון בדילול של 1:3000 ואנטי-עכבר כנוגדן שני בדילול 1:10000. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח אימונובלוט של תמציות חלבון. לאחר Co-immunoprecipitation (Co-IP), ניתוח כתמים מערביים של חלבונים biotinylated בעלים agroinfiltrated של Cucumis sativus (מלפפון) עם streptavidin-HRP בוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בניסוי הנוכחי, AirID שימש לתיוג קרבה, ש-Kido ועמיתיו פיתחו באמצעות אלגוריתם של שחזור אנזימים קדמונים באמצעות מערך נתונים גנומי גדול וחמישהאנזימי BirA 5 קונבנציונליים. מוטציות אקראיות שימשו בהנדסת חלבונים אבולוציונית מסורתית כדי לשפר את פעילות 9,10 מכיוון שמוטציות אקראיות אינן יכולות לייצר שינויים דינמיים ברצף. בהשוואה לאנזימי PL אחרים, ל- AirID מספר יתרונות. בעבר שיטת PL זו הייתה ישימה רק למערכות בעלי חיים. במחקר זה נעשה שימוש כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון בצמחים. הפרוטוקול מתאר כיצד להגדיר PL מבוסס AirID בצמחים צעד אחר צעד, כולל הכנת דגימות עלים, הסרת ביוטין חופשי, כימות חלבונים שחולצו והעשרת חלבונים ביוטינילטים.
באמצעות שימוש בביטוי חולף מבוסס היטב בתיווך אגרובקטריום במלפפון, גישה זו משמשת למציאת PPIs של חלבון המטרה המעניין מלפפון. הביטוי הארעי עלול לגרום לביטוי יתר של חלבוני האיחוי. היתוך AirID חייב גם להיבדק כדי לוודא שהוא אינו מפריע לתפקוד של חלבון המטרה המעניין, וזה שיקול מכריע נוסף. עם זאת, בעוד PL מספק מספר יתרונות על פני טכניקות IP-MS סטנדרטיות לזיהוי PPI חולף או חלש, יש לו גם כמה מגבלות. בראש ובראשונה, גילוי חלבון האינטראקציה המועמד אינו מרמז אוטומטית על אינטראקציה ישירה או עקיפה עם חלבון הפיתיון, אלא משקף קרבה לחלבון הפיתיון9. ניתן לאמת עוד יותר PPIs in vivo באמצעות בדיקות עצמאיות (למשל, co-immunoprecipitation, השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית (BiFC), או מבחן GST במבחנה , אשר ניתן לבצע כדי לאמת PPIs עוד יותר.
המחקר מצא כי פעילות הביוטינילציה הפרוקסימלית של AirID הייתה נמוכה משמעותית מזו של TurboID. במבחנה ובתאים, TurboID היה בעל פעילות הביוטינילציה הפרוקסימלית הגבוהה ביותר. ניתן להשתמש באנזים זה תוך 10 דקות לביוטינילט 9,11. עם זאת, בתאים שטופלו בדגירה ממושכת של מעל 6 שעות וריכוזי ביוטין גבוהים יותר, פעילות TurboID הגבוהה ביותר הובילה לביוטינילציה נוספת על חלבונים בלתי צפויים, כגון טובולין ו-GFP (כגון ביוטין של 50 מיליגרם). בניגוד לשימוש כאנזים ביוטינילציה פרוקסימלי עבור PPIs, TurboID דווח לראשונה כאנזים לסימון ביוטין 4,6,5,7. אם TurboID היה מעריך PPIs, הוא היה מתפקד בצורה הטובה ביותר בתנאים מגבילים, כגון משך הזמן קצר, כשעה אחת בתאים. AirID, biotinylation של tubulin ו- GFP לא נמצאו באותם תנאים כמו אלה שנצפו עבור TurboID biotinylation. חלבוני היתוך AirID נמצאו כמסוגלים לביוטיניל של כל אינטראקטור ידוע בשני הארעיים, כפי שהודגם על ידי בדיקת משיכת סטרפטווידין וניתוח LC-MS/MS5. בריכוזי ATP נמוכים (1 מילימול), היווצרות ביוטינויל-5-AMP הייתה חזקה יותר עבור AirID מאשר עבור TurboID. הוא מעדיף ריכוזים נמוכים יותר של ביוטין (עם 5 מילימטר ביוטין או ללא תוספת ביוטין) מאשר TurboID, המעדיף ריכוזים גבוהים יותר. בנוסף, בדיקה של אתרי ביוטינילציה באמצעות LC-MS/MS גילתה כי ביוטינילציה של AirID התרחשה ללא העדפת רצף ייחודית על שאריות Lys סמוכות, מה שמצביע על כך שתהליך הביוטינילציה לא היה מועדף5. למרות שדמיון הרצף בין BioID ל-AirID הוא 82%, AirID הראה פעילות ביוטינילציה גבוהה כנגד חלבונים המקיימים אינטראקציה. Kido et al., 2020 מצאו כי AirID יכול לנתח אינטראקציות חלבון-חלבון במבחנה ובתאים. ממצאיהם מצביעים על כך שביוטינילציה התלויה ב-AirID עשויה להיות שימושית לניתוח PPI של תרכובות כימיות. זיהוי שותפי in vivo של חלבוני מטרה הוא חיוני להבנת תפקודים ביולוגיים12,13, והוא חשף PPIs חדשים, כך שביוטינילציה של קרבת in vivo באמצעות BioID שימשה במחקרים רבים. גם כאשר ביוטין קיבל תוספת, ביטוי יציב של AirID לא גרם לעיכוב צמיחת תאים, מה שמצביע על כך שהביטוי של חלבוני היתוך AirID יהיה דל מאוד רעיל5. AirID צפוי לשפר את דיוק הביו-טינילציה התלוי ב-PPI בשילוב; לסיכום, המסקנה היא כי AirID הוא אידיאלי עבור ניתוח PPI בצמחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא הצהירו על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '32000197 ל- X.H.), המענק הכספי המיוחד מהקרן הסינית למדע פוסט-דוקטורט (מענק מס '2019T120467 ל- X.H.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | S1519 | |
| Acryl/Bis 30% solution | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 1510KA4528 | |
| Agar | BioFroxx GmbH | D64683 | |
| Agarose | tsingke (Shanghai) Co.Ltd | TSJ001 | |
| Ammonium bicarbonate | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G313BA0018 | |
| Biotin | BBI life Sciences | G908BA0012 | |
| CaCl2 | BBI life Sciences | E209BA0008 | |
| Competent cells GV3101 | Made in the current experiment | ||
| Desalting column | Thermo scientific | WC321753 | |
| Deoxycholic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G818BA0029 | |
| DH5α competent cells | Made in the current experiment | E.coli DH5α | |
| β-D-maltoside | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S818 | |
| EDTA | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | E104BA0029 | |
| Glycine | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 161BA0031 | |
| HEPES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | H8090 | |
| LiCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H209BA0003 | |
| MES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | M8019 | |
| MiraCloth | EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay | 3429963 | Quick filtration material filter |
| MgCl2 | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | 20200819 | |
| NaCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H324BA0003 | |
| NP40 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | N8030 | |
| Protein inhibitor cocktail | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S3450 | |
| PVDF | BIO-RAD | 5820172 | |
| SDS | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S1015 | |
| Silwet | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | S9430 | |
| Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads | Enriching Biotechnology | 7E511E1 | Magnetic beads |
| TEMED | Servicebio | G2056 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | GB03BA007 | |
| Tris-HCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | F828BA0020 | |
| Tryptone | Thermo scientific | LP0042 |
References
- Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226 (2015).
- Zhao, S., et al. Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system. Parasites & Vectors. 10 (1), 536 (2017).
- Zhang, Y., et al. A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species. Plant Communications. 1 (5), 100028 (2020).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments. (159), e60728 (2020).
- Kido, K., et al. AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions. eLife. 9, 54983 (2020).
- Hu, X., et al. Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants. Biomolecules. 11 (8), 1143 (2021).
- Ammiraju, J., et al. The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza. Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).
- Liu, C., et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459 (2019).
- Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix. Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).
- Motani, K., Kosako, H. Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).
