Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राम का गहन शिक्षण-आधारित विभाजन

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64435
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Pennsylvania State University-College of Medicine, 2Object Research Systems

Summary

यह प्रशिक्षण इनपुट के रूप में एक टोमोग्राम के एक हिस्से का उपयोग करके क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राम के बहु-वर्ग विभाजन के लिए एक बहु-स्लाइस यू-नेट को प्रशिक्षित करने की एक विधि है। हम वर्णन करते हैं कि इस नेटवर्क को अन्य टोमोग्राम में कैसे अनुमान लगाया जाए और आगे के विश्लेषणों के लिए विभाजन कैसे निकाला जाए, जैसे कि सबटोमोग्राम औसत और फिलामेंट ट्रेसिंग।

Abstract

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) शोधकर्ताओं को वर्तमान में संभव उच्चतम रिज़ॉल्यूशन पर अपने मूल, हाइड्रेटेड अवस्था में कोशिकाओं की छवि बनाने की अनुमति देता है। तकनीक की कई सीमाएं हैं, हालांकि, जो डेटा का विश्लेषण करने को समय-गहन और कठिन बनाती हैं। एक टोमोग्राम को हाथ से विभाजित करने में घंटों से लेकर दिन तक का समय लग सकता है, लेकिन एक माइक्रोस्कोप आसानी से एक दिन में 50 या अधिक टोमोग्राम उत्पन्न कर सकता है। क्रायो-ईटी के लिए वर्तमान गहन शिक्षण विभाजन कार्यक्रम मौजूद हैं, लेकिन एक समय में एक संरचना को विभाजित करने तक सीमित हैं। यहां, मल्टी-स्लाइस यू-नेट कन्वोल्यूशनल न्यूरल नेटवर्क को क्रायो-टोमोग्राम के भीतर एक साथ कई संरचनाओं को स्वचालित रूप से विभाजित करने के लिए प्रशिक्षित और लागू किया जाता है। उचित प्रीप्रोसेसिंग के साथ, इन नेटवर्कों को प्रत्येक टोमोग्राम के लिए व्यक्तिगत नेटवर्क को प्रशिक्षित करने की आवश्यकता के बिना कई टोमोग्राम के लिए मजबूत रूप से अनुमान लगाया जा सकता है। यह वर्कफ़्लो नाटकीय रूप से उस गति में सुधार करता है जिसके साथ क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राम का विश्लेषण ज्यादातर मामलों में विभाजन समय को 30 मिनट से कम करके किया जा सकता है। इसके अलावा, विभाजन का उपयोग सेलुलर संदर्भ के भीतर फिलामेंट ट्रेसिंग की सटीकता में सुधार करने और सबटोमोग्राम औसत के लिए निर्देशांक को तेजी से निकालने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

पिछले दशक में हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर विकास के परिणामस्वरूप क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) 1,2 के लिए "रिज़ॉल्यूशन क्रांति" हुई है। बेहतर और तेज़ डिटेक्टरों3 के साथ, डेटा संग्रह 4,5 को स्वचालित करने के लिए सॉफ्टवेयर, और चरण प्लेट6 जैसे सिग्नल बूस्टिंग एडवांस, बड़ी मात्रा में उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटा एकत्र करना अपेक्षाकृत सरल है।

क्रायो-ईटी एक देशी, हाइड्रेटेड अवस्था 7,8,9,10 में सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। प्राथमिक सीमा नमूना मोटाई है, लेकिन केंद्रित आयन बीम (एफआईबी) मिलिंग जैसे तरीकों को अपनाने के साथ, जहां टोमोग्राफी11 के लिए मोटी सेलुलर और ऊतक के नमूने पतले होते हैं, क्रायो-ईटी के साथ चित्रित किए जा सकने वाले क्षितिज का लगातार विस्तार हो रहा है। नवीनतम माइक्रोस्कोप एक दिन में 50 से अधिक टोमोग्राम का उत्पादन करने में सक्षम हैं, और यह दर केवल तेजी से डेटा संग्रह योजनाओं12,13 के विकास के कारण बढ़ने का अनुमान है। क्रायो-ईटी द्वारा उत्पादित डेटा की विशाल मात्रा का विश्लेषण करना इस इमेजिंग पद्धति के लिए एक अड़चन बनी हुई है।

टोमोग्राफिक जानकारी के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए आवश्यक है कि इसे पहले एनोटेट किया जाए। परंपरागत रूप से, इसके लिए एक विशेषज्ञ द्वारा हाथ विभाजन की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाला है; क्रायो-टोमोग्राम के भीतर निहित आणविक जटिलता के आधार पर, इसे समर्पित ध्यान के घंटों से दिनों तक लग सकता है। कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क इस समस्या का एक आकर्षक समाधान है क्योंकि उन्हें समय के एक अंश में विभाजन कार्य के थोक करने के लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है। संक्रामक तंत्रिका नेटवर्क (सीएनएन) विशेष रूप से कंप्यूटर दृष्टिकार्यों 14 के लिए अनुकूल हैं और हाल ही में क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राम 15,16,17 के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया है।

पारंपरिक सीएनएन को कई हजारों एनोटेटेड प्रशिक्षण नमूनों की आवश्यकता होती है, जो अक्सर जैविक छवि विश्लेषण कार्यों के लिए संभव नहीं होता है। इसलिए, यू-नेट आर्किटेक्चर ने इस स्पेस18 में उत्कृष्ट प्रदर्शन किया है क्योंकि यह नेटवर्क को सफलतापूर्वक प्रशिक्षित करने के लिए डेटा वृद्धि पर निर्भर करता है, जिससे बड़े प्रशिक्षण सेटों पर निर्भरता कम हो जाती है। उदाहरण के लिए, एक यू-नेट आर्किटेक्चर को एक ही टोमोग्राम (चार या पांच स्लाइस) के केवल कुछ स्लाइस के साथ प्रशिक्षित किया जा सकता है और पुन: प्रशिक्षण के बिना अन्य टोमोग्राम के लिए मजबूती से अनुमान लगाया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल ड्रैगनफ्लाई 2022.119 के भीतर इलेक्ट्रॉन क्रायो-टोमोग्राम को विभाजित करने के लिए यू-नेट न्यूरल नेटवर्क आर्किटेक्चर को प्रशिक्षित करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करता है।

ड्रैगनफ्लाई व्यावसायिक रूप से विकसित सॉफ्टवेयर है जिसका उपयोग गहन शिक्षण मॉडल द्वारा 3 डी छवि विभाजन और विश्लेषण के लिए किया जाता है, और यह अकादमिक उपयोग के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है (कुछ भौगोलिक प्रतिबंध लागू होते हैं)। इसमें एक उन्नत ग्राफिकल इंटरफ़ेस है जो एक गैर-विशेषज्ञ को सिमेंटिक विभाजन और छवि विरूपण दोनों के लिए गहरी शिक्षा की शक्तियों का पूरा लाभ उठाने की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क के प्रशिक्षण के लिए ड्रैगनफ्लाई के भीतर क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राम को कैसे पूर्व-संसाधित और एनोटेट किया जाए, जिसे तब बड़े डेटासेट को तेजी से विभाजित करने का अनुमान लगाया जा सकता है। यह आगे चर्चा करता है और संक्षेप में दर्शाता है कि आगे के विश्लेषण के लिए खंडित डेटा का उपयोग कैसे किया जाए जैसे कि फिलामेंट ट्रेसिंग और उप-टोमोग्राम औसत के लिए निष्कर्षण का समन्वय करें।

Protocol

नोट: ड्रैगनफ्लाई 2022.1 के लिए एक उच्च प्रदर्शन वर्कस्टेशन की आवश्यकता होती है। सिस्टम अनुशंसाएँ इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्कस्टेशन के हार्डवेयर के साथ सामग्री की तालिका में शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी टोमोग्राम 3.3 से 13.2 एंजी / पिक्स के पिक्सेल आकार से 4x बिन किए जाते हैं। प्रतिनिधि परिणामों में उपयोग किए गए नमूने एक कंपनी से प्राप्त किए गए थे ( सामग्री की तालिका देखें) जो पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है जो इस संस्थान के नैतिक मानकों के अनुरूप हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले टोमोग्राम और प्रशिक्षण इनपुट के रूप में उत्पन्न मल्टी-आरओआई को पूरक फ़ाइल 1 (जो https://datadryad.org/stash/dataset/doi:10.5061/dryad.rxwdbrvct पर पाया जा सकता है) में एक बंडल डेटासेट के रूप में शामिल किया गया है ताकि उपयोगकर्ता उसी डेटा के साथ अनुसरण कर सके। ड्रैगनफ्लाई एक ओपन एक्सेस डेटाबेस भी होस्ट करता है जिसे इनफिनिटी टूलबॉक्स कहा जाता है जहां उपयोगकर्ता प्रशिक्षित नेटवर्क साझा कर सकते हैं।

1. सेटअप

  1. डिफ़ॉल्ट कार्यस्थान बदलना:
    1. इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए कार्यस्थान को दर्पण करने के लिए बदलने के लिए, मुख्य पैनल में बाईं ओर, दृश्य दृश्य गुण अनुभाग पर नीचे स्क्रॉल करें और शो लीजेंड्स का चयन करें। लेआउट अनुभाग पर नीचे स्क्रॉल करें और एकल दृश्य और चार समान दृश्य दृश्य का चयन करें.
    2. डिफ़ॉल्ट इकाई को अद्यतन करने के लिए, फ़ाइल पर जाएँ | प्राथमिकताएं. खुलने वाली विंडो में, डिफ़ॉल्ट इकाई को मिलीमीटर से नैनोमीटर में बदलें।
  2. उपयोगी डिफ़ॉल्ट कुंजीबिंद:
    1. 2 डी दृश्यों में क्रॉसहेयर प्रदर्शित करने के लिए ईएससी दबाएं और 3 डी दृश्य में 3 डी वॉल्यूम रोटेशन की अनुमति दें। 2D दृश्यों में क्रॉसहेयर को छिपाने के लिए X दबाएँ और 3D दृश्य में 2D अनुवाद और 3D वॉल्यूम अनुवाद की अनुमति दें.
    2. छोटे तीरों को देखने के लिए क्रॉसहेयर पर मंडराएं जिन्हें अन्य 2 डी दृश्यों में देखने वाले विमान के कोण को बदलने के लिए क्लिक और खींचा जा सकता है।
    3. दोनों दृश्यों में ज़ूम स्थिति में प्रवेश करने के लिए Z दबाएँ, जिससे उपयोगकर्ता ज़ूम इन और आउट करने के लिए कहीं भी क्लिक और खींच सकते हैं।
    4. केवल उस दृश्य पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चार दृश्य दृश्य में किसी दृश्य पर डबल-क्लिक करें; सभी चार दृश्यों पर लौटने के लिए फिर से डबल-क्लिक करें।
  3. समय-समय पर आसान आयात के लिए एक ओआरएस ऑब्जेक्ट के रूप में गुण टैब में सब कुछ निर्यात करके प्रगति सहेजें। सूची में सभी ऑब्जेक्ट्स का चयन करें और निर्यात करें पर राइट क्लिक करें | ओआरएस ऑब्जेक्ट के रूप में। फ़ाइल को नाम दें और सहेजें. वैकल्पिक रूप से, फ़ाइल पर जाएँ | सत्र सहेजें. सॉफ्टवेयर में ऑटोसेव सुविधा का उपयोग करने के लिए, इसे फ़ाइल के माध्यम से सक्षम करें | प्राथमिकताएं | ऑटोसेव।

2. छवि आयात

  1. छवि आयात के लिए, फ़ाइल पर जाएँ | छवि फ़ाइलें आयात करें. जोड़ें पर क्लिक करें, छवि फ़ाइल पर नेविगेट करें, और खोलें पर क्लिक करें | अगला | समाप्त करें।
    नोट: सॉफ़्टवेयर .rec फ़ाइलों को नहीं पहचानता है। सभी टोमोग्राम में .mrc प्रत्यय होना चाहिए। यदि प्रदान किए गए डेटा का उपयोग कर रहे हैं, तो इसके बजाय फ़ाइल पर जाएं | ऑब्जेक्ट (ओं) आयात करें। Training.ORSObject फ़ाइल पर नेविगेट करें और खोलें क्लिक करें, फिर ठीक क्लिक करें.

3. प्रीप्रोसेसिंग (चित्रा 1.1)

  1. एक कस्टम तीव्रता पैमाने बनाएं (डेटासेट में छवि तीव्रता को कैलिब्रेट करने के लिए उपयोग किया जाता है)। उपयोगिताओं पर जाएं | आयाम इकाई प्रबंधक. निचले बाएँ में, एक नई आयाम इकाई बनाने के लिए + क्लिक करें.
  2. एक उच्च तीव्रता (उज्ज्वल) और कम तीव्रता (अंधेरे) सुविधा चुनें जो रुचि के सभी टोमोग्राम में है। इकाई को एक नाम और एक संक्षिप्त नाम दें (उदाहरण के लिए, इस पैमाने के लिए, 0.0 मानक तीव्रता और पृष्ठभूमि को 100.0 पर सेट करें)। कस्टम आयाम इकाई सहेजें.
    नोट: एक कस्टम तीव्रता पैमाना एक मनमाना पैमाना है जिसे यह सुनिश्चित करने के लिए डेटा पर बनाया और लागू किया जाता है कि सभी डेटा अलग-अलग समय पर या विभिन्न उपकरणों पर एकत्र किए जाने के बावजूद समान तीव्रता पैमाने पर हैं। प्रकाश और अंधेरे विशेषताओं का चयन करें जो सिग्नल के भीतर आने वाली सीमा का सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व करते हैं। यदि डेटा में कोई भौतिक विशेषताएं नहीं हैं, तो बस सबसे अंधेरे सुविधा का चयन करें जो खंडित होने जा रहा है (उदाहरण के लिए प्रोटीन का सबसे गहरा क्षेत्र)।
  3. कस्टम तीव्रता पैमाने पर छवियों को कैलिब्रेट करने के लिए, स्क्रीन के दाईं ओर गुण कॉलम में डेटासेट पर राइट-क्लिक करें और कैलिब्रेट इंटेंसिटी स्केल का चयन करें। स्क्रीन के बाईं ओर मुख्य टैब पर, प्रोब अनुभाग पर नीचे स्क्रॉल करें। उपयुक्त व्यास के साथ परिपत्र जांच उपकरण का उपयोग करके, टोमोग्राम के पृष्ठभूमि क्षेत्र में कुछ स्थानों पर क्लिक करें और कच्चे तीव्रता कॉलम में औसत संख्या रिकॉर्ड करें; फिड्यूशियल मार्करों के लिए दोहराएं, फिर कैलिब्रेट पर क्लिक करें। यदि आवश्यक हो, तो मुख्य टैब के विंडो लेवलिंग अनुभाग में क्षेत्र उपकरण के साथ संरचनाओं को फिर से दृश्यमान बनाने के लिए कंट्रास्ट को समायोजित करें।
  4. छवि फ़िल्टरिंग:
    नोट: छवि फ़िल्टरिंग शोर को कम कर सकती है और सिग्नल को बढ़ावा दे सकती है। यह प्रोटोकॉल तीन फिल्टर का उपयोग करता है जो सॉफ्टवेयर में बनाए गए हैं क्योंकि वे इस डेटा के लिए सबसे अच्छा काम करते हैं, लेकिन कई फिल्टर उपलब्ध हैं। एक बार रुचि के डेटा के लिए एक छवि फ़िल्टरिंग प्रोटोकॉल पर तय होने के बाद, विभाजन से पहले सभी टोमोग्राम पर बिल्कुल समान प्रोटोकॉल लागू करना आवश्यक होगा।
    1. बाईं ओर मुख्य टैब में, छवि प्रसंस्करण पैनल पर नीचे स्क्रॉल करें। उन्नत क्लिक करें और नई विंडो खुलने की प्रतीक्षा करें. गुण पैनल से, फ़िल्टर किए जाने वाले डेटासेट का चयन करें और डेटासेट के बाईं ओर आंख आइकन पर क्लिक करके इसे दृश्यमान बनाएं।
    2. ऑपरेशन पैनल से, पहले ऑपरेशन के लिए हिस्टोग्राम इक्वलाइजेशन (कंट्रास्ट सेक्शन के तहत) का चयन करने के लिए ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करें। कार्रवाई जोड़ें का चयन करें | गॉसियन (स्मूथिंग सेक्शन के तहत)। कर्नेल आयाम को 3D में बदलें.
    3. एक तीसरा ऑपरेशन जोड़ें; फिर, Unsharp ( शार्पिंग अनुभाग के तहत) का चयन करें। इस के लिए आउटपुट छोड़ दें। सभी स्लाइस पर लागू करें और फ़िल्टरिंग को चलने दें, फिर मुख्य इंटरफ़ेस पर लौटने के लिए छवि प्रसंस्करण विंडो बंद करें।

4. प्रशिक्षण डेटा बनाएं (चित्रा 1.2)

  1. डेटा गुण पैनल में बाईं ओर आंख आइकन पर क्लिक करके पहले अनफ़िल्टर्ड डेटासेट को छिपाकर प्रशिक्षण क्षेत्र की पहचान करें। फिर, नए फ़िल्टर किए गए डेटासेट दिखाएं (जिसे स्वचालित रूप से DataSet-HistEq-गॉस-Unsharp नाम दिया जाएगा)। फ़िल्टर किए गए डेटासेट का उपयोग करके, टोमोग्राम के एक उप-क्षेत्र की पहचान करें जिसमें रुचि की सभी विशेषताएं शामिल हैं।
  2. रुचि के क्षेत्र के चारों ओर एक बॉक्स बनाने के लिए, बाईं ओर, मुख्य टैब में, आकृतियाँ श्रेणी में नीचे स्क्रॉल करें और बॉक्स बनाएँ का चयन करें. फोर व्यू पैनल में रहते हुए, बॉक्स के किनारों को मार्गदर्शन / खींचने में मदद करने के लिए विभिन्न 2 डी विमानों का उपयोग करें ताकि सभी आयामों में केवल रुचि के क्षेत्र को संलग्न किया जा सके। डेटा सूची में, बॉक्स क्षेत्र का चयन करें और आंख के प्रतीक के बगल में ग्रे स्क्वायर पर क्लिक करके आसानी से देखने के लिए सीमा का रंग बदलें।
    नोट: 2 डी यू-नेट के लिए सबसे छोटा पैच आकार 32 x 32 पिक्सेल है; 400 x 400 x 50 पिक्सेल शुरू करने के लिए एक उचित बॉक्स आकार है।
  3. मल्टी-आरओआई बनाने के लिए, बाईं ओर, विभाजन टैब का चयन करें | नया और मल्टी-आरओआई के रूप में बनाएं की जांच करें। सुनिश्चित करें कि कक्षाओं की संख्या रुचि की विशेषताओं की संख्या + एक पृष्ठभूमि वर्ग से मेल खाती है। मल्टी-आरओआई प्रशिक्षण डेटा को नाम दें और सुनिश्चित करें कि ओके पर क्लिक करने से पहले ज्यामिति डेटासेट से मेल खाती है।
  4. प्रशिक्षण डेटा को विभाजित करना
    1. बॉक्स किए गए क्षेत्र की सीमा के भीतर तक डेटा के माध्यम से स्क्रॉल करें। दाईं ओर गुण मेनू में मल्टी-ROI का चयन करें। इसे नाम देने के लिए मल्टी-ROI में पहले रिक्त वर्ग के नाम पर डबल-क्लिक करें।
    2. 2 डी ब्रश के साथ पेंट करें। बाईं ओर विभाजन टैब में, 2 डी टूल पर नीचे स्क्रॉल करें और एक परिपत्र ब्रश का चयन करें। फिर, ड्रॉपडाउन मेनू से अनुकूली गॉसियन या स्थानीय ओटीएसयू का चयन करें। पेंट करने के लिए, बाएं ctrl दबाए रखें और क्लिक करें। मिटाने के लिए, बाईं शिफ्ट पकड़ें और क्लिक करें।
      नोट: ब्रश वर्तमान में चयनित वर्ग के रंग को प्रतिबिंबित करेगा।
    3. मल्टी-आरओआई में प्रत्येक ऑब्जेक्ट क्लास के लिए पिछले चरण को दोहराएं। सुनिश्चित करें कि बॉक्स किए गए क्षेत्र के भीतर सभी संरचनाएं पूरी तरह से खंडित हैं या उन्हें नेटवर्क द्वारा पृष्ठभूमि माना जाएगा।
    4. जब सभी संरचनाओं को लेबल किया गया है, तो मल्टी-आरओआई में पृष्ठभूमि वर्ग पर राइट-क्लिक करें और क्लास में सभी अनलेबल वोक्सेल जोड़ें का चयन करें।
  5. मास्क नामक एक नया एकल-श्रेणी आरओआई बनाएं। सुनिश्चित करें कि ज्यामिति फ़िल्टर किए गए डेटासेट पर सेट है, फिर लागू करें पर क्लिक करें। दाईं ओर गुण टैब में, बॉक्स पर राइट-क्लिक करें और ROI में जोड़ें का चयन करें. इसे मास्क ROI में जोड़ें।
  6. मास्क का उपयोग करके प्रशिक्षण डेटा को ट्रिम करने के लिए, गुण टैब में, Ctrl पकड़कर और प्रत्येक पर क्लिक करके प्रशिक्षण डेटा मल्टी-ROI और मास्क ROI दोनों का चयन करें। इसके बाद, बुलियन ऑपरेशन लेबल वाले अनुभाग में डेटा गुण सूची के नीचे प्रतिच्छेद पर क्लिक करें। नए डेटासेट ट्रिम्ड ट्रेनिंग इनपुट का नाम दें, और सुनिश्चित करें कि ओके पर क्लिक करने से पहले ज्यामिति फ़िल्टर किए गए डेटासेट से मेल खाती है।

5. पुनरावृत्ति प्रशिक्षण के लिए विभाजन विज़ार्ड का उपयोग करना (चित्र 1.3)

  1. पहले गुण टैब में फ़िल्टर किए गए डेटासेट पर राइट-क्लिक करके और फिर विभाजन विज़ार्ड विकल्प का चयन करके विभाजन विज़ार्ड में प्रशिक्षण डेटा आयात करें. जब कोई नई विंडो खुलती है, तो दाईं ओर इनपुट टैब देखें। किसी मल्टी-ROI से फ़्रेम आयात करें क्लिक करें और छंटनी किए गए प्रशिक्षण इनपुट का चयन करें.
  2. (वैकल्पिक) वास्तविक समय में प्रशिक्षण प्रगति की निगरानी के लिए एक दृश्य प्रतिक्रिया फ्रेम बनाएँ।
    1. डेटा से एक फ़्रेम का चयन करें जो खंडित नहीं है और इसे एक नए फ़्रेम के रूप में जोड़ने के लिए + क्लिक करें. फ़्रेम के दाईं ओर मिश्रित लेबल को डबल-क्लिक करें और इसे मॉनिटरिंग में बदलें।
  3. एक नया न्यूरल नेटवर्क मॉडल उत्पन्न करने के लिए, मॉडल टैब में दाईं ओर, एक नया मॉडल उत्पन्न करने के लिए + बटन पर क्लिक करें। सूची से U-Net का चयन करें, और उसके बाद इनपुट आयाम के लिए, 2.5D और 5 स्लाइस का चयन करें, फिर जनरेट करें क्लिक करें.
  4. नेटवर्क को प्रशिक्षित करने के लिए, SegWiz विंडो के निचले दाईं ओर ट्रेन क्लिक करें।
    नोट: प्रगति खोए बिना प्रशिक्षण को जल्दी रोका जा सकता है।
  5. नए फ्रेम को सेगमेंट करने के लिए प्रशिक्षित नेटवर्क का उपयोग करने के लिए, जब U-Net प्रशिक्षण पूरा हो जाता है, तो एक नया फ़्रेम बनाएं और Predict (नीचे दाईं ओर) क्लिक करें। फिर, विभाजन को वास्तविक फ्रेम में स्थानांतरित करने के लिए अनुमानित फ्रेम के ऊपरी दाईं ओर अप तीर पर क्लिक करें।
  6. भविष्यवाणी को सही करने के लिए, Ctrl-एक के खंडित पिक्सेल को दूसरे में बदलने के लिए दो वर्गों पर क्लिक करें । दोनों वर्गों का चयन करें और किसी भी वर्ग से संबंधित केवल पिक्सेल को पेंट करने के लिए ब्रश के साथ पेंट करें। कम से कम पांच नए फ्रेम में विभाजन को सही करें।
    नोट: दोनों वर्गों का चयन करते समय ब्रश टूल के साथ पेंटिंग का मतलब है कि शिफ्ट-क्लिक मिटाने के बजाय, जैसा कि यह सामान्य रूप से करता है, यह पहली कक्षा के पिक्सेल को दूसरे में परिवर्तित कर देगा। Ctrl-click रिवर्स को पूरा करेगा।
  7. पुनरावृत्ति प्रशिक्षण के लिए, ट्रेन बटन पर फिर से क्लिक करें और नेटवर्क को एक और 30-40 और युगों के लिए आगे प्रशिक्षित करने की अनुमति दें, जिस बिंदु पर प्रशिक्षण बंद करें और प्रशिक्षण के एक और दौर के लिए चरण 4.5 और 4.6 दोहराएं।
    नोट: इस तरह, एक मॉडल को एकल डेटासेट का उपयोग करके पुनरावर्ती रूप से प्रशिक्षित और बेहतर बनाया जा सकता है।
  8. नेटवर्क को प्रकाशित करने के लिए, जब उसके प्रदर्शन से संतुष्ट हों, तो विभाजन विज़ार्ड से बाहर निकलें. संवाद बॉक्स में जो स्वचालित रूप से पॉप अप करता है और पूछता है कि कौन से मॉडल प्रकाशित (सहेजना) करना है, सफल नेटवर्क का चयन करें, इसे नाम दें, फिर नेटवर्क को विभाजन विज़ार्ड के बाहर उपयोग के लिए उपलब्ध कराने के लिए इसे प्रकाशित करें।

6. नेटवर्क लागू करें (चित्रा 1.4)

  1. पहले प्रशिक्षण टोमोग्राम पर लागू करने के लिए, गुण पैनल में फ़िल्टर किए गए डेटासेट का चयन करें। बाईं ओर विभाजन पैनल में, एआई अनुभाग के साथ सेगमेंट में नीचे स्क्रॉल करें। सुनिश्चित करें कि सही डेटासेट का चयन किया गया है, उस मॉडल को चुनें जो अभी ड्रॉपडाउन मेनू में प्रकाशित हुआ था, फिर सेगमेंट पर क्लिक करें | सभी स्लाइस। वैकल्पिक रूप से, विभाजन का एक-टुकड़ा पूर्वावलोकन देखने के लिए पूर्वावलोकन का चयन करें।
  2. अनुमान डेटासेट पर लागू करने के लिए, नया टोमोग्राम आयात करें। चरण 3 (चित्रा 1.1) के अनुसार प्रीप्रोसेस। सेगमेंटेशन पैनल में, एआई सेक्शन के साथ सेगमेंट में जाएं। सुनिश्चित करें कि नया फ़िल्टर किया गया टोमोग्राम चयनित डेटासेट है, पहले प्रशिक्षित मॉडल चुनें, और सेगमेंट पर क्लिक करें | सभी स्लाइस।

7. विभाजन हेरफेर और सफाई

  1. पहले उन वर्गों में से एक को चुनकर शोर को जल्दी से साफ करें जिसमें खंडित शोर और रुचि की विशेषता है। राइट-क्लिक | प्रक्रिया द्वीप समूह | Voxel Count द्वारा हटा दें | Voxel आकार का चयन करें. छोटे (~ 200) शुरू करें और धीरे-धीरे अधिकांश शोर को दूर करने के लिए गिनती बढ़ाएं।
  2. विभाजन सुधार के लिए, Ctrl-उन वर्गों से संबंधित पिक्सेल को पेंट करने के लिए दो वर्गों पर क्लिक करें। दूसरी कक्षा के पिक्सेल को पहले में बदलने के लिए सेगमेंटेशन टूल के साथ Ctrl-click + ड्रैग और विपरीत को पूरा करने के लिए Shift-click + ड्रैग। गलत लेबल किए गए पिक्सेल को जल्दी से सही करने के लिए ऐसा करना जारी रखें।
  3. अलग कनेक्टेड घटक।
    1. एक कक्षा चुनें। मल्टी-आरओआई में एक कक्षा पर राइट-क्लिक करें | प्रत्येक घटक के लिए एक नया वर्ग बनाने के लिए कनेक्ट किए गए घटकों को अलग करें जो समान वर्ग के किसी अन्य घटक से कनेक्ट नहीं है। कक्षाओं को आसानी से विलय करने के लिए मल्टी-आरओआई के नीचे दिए गए बटन का उपयोग करें।
  4. ROI को बाइनरी / TIFF के रूप में निर्यात करें।
    1. मल्टी-आरओआई में एक वर्ग चुनें, फिर राइट-क्लिक करें और आरओआई के रूप में क्लास निकालें। ऊपर दिए गए गुण पैनल में, नए ROI का चयन करें, राइट-क्लिक करें | निर्यात | बाइनरी के रूप में ROI (सुनिश्चित करें कि सभी छवियों को एक फ़ाइल में निर्यात करने का विकल्प चुना गया है)।
      नोट: उपयोगकर्ता आसानी से IMOD प्रोग्राम tif2mrc20 का उपयोग करके tiff से mrc प्रारूप में परिवर्तित कर सकते हैं। यह फिलामेंट ट्रेसिंग के लिए उपयोगी है।

8. आरओआई से औसत उप-टोमोग्राम के लिए निर्देशांक उत्पन्न करना

  1. एक कक्षा निकालें।
    1. औसत के लिए उपयोग की जाने वाली क्लास राइट-क्लिक करें | आरओआई के रूप में कक्षा निकालें। राइट-क्लिक क्लास ROI | कनेक्टेड घटक | नई मल्टी-आरओआई (26 कनेक्टेड)।
  2. निर्देशांक जनरेट करें.
    1. नए मल्टी-आरओआई पर राइट-क्लिक करें | स्केलर जनरेटर। डेटासेट के साथ बुनियादी माप का विस्तार करें | द्रव्यमान एक्स, वाई और जेड के भारित केंद्र की जांच करें। डेटासेट का चयन करें और गणना करें। मल्टी-आरओआई पर राइट-क्लिक करें | स्केलर मान निर्यात करें। सभी स्केलर स्लॉट का चयन करें, फिर सीएसवी फ़ाइल के रूप में मल्टी-आरओआई में प्रत्येक वर्ग के लिए केन्द्रक विश्व निर्देशांक उत्पन्न करने के लिए ठीक है।
      नोट: यदि कण एक साथ करीब हैं और विभाजन स्पर्श कर रहे हैं, तो घटकों को बहु-आरओआई में अलग करने के लिए वाटरशेड ट्रांसफॉर्म करना आवश्यक हो सकता है।

9. वाटरशेड परिवर्तन

  1. मल्टी-आरओआई में राइट-क्लिकिंग क्लास द्वारा कक्षा निकालें ताकि औसत के लिए उपयोग किया जा सके आरओआई के रूप में कक्षा निकालें। इस ROI वाटरशेड मास्क का नाम बताएं।
  2. (वैकल्पिक) छेद बंद करो.
    1. यदि खंडित कणों में छेद या उद्घाटन हैं, तो इन्हें वाटरशेड के लिए बंद कर दें। डेटा गुण में ROI क्लिक करें। विभाजन टैब (बाईं ओर) में, रूपात्मक संचालन पर जाएं और बिना किसी छेद के ठोस विभाजन प्राप्त करने के लिए जो भी आवश्यक पतला, इरोड और क्लोज के संयोजन का उपयोग करें।
  3. ROI पर क्लिक करके ROI को इनवर्ट करें | चयनित ऑब्जेक्ट की प्रतिलिपि बनाएँ (नीचे डेटा गुण). कॉपी किए गए ROI का चयन करें, और विभाजन टैब में बाईं ओर Invert क्लिक करें।
  4. उल्टे ROI पर राइट-क्लिक करके एक दूरी का नक्शा बनाएं | मैपिंग बनाएं | दूरी का नक्शा. बाद में उपयोग के लिए, दूरी के नक्शे की एक प्रति बनाएं और इसे उलट दें (राइट-क्लिक करें ) संशोधित करें और बदलें | इनवर्ट मान | लागू करें)। इस उल्टे मानचित्र लैंडस्केप को नाम दें।
  5. बीज बिंदु बनाएं।
    1. ROI छुपाएँ और दूरी मानचित्र प्रदर्शित करें. विभाजन टैब में, श्रेणी निर्धारित करें पर क्लिक करें और श्रेणी तब तक घटाएँ जब तक कि प्रत्येक बिंदु के केंद्र में केवल कुछ पिक्सेल हाइलाइट न हों और कोई भी किसी अन्य बिंदु से कनेक्ट न हो. श्रेणी अनुभाग के निचले भाग में, नया में जोड़ें क्लिक करें. इस नए ROI सीडपॉइंट्स का नाम दें।
  6. वाटरशेड ट्रांसफॉर्म करें।
    1. सीडपॉइंट आरओआई पर राइट-क्लिक करें | कनेक्टेड घटक | नई मल्टी-आरओआई (26 कनेक्टेड)। नए जेनरेट किए गए मल्टी-आरओआई पर राइट-क्लिक करें | वाटरशेड ट्रांसफॉर्म। लैंडस्केप नाम के दूरी मानचित्र का चयन करें और ठीक पर क्लिक करें; वाटरशेड मास्क नामक आरओआई का चयन करें और प्रत्येक बीज बिंदु से वाटरशेड परिवर्तन की गणना करने के लिए ओके पर क्लिक करें और अलग-अलग कणों को मल्टी-आरओआई में अलग-अलग वर्गों में विभाजित करें। चरण 8.2 में निर्देशांक उत्पन्न करें।

Figure 1
चित्रा 1: वर्कफ़्लो. 1) तीव्रता पैमाने को कैलिब्रेट करके और डेटासेट को फ़िल्टर करके प्रशिक्षण टोमोग्राम को प्रीप्रोसेस करें। 2) एक टोमोग्राम के एक छोटे से हिस्से को उन सभी उपयुक्त लेबल के साथ हाथ से विभाजित करके प्रशिक्षण डेटा बनाएं जिन्हें उपयोगकर्ता पहचानना चाहता है। 3) फ़िल्टर किए गए टोमोग्राम को इनपुट के रूप में और हाथ विभाजन को प्रशिक्षण आउटपुट के रूप में उपयोग करते हुए, एक पांच-परत, बहु-स्लाइस यू-नेट को विभाजन विज़ार्ड में प्रशिक्षित किया जाता है। 4) प्रशिक्षित नेटवर्क को एनोटेट करने के लिए पूर्ण टोमोग्राम पर लागू किया जा सकता है और प्रत्येक खंडित वर्ग से 3 डी रेंडरिंग उत्पन्न की जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

प्रोटोकॉल के बाद, पांच वर्गों की पहचान करने के लिए एक एकल टोमोग्राम (चित्रा 2 ए) पर एक पांच-स्लाइस यू-नेट को प्रशिक्षित किया गया था: झिल्ली, सूक्ष्मनलिकाएं, एक्टिन, फिड्यूशियल मार्कर और पृष्ठभूमि। नेटवर्क को कुल तीन बार पुनरावृत्त रूप से प्रशिक्षित किया गया था, और फिर इसे पूरी तरह से विभाजित करने और एनोटेट करने के लिए टोमोग्राम पर लागू किया गया था (चित्रा 2 बी, सी)। चरण 7.1 और 7.2 का उपयोग करके न्यूनतम सफाई की गई थी। रुचि के अगले तीन टोमोग्राम (चित्रा 2 डी, जी, जे) प्रीप्रोसेसिंग के लिए सॉफ्टवेयर में लोड किए गए थे। छवि आयात से पहले, टोमोग्राम (चित्रा 2 जे) में से एक को 17.22 A / px से 13.3 A / px तक पिक्सेल आकार समायोजन की आवश्यकता होती है क्योंकि इसे थोड़ा अलग आवर्धन पर एक अलग माइक्रोस्कोप पर एकत्र किया गया था। IMOD प्रोग्राम निचोड़वोल का उपयोग निम्नलिखित कमांड के साथ आकार बदलने के लिए किया गया था:

'निचोड़वोल -एफ 0.772 इनपुटफाइल.mrc आउटपुटफाइल.mrc'

इस आदेश में, -एफ उस कारक को संदर्भित करता है जिसके द्वारा पिक्सेल आकार को बदलना है (इस मामले में: 13.3/17.22)। आयात के बाद, चरण 3.2 और 3.3 के अनुसार सभी तीन अनुमान लक्ष्यों को पूर्व-संसाधित किया गया था, और फिर पांच-स्लाइस यू-नेट लागू किया गया था। न्यूनतम सफाई फिर से की गई थी। अंतिम विभाजन चित्र 2 में प्रदर्शित किए गए हैं।

प्रत्येक टोमोग्राम से सूक्ष्मनलिका विभाजन को बाइनरी (चरण 7.4) टीआईएफ फ़ाइलों के रूप में निर्यात किया गया था, एमआरसी (आईएमओडी टीआईएफ 2 एमआरसी प्रोग्राम) में परिवर्तित किया गया था, और फिर सिलेंडर सहसंबंध और फिलामेंट ट्रेसिंग के लिए उपयोग किया गया था। फिलामेंट्स के बाइनरी विभाजन के परिणामस्वरूप टोमोग्राम पर ट्रेसिंग की तुलना में बहुत अधिक मजबूत फिलामेंट ट्रेसिंग होती है। फिलामेंट ट्रेसिंग (चित्रा 3) से समन्वय मानचित्र का उपयोग आगे के विश्लेषण के लिए किया जाएगा, जैसे कि निकटतम पड़ोसी माप (फिलामेंट पैकिंग) और सूक्ष्मनलिका अभिविन्यास निर्धारित करने के लिए एकल फिलामेंट्स के साथ पेचदार उप-टोमोग्राम औसत।

असफल या अपर्याप्त रूप से प्रशिक्षित नेटवर्क निर्धारित करना आसान है। एक असफल नेटवर्क किसी भी संरचना को विभाजित करने में असमर्थ होगा, जबकि एक अपर्याप्त रूप से प्रशिक्षित नेटवर्क आमतौर पर कुछ संरचनाओं को सही ढंग से विभाजित करेगा और इसमें गलत सकारात्मक और झूठे नकारात्मक की एक महत्वपूर्ण संख्या होगी। इन नेटवर्कों को उनके प्रदर्शन को बेहतर बनाने के लिए सही किया जा सकता है और पुनरावृत्ति रूप से प्रशिक्षित किया जा सकता है। विभाजन विज़ार्ड स्वचालित रूप से एक मॉडल के डाइस समानता गुणांक (जिसे सेगविज में स्कोर कहा जाता है) की गणना करता है। यह आंकड़ा प्रशिक्षण डेटा और यू-नेट विभाजन के बीच समानता का अनुमान देता है। ड्रैगनफ्लाई 2022.1 में एक मॉडल के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक अंतर्निहित उपकरण भी है जिसे इंटरफ़ेस के शीर्ष पर आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस टैब में एक्सेस किया जा सकता है (उपयोग के लिए प्रलेखन देखें)।

Figure 2
(ए-सी) टाइटन क्रिओस पर 2019 में एकत्र किए गए डीआईवी 5 हिप्पोकैम्पल चूहे न्यूरॉन का मूल प्रशिक्षण टोमोग्राम। यह आईएमओडी में सीटीएफ सुधार के साथ एक बैकप्रोजेक्टेड पुनर्निर्माण है। (ए) पीला बॉक्स उस क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है जहां प्रशिक्षण इनपुट के लिए हाथ विभाजन किया गया था। (बी) प्रशिक्षण पूरा होने के बाद यू-नेट से 2 डी विभाजन। (सी) झिल्ली (नीला), सूक्ष्मनलिकाएं (हरा), और एक्टिन (लाल) दिखाने वाले खंडित क्षेत्रों का 3 डी प्रतिपादन। (डी-एफ) प्रशिक्षण टोमोग्राम के समान सत्र से डीआईवी 5 हिप्पोकैम्पल चूहा न्यूरॉन। (ई) यू-नेट से 2 डी विभाजन जिसमें कोई अतिरिक्त प्रशिक्षण और त्वरित सफाई नहीं है। झिल्ली (नीला), सूक्ष्मनलिकाएं (हरा), एक्टिन (लाल), फिड्यूशियल्स (गुलाबी)। (च) खंडित क्षेत्रों का 3डी प्रतिपादन। (G-I) 2019 सत्र से डीआईवी 5 हिप्पोकैम्पल चूहा न्यूरॉन। (एच) त्वरित सफाई और (आई) 3 डी रेंडरिंग के साथ यू-नेट से 2 डी विभाजन। (J-L) डीआईवी 5 हिप्पोकैम्पल चूहा न्यूरॉन, 2021 में एक अलग टाइटन क्रिओस पर एक अलग आवर्धन पर एकत्र किया गया था। प्रशिक्षण टोमोग्राम से मेल खाने के लिए पिक्सेल आकार को आईएमओडी प्रोग्राम स्क्वीज़वोल के साथ बदल दिया गया है। (के) त्वरित सफाई के साथ यू-नेट से 2 डी विभाजन, उचित प्रीप्रोसेसिंग और (एल) विभाजन के 3 डी प्रतिपादन के साथ डेटासेट में मजबूत अनुमान का प्रदर्शन करता है। स्केल सलाखों = 100 एनएम। संक्षिप्तरूप: DIV = विट्रो में दिन; सीटीएफ = कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: फिलामेंट ट्रेसिंग सुधार। (ए) टाइटन क्रिओस पर एकत्र किए गए एक डीआईवी 4 चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन का टोमोग्राम। (बी) एक्टिन फिलामेंट्स पर सिलेंडर सहसंबंध से उत्पन्न सहसंबंध मानचित्र। (ग) पैरामीटरों को परिभाषित करने के लिए सहसंबंध मानचित्र में एक्टिन फिलामेंट्स की तीव्रता का उपयोग करके एक्टिन का फिलामेंट अनुरेखण। ट्रेसिंग झिल्ली और सूक्ष्मनलिकाएं, साथ ही शोर को पकड़ती है, जबकि सिर्फ एक्टिन का पता लगाने की कोशिश करती है। (डी) टोमोग्राम का यू-नेट विभाजन। झिल्ली नीले रंग में हाइलाइट की गई, लाल रंग में सूक्ष्मनलिकाएं, नारंगी में राइबोसोम, बैंगनी में ट्राइक और हरे रंग में एक्टिन। (ई) फिलामेंट ट्रेसिंग के लिए बाइनरी मास्क के रूप में निकाले गए एक्टिन विभाजन। (च) (बी) से समान मापदंडों के साथ सिलेंडर सहसंबंध से उत्पन्न सहसंबंध मानचित्र। (जी) टोमोग्राम से सिर्फ एक्टिन फिलामेंट्स के फिलामेंट ट्रेसिंग में काफी सुधार हुआ। संक्षिप्त नाम: DIV = विट्रो में दिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले टोमोग्राम और प्रशिक्षण इनपुट के रूप में उत्पन्न मल्टी-आरओआई को बंडल डेटासेट (Training.ORSObject) के रूप में शामिल किया गया है। https://datadryad.org/stash/dataset/doi:10.5061/dryad.rxwdbrvct देखें।

Discussion

यह प्रोटोकॉल एकल टोमोग्राम से बहु-श्रेणी यू-नेट को प्रशिक्षित करने के लिए ड्रैगनफ्लाई 2022.1 सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एक प्रक्रिया निर्धारित करता है, और उस नेटवर्क को अन्य टोमोग्राम में कैसे अनुमान लगाया जाए जिन्हें एक ही डेटासेट से होने की आवश्यकता नहीं है। प्रशिक्षण अपेक्षाकृत त्वरित है (प्रति युग 3-5 मिनट जितना तेज या कुछ घंटों जितना धीमा हो सकता है, पूरी तरह से प्रशिक्षित किए जा रहे नेटवर्क और उपयोग किए जाने वाले हार्डवेयर पर निर्भर करता है), और इसके सीखने में सुधार के लिए एक नेटवर्क को फिर से प्रशिक्षित करना सहज है। जब तक प्रीप्रोसेसिंग चरण प्रत्येक टोमोग्राम के लिए किए जाते हैं, तब तक अनुमान आमतौर पर मजबूत होता है।

लगातार प्रीप्रोसेसिंग गहन शिक्षण अनुमान के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है। सॉफ्टवेयर में कई इमेजिंग फिल्टर हैं और उपयोगकर्ता यह निर्धारित करने के लिए प्रयोग कर सकता है कि कौन से फिल्टर विशेष डेटासेट के लिए सबसे अच्छा काम करते हैं; ध्यान दें कि प्रशिक्षण टोमोग्राम पर जो भी फ़िल्टरिंग का उपयोग किया जाता है, उसे अनुमान टोमोग्राम के समान ही लागू किया जाना चाहिए। नेटवर्क को सटीक और पर्याप्त प्रशिक्षण जानकारी प्रदान करने के लिए भी सावधानी बरतनी चाहिए। यह महत्वपूर्ण है कि प्रशिक्षण स्लाइस के भीतर खंडित सभी सुविधाओं को यथासंभव सावधानीपूर्वक और सटीक रूप से विभाजित किया जाए।

छवि विभाजन एक परिष्कृत वाणिज्यिक-ग्रेड उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस द्वारा सुविधाजनक है। यह हाथ विभाजन के लिए सभी आवश्यक उपकरण प्रदान करता है और प्रशिक्षण और पुन: प्रशिक्षण से पहले किसी भी एक वर्ग से दूसरे में वोक्सेल के सरल पुन: असाइनमेंट की अनुमति देता है। उपयोगकर्ता को टोमोग्राम के पूरे संदर्भ में वोक्सेल को हाथ से विभाजित करने की अनुमति है, और उन्हें कई दृश्य और वॉल्यूम को स्वतंत्र रूप से घुमाने की क्षमता दी जाती है। इसके अतिरिक्त, सॉफ्टवेयर मल्टी-क्लास नेटवर्क का उपयोग करने की क्षमता प्रदान करता है, जो बेहतर प्रदर्शन करते हैंऔर कई एकल-वर्ग नेटवर्क के साथ सेगमेंटिंग की तुलना में तेज होते हैं।

बेशक, तंत्रिका नेटवर्क की क्षमताओं की सीमाएं हैं। क्रायो-ईटी डेटा, प्रकृति से, कोणीय नमूने में बहुत शोर और सीमित है, जो समान वस्तुओं में अभिविन्यास-विशिष्ट विकृतियों की ओर जाताहै। प्रशिक्षण संरचनाओं को सटीक रूप से हाथ से विभाजित करने के लिए एक विशेषज्ञ पर निर्भर करता है, और एक सफल नेटवर्क केवल उतना ही अच्छा (या बुरा) होता है जितना कि प्रशिक्षण डेटा दिया जाता है। सिग्नल को बढ़ावा देने के लिए छवि फ़िल्टरिंग ट्रेनर के लिए सहायक है, लेकिन अभी भी कई मामले हैं जहां किसी दिए गए संरचना के सभी पिक्सेल की सटीक पहचान करना मुश्किल है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रशिक्षण विभाजन बनाते समय बहुत सावधानी बरती जाए ताकि नेटवर्क को प्रशिक्षण के दौरान सीखने के लिए सबसे अच्छी जानकारी मिल सके।

इस वर्कफ़्लो को प्रत्येक उपयोगकर्ता की वरीयता के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है. हालांकि यह आवश्यक है कि सभी टोमोग्राम को बिल्कुल उसी तरह से प्रीप्रोसेस किया जाए, प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सटीक फिल्टर का उपयोग करना आवश्यक नहीं है। सॉफ्टवेयर में कई छवि फ़िल्टरिंग विकल्प हैं, और कई टोमोग्राम में फैले एक बड़े विभाजन परियोजना पर स्थापित होने से पहले उपयोगकर्ता के विशेष डेटा के लिए इन्हें अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है। उपयोग करने के लिए काफी कुछ नेटवर्क आर्किटेक्चर भी उपलब्ध हैं: इस प्रयोगशाला से डेटा के लिए एक मल्टी-स्लाइस यू-नेट सबसे अच्छा काम करने के लिए पाया गया है, लेकिन किसी अन्य उपयोगकर्ता को लग सकता है कि एक और आर्किटेक्चर (जैसे 3 डी यू-नेट या सेंसर 3 डी) बेहतर काम करता है। विभाजन विज़ार्ड एक ही प्रशिक्षण डेटा का उपयोग करके कई नेटवर्क के प्रदर्शन की तुलना करने के लिए एक सुविधाजनक इंटरफ़ेस प्रदान करता है।

यहां प्रस्तुत किए गए उपकरण पूर्ण टोमोग्राम के हाथ विभाजन को अतीत का कार्य बनाएंगे। अच्छी तरह से प्रशिक्षित तंत्रिका नेटवर्क के साथ जो मजबूत रूप से अनुमान लगाने योग्य हैं, एक वर्कफ़्लो बनाना पूरी तरह से संभव है जहां टोमोग्राफिक डेटा का पुनर्निर्माण, प्रसंस्करण और पूरी तरह से खंडित किया जाता है जितनी जल्दी माइक्रोस्कोप इसे इकट्ठा कर सकता है।

Disclosures

इस प्रोटोकॉल के लिए ओपन-एक्सेस लाइसेंस का भुगतान ऑब्जेक्ट रिसर्च सिस्टम द्वारा किया गया था।

Acknowledgments

इस अध्ययन को पेन स्टेट कॉलेज ऑफ मेडिसिन और जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान विभाग, साथ ही तंबाकू निपटान निधि (टीएसएफ) अनुदान 4100079742-ईएक्सटी द्वारा समर्थित किया गया था। क्रायोईएम और क्रायोईटी कोर (आरआरआईडी: SCR_021178) सेवाओं और उपकरणों को पेंसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन द्वारा वाइस डीन ऑफ रिसर्च एंड ग्रेजुएट स्टूडेंट्स के कार्यालय और पेंसिल्वेनिया डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ द्वारा तंबाकू निपटान निधि (क्योर) का उपयोग करके वित्त पोषित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि विश्वविद्यालय या कॉलेज ऑफ मेडिसिन के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है। पेंसिल्वेनिया स्वास्थ्य विभाग विशेष रूप से किसी भी विश्लेषण, व्याख्या या निष्कर्ष के लिए जिम्मेदारी का दावा करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dragonfly 2022.1 Object Research Systems https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
E18 Rat Dissociated Hippocampus Transnetyx Tissue KTSDEDHP https://tissue.transnetyx.com/faqs
IMOD University of Colorado https://bio3d.colorado.edu/imod/
Intel® Xeon® Gold 6124 CPU 3.2GHz Intel https://www.intel.com/content/www/us/en/products/sku/120493/intel-xeon-gold-6134-processor-24-75m-cache-3-20-ghz/specifications.html
NVIDIA Quadro P4000 NVIDIA https://www.nvidia.com/content/dam/en-zz/Solutions/design-visualization/productspage/quadro/quadro-desktop/quadro-pascal-p4000-data-sheet-a4-nvidia-704358-r2-web.pdf
Windows 10 Enterprise 2016 Microsoft https://www.microsoft.com/en-us/evalcenter/evaluate-windows-10-enterprise
Workstation Minimum Requirements https://theobjects.com/dragonfly/system-requirements.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bai, X. -C., Mcmullan, G., Scheres, S. H. W. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  2. de Oliveira, T. M., van Beek, L., Shilliday, F., Debreczeni, J., Phillips, C. Cryo-EM: The resolution revolution and drug discovery. SLAS Discovery. 26 (1), 17-31 (2021).
  3. Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-EM performance testing of hardware and data acquisition strategies. Microscopy. 70 (6), 487-497 (2021).
  4. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  5. Tomography 5 and Tomo Live Software User-friendly batch acquisition for and on-the-fly reconstruction for cryo-electron tomography Datasheet. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/tomography-5-software-ds0362.pdf (2022).
  6. Danev, R., Baumeister, W. Expanding the boundaries of cryo-EM with phase plates. Current Opinion in Structural Biology. 46, 87-94 (2017).
  7. Hylton, R. K., Swulius, M. T. Challenges and triumphs in cryo-electron tomography. iScience. 24 (9), (2021).
  8. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  9. Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. Cellular electron cryotomography: Toward structural biology in situ. Annual Review of Biochemistry. 86, 873-896 (2017).
  10. Wagner, J., Schaffer, M., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  11. Lam, V., Villa, E. Practical approaches for Cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography. Methods in Molecular Biology. 2215, 49-82 (2021).
  12. Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography. Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).
  13. Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition. Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).
  14. Esteva, A., et al. Deep learning-enabled medical computer vision. npj Digital Medicine. 4 (1), (2021).
  15. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning. bioRxiv. , (2021).
  16. Moebel, E., et al. Deep learning improves macromolecule identification in 3D cellular cryo-electron tomograms. Nature Methods. 18 (11), 1386-1394 (2021).
  17. Chen, M., et al. Convolutional neural networks for automated annotation of cellular cryo-electron tomograms. Nature Methods. 14 (10), 983-985 (2017).
  18. Ronneberger, O., Fischer, P., Brox, T. U-net: Convolutional networks for biomedical image segmentation. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). 9351, 234-241 (2015).
  19. Dragonfly 2021.3 (Computer Software). , Available from: http://www.theobjects.com/dragonfly (2021).
  20. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  21. Iancu, C. V., et al. A "flip-flop" rotation stage for routine dual-axis electron cryotomography. Journal of Structural Biology. 151 (3), 288-297 (2005).

Tags

जीव विज्ञान अंक 189
क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राम का गहन शिक्षण-आधारित विभाजन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heebner, J. E., Purnell, C., Hylton, … More

Heebner, J. E., Purnell, C., Hylton, R. K., Marsh, M., Grillo, M. A., Swulius, M. T. Deep Learning-Based Segmentation of Cryo-Electron Tomograms. J. Vis. Exp. (189), e64435, doi:10.3791/64435 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter