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Biology

Establecimiento de organoides endometriales 3D a partir del útero del ratón

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64448
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

Summary

Este protocolo describe metodologías para establecer organoides epiteliales endometriales de ratón para la expresión génica y análisis histológicos.

Abstract

El tejido endometrial recubre la cavidad interna del útero y está bajo el control cíclico del estrógeno y la progesterona. Es un tejido que se compone de epitelio luminal y glandular, un compartimento estromal, una red vascular y una población compleja de células inmunes. Los modelos de ratón han sido una herramienta poderosa para estudiar el endometrio, revelando mecanismos críticos que controlan la implantación, la placentación y el cáncer. El reciente desarrollo de cultivos de organoides endometriales 3D presenta un modelo de vanguardia para diseccionar las vías de señalización que subyacen a la biología endometrial. Establecer organoides endometriales a partir de modelos de ratón genéticamente modificados, analizar sus transcriptomas y visualizar su morfología a una resolución de una sola célula son herramientas cruciales para el estudio de las enfermedades endometriales. Este documento describe métodos para establecer cultivos 3D de epitelio endometrial de ratones y describe técnicas para cuantificar la expresión génica y analizar la histología de los organoides. El objetivo es proporcionar un recurso que pueda usarse para establecer, cultivar y estudiar la expresión génica y las características morfológicas de los organoides epiteliales endometriales.

Introduction

El endometrio, el tejido mucoso del revestimiento interno de la cavidad uterina, es un tejido único y altamente dinámico que desempeña un papel crítico en la salud reproductiva de una mujer. Durante la vida reproductiva, el endometrio tiene el potencial de someterse a cientos de ciclos de proliferación, diferenciación y descomposición, coordinados por la acción concertada de las hormonas ováricas: estrógeno y progesterona. Los estudios de ratones genéticamente modificados han descubierto mecanismos biológicos básicos que sustentan la respuesta endometrial a las hormonas y el control de la implantación embrionaria, la decidualización de las células estromales y el embarazo1. Sin embargo, los estudios in vitro han sido limitados debido a las dificultades para mantener tejidos endometriales primarios de ratón no transformados en cultivos celulares 2D tradicionales 2,3. Los avances recientes en el cultivo de tejidos endometriales como sistemas de órganos 3D, u organoides, presentan una nueva oportunidad para investigar las vías biológicas que controlan la regeneración y diferenciación de las células endometriales. Los sistemas organoides endometriales de ratón y humano se han desarrollado a partir de epitelio endometrial puro encapsulado en varias matrices4,5, mientras que el endometrio humano se ha cultivado como cocultivos epiteliales/estromales sin andamios 6,7, y más recientemente como ensamblajes epiteliales/estromales encapsulados en colágeno8 . El crecimiento y el potencial regenerativo de los cultivos de organoides epiteliales están respaldados por un cóctel definido de factores de crecimiento e inhibidores de moléculas pequeñas que han sido determinados empíricamente para maximizar el crecimiento y la regeneración de los organoides 4,5,9. Además, la capacidad de congelar y descongelar organoides endometriales permite el almacenamiento a largo plazo de organoides endometriales de ratones y humanos para futuros estudios.

Los ratones genéticamente modificados han revelado las complejas vías de señalización que controlan el embarazo temprano y la decidualización, y se han utilizado como modelos de pérdida de embarazo, cáncer de endometrio y endometriosis. Estos estudios genéticos se han logrado en gran medida con la deleción celular específica de alelos flanqueados por loxP ("floxed") utilizando recombinasas cre que son específicamente activas en los tejidos reproductivos femeninos. Estos modelos de ratón incluyen el ampliamente utilizado receptor de progesterona-cre 10, que tiene una fuerte actividad recombinasa en los tejidos epiteliales y estromales endometriales, lactoferrina i-cre, que induce la recombinación epitelial endometrial en ratones adultos11, o Wnt7a-cre, que desencadena la deleción epitelial específica en tejidos derivados de Müllerian12 . El cultivo de tejidos endometriales a partir de modelos de ratón genéticamente modificados como organoides 3D ha brindado una excelente oportunidad para investigar la biología endometrial y facilitar la identificación de factores de crecimiento y vías de señalización que controlan la renovación y diferenciación de las células endometriales13,14. Los métodos para el aislamiento y cultivo de tejido endometrial de ratón se describen en la literatura y reportan el uso de diversas estrategias enzimáticas para el aislamiento del epitelio uterino para el posterior cultivo de organoides epiteliales endometriales4. Si bien la literatura previa proporciona un marco crítico para los protocolos de cultivo de organoides epiteliales endometriales 4,5,6, este documento proporciona un método claro y completo para generar, mantener, procesar y analizar estos organoides. La estandarización de estas técnicas es importante para acelerar los avances en el campo de la biología reproductiva de la mujer. Aquí, presentamos una metodología detallada para la purificación enzimática y mecánica del tejido epitelial endometrial de ratón para el posterior cultivo de organoides endometriales en un andamio de matriz de gel. También describimos las metodologías para los análisis histológicos y moleculares posteriores de los organoides epiteliales endometriales de ratón encapsulados en matriz de gel.

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Protocol

El manejo de ratones y los estudios experimentales se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Baylor College of Medicine y las pautas establecidas por la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Aislamiento del epitelio uterino de ratones utilizando métodos enzimáticos y mecánicos

NOTA: Esta sección describe los pasos necesarios para establecer, pasar, congelar y descongelar organoides endometriales epiteliales de ratones utilizando un andamio de matriz de gel. Estudios previos han determinado que los cultivos óptimos de organoides endometriales de ratón se establecen a partir de ratones durante la fase4 del estro, que puede determinarse mediante el examen citológico de un hisopo vaginal15. Se utilizaron ratones WT hembra adultos (6-8 semanas de edad, híbridos C57BL / 6J y 129S5 / SvEvBrd) para todos los experimentos. Los ratones fueron sacrificados humanamente de acuerdo con las pautas aprobadas por IACUC utilizando sedación con isoflurano seguida de desarticulación cervical. Una vez que los ratones son sacrificados, se deben seguir los siguientes pasos. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con los materiales y soluciones utilizados en este protocolo.

  1. Deje que la matriz de gel se descongele en hielo durante aproximadamente 1-2 h antes de usar.
  2. Para diseccionar el ratón, use tijeras para hacer una incisión en la línea media en el abdomen y retire suavemente la piel para exponer la capa peritoneal subyacente. Use fórceps para sostener la capa peritoneal y haga incisiones laterales con las tijeras para exponer el contenido abdominal.
    1. Localice los cuernos uterinos moviendo suavemente las almohadillas de grasa abdominal a un lado. Diseccionarlos sosteniéndolos primero en la unión cervical y usando tijeras para cortar a lo largo de la grasa mesentérica. Después de la disección del útero del ratón, retire completamente el tejido graso del cuerno uterino con tijeras pequeñas.
      NOTA: Mantenga la esterilidad durante el aislamiento celular esterilizando todas las herramientas quirúrgicas antes de usarlas, rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70% y realice todos los pasos posteriores a la disección bajo una campana de cultivo de tejido estéril.
  3. Corte cada cuerno uterino en pequeños fragmentos, cada uno midiendo aproximadamente 4-5 mm.
  4. Coloque todos los fragmentos uterinos de un útero en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga 0,5 ml de tripsina al 1%. Permita que la solución enzimática entre en la luz uterina, causando la separación enzimática del epitelio endometrial del estroma subyacente.
  5. Incubar la placa de 24 pocillos en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 °C durante aproximadamente 1 h.
  6. Después de la incubación de 1 h, transfiera los fragmentos uterinos a una placa de cultivo tisular de 35 mm que contenga 1 ml de solución tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  7. Bajo un microscopio de disección, use fórceps finos y una pipeta de 1 ml para separar mecánicamente el epitelio uterino de la trompa uterina. Mientras mantiene presionado un extremo de un fragmento uterino con los fórceps, pase suavemente la punta de la pipeta longitudinalmente a través del fragmento, apretando el epitelio por el otro extremo de la trompa uterina. Observe las hojas epiteliales separadas del fragmento uterino bajo el microscopio de disección.
  8. Utilice la pipeta de 1 ml para recoger y transferir suavemente las láminas epiteliales a un tubo de 1,5 ml.
  9. Repita el proceso para los fragmentos uterinos restantes, transfiriendo todas las láminas epiteliales al mismo tubo de recolección.
  10. Granular las láminas epiteliales disociadas por centrifugación durante 5 min a 375 × g.
  11. Retire con cuidado el sobrenadante para evitar alterar el pellet celular.
  12. Resuspender el pellet celular en 0,5 mL de 2,5 mg/mL de colagenasa + 2 mg/ml de solución de DNasa. Pipetear hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces, o hasta que se logre una suspensión de una sola celda.
  13. Agregue 0.5 ml de DMEM / F12 + 10% de suero bovino fetal (FBS) + antibióticos, y centrifugar las células durante 5 minutos a 375 × g.
    NOTA: Para obtener información adicional sobre el antibiótico de amplio espectro utilizado para el cultivo celular, consulte la Tabla de materiales.
  14. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de DMEM / F12 + 10% FBS + antibióticos. Centrifugar las celdas durante 5 min a 375 × g.

2. Procesamiento del compartimento estromal

NOTA: Esta sección describe los protocolos necesarios para aislar el compartimiento estromal del endometrio del ratón. Dado el creciente interés en los experimentos de cocultivo epitelial/estromal, es importante poder procesar las poblaciones de células estromales además de las células epiteliales que generarán organoides.

  1. Una vez que todo el epitelio se ha separado enzimática y mecánicamente de los fragmentos uterinos, las estructuras tubulares restantes son los compartimentos "estromal / miometrial". Recoja este tejido en una colagenasa de 2,5 mg/ml + 2 mg/ml de DNasa en solución HBSS.
  2. Incubar la muestra estromal/miometrial en una agitadora de 37 °C durante 15 min.
  3. Después de la incubación, agregue 500 μL de DMEM / F12 + 10% FBS + antibióticos por ratón, y filtre los fragmentos no disociados a través de un filtro celular de 40 μm.
  4. Granular las células por centrifugación durante 5 min a 375 × g.
  5. Retire con cuidado el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de DMEM / F12 + 10% FBS + antibióticos. Agregue la mezcla gota a 10 ml de DMEM / F12 + 10% FBS + antibióticos en una placa de cultivo celular de 10 cm. Incubar la placa a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificada.
  6. Para generar cocultivos de células epiteliales y estromales endometriales de ratón, seguir los métodos descritos para organoides endometriales humanos utilizando sistemas de matriz de colágeno o sin andamios 6,8.
    NOTA: Si bien estas técnicas aún no se han publicado para ratones, se pueden adaptar en función de los protocolos publicados con endometrio humano.

3. Encapsulación del epitelio uterino en matriz de gel para establecer organoides

NOTA: Mantenga la matriz de gel en hielo hasta que esté lista para ser utilizada.

  1. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en un volumen de matriz de gel que sea 20 veces mayor que el del pellet celular (es decir, si el pellet celular es de 20 μL, resuspenda las células con 400 μL de matriz de gel). Vuelva a suspender el pellet con cuidado para evitar la introducción de burbujas.
  2. Deje que la suspensión de la matriz de gel / celda se asiente a temperatura ambiente durante ~ 10 min.
  3. Una vez que la suspensión de la matriz de gel / celda se convierta en un gel semisólido, use una micropipeta P200 con una punta de 200 μL de diámetro ancho para aspirar suavemente 25 μL de la suspensión de matriz / celda de gel. Dispense tres domos separados de 25 μL por pocillo de una placa de 12 pocillos y permita que la matriz de gel se cure durante 15 minutos en una incubadora de cultivo de tejido humidificado a 37 °C.
  4. Después de que la matriz de gel se haya curado, agregue 750 μL de medio organoide a cada pocillo que contenga cúpulas de matriz de gel. Incubar a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado.
    NOTA: La formulación de los medios organoides se indica en la Tabla de materiales. Los organoides generalmente se forman dentro de los 4 días posteriores al cultivo inicial.

4. Análisis de la expresión génica de organoides endometriales tras el tratamiento con estradiol

NOTA: Esta sección describe los métodos utilizados para perfilar la expresión génica de los organoides epiteliales endometriales utilizando qPCR en tiempo real después del tratamiento con estradiol (E2; ver Tabla 1). Debido a que el endometrio está bajo el control cíclico de la hormona ovárica E2, probar la capacidad de respuesta de los organoides a E2 es una medida importante de la función fisiológica. Hemos obtenido ARN de alta calidad y generado suficiente ARNm para perfilar la expresión génica mediante qPCR y/o secuenciación de ARN a partir de nuestros organoides epiteliales endometriales. Esta sección describe cómo recolectar organoides y procesarlos para el análisis posterior de la expresión génica. El medio de tratamiento seleccionado refleja el utilizado para tratar las células endometriales cultivadas. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que este medio de tratamiento puede optimizarse en consecuencia, como se hace para el tratamiento de cultivos 3D endometriales humanos con hormonas 8,16,17.

  1. Cultivar los organoides endometriales como se describió anteriormente.
  2. Retire el medio organoide y reemplácelo con 750 μL de medio de inanición cuatro días después de la siembra. Incubar durante la noche.
  3. A la mañana siguiente, retire el medio de inanición. Añadir 750 μL de medio de tratamiento que contenga cualquiera de los vehículos o 10 nM E2. Incubar durante 48 h.
  4. Proceda con el aislamiento de ARN siguiendo el protocolo del fabricante del kit.

5. Análisis histológico de organoides endometriales

NOTA: La obtención de imágenes de las características morfológicas de los organoides endometriales es fundamental para evaluar el efecto celular de los factores de crecimiento, las manipulaciones genéticas o los inhibidores de moléculas pequeñas. Esta sección describe las técnicas utilizadas para fijar, procesar y obtener imágenes de los organoides epiteliales endometriales mediante tinciones histológicas y tinción inmunofluorescente de anticuerpos.

  1. Preparar tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contengan 1 ml de paraformaldehído al 4% en 1x PBS. Colócalos en hielo.
  2. Aspirar el medio de los pocillos de la placa de 12 pocillos que contiene los organoides.
  3. Usando una punta de pipeta de 1 ml con una punta cortada, transfiera 500 μL de paraformaldehído al 4% a cada pocillo y separe suavemente las cúpulas de la matriz de gel del fondo de la placa.
  4. Aspire suavemente todas las cúpulas de la matriz de gel en la punta de la pipeta y transfiéralas al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  5. Fijar los organoides colocándolos sobre un rotador a 4 °C durante la noche.
  6. A la mañana siguiente, centrifugar el tubo a 600 × g durante 5 min para granular los organoides. Retire suavemente la solución de paraformaldehído al 4% con una pipeta y deséchela. Lave los organoides 2x con etanol al 70%.
  7. Después del último lavado, retire todo menos 50-100 μL de etanol del tubo. Deje el tubo a un lado.
  8. Coloque un tubo de gel de procesamiento de muestras en un baño de agua y microondas durante ~ 30 s para derretir el gel. Asegúrese de que el gel de procesamiento de muestras no hierva controlando la consistencia del gel.
    NOTA: Una vez que el gel de procesamiento de muestras esté derretido, pero no hirviendo, trabaje rápidamente para encapsular los organoides.
  9. Transfiera suficiente gel de procesamiento de muestras para cubrir toda la superficie del molde (aproximadamente 250 μL).
  10. Mientras el gel de procesamiento de la muestra aún está fundido, transfiera rápidamente los 50 μL de solución de etanol al 70% que contiene los organoides. Asegúrese de que los organoides estén hundidos o empujados a la parte inferior del molde.
  11. Coloque el molde histológico en un cubo de hielo y permita que el gel de procesamiento de la muestra se enfríe y solidifique.
  12. Una vez que el gel de procesamiento de muestras esté completamente seco, transfiera cuidadosamente el cuadrado del gel de procesamiento de muestras a una bolsa de muestras, haciendo un seguimiento del plano donde se encuentran los organoides.
  13. Colocar la bolsa en un casete histológico y procesar utilizando métodos estándar utilizados para la fijación de formalina y la incrustación de parafina de los tejidos18.
  14. Después de la fijación e incrustación en parafina, sección en secciones de 5 μm utilizando un micrótomo19. Proceda con los procedimientos estándar de tinción o inmunotinción de hematoxilina y eosina (H&E), como se describe a continuación.

6. Tinción de hematoxilina y eosina

  1. Desparafinar las secciones de la siguiente manera: xileno, 2 x 10 min; 100% etanol, 2 x 3 min; 80% etanol, 3 min; 60% etanol, 3 min; dH 2 O,2x 3 min; 1 min en hematoxilina; agua del grifo (3 x 5 s); 1 min en eosina.
  2. Deshidratar las secciones de la siguiente manera: 60% etanol, 3 min; 80% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 100% etanol, 2 x 3 min; xileno, 2 x 15 min.
  3. Montar con medio de montaje.

7. Tinción por inmunofluorescencia

  1. Desparafinar las secciones como se describe en el paso 6.1.
  2. Realizar la recuperación de antígenos
    1. Sumerja los portaobjetos en una solución de recuperación de antígenos en un recipiente apto para microondas.
    2. Microondas a fuego alto durante 20 minutos, utilizando intervalos de 5 minutos para asegurarse de que la solución no hierva.
  3. Después de completar el paso de recuperación de antígenos de 20 minutos, permita que los portaobjetos se enfríen en hielo durante 40 minutos mientras aún están sumergidos en el tampón de recuperación de antígenos.
  4. Lave las diapositivas con 1x TBST durante 3 minutos
  5. Bloquear los portaobjetos incubando en BSA al 3% en TBST durante 1 h a temperatura ambiente.
  6. Incubación de anticuerpos primarios
    1. Diluir el anticuerpo en BSA al 3% en TBST (1:50-1:1.000, dependiendo de Ab).
    2. Incubar durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada.
    3. Lavar 3 x 5 min con TBST.
  7. Incubación secundaria de anticuerpos
    1. Diluir el anticuerpo en BSA al 3% (en TBST) (1:250), o en suero de burro normal al 5%.
    2. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad, ya que el anticuerpo se conjuga con un fluoróforo.
  8. Tinción nuclear
    1. Diluir 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:1.000 en TBST.
    2. Incubar durante 5 min en RT.
    3. Lavar 2 x 5 min con TBST.
  9. Montura
    1. Utilice una gota de medio de montaje para montar el cubreobjetos.
    2. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas al día siguiente.

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Representative Results

Imágenes de contraste de fase de organoides endometriales de ratón
Establecimos organoides a partir de epitelio endometrial de ratón WT, como se describe en el protocolo adjunto (ver diagrama en la Figura 1). Después de la disociación enzimática del epitelio endometrial del ratón, las láminas epiteliales se separaron mecánicamente de las células del estroma uterino y se disociaron aún más con colagenasa para generar una suspensión unicelular. Si se realiza correctamente, este método de separación de células epiteliales y estromales debe producir muestras con contaminación de no más del 10% -15% del tipo de célula opuesto (ver imágenes de inmunofluorescencia en la Figura 2). El pellet de células epiteliales se resuspendió en matriz de gel, se dejó gel a temperatura ambiente y se colocó en cúpulas de 25 μL en placas de cultivo de tejidos. Después de que las cúpulas de la matriz de gel se solidificaron, se superpusieron con medio organoide y se les permitió crecer. Por lo general, observamos que las células epiteliales endometriales se ensamblaron en organoides dentro de 3-4 días, como se muestra en la Figura 3. Los organoides se mantuvieron en cultivo, con cambios en los medios que ocurrieron cada 3 días y pasaron cada 5-7 días.

Imágenes de organoides endometriales de ratón mediante tinción histológica e inmunofluorescente
Para analizar la morfología de los organoides epiteliales de ratón, adaptamos los métodos utilizados para la encapsulación de aspirados celulares con aguja fina utilizando gel de procesamiento de muestras20. Esto permite la preservación de la morfología del organoide endometrial y la encapsulación en una matriz que puede someterse a procesamiento en preparación para la incrustación de parafina. El gel de procesamiento de muestras es un agar modificado que es ampliamente utilizado en laboratorios de patología clínica para el análisis de aspirados con aguja fina y se ha utilizado para encapsular organoides vaginales21,22. Después de que la mezcla de gel / organoide de procesamiento de muestras se solidifica, se puede procesar, teñir y obtener imágenes con técnicas típicamente utilizadas para analizar tejidos. En la Figura 4A,B, mostramos que los organoides endometriales seccionados fijados en parafina fijados en formalina pueden visualizarse mediante tinciones de hematoxilina y eosina, que muestran la única capa de epitelio y centros huecos -los lúmenes- de los organoides. Ciertos organoides también contienen secreciones en la luz, lo que indica que los organoides adquieren las propiedades funcionales de las células epiteliales glandulares. También describimos técnicas para visualizar los organoides mediante inmunotinción (Figura 4C, D); Los organoides endometriales seccionados se incubaron con un anticuerpo primario de citoqueratina 8 (TROMA-1) y un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anti-rata secundaria 594). Los núcleos se visualizaron con DAPI, y las diapositivas se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia. Observamos que todas las células de los organoides eran positivas para citoqueratina 8 y contenían DAPI, lo que indica que la fijación, incrustación y procesamiento de los organoides endometriales es compatible con la inmunotinción basada en anticuerpos.

Extracción de ARN y análisis de expresión génica
Para determinar la respuesta de expresión génica de los organoides endometriales, permitimos que los organoides endometriales de ratones WT crecieran durante 4 días después del primer paso. La noche anterior al tratamiento, el medio organoide endometrial se cambió a medio de inanición. Los organoides se trataron en pocillos triplicados (cada pocillo contenía tres domos) con vehículo (etanol; volumen igual en solución como se usa para estradiol) o estradiol 10 nM (E2) durante un total de 48 h. Después de 48 h, se retiró el medio y los organoides se procesaron para la extracción de ARN. Se pueden obtener aproximadamente 4 μg de ARN de un total de dos cúpulas de cada pocillo, y se utilizó 1 μg de ARN para transcribir el ADNc de reversión. La amplificación de los genes que codifican la lipocalina 2 (Lcn2), la lactoferrina (Ltf) y el receptor de progesterona (Pgr) se realizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real (Figura 5 y Tabla 1)23,24,25. Como era de esperar, observamos que la expresión de Lcn2, Ltf y Pgr aumentó en los organoides epiteliales después de la estimulación con 10 nM E2 (Figura 5). Por lo tanto, estos resultados muestran que los organoides epiteliales endometriales se pueden utilizar con éxito para medir los cambios en la expresión génica en respuesta a E2.

Figure 1
Figura 1: Procedimientos utilizados para establecer organoides endometriales. El diagrama describe los pasos clave que se siguieron para (A) establecer y (B) pasar organoides epiteliales del endometrio del ratón. (A) Los métodos incluyen la disociación enzimática y mecánica del epitelio endometrial del útero del ratón, seguida de la dispersión unicelular y la encapsulación del epitelio en una matriz de gel. Para obtener los tejidos uterinos para la disociación enzimática, los ovarios y oviductos se eliminan de los cuernos uterinos con tijeras finas, se cortan lateralmente en fragmentos de 4-5 mm y luego se colocan en la solución enzimática. Después de la incubación enzimática, el epitelio endometrial se separa mecánicamente del estroma subyacente bajo un microscopio usando fórceps y una pipeta para "exprimir" el epitelio de la trompa uterina. El epitelio se digiere aún más en las células epiteliales mediante una breve incubación en colagenasa, seguida de la encapsulación en una matriz de gel. (B) El paso de los organoides endometriales requiere disociación mecánica en medio frío y centrifugación para liberar los organoides de la matriz y generar fragmentos de organoides más pequeños. Una vez que los organoides han sido liberados de la matriz y disociados mecánicamente en fragmentos más pequeños, se encapsulan en matriz y se vuelven a platear. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Inmunotinción de epitelio endometrial aislado y poblaciones de células del estroma. Las imágenes de inmunofluorescencia muestran poblaciones de células epiteliales y estromales de las fracciones de células epiteliales (A, B) y (C, D) de células estromales después de la separación enzimática y mecánica del útero. La citoqueratina 8 (un marcador de células epiteliales) se muestra en rojo, la vimentina (un marcador de células estromales) se muestra en verde y DAPI (un marcador nuclear) se muestra en azul. Barras de escala = 100 μm (A,C), 20 μm (B,D). Abreviaturas: CK8 = citoqueratina 8; VIM = vimentina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Formación de organoides endometriales de ratones WT en el transcurso de 4 días. El epitelio endometrial se aisló de un ratón WT y se utilizó para generar organoides. (A) Imagen de contraste de fase de las células epiteliales encapsuladas en la matriz de gel inmediatamente después de la digestión (día 0). (B,C) Se pueden observar algunos organoides pequeños en el día 1 (B) y el día 2 (C) de cultivo. (D) Se pueden observar organoides epiteliales más grandes y maduros en el día 3 de cultivo. Las imágenes fueron capturadas con un objetivo 5x; barras de escala = 200 μm. Abreviatura: WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis histológico de organoides endometriales. (A,B) Los organoides epiteliales endometriales FFPE fueron seccionados y teñidos con H&E. (C,D) Los organoides epiteliales FFPE fueron inmunoteñidos con el marcador celular epitelial citoqueratina 8 (rojo). Los núcleos celulares fueron teñidos con DAPI (azul). Barras de escala = 200 μm (A), 100 μm (C), 50 μm (B,D). Abreviaturas: FFPE = parafina fijada en formalina incrustada; H&E = hematoxilina y eosina; CK8 = citoqueratina 8; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis de expresión génica de organoides endometriales de ratón. Los organoides epiteliales endometriales de ratón de ratones WT se cultivaron durante 4 días en medio de crecimiento organoide, seguido de un tratamiento con vehículo o 10 nM E2 durante 48 h en DMEM / F12 suplementado con FBS con carbón al 2%. (A,B) Imágenes de contraste de fase de los organoides de ratón WT después del tratamiento con vehículo (A) o 10 nM E2 (B). (C-E) Análisis qPCR en tiempo real de organoides endometriales epiteliales tratados con vehículo o 10 nM E2. Expresión de genes regulados por E2, lipocalina 2 (Lnc2), lactoferrina (Ltf) y receptor de progesterona (Pgr). Las barras representan la media ± SEM, analizada por una prueba t de dos colas; *p < 0,033, **p < 0,002, ***p < 0,001. Se repite con organoides derivados de n = 3 WT ratones por condición. Barras de escala = 200 μm (A,B). Abreviaturas: WT = tipo salvaje; E2 = estradiol; qPCR = PCR cuantitativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Secuencia de cebadores Delantero (5'-3') Reverso (5'-3')
Lipocalina 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrina (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterona (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATTTCCGG
Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT
La mezcla de PCR contiene:
2x SYBR Verde
0.5 μM Fwd Primer
0.5 μM Rev Primer
ADNc
RNAsa/DNAsa-FreeH2O
Condiciones del ciclador:
Temperatura Hora Ciclos
Sostener 95 °C 10 minutos 1
Desnaturalizar 95 °C 15 s 40
Extender 60 °C 60 s

Tabla 1: Secuencias de cebadores y condiciones de PCR.

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Discussion

Aquí, describimos los métodos para generar organoides epiteliales endometriales a partir del endometrio del ratón y los protocolos utilizados rutinariamente para su análisis posterior. Los organoides endometriales son una herramienta poderosa para estudiar los mecanismos que controlan las enfermedades relacionadas con el endometrio, como la endometriosis, el cáncer de endometrio y el fracaso de la implantación. Estudios históricos publicados en 2017 reportaron las condiciones para cultivar cultivos a largo plazo y renovables de organoides endometriales de epitelio humano y de ratón 4,5. A pesar de que los organoides han sido ampliamente utilizados para estudiar las vías biológicas en otros sistemas, el estudio del tejido endometrial in vitro se ha visto limitado por la ausencia de un modelo adecuado para estudiar el epitelio primario no transformado en cultivo26. Los organoides endometriales derivados del endometrio humano y de ratón se establecieron con éxito utilizando condiciones típicamente utilizadas para cultivar organoides de otros tejidos de órganos, como intestino, riñón y pulmón, e incrustándolos en un andamio de matriz extracelular compuesto de matriz de gel4. Desde estos informes iniciales, el uso de organoides endometriales para estudiar la biología del endometrio ha aumentado significativamente en la comunidad científica.

Al modificar un método previamente publicado de aislamiento epitelial del útero de ratón27,28, este protocolo destaca de manera única los pasos clave para aislar el útero del ratón colocando directamente el tejido en una solución enzimática, evitando la necesidad de transectar el útero o usar filtración. Usando este método, obtuvimos epitelio con ~85%-90% de pureza, según lo determinado por citoqueratina 8 e inmunotinción de vimentina (Figura 2). Este protocolo también describe claramente los detalles clave para la encapsulación de las células epiteliales aisladas en la matriz de crecimiento para la generación, mantenimiento y paso de los organoides. Las imágenes de la Figura 4 y nuestros estudios inéditos han identificado la presencia de mucinas y células glandulares (es decir, FOXA2 positivas) en nuestros cultivos organoides29. Estos indican que el método presentado aquí es efectivo para el aislamiento de poblaciones de células glandulares y luminal-epiteliales del endometrio del ratón.

Las limitaciones clave para el crecimiento de estos organoides incluyen el uso de la matriz comercial (es decir, Matrigel), que puede dar lugar a variaciones de lote a lote y contiene factores de crecimiento que pueden afectar el crecimiento de organoides. Además, mientras que estos organoides contienen epitelio uterino puro, el uso de tipos adicionales de células endometriales (es decir, inmune, estromales) se ha descrito recientemente en sistemas organoides humanos del endometrio 8,30. Otros grupos han demostrado la capacidad de aislar células epiteliales luminales y glandulares para cultivos organoides del útero de ratón14.

Este enfoque utiliza tejidos de un modelo animal pequeño que es relativamente común y está disponible para la mayoría de los investigadores; La generación de organoides endometriales a partir de modelos animales más grandes, o humanos, puede plantear desafíos éticos o técnicos, que pueden superarse mediante el uso de técnicas basadas en células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Tales tecnologías han sido descritas previamente para tejidos endometriales 31, otros tejidos del tracto reproductivo32 y han sido utilizadas eficazmente para estudiar las interacciones endometrial/placentaria in vitro33. Por lo tanto, el uso de iPSCs como fuente de células estromales y epiteliales endometriales del endometrio de humanos y otros modelos de animales grandes plantea una fuente renovable y accesible para generar organoides endometriales.

Si bien el ratón es un modelo ampliamente utilizado para el estudio de la implantación, existen diferencias evolutivas clave en el mecanismo de implantación entre ratones y humanos que deben tenerse en cuenta. Por ejemplo, mientras que la implantación intersticial se caracteriza por una invasión trofoblástica profunda a través del epitelio luminal en el estroma subyacente, el mecanismo del proceso de invasión difiere entre ratones y primates34. En ratones, la invasión del trofoblasto a través del epitelio luminal implica apoptosis o entosis 35,36, mientras que los trofoblastos migran entre el epitelio luminal hacia el estroma subyacente en primates 34,35.

Proporcionar a los organoides endometriales los factores de crecimiento necesarios para apoyar el autoensamblaje y la renovación a largo plazo es esencial para obtener cultivos de organoides endometriales que recapitulen el tejido nativo. La compleja composición de los medios para los organoides endometriales indica las múltiples vías de señalización que contribuyen a las características de las células epiteliales, y surgirían de fuentes paracrinas y autocrinas. El compartimiento estromal del endometrio es un conjunto complejo de numerosos tipos de células, incluyendo células estromales similares a fibroblastos, endotelio, macrófagos y otras células inmunes especializadas que cambian constantemente en respuesta al estrógeno y la progesterona37.

Por ejemplo, el medio de cultivo de organoides contiene factores que activan la señalización WNT/β-catenina en los organoides, como WNT3a y R-Spondin. Los estudios en ratones han demostrado que los ligandos WNT son críticos para el desarrollo uterino y la función glandular; Por lo tanto, la activación de esta vía de señalización es crítica para el desarrollo y mantenimiento de organoides38,39. R-Spondin amplifica la señalización WNT y es el ligando del receptor acoplado a proteína G rico en leucina que contiene repeticiones (LGR5)40. Los cultivos de organoides endometriales también requieren la inhibición de las vías de señalización del factor de crecimiento transformante β (TGFβ) y la proteína morfogenética ósea (BMP). Por ejemplo, el medio de cultivo de organoides endometriales contiene el inhibidor de BMP, Noggin, una proteína secretada que se une e inactiva BMP2, BMP4 y BMP741. El inhibidor farmacológico, A83-01, también está presente en el medio organoide endometrial. A83-01 es un inhibidor de moléculas pequeñas con alta especificidad para los receptores ALK4, ALK5 y ALK742. ALK4/5/7 son receptores tipo 1 de la familia de señalización TGFβ que se unen y transmiten señales provocadas por ligandos como TGFβ, activina o nodal. Las señales BMP son críticas para el mantenimiento de células madre en tejidos como el intestino43 y los folículos pilosos44. La inhibición de la señalización de TGFβ contribuye a la capacidad proliferativa y a la eficiencia de formación de colonias de las células madre mesenquimales endometriales45, lo que ocurre mediante la remodelación de regiones clave en la cromatina46. Por lo tanto, la modulación de estas dos vías de señalización clave, BMP y TGFβ, es necesaria para mantener cultivos organoides con capacidad de autorrenovación.

Aunque no se muestra aquí, encontramos que el cultivo a largo plazo de los organoides de ratón con el inhibidor ALK4/5/7, A83-01, condujo a cambios morfológicos en los organoides epiteliales después de tres o cuatro pasajes continuos (Kriseman et al., en revisión). Los cambios morfológicos en los organoides epiteliales fueron una reminiscencia de los organoides epiteliales "densos" descritos por Boretto et al.4, donde se produjo el desarrollo de células más secretoras debido a la disminución de la secreción paracrina de ligandos WNT. Por lo tanto, es probable que las vías de señalización de TGFβ y WNT se crucen para controlar la regeneración y diferenciación de organoides epiteliales endometriales.

Estudios recientes han generado sistemas de cocultivo epitelial/estromal endometrial 3D a partir de tejidos humanos 7,8,16. Un método de cocultivo utiliza un sistema sin andamios, en el que las células epiteliales y estromales endometriales se combinan y se les permite ensamblarse en estructuras 3D en un pozo sin andamios utilizando un medio de cultivo definido. Estos organoides epiteliales / estromales endometriales 3D no solo expresan receptores de estrógeno, progesterona y andrógenos, sino que también recapitulan fielmente la respuesta a las hormonas ováricas: estrógeno y progesterona 6,7. En otro método de cocultivo, utilizado en un estudio de Rawlings et al., los organoides epiteliales endometriales se combinan con células estromales en una matriz de colágeno y se cultivan en un medio organoide modificado8. Estos organoides cocultivados epiteliales / estromales, o ensamblajes, se organizan en un sistema 3D suspendido, donde las células del estroma rodean las estructuras similares a glándulas epiteliales.

La mayoría de los organoides endometriales se cultivan en matriz de gel reducida por factor de crecimiento; Sin embargo, la presencia de compuestos activos en la matriz puede ejercer respuestas celulares no deseadas dentro de los organoides. Para superar esta limitación, los organoides se han establecido en andamios libres de matriz de gel, como los moldes de agarosa impresos en 3D en los que se permite que los organoides individuales se autoensamblen6. Otros grupos han desarrollado hidrogeles sintéticos para servir como matrices 3D para el cultivo de organoides endometriales47. Estos organoides se ensamblan en estructuras 3D con polaridad apicobasal y también pueden combinarse con células estromales del endometrio para formar organoides complejos48. Dado que los organoides se pueden utilizar con éxito para cultivar tejidos endometriales humanos y de ratón primarios no transformados de una manera que los cultivos celulares 2D no pueden, no hay duda de que los organoides endometriales avanzarán en el campo de la salud reproductiva de las mujeres y serán una herramienta increíble para estudiar patologías reproductivas como la pérdida recurrente del embarazo, la endometriosis y el cáncer de endometrio16, 49,50.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a la Dra. Stephanie Pangas y al Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) por la lectura crítica y edición de nuestro manuscrito. Los estudios fueron apoyados por las subvenciones del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) y R01-HD110038 (M.M.M.), y por la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico NCI-P30 (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. tiene un Premio al Embarazo de la Próxima Generación del Burroughs Wellcome Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT

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Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).

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