Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Etablering af 3D endometrieorganoider fra musens livmoder

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64448
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

Summary

Denne protokol beskriver metoder til etablering af museendometrieepitelorganoider til genekspression og histologiske analyser.

Abstract

Endometrievæv linjer livmoderens indre hulrum og er under cyklisk kontrol af østrogen og progesteron. Det er et væv, der består af luminalt og kirtelepitel, et stromalt rum, et vaskulært netværk og en kompleks immuncellepopulation. Musemodeller har været et kraftfuldt værktøj til at studere endometrium og afsløre kritiske mekanismer, der styrer implantation, placentation og kræft. Den seneste udvikling af 3D endometrieorganoidkulturer præsenterer en state-of-the-art model til at dissekere de signalveje, der ligger til grund for endometriebiologi. Etablering af endometrieorganoider fra genetisk manipulerede musemodeller, analyse af deres transkriptomer og visualisering af deres morfologi ved en enkeltcelleopløsning er afgørende værktøjer til undersøgelse af endometriesygdomme. Dette papir skitserer metoder til at etablere 3D-kulturer af endometrieepitel fra mus og beskriver teknikker til kvantificering af genekspression og analyse af organoidernes histologi. Målet er at tilvejebringe en ressource, der kan bruges til at etablere, dyrke og studere genekspression og morfologiske egenskaber ved endometrieepitelorganoider.

Introduction

Endometrium - det indre slimhindevæv i livmoderhulen - er et unikt og meget dynamisk væv, der spiller kritiske roller i en kvindes reproduktive sundhed. I løbet af den reproduktive levetid har endometrium potentialet til at gennemgå hundredvis af cyklusser med spredning, differentiering og nedbrydning, koordineret af den samordnede virkning af ovariehormonerne - østrogen og progesteron. Undersøgelser af genetisk manipulerede mus har afdækket grundlæggende biologiske mekanismer, der understøtter endometrieresponset på hormoner og kontrol af embryoimplantation, stromalcelledecidualisering og graviditet1. In vitro-studier har imidlertid været begrænsede på grund af vanskeligheder med at opretholde ikke-transformeret primært museendometrievæv i traditionelle 2D-cellekulturer 2,3. Nylige fremskridt inden for kulturen af endometrievæv som 3D-organsystemer eller organoider giver en ny mulighed for at undersøge biologiske veje, der styrer endometriecellegenerering og differentiering. Mus og humane endometrieorganoidsystemer er blevet udviklet fra rent endometrieepitel indkapslet i forskellige matricer4,5, mens humant endometrium er blevet dyrket som stilladsfri epitel/stromale co-kulturer 6,7 og for nylig som kollagenindkapslede epitel-/stromale samlinger8 . Væksten og det regenerative potentiale af epitelorganoidkulturer understøttes af en defineret cocktail af vækstfaktorer og små molekylehæmmere, der er blevet empirisk bestemt til at maksimere vækst og regenerering af organoiderne 4,5,9. Desuden tillader evnen til at fryse og optø endometrieorganoider langsigtet bankning af endometrieorganoider fra mus og mennesker til fremtidige undersøgelser.

Gensplejsede mus har afsløret de komplekse signalveje, der styrer tidlig graviditet og decidualisering, og er blevet brugt som modeller for graviditetstab, endometriecancer og endometriose. Disse genetiske undersøgelser er stort set opnået med cellespecifik deletion af loxP-flankerede alleler ("floxed") ved hjælp af cre-rekombinaser, der er specifikt aktive i kvindeligt reproduktionsvæv. Disse musemodeller omfatter den meget anvendte progesteronreceptor-cre 10, som har stærk rekombinaseaktivitet i endometrieepitel- og stromalvævet, lactoferrin i-cre, som inducerer endometrieepitelrekombination hos voksne mus11 eller Wnt7a-cre, som udløser epitelspecifik deletion i Müllerian-afledte væv12 . Dyrkning af endometrievæv fra genetisk manipulerede musemodeller som 3D-organoider har givet en glimrende mulighed for at undersøge endometriebiologi og lette identifikationen af vækstfaktorer og signalveje, der styrer endometriecellefornyelse og differentiering13,14. Metoder til isolering og dyrkning af museendometrievæv er beskrevet i litteraturen og rapporterer brugen af forskellige enzymatiske strategier til isolering af livmoderepitel til efterfølgende dyrkning af endometrieepitelorganoider4. Mens tidligere litteratur giver en kritisk ramme for endometrieepitelorganoidkulturprotokoller 4,5,6, giver dette papir en klar, omfattende metode til generering, vedligeholdelse, behandling og analyse af disse organoider. Standardisering af disse teknikker er vigtig for at fremskynde fremskridt inden for kvinders reproduktive biologi. Her rapporterer vi en detaljeret metode til enzymatisk og mekanisk oprensning af museendometrieepitelvæv til den efterfølgende kultur af endometrieorganoider i et gelmatrixstillads. Vi beskriver også metoderne til downstream histologiske og molekylære analyser af gelmatrix-indkapslede museendometrieepitelorganoider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Musehåndtering og eksperimentelle undersøgelser blev udført i henhold til protokoller godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Baylor College of Medicine og retningslinjer fastlagt af NIH Guide for pleje og brug af forsøgsdyr.

1. Isolering af livmoderepitel fra mus ved hjælp af enzymatiske og mekaniske metoder

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver de trin, der kræves for at etablere, passage, fryse og optø epitelendometrieorganoider fra mus ved hjælp af et gelmatrixstillads. Tidligere undersøgelser har fastslået, at optimale kulturer af museendometrieorganoider etableres fra mus under østrusfase4, hvilket kan bestemmes ved cytologisk undersøgelse af en vaginal vatpind15. Voksne kvindelige WT-mus (6-8 uger gamle, hybrid C57BL/6J og 129S5/SvEvBrd) blev anvendt til alle forsøg. Musene blev humant aflivet i henhold til IACUC-godkendte retningslinjer ved hjælp af isofluransedation efterfulgt af cervikal disartikulation. Når musene er aflivet, skal følgende trin følges. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende materialer og løsninger, der anvendes i denne protokol.

  1. Lad gelmatrixen tø op på is i ca. 1-2 timer før brug.
  2. For at dissekere musen skal du bruge en saks til at lave et midterlinjesnit på maven og forsigtigt skrælle huden tilbage for at udsætte det underliggende peritoneale lag. Brug tang til at holde peritoneallaget op og lav laterale snit med saksen for at udsætte maveindholdet.
    1. Find livmoderhornene ved forsigtigt at flytte de abdominale fedtpuder til side. Disseker dem ved først at holde dem ved livmoderhalskrydset og bruge en saks til at skære langs mesenterialfedtet. Efter dissektion af musens livmoder skal du grundigt fjerne fedtvæv fra livmoderhornet med en lille saks.
      BEMÆRK: Oprethold steriliteten under celleisoleringen ved at sterilisere alle kirurgiske værktøjer før brug, spray musens mave med 70% ethanol og udfør alle trin efter dissektion under en steril vævskulturhætte.
  3. Skær hvert livmoderhorn i små fragmenter, der hver måler ca. 4-5 mm.
  4. Placer alle livmoderfragmenterne fra en livmoder i en brønd i en 24-brøndplade indeholdende 0,5 ml 1% trypsin. Lad den enzymatiske opløsning komme ind i livmoderlumen, hvilket forårsager enzymatisk adskillelse af endometriepitelet fra det underliggende stroma.
  5. Pladen med 24 huller inkuberes i en 37 °C befugtet vævskulturinkubator i ca. 1 time.
  6. Efter inkubationen på 1 time overføres livmoderfragmenterne til en 35 mm vævskulturplade indeholdende 1 ml Dulbeccos fosfatbufferede opløsning (DPBS).
  7. Under et dissektionsmikroskop skal du bruge fine tang og en 1 ml pipette til mekanisk at adskille livmoderepitelet fra livmoderrøret. Mens du holder den ene ende af et livmoderfragment nede med tangen, skal du forsigtigt køre pipettespidsen i længderetningen over fragmentet og klemme epitelet ud af den anden ende af livmoderrøret. Overhold de adskilte epitelark fra livmoderfragmentet under dissektionsmikroskopet.
  8. Brug 1 ml pipetten til at opsamle og forsigtigt overføre epitelpladerne til et 1,5 ml rør.
  9. Gentag processen for de resterende livmoderfragmenter, og overfør alle epitelarkene til det samme opsamlingsrør.
  10. Pellet de dissocierede epitelplader ved centrifugering i 5 minutter ved 375 × g.
  11. Supernatanten fjernes forsigtigt for ikke at forstyrre cellepelletsen.
  12. Resuspender cellepillen i 0,5 ml 2,5 mg/ml collagenase + 2 mg/ml DNase-opløsning. Pipetten pipetteres op og ned ca. 10x, eller indtil der opnås en enkeltcellesuspension.
  13. Tilsæt 0,5 ml DMEM/F12 + 10% føtalt bovint serum (FBS) + antibiotika, og centrifuger cellerne i 5 minutter ved 375 × g.
    BEMÆRK: For yderligere oplysninger om det bredspektrede antibiotikum, der anvendes til cellekultur, henvises til materialetabellen.
  14. Supernatanten fjernes forsigtigt, og cellerne resuspenderes i 1 ml DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotika. Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 375 × g.

2. Behandling af stromalrummet

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver de protokoller, der er nødvendige for at isolere det stromale rum i museendometrium. I betragtning af den stigende interesse for epitel/stromale co-kultureksperimenter er det vigtigt at kunne behandle stromale cellepopulationer ud over de epitelceller, der vil generere organoider.

  1. Når alt epitel er blevet enzymatisk og mekanisk adskilt fra livmoderfragmenterne, er de resterende rørlignende strukturer de "stromale / myometriale" rum. Opsaml dette væv i en 2,5 mg/ml collagenase + 2 mg/ml DNase i HBSS-opløsning.
  2. Den stromale/myometriale prøve inkuberes på en 37 °C ryster i 15 minutter.
  3. Efter inkubation tilsættes 500 μL DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotika pr. mus, og de ikke-dissocierede fragmenter filtreres gennem et 40 μm cellefilter.
  4. Pillecellerne centrifugeres i 5 minutter ved 375 × g.
  5. Supernatanten fjernes forsigtigt, og cellepelletsen resuspenderes i 1 ml DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotika. Blandingen tilsættes dråbevis til 10 ml DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotika i en 10 cm cellekulturplade. Pladen inkuberes ved 37 °C i en befugtet cellekulturkuvøse.
  6. For at generere co-kulturer af museendometrieepitel- og stromale celler skal du følge de beskrevne metoder for humane endometrieorganoider ved hjælp af stilladsfrie eller kollagenmatrixsystemer 6,8.
    BEMÆRK: Selvom disse teknikker endnu ikke er offentliggjort for mus, kan de tilpasses baseret på de offentliggjorte protokoller med humant endometrium.

3. Indkapsling af livmoderepitel i gelmatrix for at etablere organoider

BEMÆRK: Opbevar gelmatrixen på is, indtil den er klar til brug.

  1. Supernatanten fjernes, og cellepelletsen resuspenderes i et volumen gelmatrix, der er 20 gange større end cellepellets (dvs. hvis cellepellet er 20 μL, resuspenderes cellerne med 400 μL gelmatrix). Resuspender pellet forsigtigt for at undgå at indføre bobler.
  2. Lad gelmatrixen/cellesuspensionen bundfælde sig ved stuetemperatur i ~10 min.
  3. Når gelmatrixen/cellesuspensionen bliver til en halvfast gel, anvendes en P200-mikropipette med en bred boring på 200 μL til forsigtigt at aspirere 25 μL af gelmatrixen/cellesuspensionen. Dispenser tre separate 25 μL kupler pr. hul på en plade med 12 huller, og lad gelmatrixen hærde i 15 minutter i en 37 °C befugtet vævskulturinkubator.
  4. Efter at gelmatrixen er hærdet, tilsættes 750 μL organoidmedium til hvert hul, der indeholder gelmatrixkupler. Der inkuberes ved 37 °C i en befugtet vævskulturkuvøse.
    BEMÆRK: Organoid medieformulering er noteret i materialetabellen. Organoider dannes typisk inden for 4 dage efter den indledende kultur.

4. Genekspressionsanalyse af endometrieorganoider efter behandling med østradiol

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver de metoder, der anvendes til at profilere genekspressionen af endometrieepitelorganoider ved hjælp af qPCR i realtid efter behandling med østradiol (E2; se tabel 1). Fordi endometrium er under cyklisk kontrol af ovariehormonet E2, er test af organoidernes respons til E2 et vigtigt mål for fysiologisk funktion. Vi har opnået RNA af høj kvalitet og genereret tilstrækkeligt mRNA til at profilere genekspression ved hjælp af qPCR og/eller RNA-sekventering fra vores endometrieepitelorganoider. Dette afsnit beskriver, hvordan man indsamler organoider og behandler dem til downstream-analyse af genekspression. Det valgte behandlingsmedium afspejler det, der anvendes til behandling af dyrkede endometriecceller. Det skal dog bemærkes, at dette behandlingsmedium kan optimeres i overensstemmelse hermed, som det gøres til behandling af humane endometrie 3D-kulturer med hormoner 8,16,17.

  1. Kultur endometrieorganoiderne som beskrevet ovenfor.
  2. Fjern det organoide medium og erstat det med 750 μL sultemedium fire dage efter såning. Inkuber natten over.
  3. Den følgende morgen fjernes sultmediet. Der tilsættes 750 μL behandlingsmedium, der indeholder enten vehikel eller 10 nM E2. Inkuber i 48 timer.
  4. Fortsæt med RNA-isolering efter kitproducentens protokol.

5. Histologisk analyse af endometrieorganoider

BEMÆRK: Billeddannelse af endometrieorganoiders morfologiske egenskaber er afgørende for at evaluere den cellulære virkning af vækstfaktorer, genetiske manipulationer eller små molekylehæmmere. Dette afsnit beskriver de teknikker, der bruges til at fikse, behandle og billedendometrieepitelorganoider ved hjælp af histologiske pletter og antistofimmunofluorescerende farvning.

  1. Forbered 1,5 ml mikrocentrifugeglas indeholdende 1 ml 4% paraformaldehyd i 1x PBS. Placer dem på is.
  2. Opsug mediet fra brøndene på 12-brøndpladen, der indeholder organoiderne.
  3. Brug en 1 ml pipettespids med en skåret spids til at overføre 500 μL 4% paraformaldehyd til hvert hul og løsn forsigtigt gelmatrixkuplerne fra bunden af pladen.
  4. Rør forsigtigt hele gelmatrixkuplerne ind i pipettespidsen og overfør dem til 1,5 ml mikrocentrifugerøret.
  5. Fastgør organoiderne ved at placere dem på en rotator ved 4 °C natten over.
  6. Den følgende morgen centrifugeres røret ved 600 × g i 5 minutter for at pelletere organoiderne. Fjern forsigtigt 4% paraformaldehydopløsningen med en pipette og kassér den. Vask organoiderne 2x med 70% ethanol.
  7. Efter den sidste vask fjernes alle undtagen 50-100 μL ethanol fra røret. Sæt røret til side.
  8. Anbring et rør med prøvebehandlingsgel i et vandbad og mikrobølgeovn i ~ 30 s for at smelte gelen. Sørg for, at prøveforarbejdningsgelen ikke koger over ved at overvåge gelens konsistens.
    BEMÆRK: Når prøveforarbejdningsgelen er smeltet, men ikke kogende varm, skal du arbejde hurtigt for at indkapsle organoiderne.
  9. Overfør nok prøvebehandlingsgel til at dække hele formens overflade (ca. 250 μL).
  10. Mens prøveforarbejdningsgelen stadig er smeltet, overføres hurtigt 50 μL 70% ethanolopløsning indeholdende organoiderne. Sørg for, at organoiderne er nedsænket eller skubbet til den nederste del af formen.
  11. Placer histologiformen på en spand is, og lad prøvebehandlingsgelen afkøle og størkne.
  12. Når prøvebehandlingsgelen er helt tør, skal du forsigtigt overføre prøvebehandlingsgelkvadratet til en prøvepose og holde styr på det plan, hvor organoiderne er placeret.
  13. Posen anbringes i en histologikassette og behandles ved hjælp af standardmetoder, der anvendes til formalinfiksering og paraffinindlejring af væv18.
  14. Efter fiksering og indlejring i paraffin, sektion i 5 μm sektioner ved hjælp af et mikrotomt19. Fortsæt med standard hæmatoxylin og eosin (H &E) farvnings- eller immunfarvningsprocedurer som beskrevet nedenfor.

6. Hæmatoxylin &; eosin farvning

  1. Afparaffiniser sektionerne som følger: xylen, 2 x 10 min; 100% ethanol, 2 x 3 min; 80% ethanol, 3 min; 60% ethanol, 3 min; dH 2 O,2x 3 min; 1 min i hæmatoxylin; ledningsvand (3 x 5 s); 1 min i Eosin.
  2. Dehydrer sektionerne som følger: 60% ethanol, 3 min; 80% ethanol, 3 min; 95% ethanol, 3 min; 100% ethanol, 2 x 3 min; xylen, 2 x 15 min.
  3. Monter ved hjælp af monteringsmedium.

7. Immunofluorescensfarvning

  1. Afparaffiniser afsnittene som beskrevet i trin 6.1.
  2. Udfør antigenhentning
    1. Nedsænk diasene i antigenhentningsopløsning i en mikrobølgesikker beholder.
    2. Mikrobølgeovn ved høj varme i 20 min, med 5 minutters intervaller for at sikre, at opløsningen ikke koger over.
  3. Når 20 minutters antigenhentningstrinnet er afsluttet, skal du lade diasene køle af på is i 40 minutter, mens de stadig er nedsænket i antigenhentningsbuffer.
  4. Vask lysbillederne med 1x TBST i 3 min
  5. Bloker diasene ved at inkubere i 3% BSA i TBST i 1 time ved stuetemperatur.
  6. Primær antistofinkubation
    1. Fortynd antistoffet i 3% BSA i TBST (1:50-1:1.000, afhængigt af Ab).
    2. Der inkuberes natten over ved 4 °C i et befugtet kammer.
    3. Vask 3 x 5 min med TBST.
  7. Sekundær antistofinkubation
    1. Fortynd antistoffet i 3% BSA (i TBST) (1:250) eller i 5% normalt æsesrum.
    2. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur (RT) i mørke, da antistoffet konjugeres til en fluorofor.
  8. Nuklear farvning
    1. Fortynd 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) 1:1,000 i TBST.
    2. Inkuber i 5 minutter ved RT.
    3. Vask 2 x 5 min med TBST.
  9. Montering
    1. Brug en dråbe monteringsmedium til at montere dæksedlen.
    2. Forsegl dækslet med neglelak den følgende dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fasekontrastbilleder af museendometrieorganoider
Vi etablerede organoider fra WT-museendometrieepitel, som beskrevet i vedlagte protokol (se diagram i figur 1). Efter enzymatisk dissociation af museendometriepitelet blev epitelarkene mekanisk adskilt fra livmoderstromale celler og yderligere dissocieret med kollagenase for at generere en enkeltcellesuspension. Hvis denne metode til epitel- og stromalcelleseparation udføres korrekt, bør den give prøver med en kontaminering på højst 10-15 % af den modsatte celletype (se immunfluorescensbilleder i figur 2). Epitelcellepelleten blev derefter resuspenderet i gelmatrix, fik lov til at gelere ved stuetemperatur og belagt i 25 μL kupler på vævskulturplader. Efter at gelmatrixkuplerne størknede, blev de overlejret med organoidmedium og fik lov til at vokse. Vi observerede typisk, at endometrieepitelceller samlet i organoider inden for 3-4 dage, som afbildet i figur 3. Organoiderne blev opretholdt i kultur, med medieændringer, der forekom hver 3. dag og passerede hver 5-7 dage.

Billeddannelse af museendometrieorganoider ved hjælp af histologisk og immunofluorescerende farvning
For at analysere morfologien af museepitelorganoiderne tilpassede vi metoder, der blev brugt til indkapsling af cellulære fine nåleaspirater ved hjælp af prøvebehandlingsgel20. Dette muliggør bevarelse af endometrieorganoidmorfologien og indkapsling i en matrix, der kan underkastes behandling som forberedelse til paraffinindlejring. Prøvebehandlingsgel er en modificeret agar, der i vid udstrækning anvendes i kliniske patologilaboratorier til analyse af fine nåleaspirater og er blevet brugt til at indkapsle vaginale organoider21,22. Når prøvebehandlingsgelen / organoidblandingen størkner, kan den behandles, farves og afbildes med teknikker, der typisk bruges til at analysere væv. I figur 4A, B viser vi, at sektionerede formalinfikserede paraffinindlejrede endometrieorganoider kan visualiseres af hæmatoxylin- og eosinpletter, som viser det enkelte lag af epitel og hule centre - organoidernes lumen. Visse organoider indeholder også sekretioner i lumen, hvilket indikerer, at organoiderne erhverver de funktionelle egenskaber af kirtelepitelceller. Vi beskriver også teknikker til at visualisere organoiderne ved hjælp af immunfarvning (figur 4C, D); sektionerede endometrieorganoider blev inkuberet med et cytokeratin 8 primært antistof (TROMA-1) og et fluoroforkonjugeret sekundært antistof (sekundært anti-rotte-594). Kerner blev derefter visualiseret med DAPI, og diasene blev afbildet ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Vi observerede, at alle cellerne i organoiderne var cytokeratin 8-positive og indeholdt DAPI, hvilket indikerer, at fiksering, indlejring og behandling af endometrieorganoiderne er kompatibel med antistofbaseret immunfarvning.

RNA-ekstraktion og genekspressionsanalyse
For at bestemme endometrieorganoidernes genekspressionsrespons tillod vi endometrieorganoider fra WT-mus at vokse i 4 dage efter den første passage. Aftenen før behandlingen blev endometrieorganoidmediet ændret til sultemedium. Organoiderne blev derefter behandlet i tredobbelte brønde (hver brønd indeholdende tre kupler) med køretøj (ethanol; lige volumen i opløsning som anvendt til østradiol) eller 10 nM østradiol (E2) i alt 48 timer. Efter 48 timer blev mediet fjernet, og organoiderne blev behandlet til RNA-ekstraktion. Ca. 4 μg RNA kan opnås fra i alt to kupler fra hver brønd, og 1 μg RNA blev brugt til at vende transskribere cDNA. Amplifikation af de gener, der koder for lipocalin 2 (Lcn2), lactoferrin (Ltf) og progesteronreceptoren (Pgr) blev udført under anvendelse af kvantitativ PCR i realtid (figur 5 og tabel 1) 23,24,25. Som forventet observerede vi, at ekspressionen af Lcn2, Ltf og Pgr steg i epitelorganoiderne efter stimulering med 10 nM E2 (figur 5). Disse resultater viser således, at endometrieepitelorganoider med succes kan anvendes til at måle genekspressionsændringerne som reaktion på E2.

Figure 1
Figur 1: Procedurer, der anvendes til at etablere endometrieorganoider. Diagrammet skitserer de vigtigste trin, der blev fulgt for at (A) etablere og (B) passere epitelorganoider fra musens endometrium. (A) Metoderne omfatter enzymatisk og mekanisk dissociation af endometrieepitel fra museuterusen efterfulgt af enkeltcelledispersion og indkapsling af epitelet i en gelmatrix. For at opnå livmodervævene til enzymatisk dissociation fjernes æggestokkene og ovidukterne fra livmoderhornene med fin saks, skæres sideværts i 4-5 mm fragmenter og anbringes derefter i enzymopløsningen. Efter enzymatisk inkubation adskilles endometriepitelet mekanisk fra det underliggende stroma under et mikroskop ved hjælp af tang og en pipette til at "klemme" epitelet ud af livmoderrøret. Epitelet fordøjes yderligere i epitelceller ved anvendelse af en kort inkubation i collagenase, efterfulgt af indkapsling i en gelmatrix. (B) Passage af endometrieorganoiderne kræver mekanisk dissociation i koldt medium og centrifugering for at frigøre organoiderne fra matrixen og generere mindre organoidfragmenter. Når organoiderne er blevet frigivet fra matrixen og mekanisk dissocieret i mindre fragmenter, indkapsles de i matrix og forplades. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Immunfarvning af isolerede endometrieepitel- og stromale cellepopulationer. Immunofluorescensbilleder viser epitel- og stromale cellepopulationer af (A,B) epitelcelle og (C,D) stromale cellefraktioner efter enzymatisk og mekanisk adskillelse af livmoderen. Cytokeratin 8 (en epitelcellemarkør) vises med rødt, vimentin (en stromalcellemarkør) vises med grønt, og DAPI (en nuklear markør) vises med blåt. Skalastænger = 100 μm (A,C), 20 μm (B,D). Forkortelser: CK8 = cytokeratin 8; VIM = vimentin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Dannelse af endometrieorganoider fra WT-mus i løbet af 4 dage. Endometriepitel blev isoleret fra en WT-mus og brugt til at generere organoider. A) Fasekontrastbillede af epitelcellerne indkapslet i gelmatrixen umiddelbart efter fordøjelsen (dag 0). (B,C) Et par små organoider kan observeres på dag 1 (B) og dag 2 (C) af kultur. (D) Større og modne epitelorganoider kan observeres på dag 3 i kulturen. Billeder blev taget med et 5x mål; skalastænger = 200 μm. Forkortelse: WT = vildtype. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Histologisk analyse af endometrieorganoider . (A,B) FFPE endometrieepitelorganoider blev snittet og farvet med H&E. (C,D) FFPE-epitelorganoider blev immunfarvet med epitelcellemarkøren cytokeratin 8 (rød). Cellekerner blev farvet med DAPI (blå). Skalastænger = 200 μm (A), 100 μm (C), 50 μm (B, D). Forkortelser: FFPE = formalinfikseret paraffin indlejret; H&E = hæmatoxylin & eosin; CK8 = cytokeratin 8; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Genekspressionsanalyse af museendometrieorganoider. Museendometrieepitelorganoider fra WT-mus blev dyrket i 4 dage i organoidvækstmedium, efterfulgt af behandling med vehikel eller 10 nM E2 i 48 timer i DMEM/F12 suppleret med 2% kulstrippet FBS. (A,B) Fasekontrastbilleder af WT-museorganoiderne efter behandling med vehikel (A) eller 10 nM E2 (B). (C-E) Realtids qPCR-analyse af epitelendometrieorganoider behandlet med vehikel eller 10 nM E2. Ekspression af E2-regulerede gener, lipocalin 2 (Lnc2), lactoferrin (Ltf) og progesteronreceptor (Pgr). Søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM, analyseret ved en tosidet t-test; *p < 0,033, **p < 0,002, ***p < 0,001. Gentaget med organoider afledt af n = 3 WT-mus pr. tilstand. Skalastænger = 200 μm (A,B). Forkortelser: WT = vildtype; E2 = østradiol; qPCR = kvantitativ PCR. Klik her for at se en større version af denne figur.

Primer sekvens Fremad (5'-3') Baglæns (5'-3')
Lipocalin 2 (LCN2) GCAGGTGGTACGTGTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (LTF) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesteron (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyd 3 phosphat dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCTTCTT
PCR-blanding indeholder:
2x SYBR grøn
0,5 μM Fwd Primer
0,5 μM omdrejningstal Primer
cDNA
RNAse/DNAse-fri H2O
Cyklistens forhold:
Temperatur Tidspunkt Cykler
Holde 95 °C 10 minutter 1
Denaturering 95 °C 15 sek 40
Udvide 60 °C 60 s

Tabel 1: Primersekvenser og PCR-betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi metoder til at generere endometrieepitelorganoider fra museendometrium og de protokoller, der rutinemæssigt anvendes til deres nedstrømsanalyse. Endometrieorganoider er et kraftfuldt værktøj til at studere de mekanismer, der styrer endometrierelaterede sygdomme, såsom endometriose, endometriecancer og implantationsfejl. Skelsættende undersøgelser offentliggjort i 2017 rapporterede betingelserne for dyrkning af langsigtede og vedvarende kulturer af endometrieorganoider fra mus og humant epitel 4,5. Selvom organoider i vid udstrækning er blevet brugt til at studere biologiske veje i andre systemer, har undersøgelsen af endometrievæv in vitro været begrænset af fraværet af en passende model til undersøgelse af det ikke-transformerede primære epitel i kultur26. Endometrieorganoider afledt af mendemometrium hos mennesker og mus blev med succes etableret under anvendelse af betingelser, der typisk anvendes til dyrkning af organoider fra andre organvæv, såsom tarm, nyre og lunge, og ved at indlejre dem i et ekstracellulært matrixstillads sammensat af gelmatrix4. Siden disse indledende rapporter er brugen af endometrieorganoider til at studere endometriumets biologi steget betydeligt i det videnskabelige samfund.

Ved at modificere en tidligere offentliggjort metode til epitelisolering fra muselivmoderen27,28 fremhæver denne protokol unikt vigtige trin til isolering af muselivmoderen ved direkte at placere vævet i en enzymopløsning, omgå behovet for at transektere livmoderen eller bruge filtrering. Ved hjælp af denne metode opnåede vi epitel med ~ 85% -90% renhed, som bestemt af cytokeratin 8 og vimentin immunfarvning (figur 2). Denne protokol skitserer også klart nøgledetaljerne for indkapsling af de isolerede epitelceller i vækstmatrixen til generering, vedligeholdelse og passage af organoiderne. Billederne i figur 4 og vores upublicerede undersøgelser har identificeret tilstedeværelsen af muciner og kirtelceller (dvs. FOXA2-positive) i vores organoidkulturer29. Disse indikerer, at metoden præsenteret her er effektiv til isolering af både kirtel- og luminalepitelcellepopulationer fra museendometrium.

Nøglebegrænsninger for væksten af disse organoider omfatter brugen af den kommercielle matrix (dvs. Matrigel), hvilket kan resultere i batch-til-batch-variationer og indeholder vækstfaktorer, der kan påvirke organoidvækst. Desuden, mens disse organoider indeholder rent livmoderepitel, er brugen af yderligere endometriecelletyper (dvs. immun, stromal) for nylig blevet beskrevet i humane organoidsystemer af endometrium 8,30. Andre grupper har vist evnen til at isolere både luminale og kirtelepitelceller til organoidkulturer fra muselivmoderen14.

Denne tilgang bruger væv fra en lille dyremodel, der er relativt almindelig og tilgængelig for de fleste forskere; generering af endometrieorganoider fra større dyremodeller eller mennesker kan udgøre etiske eller tekniske udfordringer, som kan overvindes ved hjælp af inducerede pluripotente stamcellebaserede teknikker (iPSC). Sådanne teknologier er tidligere blevet beskrevet for endometrievæv31, andre væv i reproduktionskanalen32 og er blevet anvendt effektivt til at studere endometrie/placentainteraktioner in vitro33. Derfor udgør anvendelse af iPSC'er som kilde til endometriestromale og epitelceller i endometrium fra mennesker og andre store dyremodeller en vedvarende og tilgængelig kilde til generering af endometrieorganoider.

Mens musen er en meget anvendt model til undersøgelse af implantation, er der vigtige evolutionelle forskelle i implantationsmekanismen mellem mus og mennesker, der skal bemærkes. For eksempel, mens interstitiel implantation er karakteriseret ved dyb trofoblastisk invasion gennem luminalepitelet ind i det underliggende stroma, adskiller mekanismen for invasionsprocessen sig mellem mus og primater34. Hos mus involverer trofoblastinvasion gennem luminalepitelet apoptose eller entosis 35,36, mens trofoblaster migrerer mellem luminalepitel ind i det underliggende stroma i primater 34,35.

Tilvejebringelse af endometrieorganoider med de nødvendige vækstfaktorer til støtte for selvmontering og langsigtet fornyelse er afgørende for at opnå endometrieorganoidkulturer, der rekapitulerer det indfødte væv. Den komplekse mediesammensætning for endometrieorganoiderne indikerer de mange signalveje, der bidrager til epitelcelleegenskaber, og ville opstå fra både parakrin og autokrin kilde. Det stromale rum i endometrium er en kompleks samling af adskillige celletyper, herunder fibroblastlignende stromale celler, endotel, makrofager og andre specialiserede immunceller, der konstant ændrer sig som reaktion på østrogen og progesteron37.

For eksempel indeholder organoidkulturmediet faktorer, der aktiverer WNT / β-catenin-signalering i organoiderne, såsom WNT3a og R-Spondin. Undersøgelser hos mus har vist, at WNT-ligander er kritiske for livmoderudvikling og kirtelfunktion; Derfor er aktivering af denne signalvej kritisk for organoid udvikling og vedligeholdelse38,39. R-Spondin forstærker WNT-signalering og er liganden af den leucinrige gentagne indeholdende G-proteinkoblede receptor (LGR5)40. Endometrieorganoidkulturer kræver også hæmning af de transformerende vækstfaktor β (TGFβ) og knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalveje. For eksempel indeholder endometrieorganoidkulturmedium BMP-hæmmeren, Noggin, et udskilt protein, der binder til og inaktiverer BMP2, BMP4 og BMP741. Den farmakologiske hæmmer, A83-01, er også til stede i endometrieorganoidmedium. A83-01 er en lille molekylehæmmer med høj specificitet over for receptorerne ALK4, ALK5 og ALK742. ALK4/5/7 er type 1-receptorer af TGFβ-signalfamilien, der binder til og transmitterer signaler fremkaldt af ligander såsom TGFβ, activin eller nodal. BMP-signaler er afgørende for stamcellevedligeholdelse i væv som tarm43 og hårsække44. Inhibering af TGFβ-signalering bidrager til proliferativ kapacitet og kolonidannelseseffektivitet af endometriemessenkymale stamceller45, hvilket sker ved ombygning af nøgleregioner i kromatin46. Således er modulering af disse to nøglesignalveje, BMP og TGFβ, nødvendig for at opretholde organoidkulturer med selvfornyelseskapacitet.

Selvom det ikke vises her, fandt vi, at langvarig dyrkning af museorganoiderne med ALK4/5/7-hæmmeren, A83-01, førte til morfologiske ændringer i epitelorganoiderne efter tre eller fire kontinuerlige passager (Kriseman et al., under gennemgang). De morfologiske ændringer i epitelorganoiderne mindede om de "tætte" epitelorganoider beskrevet af Boretto et al.4, hvor udviklingen af mere sekretoriske lignende celler opstod på grund af nedsat parakrin sekretion af WNT-ligander. Det er således sandsynligt, at TGFβ- og WNT-signalveje skærer hinanden for at kontrollere endometrieepitelorganoidregenerering og differentiering.

Nylige undersøgelser har genereret 3D endometrieepitel / stromale co-kultursystemer fra humane væv 7,8,16. En metode til co-dyrkning anvender et stilladsfrit system, hvor endometrieepitel- og stromale celler kombineres og får lov til at samle sig i 3D-strukturer i en stilladsfri brønd ved hjælp af et defineret kulturmedium. Disse 3D endometrieepitel / stromale organoider udtrykker ikke kun receptorer for østrogen, progesteron og androgen, men rekapitulerer også trofast responsen på ovariehormoner - østrogen og progesteron 6,7. I en anden co-kultureringsmetode, der anvendes i en undersøgelse af Rawlings et al., kombineres endometrieepitelorganoider med stromale celler i en kollagenmatrix og dyrkes i et modificeret organoidmedium8. Disse epitel / stromale co-dyrkede organoider eller assembloider organiserer sig i et suspenderet 3D-system, hvor stromale celler omgiver epitellignende strukturer.

Størstedelen af endometrieorganoider dyrkes i vækstfaktorreduceret gelmatrix; Men, tilstedeværelsen af aktive forbindelser i matrixen kan udøve uønskede cellulære reaktioner i organoiderne. For at overvinde denne begrænsning er organoider blevet etableret i gelmatrixfrie stilladser, såsom 3D-printede agaroseforme, hvor individuelle organoider får lov til at samle sigselv 6. Andre grupper har udviklet syntetiske hydrogeler til at tjene som 3D-matricer til kulturen af endometrieorganoider47. Disse organoider samles i 3D-strukturer med apicobasal polaritet og kan også kombineres med stromale celler i endometrium til dannelse af komplekse organoider48. Da organoider med succes kan anvendes til dyrkning af ikke-transformerede primære humane og museendometrievæv på måder, som 2D-cellekulturer ikke kan, er der ingen tvivl om, at endometrieorganoider vil fremme området for kvinders reproduktive sundhed og være et utroligt værktøj til at studere reproduktive patologier såsom tilbagevendende graviditetstab, endometriose og endometriecancer16, 49,50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Stephanie Pangas og Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) for kritisk læsning og redigering af vores manuskript. Undersøgelser blev støttet af Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development tilskud R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) og R01-HD110038 (M.M.M.) og af NCI- P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. har en Next Gen Pregnancy Award fra Burroughs Wellcome Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987 (2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739 (2021).

Tags

Biologi udgave 191 endometrium organoider infertilitet livmoder regenerering
Etablering af 3D endometrieorganoider fra musens livmoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z.,… More

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter