Summary
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכברים לביטוי גנים וניתוחים היסטולוגיים.
Abstract
רקמת רירית הרחם מסדרת את החלל הפנימי של הרחם ונמצאת תחת שליטה מחזורית של אסטרוגן ופרוגסטרון. זוהי רקמה המורכבת מאפיתל לומינלי ובלוטתי, תא סטרומלי, רשת כלי דם ואוכלוסיית תאי חיסון מורכבת. מודלים של עכברים היו כלי רב עוצמה לחקר רירית הרחם, וחשפו מנגנונים קריטיים השולטים בהשתלה, בהשליה ובסרטן. הפיתוח האחרון של תרביות אורגנואידיות רירית הרחם התלת-ממדיות מציג מודל חדשני לניתוח מסלולי האיתות העומדים בבסיס הביולוגיה של רירית הרחם. ביסוס אורגנואידים של רירית הרחם ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית, ניתוח התמלילים שלהם והדמיה של המורפולוגיה שלהם ברזולוציה של תא בודד הם כלים חיוניים לחקר מחלות רירית הרחם. מאמר זה מתווה שיטות לביסוס תרביות תלת-ממדיות של אפיתל רירית הרחם מעכברים ומתאר טכניקות לכימות ביטוי גנים ולניתוח ההיסטולוגיה של האורגנואידים. המטרה היא לספק משאב שניתן להשתמש בו כדי לבסס, לתרבת ולחקור את ביטוי הגנים והמאפיינים המורפולוגיים של אורגנואידים אפיתליאליים רירית הרחם.
Introduction
רירית הרחם - רקמת הרירית הפנימית של חלל הרחם - היא רקמה ייחודית ודינמית מאוד הממלאת תפקידים קריטיים בבריאות הרבייה של האישה. במהלך חיי הרבייה, רירית הרחם טומנת בחובה פוטנציאל לעבור מאות מחזורים של התפשטות, התמיינות ופירוק, המתואמים על ידי הפעולה המרוכזת של הורמוני השחלות - אסטרוגן ופרוגסטרון. מחקרים על עכברים מהונדסים גנטית חשפו מנגנונים ביולוגיים בסיסיים העומדים בבסיס תגובת רירית הרחם להורמונים ובקרה על השתלת עוברים, דצידואליזציה של תאים סטרומליים והריון1. עם זאת, מחקרים במבחנה היו מוגבלים בשל קשיים בשמירה על רקמות רירית הרחם העיקריות של עכברים שלא עברו טרנספורמציה בתרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות 2,3. ההתקדמות האחרונה בתרבית של רקמות רירית הרחם כמערכות איברים תלת-ממדיות, או אורגנואידים, מהווה הזדמנות חדשה לחקור מסלולים ביולוגיים השולטים בהתחדשות והתמיינות תאי רירית הרחם. מערכות אורגנואידיות של רירית הרחם של עכברים ובני אדם פותחו מאפיתל רירית הרחם טהור עטוף במטריצות שונות4,5, בעוד רירית הרחם האנושית תורבית כתרביות אפיתל/סטרומליות ללא פיגומים6,7, ולאחרונה כמכלולי אפיתל/סטרומלים ללא קולגן8 . פוטנציאל הצמיחה וההתחדשות של תרביות אפיתל אורגנואידיות נתמך על ידי קוקטייל מוגדר של גורמי גדילה ומעכבי מולקולות קטנות שנקבעו אמפירית כדי למקסם את הצמיחה וההתחדשות של האורגנואידים 4,5,9. יתר על כן, היכולת להקפיא ולהפשיר אורגנואידים של רירית הרחם מאפשרת בנקאות ארוכת טווח של אורגנואידים רירית הרחם מעכברים ובני אדם למחקרים עתידיים.
עכברים מהונדסים גנטית חשפו את מסלולי האיתות המורכבים השולטים בתחילת ההריון ובדצידוליזציה, ושימשו כמודלים של אובדן הריון, סרטן רירית הרחם ואנדומטריוזיס. מחקרים גנטיים אלה הושגו במידה רבה עם מחיקה ספציפית לתאים של אללים מסוג loxP ("floxed") באמצעות רקומבינאזות cre הפעילים במיוחד ברקמות הרבייה הנשיות. מודלים אלה של עכברים כוללים את קולטן הפרוגסטרון-cre10 הנמצא בשימוש נרחב, בעל פעילות רקומבינאז חזקה ברקמות אפיתל רירית הרחם והסטרומלית, לקטופרין i-cre, הגורם לרקומבינציית אפיתל רירית הרחם בעכברים בוגרים 11, או Wnt7a-cre, המעורר מחיקה ספציפית לאפיתל ברקמות שמקורן במולריאן12 . גידול רקמות רירית הרחם ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית כאורגנואידים תלת-ממדיים סיפק הזדמנות מצוינת לחקור את הביולוגיה של רירית הרחם ולהקל על זיהוי גורמי גדילה ומסלולי איתות השולטים בחידוש תאי רירית הרחם ובהתמיינות13,14. שיטות לבידוד ותרבית של רקמת רירית הרחם של העכבר מתוארות בספרות ומדווחות על שימוש באסטרטגיות אנזימטיות שונות לבידוד אפיתל הרחם להתרבות הבאה של אורגנואידים אפיתל רירית הרחם4. בעוד שספרות קודמת מספקת מסגרת קריטית לפרוטוקולים של תרביות אפיתל רירית הרחם 4,5,6, מאמר זה מספק שיטה ברורה ומקיפה ליצירה, שמירה, עיבוד וניתוח של אורגנואידים אלה. סטנדרטיזציה של טכניקות אלה חשובה להאצת ההתקדמות בתחום הביולוגיה של הרבייה של נשים. כאן אנו מדווחים על מתודולוגיה מפורטת לטיהור אנזימטי ומכני של רקמת אפיתל רירית הרחם של עכבר עבור התרבית הבאה של אורגנואידים רירית הרחם בפיגום מטריצת ג'ל. אנו מתארים גם את המתודולוגיות לניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים במורד הזרם של אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכבר עטוף במטריצת ג'ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפול בעכבר ומחקרים ניסיוניים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מכללת ביילור לרפואה והנחיות שנקבעו על ידי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. בידוד אפיתל הרחם מעכברים בשיטות אנזימטיות ומכניות
הערה: סעיף זה מתאר את השלבים הנדרשים כדי ליצור, לעבור, להקפיא ולהפשיר אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם מעכברים באמצעות פיגום מטריצת ג'ל. מחקרים קודמים קבעו כי תרביות אופטימליות של אורגנואידים רירית הרחם של עכברים נקבעות מעכברים במהלך שלב4 estrus, אשר ניתן לקבוע על ידי בדיקה ציטולוגית של ספוגית נרתיק15. נקבות עכברי WT בוגרות (בנות 6-8 שבועות, C57BL/6J היברידי ו-129S5/SvEvBrd) שימשו לכל הניסויים. העכברים הומתו באופן הומני על פי הנחיות שאושרו על ידי IACUC באמצעות טשטוש איזופלורן ואחריו דיסארטיקולציה של צוואר הרחם. לאחר הרדמת העכברים, יש לבצע את השלבים הבאים. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לחומרים ולפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.
- יש להפשיר את מטריצת הג'ל על הקרח למשך כ-1-2 שעות לפני השימוש.
- כדי לנתח את העכבר, השתמש במספריים כדי לבצע חתך בקו האמצע על הבטן ולקלף בעדינות את העור בחזרה כדי לחשוף את שכבת הצפק שמתחת. השתמש מלקחיים כדי להחזיק את שכבת הצפק ולעשות חתכים לרוחב עם מספריים כדי לחשוף את תוכן הבטן.
- אתר את קרני הרחם על ידי הזזה עדינה של כריות שומן הבטן הצידה. נתחו אותם על ידי החזקתם תחילה בצומת צוואר הרחם ושימוש במספריים כדי לחתוך לאורך השומן המזנטרי. לאחר כריתה של רחם העכבר, להסיר ביסודיות רקמת שומן מן קרן הרחם עם מספריים קטנים.
הערה: שמור על סטריליות במהלך בידוד התאים על ידי עיקור כל כלי הניתוח לפני השימוש, רסס את בטן העכבר ב-70% אתנול ובצע את כל השלבים שלאחר כריתה תחת מכסה מנוע של תרבית רקמה סטרילית.
- אתר את קרני הרחם על ידי הזזה עדינה של כריות שומן הבטן הצידה. נתחו אותם על ידי החזקתם תחילה בצומת צוואר הרחם ושימוש במספריים כדי לחתוך לאורך השומן המזנטרי. לאחר כריתה של רחם העכבר, להסיר ביסודיות רקמת שומן מן קרן הרחם עם מספריים קטנים.
- חותכים כל קרן רחם לשברים קטנים, כל אחד בגודל של כ 4-5 מ"מ.
- מניחים את כל שברי הרחם מרחם אחד לבאר אחת של צלחת בת 24 בארות המכילה 0.5 מ"ל של 1% טריפסין. אפשר את הפתרון האנזימטי להיכנס לומן הרחם, גרימת הפרדה אנזימטית של אפיתל רירית הרחם מן stroma התחתון.
- לדגום את צלחת 24 באר בחממה תרבית רקמה לחה של 37 מעלות צלזיוס במשך כשעה.
- לאחר הדגירה של שעה, מעבירים את שברי הרחם לצלחת תרבית רקמה בקוטר 35 מ"מ המכילה 1 מ"ל של תמיסת אגירת פוספטים (DPBS) של דולבקו.
- תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש מלקחיים עדינים פיפטה 1 מ"ל כדי להפריד מכנית את אפיתל הרחם מן צינור הרחם. תוך כדי החזקת קצה אחד של שבר הרחם עם המלקחיים, הפעל בעדינות את קצה הפיפטה לאורך השבר, וסוחט את האפיתל מהקצה השני של צינור הרחם. שימו לב ליריעות האפיתל המופרדות מקטע הרחם תחת מיקרוסקופ הדיסקציה.
- השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לאסוף ולהעביר בעדינות את יריעות האפיתל לתוך צינור 1.5 מ"ל.
- חזור על התהליך עבור שברי הרחם הנותרים, העברת כל יריעות האפיתל לאותו צינור איסוף.
- גלולה את יריעות האפיתל המנותקות על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 375 × גרם.
- הסר בזהירות את הסופרנטנט כדי למנוע הפרעה לכדור התא.
- יש להשהות את גלולת התא ב-0.5 מ"ל של קולגן במינון 2.5 מ"ג/מ"ל + תמיסת DNase של 2 מ"ג/מ"ל. פיפטה למעלה ולמטה בערך פי 10, או עד להשגת השעיה של תא בודד.
- יש להוסיף 0.5 מ"ל של DMEM/F12 + 10% סרום בקר עוברי (FBS) + אנטיביוטיקה, ולבצע צנטריפוגה בתאים למשך 5 דקות ב-375 × גרם.
הערה: למידע נוסף על האנטיביוטיקה רחבת הטווח המשמשת לתרבית תאים, עיין בטבלת החומרים. - הסר בזהירות את הסופרנטנט והושיע מחדש את התאים ב-1 מ"ל של DMEM/F12 + 10% FBS + אנטיביוטיקה. צנטריפוגה של התאים במשך 5 דקות ב 375 × גרם.
2. עיבוד של תא stromal
הערה: סעיף זה מתאר את הפרוטוקולים הדרושים לבידוד התא הסטרומלי של רירית הרחם של העכבר. לאור העניין הגובר בניסויים בתרבית אפיתל/סטרומלית, חשוב להיות מסוגלים לעבד את אוכלוסיות התאים הסטרומליים בנוסף לתאי האפיתל שייצרו אורגנואידים.
- לאחר שכל האפיתל הופרד באופן אנזימטי ומכני משברי הרחם, המבנים דמויי הצינור הנותרים הם התאים "הסטרומלים/מיומטריים". אסוף רקמה זו בקולגן של 2.5 מ"ג/מ"ל + 2 מ"ג/מ"ל DNase בתמיסת HBSS.
- דגרו את הדגימה הסטרומלית/מיומטרלית על שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- לאחר הדגירה, יש להוסיף 500 μL של DMEM/F12 + 10% FBS + אנטיביוטיקה לכל עכבר, ולסנן את השברים שאינם מנותקים דרך מסנן תאים של 40 מיקרומטר.
- גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 375 × גרם.
- הסר בזהירות את הסופרנטנט ושלח מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של DMEM/F12 + 10% FBS + אנטיביוטיקה. הוסיפו את התערובת ל-10 מ"ל של DMEM/F12 + 10% FBS + אנטיביוטיקה בצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ. לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאים לחות.
- כדי ליצור תרביות משותפות של תאי אפיתל רירית הרחם של עכברים ותאי סטרומל, בצע את השיטות המתוארות עבור אורגנואידים אנושיים של רירית הרחם באמצעות מערכות נטולות פיגומים או מטריצת קולגן 6,8.
הערה: בעוד שטכניקות אלה טרם פורסמו עבור עכברים, ניתן להתאים אותן על סמך הפרוטוקולים שפורסמו עם רירית הרחם האנושית.
3. אנקפסולציה של אפיתל הרחם לתוך מטריצת ג'ל כדי ליצור אורגנואידים
הערה: יש לשמור את מטריצת הג'ל על קרח עד שהיא מוכנה לשימוש.
- הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש את כדור התא בנפח של מטריצת ג'ל שהוא פי 20 מזה של כדור התא (כלומר, אם כדור התא הוא 20 μL, להשעות את התאים עם 400 μL של מטריצת ג'ל). יש להשעות את הכדור בזהירות כדי למנוע החדרת בועות.
- אפשרו למטריצת הג'ל/מתלה התא לשקוע בטמפרטורת החדר למשך ~10 דקות.
- ברגע שמטריצת הג'ל/תרחיף התא הופכת לג'ל מוצק למחצה, השתמש במיקרופיפט P200 עם קצה רחב של 200 μL כדי לשאוף בעדינות 25 μL של מטריצת הג'ל / תרחיף התא. יש לפזר שלוש כיפות נפרדות של 25 μL לכל באר של צלחת 12 בארות, ולאפשר למטריצת הג'ל לרפא במשך 15 דקות באינקובטור תרבית רקמה לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר שמטריצת הג'ל נרפאה, הוסף 750 μL של מדיום אורגנואידי לכל באר המכילה כיפות מטריצת ג'ל. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמה לחות.
הערה: נוסחת המדיה האורגנואידית מצוינת בטבלת החומרים. אורגנואידים נוצרים בדרך כלל תוך 4 ימים מהתרבית הראשונית.
4. ניתוח ביטוי גנים של אורגנואידים רירית הרחם לאחר טיפול באסטרדיול
הערה: סעיף זה מתאר את השיטות המשמשות לפרופיל ביטוי הגנים של אורגנואידים אפיתליאליים רירית הרחם באמצעות qPCR בזמן אמת לאחר טיפול באסטרדיול (E2; ראה טבלה 1). מכיוון שהאנדומטריום נמצא תחת שליטה מחזורית של הורמון השחלות E2, בדיקת ההיענות של האורגנואידים ל- E2 היא מדד חשוב לתפקוד הפיזיולוגי. השגנו RNA באיכות גבוהה ויצרנו מספיק mRNA כדי ליצור פרופיל של ביטוי גנים באמצעות qPCR ו/או ריצוף RNA מהאורגנואידים האפיתליאליים של רירית הרחם שלנו. חלק זה מתאר כיצד לאסוף אורגנואידים ולעבד אותם לניתוח במורד הזרם של ביטוי גנים. מדיום הטיפול שנבחר משקף את זה המשמש לטיפול בתאי רירית הרחם בתרבית. עם זאת, יש לציין כי אמצעי טיפול זה יכול להיות מותאם בהתאם, כפי שנעשה לטיפול של תרביות 3D רירית הרחם האנושית עם הורמונים 8,16,17.
- תרבית את האורגנואידים רירית הרחם כמתואר לעיל.
- הסר את המדיום האורגנואידי והחלף אותו עם 750 μL של מדיום רעב ארבעה ימים לאחר הזריעה. לדגור לילה.
- למחרת בבוקר, הסר את מדיום הרעב. הוסף 750 μL של אמצעי טיפול המכיל את הרכב או 10 nM E2. דגירה במשך 48 שעות.
- המשך בבידוד RNA בהתאם לפרוטוקול של יצרן הערכה.
5. ניתוח היסטולוגי של אורגנואידים רירית הרחם
הערה: הדמיית התכונות המורפולוגיות של אורגנואידים רירית הרחם היא קריטית להערכת ההשפעה התאית של גורמי גדילה, מניפולציות גנטיות או מעכבי מולקולות קטנות. חלק זה מתאר את הטכניקות המשמשות לתיקון, עיבוד והדמיה של אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם באמצעות כתמים היסטולוגיים וכתמים אימונופלואורסצנטיים של נוגדנים.
- הכינו צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכילים 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS אחד. מניחים אותם על קרח.
- שאפו את המדיום מהבארות של צלחת 12 הבאר המכילה את האורגנואידים.
- באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל עם קצה חיתוך, העבר 500 μL של 4% paraformaldehyde לכל באר בעדינות לנתק את כיפות מטריצת ג'ל מתחתית הצלחת.
- שאפו בעדינות את כל כיפות מטריצת הג'ל לתוך קצה הפיפטה והעבירו לצינור המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
- תקן את האורגנואידים על ידי הנחתם על מסובב ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
- למחרת בבוקר, צנטריפוגה את הצינור ב 600 × גרם במשך 5 דקות כדי לזרוק את האורגנואידים. הסר בעדינות את תמיסת 4% paraformaldehyde עם פיפטה והשלכו. לשטוף את האורגנואידים 2x עם 70% אתנול.
- לאחר הכביסה האחרונה, הסר את כל מלבד 50-100 μL של אתנול מן הצינור. מניחים את הצינור בצד.
- מניחים צינור של ג'ל לעיבוד דגימות באמבט מים ובמיקרוגל למשך ~ 30 שניות כדי להמיס את הג'ל. ודא שג'ל עיבוד הדגימה אינו רותח על ידי ניטור עקביות הג'ל.
הערה: לאחר שג'ל עיבוד הדגימה נמס, אך לא רותח חם, יש לעבוד במהירות כדי לעטוף את האורגנואידים. - מעבירים מספיק ג'ל לעיבוד דגימות כדי לכסות את כל פני השטח של התבנית (כ-250 μL).
- בעוד ג'ל עיבוד הדגימה עדיין מותך, להעביר במהירות את 50 μL של 70% אתנול פתרון המכיל את האורגנואידים. ודא כי האורגנואידים שקועים או נדחפים לחלק התחתון של התבנית.
- מניחים את התבנית ההיסטולוגית על דלי קרח ומאפשרים לג'ל עיבוד הדגימה להתקרר ולהתמצק.
- לאחר שג'ל עיבוד הדגימה יבש לחלוטין, העבירו בזהירות את ריבוע ג'ל עיבוד הדגימה לשקית דגימה, תוך מעקב אחר המטוס שבו נמצאים האורגנואידים.
- מניחים את השקית בקלטת היסטולוגיה ומעבדים בשיטות סטנדרטיות המשמשות לקיבוע פורמלין והטמעת פרפין של רקמות18.
- לאחר קיבוע והטמעה בפרפין, חתך למקטעים של 5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום19. המשך עם הליכי צביעה סטנדרטיים של המטוקסילין ואאוזין (H&E) או אימונוסטינינג, כמפורט להלן.
6. המטוקסילין וכתמי אאוסין
- Deparaffinize את הסעיפים כדלקמן: קסילן, 2 x 10 דקות; 100% אתנול, 2 x 3 דקות; 80% אתנול, 3 דקות; 60% אתנול, 3 דקות; dH 2 O,2x 3 דקות; 1 דקות בהמטוקסילין; מי ברז (3 x 5 שניות); דקה אחת באוסין.
- לייבש את החלקים כדלקמן: 60% אתנול, 3 דקות; 80% אתנול, 3 דקות; 95% אתנול, 3 דקות; 100% אתנול, 2 x 3 דקות; קסילן, 2 x 15 דקות
- הרכב באמצעות מדיום הרכבה.
7. מכתים אימונופלואורסצנטיים
- לפרק את הסעיפים כמתואר בשלב 6.1.
- ביצוע שליפת אנטיגן
- טבלו את השקופיות בתמיסת אחזור אנטיגן במיכל בטוח לשימוש במיקרוגל.
- יש לחמם במיקרוגל בחום גבוה למשך 20 דקות, תוך שימוש במרווחים של 5 דקות כדי להבטיח שהתמיסה לא תרתח.
- לאחר השלמת שלב אחזור האנטיגן בן 20 הדקות, אפשרו למגלשות להתקרר על הקרח למשך 40 דקות ועדיין שקועות במאגר שליפת אנטיגן.
- שטפו את השקופיות עם 1x TBST למשך 3 דקות
- חסום את השקופיות על ידי דגירה ב-3% BSA ב-TBST למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- דגירה ראשונית של נוגדנים
- לדלל את הנוגדן ב-3% BSA ב-TBST (1:50-1:1,000, תלוי ב-Ab).
- לדגור לילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר לחות.
- לשטוף 3 x 5 דקות עם TBST.
- דגירה משנית של נוגדנים
- יש לדלל את הנוגדן ב-3% BSA (ב-TBST) (1:250), או ב-5% סרום חמור רגיל.
- דגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT) בחושך, שכן הנוגדן מצומד לפלואורופור.
- צביעה גרעינית
- דילול 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) 1:1,000 ב-TBST.
- דגירה במשך 5 דקות ב- RT.
- לשטוף 2 x 5 דקות עם TBST.
- הרכבה
- השתמש בטיפה אחת של מדיום הרכבה כדי להרכיב את הכיסוי.
- יש לאטום את הכיסוי באמצעות לק למחרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונות ניגודיות פאזה של אורגנואידים רירית הרחם של עכבר
יצרנו אורגנואידים מאפיתל רירית הרחם של עכבר WT, כפי שמתואר בפרוטוקול המצורף (ראו תרשים באיור 1). בעקבות דיסוציאציה אנזימטית של אפיתל רירית הרחם של העכבר, יריעות האפיתל הופרדו מכנית מהתאים הסטרומליים של הרחם ונותקו עוד יותר עם קולגן כדי ליצור תרחיף חד-תאי. אם היא מבוצעת נכון, שיטה זו של הפרדת תאים אפיתל וסטרומלי אמורה להניב דגימות עם זיהום של לא יותר מ-10%-15% מסוג התא ההפוך (ראו תמונות אימונופלואורסצנציה באיור 2). לאחר מכן הוחזר כדור התא האפיתליאלי במטריצת ג'ל, הותר לג'ל בטמפרטורת החדר, וצופה לכיפות של 25 μL על צלחות תרבית רקמה. לאחר שכיפות מטריצת הג'ל התמצקו, הן כוסו במדיום אורגנואידי והורשו לגדול. בדרך כלל ראינו שתאי אפיתל רירית הרחם התאספו לאורגנואידים תוך 3-4 ימים, כפי שמוצג באיור 3. האורגנואידים נשמרו בתרבית, כאשר שינויי מדיה התרחשו כל 3 ימים, ועברו כל 5-7 ימים.
הדמיה של אורגנואידים רירית הרחם של עכברים באמצעות צביעה היסטולוגית ואימונופלואורסצנטית
כדי לנתח את המורפולוגיה של האורגנואידים האפיתל של העכבר, התאמנו שיטות המשמשות לאנקפסולציה של שאיפות מחט עדינות תאיות באמצעות ג'ל עיבוד דגימות20. זה מאפשר שימור של המורפולוגיה האורגנואידית של רירית הרחם ואנקפסולציה לתוך מטריצה שיכולה להיות נתונה לעיבוד כהכנה להטמעת פרפין. ג'ל לעיבוד דגימות הוא אגר מותאם הנמצא בשימוש נרחב במעבדות פתולוגיה קלינית לניתוח שאיפות מחט עדינות ושימש לכמוסות אורגנואידים נרתיקיים21,22. לאחר שהתמצקות תערובת הג'ל/אורגנואיד לעיבוד הדגימה, ניתן לעבד אותה, להכתים אותה ולדמותה בטכניקות המשמשות בדרך כלל לניתוח רקמות. באיור 4A,B, אנו מראים שניתן לדמיין אורגנואידים בעלי רקמת רירית הרחם המשובצים בפורמלין קבוע באמצעות כתמי המטוקסילין ואאוזין, המציגים את השכבה היחידה של אפיתל ומרכזים חלולים - הלומן - של האורגנואידים. אורגנואידים מסוימים מכילים גם הפרשות לומן, מה שמעיד על כך שהאורגנואידים רוכשים את התכונות התפקודיות של תאי אפיתל בלוטותיים. אנו גם מתארים טכניקות להמחשת האורגנואידים באמצעות אימונוסטינינג (איור 4C,D); אורגנואידים של רירית הרחם שנחתכו דוגרו עם נוגדן ראשוני מסוג ציטוקרטין 8 (TROMA-1) ונוגדן משני מצומד פלואורופור (נוגדן משני נגד חולדה-594). לאחר מכן דמיינו גרעינים באמצעות DAPI, והשקופיות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראינו שכל התאים באורגנואידים היו ציטוקרטין 8-חיובי והכילו DAPI, מה שמצביע על כך שקיבוע, הטבעה ועיבוד של האורגנואידים של רירית הרחם תואמים לאימונוסטינינג מבוסס נוגדנים.
מיצוי RNA וניתוח ביטוי גנים
כדי לקבוע את תגובת ביטוי הגנים של אורגנואידים רירית הרחם, אפשרנו לאורגנואידים רירית הרחם מעכברי WT לגדול במשך 4 ימים לאחר המעבר הראשון. בערב שלפני הטיפול, המדיום האורגנואידי של רירית הרחם הוחלף למדיום הרעבה. לאחר מכן טופלו האורגנואידים בבארות משולשות (כל באר המכילה שלוש כיפות) עם רכב (אתנול; נפח שווה בתמיסה כפי שמשמש לאסטרדיול) או אסטרדיול 10 ננומטר (E2) במשך 48 שעות בסך הכל. לאחר 48 שעות, המדיום הוסר, והאורגנואידים עובדו למיצוי RNA. ניתן לקבל כ-4 מיקרוגרם של RNA משתי כיפות מכל באר, ו-1 מיקרוגרם של RNA שימש לתמלול הפוך של cDNA. הגברה של הגנים המקודדים ליפוקלין 2 (Lcn2), לקטופרין (Ltf) וקולטן פרוגסטרון (Pgr) בוצעה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (איור 5 וטבלה 1)23,24,25. כצפוי, ראינו שהביטוי של Lcn2, Ltf ו-Pgr עלה באורגנואידים של אפיתל לאחר גירוי עם 10 ננומטר E2 (איור 5). לפיכך, תוצאות אלה מראות כי ניתן להשתמש בהצלחה באורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם כדי למדוד את השינויים בביטוי הגנים בתגובה ל- E2.
איור 1: הליכים המשמשים ליצירת אורגנואידים של רירית הרחם. הדיאגרמה מתארת את השלבים העיקריים שבוצעו כדי (A) ליצור ו- (B) להעביר אורגנואידים אפיתל מרירית הרחם של העכבר. (A) השיטות כוללות דיסוציאציה אנזימטית ומכנית של אפיתל רירית הרחם מרחם העכבר, ולאחר מכן פיזור חד-תאי ומעטפת של האפיתל למטריצת ג'ל. כדי להשיג את רקמות הרחם עבור דיסוציאציה אנזימטית, השחלות ואת oviducts מוסרים מן הקרניים הרחם עם מספריים עדינים, לחתוך לרוחב לתוך 4-5 מ"מ שברים, ולאחר מכן ממוקם בתמיסת האנזים. לאחר הדגירה האנזימטית, אפיתל רירית הרחם מופרד מכנית מהסטרומה הבסיסית תחת מיקרוסקופ באמצעות מלקחיים ופיפטה כדי "לסחוט" את האפיתל מצינור הרחם. האפיתל מתעכל עוד יותר לתאי אפיתל באמצעות דגירה קצרה בקולגנאז, ולאחר מכן אנקפסולציה לתוך מטריצת ג'ל. (B) העברת האורגנואידים של רירית הרחם דורשת דיסוציאציה מכנית במדיום קר וצנטריפוגה כדי לשחרר את האורגנואידים מהמטריצה וליצור שברי אורגנואידים קטנים יותר. לאחר שהאורגנואידים השתחררו מהמטריצה והתנתקו מכנית למקטעים קטנים יותר, הם נעטפים לתוך מטריצה ומצופים מחדש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: אימונוסטינינג של אפיתל רירית הרחם המבודד ואוכלוסיות תאים סטרומליים. תמונות אימונופלואורסצנציה מראות אוכלוסיות של תאי אפיתל ותאי סטרומלית של תאי אפיתל (A,B) ושל (C,D) שברים של תאים סטרומליים לאחר הפרדה אנזימטית ומכנית של הרחם. ציטוקרטין 8 (סמן תא אפיתל) מוצג באדום, וימנטין (סמן תא סטרומלי) מוצג בירוק, ו- DAPI (סמן גרעיני) מוצג בכחול. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A,C), 20 מיקרומטר (B,D). קיצורים: CK8 = ציטוקרטין 8; VIM = וימנטין; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: היווצרות אורגנואידים של רירית הרחם מעכברי WT במשך 4 ימים. אפיתל רירית הרחם בודד מעכבר WT ושימש ליצירת אורגנואידים. (A) תמונת ניגודיות פאזה של תאי האפיתל העטופים במטריצת הג'ל מיד לאחר העיכול (יום 0). (ב,ג) ניתן לראות כמה אורגנואידים קטנים ביום 1 (B) וביום 2 (C) של תרבית. (D) ניתן לצפות באורגנואידים אפיתליאליים גדולים ובשלים ביום השלישי לתרבית. התמונות צולמו עם מטרה פי 5; סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצור: WT = סוג פראי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניתוח היסטולוגי של אורגנואידים רירית הרחם . (A,B) אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם FFPE נחתכו והוכתמו ב-H&E. (C,D) אורגנואידים אפיתליאליים FFPE הוכתמו במערכת החיסון עם סמן תאי האפיתל ציטוקרטין 8 (אדום). גרעיני התאים הוכתמו ב-DAPI (כחול). פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר (A), 100 מיקרומטר (C), 50 מיקרומטר (B,D). קיצורים: FFPE = פרפין קבוע פורמלין מוטבע; H&E = המטוקסילין ואאוזין; CK8 = ציטוקרטין 8; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: ניתוח ביטוי גנים של אורגנואידים רירית הרחם של עכברים. אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכברים מעכברי WT עברו תרבית במשך 4 ימים במדיום גדילה אורגנואידים, ולאחר מכן טיפול ברכב או 10 ננומטר E2 במשך 48 שעות ב-DMEM/F12 בתוספת FBS נטול פחם של 2%. (א,ב) תמונות ניגודיות פאזה של האורגנואידים של עכבר WT לאחר טיפול ברכב (A) או 10 ננומטר E2 (B). (ג-ה) ניתוח qPCR בזמן אמת של אורגנואידים אפיתליאליים רירית הרחם שטופלו ברכב או 10 nM E2. ביטוי של גנים מווסתים E2, ליפוקלין 2 (Lnc2), לקטופרין (Ltf) וקולטן פרוגסטרון (Pgr). ברים מייצגים ממוצע ± SEM, מנותח על ידי מבחן t דו-זנב; *p < 0.033, **p < 0.002, ***p < 0.001. חוזר על עצמו עם אורגנואידים הנגזרים מ- n = 3 עכברי WT לכל תנאי. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר (A,B). קיצורים: WT = סוג פראי; E2 = אסטרדיול; qPCR = PCR כמותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| רצף פריימר | קדימה (5'-3') | הפוך (5'-3') |
| ליפוקלין 2 (LCN2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC |
| לקטופרין (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCTCGTTC |
| פרוגסטרון (Pgr) | CCCAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATCCGG |
| גליצרלדהיד 3 פוספט דהידרוגנאז (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCTTCTT |
| תערובת PCR מכילה: |
| 2x ירוק SYBR |
| פריימר Fwd 0.5 μM |
| פריימר Rev 0.5 μM |
| דנ"א |
| RNAse/DNAse ללא תז H2O |
| תנאי רוכב: | |||
| טמפרטורה | זמן | מחזורים | |
| אחז | 95 °C | 10 דק' | 1 |
| דנטורציה | 95 °C | 15 שניות | 40 |
| האריך | 60 מעלות צלזיוס | 60 שניות |
טבלה 1: רצפי פריימרים ותנאי PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה נתאר שיטות ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם מרירית הרחם של עכברים ואת הפרוטוקולים המשמשים באופן שגרתי לניתוח שלהם במורד הזרם. אורגנואידים רירית הרחם הם כלי רב עוצמה לחקר המנגנונים השולטים במחלות הקשורות לרירית הרחם, כגון אנדומטריוזיס, סרטן רירית הרחם וכשל בהשתלה. מחקרים פורצי דרך שפורסמו בשנת 2017 דיווחו על התנאים לתרבית תרביות ארוכות טווח ומתחדשות של אורגנואידים רירית הרחם מאפיתל עכברים ואנושיים 4,5. למרות שאורגנואידים היו בשימוש נרחב לחקר מסלולים ביולוגיים במערכות אחרות, המחקר של רקמת רירית הרחם במבחנה הוגבל על ידי היעדר מודל מתאים לחקר האפיתל הראשוני שלא השתנה בתרבית26. אורגנואידים רירית הרחם שמקורם ברירית הרחם של בני אדם ועכבר נקבעו בהצלחה באמצעות תנאים המשמשים בדרך כלל לתרבית אורגנואידים מרקמות איברים אחרות, כגון מעיים, כליות וריאה, ועל ידי הטבעתם בפיגום מטריצה חוץ-תאית המורכב ממטריצת ג'ל4. מאז הדיווחים הראשוניים הללו, השימוש באורגנואידים רירית הרחם כדי לחקור את הביולוגיה של רירית הרחם גדל באופן משמעותי בקהילה המדעית.
על ידי שינוי שיטה שפורסמה בעבר של בידוד אפיתל מרחם העכבר27,28, פרוטוקול זה מדגיש באופן ייחודי צעדים מרכזיים לבידוד רחם העכבר על ידי הצבת הרקמה ישירות בתמיסת אנזים, עקיפת הצורך להעביר את הרחם, או להשתמש בסינון. בשיטה זו קיבלנו אפיתל עם טוהר של ~85%-90%, כפי שנקבע על-ידי ציטוקרטין 8 ו-vimentin immunostaining (איור 2). פרוטוקול זה גם מתאר בבירור את הפרטים העיקריים לכמוסות של תאי האפיתל המבודדים לתוך מטריצת הגדילה לייצור, תחזוקה ומעבר של האורגנואידים. התמונות באיור 4 והמחקרים שלנו שלא פורסמו זיהו את נוכחותם של מוצינים ותאי בלוטות (כלומר, FOXA2-positive) בתרביות האורגנואידיותשלנו 29. אלה מצביעים על כך שהשיטה המוצגת כאן יעילה לבידוד אוכלוסיות תאי הבלוטות והאפיתל הלומינלי מאנדומטריום העכבר.
המגבלות העיקריות לצמיחה של אורגנואידים אלה כוללות את השימוש במטריצה המסחרית (כלומר, Matrigel), שיכולה לגרום לשינויים בין אצווה לאצווה ומכילה גורמי גדילה שיכולים להשפיע על צמיחת האורגנואידים. יתר על כן, בעוד אורגנואידים אלה מכילים אפיתל רחם טהור, השימוש בסוגי תאים נוספים של רירית הרחם (כלומר, חיסוני, סטרומלי) תואר לאחרונה במערכות אורגנואידיות אנושיות של רירית הרחם 8,30. קבוצות אחרות הראו את היכולת לבודד תאי אפיתל לומינליים ובלוטות עבור תרביות אורגנואידיות מרחם העכבר14.
גישה זו משתמשת ברקמות ממודל של בעלי חיים קטנים שהוא נפוץ יחסית וזמין לרוב החוקרים; יצירת אורגנואידים רירית הרחם ממודלים גדולים יותר של בעלי חיים, או בני אדם, עשויה להציב אתגרים אתיים או טכניים, שניתן להתגבר עליהם על ידי שימוש בטכניקות מבוססות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC). טכנולוגיות כאלה תוארו בעבר עבור רקמות רירית הרחם31, רקמות אחרות של מערכת הרבייה 32 ושימשו ביעילות לחקר אינטראקציות רירית הרחם/שליה במבחנה33. לפיכך, שימוש בתאי גזע פלורמליים ותאי אפיתל של רירית הרחם מבני אדם וממודלים אחרים של בעלי חיים גדולים מהווה מקור מתחדש ונגיש ליצירת אורגנואידים של רירית הרחם.
בעוד שהעכבר הוא מודל נפוץ לחקר ההשתלה, ישנם הבדלים אבולוציוניים מרכזיים במנגנון ההשתלה בין עכברים לבני אדם שיש לשים לב אליהם. לדוגמה, בעוד שהשתלה אינטרסטיציאלית מאופיינת בפלישה טרופובלסטית עמוקה דרך האפיתל הלומינלי לתוך הסטרומה שמתחת, מנגנון תהליך הפלישה שונה בין עכברים לפרימטים34. בעכברים, פלישת טרופובלסטים דרך האפיתל הלומינלי כוללת אפופטוזיס או אנטוזיס 35,36, ואילו טרופובלסטים נודדים בין אפיתל לומינלי לסטרומה הבסיסית בפרימטים 34,35.
מתן אורגנואידים רירית הרחם עם גורמי הגדילה הדרושים לתמיכה בהרכבה עצמית והתחדשות ארוכת טווח הוא חיוני כדי להשיג תרביות אורגנואידים רירית הרחם כי recapitulate את הרקמה הטבעית. הרכב המדיה המורכב של האורגנואידים של רירית הרחם מצביע על מסלולי האיתות המרובים התורמים למאפייני תאי האפיתל, ונובעים הן ממקורות פרקרין והן ממקורות אוטוקריניים. התא הסטרומלי של רירית הרחם הוא הרכבה מורכבת של סוגי תאים רבים, כולל תאים סטרומליים דמויי פיברובלסט, אנדותל, מקרופאגים ותאי חיסון מתמחים אחרים המשתנים ללא הרף בתגובה לאסטרוגן ופרוגסטרון37.
לדוגמה, מדיום התרבית האורגנואידית מכיל גורמים המפעילים איתות WNT/β-catenin באורגנואידים, כגון WNT3a ו-R-Spondin. מחקרים בעכברים הראו כי ליגנדות WNT הן קריטיות להתפתחות הרחם ולתפקוד הבלוטות; לכן, הפעלת מסלול איתות זה היא קריטית לפיתוח ותחזוקה של אורגנואידים38,39. R-Spondin מגביר את איתות ה-WNT והוא הליגנד של הקולטן המצומד לחלבון G העשיר בלאוצין (LGR5)40. תרביות אורגנואידים של רירית הרחם דורשות גם עיכוב של גורמי הגדילה המשתנים β (TGFβ) ושל מסלולי האיתות של החלבון המורפוגנטי של העצם (BMP). לדוגמה, תרבית אורגנואידית רירית הרחם מכילה את מעכב BMP, Noggin, חלבון מופרש הנקשר ומשבית את BMP2, BMP4 ו-BMP741. המעכב הפרמקולוגי, A83-01, קיים גם במדיום אורגנואידי רירית הרחם. A83-01 הוא מעכב מולקולה קטנה עם ספציפיות גבוהה לקולטנים ALK4, ALK5 ו- ALK742. ALK4/5/7 הם קולטנים מסוג 1 ממשפחת האיתותים TGFβ הנקשרים ומעבירים אותות הנגרמים על ידי ליגנדות כגון TGFβ, activin או nodal. אותות BMP חיוניים לתחזוקת תאי גזע ברקמות כמו המעיים43 וזקיקי השיער44. עיכוב של איתות TGFβ תורם ליכולת ההתרבות וליעילות היווצרות המושבה של תאי גזע מזנכימליים של רירית הרחם45, המתרחשת על ידי שיפוץ אזורי מפתח בכרומטין46. לפיכך, אפנון של שני מסלולי איתות מרכזיים אלה, BMP ו- TGFβ, נחוץ כדי לשמור על תרבויות אורגנואידיות עם יכולת התחדשות עצמית.
למרות שלא הוצג כאן, מצאנו כי תרבית ארוכת טווח של אורגנואידים עכברים עם מעכב ALK4/5/7, A83-01, הובילה לשינויים מורפולוגיים באורגנואידים האפיתל לאחר שלושה או ארבעה מעברים רצופים (Kriseman et al., תחת בדיקה). השינויים המורפולוגיים באורגנואידים האפיתליאליים הזכירו את אורגנואידים אפיתל "צפופים" שתוארו על ידי Boretto et al.4, שם התפתחות של תאים דמויי הפרשה יותר התרחשה עקב ירידה בהפרשת הפרקרין של ליגנדות WNT. לפיכך, סביר להניח כי TGFβ ו WNT מסלולי איתות מצטלבים כדי לשלוט התחדשות אפיתל אפיתל רירית הרחם והתמיינות.
מחקרים אחרונים יצרו מערכות תלת-ממדיות של אפיתל רירית הרחם/תרבית סטרומלית מרקמות אנושיות 7,8,16. שיטה אחת של שיתוף פעולה משתמשת במערכת נטולת פיגומים, שבה משולבים תאי אפיתל וסטרומליים של רירית הרחם ומאפשרים להרכיב אותם למבנים תלת-ממדיים בבאר נטולת פיגומים באמצעות מדיום תרבית מוגדר. אורגנואידים אפיתליים/סטרומליים תלת-ממדיים אלה לא רק מבטאים קולטנים לאסטרוגן, פרוגסטרון ואנדרוגן, אלא גם משחזרים בנאמנות את התגובה להורמונים השחלתיים - אסטרוגן ופרוגסטרון 6,7. בשיטה אחרת של שיתוף פעולה, שנעשה בה שימוש במחקר של Rawlings et al., אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם משולבים עם תאים סטרומליים במטריצת קולגן וגדלים במדיום אורגנואידישונה 8. אורגנואידים אלה בתרבית אפיתליאלית/סטרומלית, או אסמבלואידים, מתארגנים במערכת תלת-ממדית מרחפת, שבה תאים סטרומליים מקיפים מבנים דמויי בלוטת אפיתל.
רוב האורגנואידים של רירית הרחם מתורבתים במטריצת ג'ל מופחתת גורם גדילה; עם זאת, נוכחות של תרכובות פעילות במטריצה עלולה להפעיל תגובות תאיות לא רצויות בתוך האורגנואידים. כדי להתגבר על מגבלה זו, אורגנואידים הוקמו בפיגומים נטולי מטריצת ג'ל, כגון תבניות אגרוז מודפסות בתלת-ממד שבהן אורגנואידים בודדים מורשים להרכיב בעצמם6. קבוצות אחרות פיתחו הידרוג'לים סינתטיים שישמשו כמטריצות תלת-ממדיות לתרבית של אורגנואידים רירית הרחם47. אורגנואידים אלה מתכנסים למבנים תלת-ממדיים עם קוטביות אפיקובסלית וניתן גם לשלב אותם עם תאים סטרומליים של רירית הרחם ליצירת אורגנואידים מורכבים48. מכיוון שניתן להשתמש בהצלחה באורגנואידים לגידול רקמות רירית הרחם הראשוניות של בני אדם ועכברים שאינם מותמרים בדרכים שבתרביות תאים דו-ממדיות אינן יכולות, אין ספק כי אורגנואידים של רירית הרחם יקדמו את תחום בריאות הרבייה של נשים ויהיו כלי מדהים לחקר פתולוגיות רבייה כגון אובדן הריון חוזר, אנדומטריוזיס וסרטן רירית הרחם16, 49,50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר סטפני פנגס ולד"ר מרטין מ. מצוק (M.M.M.) על הקריאה הביקורתית והעריכה של כתב היד שלנו. המחקרים נתמכו על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ע"ש יוניס קנדי שרייבר R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) ו-R01-HD110038 (M.M.M.), ועל ידי מענק התמיכה של מרכז הסרטן NCI- P30 (NCI-CA125123). דיאנה מונסיוויס, Ph.D. מחזיקה בפרס הריון מהדור הבא מקרן בורוז וולקום.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid Media Formulation | |||
| Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
| Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
| B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
| ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
| Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
| WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
| Other supplies and reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
| Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
| Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
| Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
| Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
| Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
| Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
| Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
| Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
| HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
| Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
| Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
| TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
| Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
| VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
| SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
| Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
| Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
| Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
| ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
| ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
| Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
| Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
| Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
| Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |
References
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
- Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
- Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
- Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
- Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
- Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
- Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
- Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
- Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
- Caligioni, C. S.
- Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
- Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P.
- Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
- Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
- Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
- Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
- Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
- McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
- Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
- Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
- Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
- Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
- Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
- Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987 (2022).
- Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
- McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E.
- Carson, D. D., et al.
- Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
- Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
- Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
- Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
- Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
- Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
- Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
- Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
- Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
- Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
- Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
- Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
- Gnecco, J. S., et al.
- Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
- Kim, J. J.
