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Biology

माउस गर्भाशय से 3 डी एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की स्थापना

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64448
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल जीन अभिव्यक्ति और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए माउस एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनोइड ्स स्थापित करने के तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

एंडोमेट्रियल ऊतक गर्भाशय की आंतरिक गुहा को रेखाबद्ध करता है और एस्ट्रोजेन और प्रोजेस्टेरोन के चक्रीय नियंत्रण में होता है। यह एक ऊतक है जो ल्यूमिनल और ग्रंथियों के उपकला, एक स्ट्रोमल डिब्बे, एक संवहनी नेटवर्क और एक जटिल प्रतिरक्षा कोशिका आबादी से बना है। माउस मॉडल एंडोमेट्रियम का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण रहा है, जो महत्वपूर्ण तंत्र का खुलासा करता है जो आरोपण, प्लेसेंटा और कैंसर को नियंत्रित करता है। 3 डी एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का हालिया विकास एंडोमेट्रियल जीव विज्ञान के तहत आने वाले सिग्नलिंग मार्गों को विच्छेदित करने के लिए एक अत्याधुनिक मॉडल प्रस्तुत करता है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की स्थापना, उनके ट्रांसस्क्रिप्टम का विश्लेषण करना, और एकल-कोशिका संकल्प पर उनकी आकृति विज्ञान की कल्पना करना एंडोमेट्रियल रोगों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यह पेपर चूहों से एंडोमेट्रियल एपिथेलियम की 3 डी संस्कृतियों को स्थापित करने के तरीकों को रेखांकित करता है और जीन अभिव्यक्ति को मापने और ऑर्गेनोइड्स के ऊतक विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए तकनीकों का वर्णन करता है। लक्ष्य एक संसाधन प्रदान करना है जिसका उपयोग एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनोइड्स की जीन अभिव्यक्ति और रूपात्मक विशेषताओं को स्थापित करने, संस्कृति और अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

एंडोमेट्रियम - गर्भाशय गुहा का आंतरिक अस्तर म्यूकोसल ऊतक - एक अद्वितीय और अत्यधिक गतिशील ऊतक है जो एक महिला के प्रजनन स्वास्थ्य में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। प्रजनन जीवनकाल के दौरान, एंडोमेट्रियम प्रसार, भेदभाव और टूटने के सैकड़ों चक्रों से गुजरने की क्षमता रखता है, जो डिम्बग्रंथि हार्मोन - एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन की ठोस कार्रवाई द्वारा समन्वित होता है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों के अध्ययन ने हार्मोन के लिए एंडोमेट्रियल प्रतिक्रिया और भ्रूण प्रत्यारोपण, स्ट्रोमल सेल निर्णय और गर्भावस्था के नियंत्रण को रेखांकित करने वाले बुनियादी जैविक तंत्रको उजागर किया है। हालांकि, पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृतियों 2,3 में गैर-रूपांतरित प्राथमिक माउस एंडोमेट्रियल ऊतकों को बनाए रखने में कठिनाइयोंके कारण इन विट्रो अध्ययन सीमित हैं। 3 डी अंग प्रणाली, या ऑर्गेनोइड्स के रूप में एंडोमेट्रियल ऊतकों की संस्कृति में हालिया प्रगति, जैविक मार्गों की जांच करने का एक नया अवसर प्रस्तुत करती है जो एंडोमेट्रियल सेल पुनर्जनन और भेदभाव को नियंत्रित करते हैं। माउस और मानव एंडोमेट्रियल ऑर्गेनॉइड सिस्टम को शुद्ध एंडोमेट्रियल एपिथेलियम से विभिन्न मैट्रिक्स 4,5 में समझाया गया है, जबकि मानव एंडोमेट्रियम को पाड़-मुक्त उपकला / स्ट्रोमल सह-संस्कृतियों 6,7 के रूप में सुसंस्कृत किया गया है, और हाल ही में कोलेजन-एनकैप्सुलेटेड एपिथेलियल / स्ट्रोमल असेंबलोइड्स8 के रूप में। . उपकला ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की वृद्धि और पुनर्योजी क्षमता को विकास कारकों और छोटे अणु अवरोधकों के परिभाषित कॉकटेल द्वारा समर्थित किया जाता है जिन्हें ऑर्गेनोइड्स 4,5,9 के विकास और उत्थान को अधिकतम करने के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया गया है। इसके अलावा, एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स को फ्रीज करने और पिघलाने की क्षमता भविष्य के अध्ययनों के लिए चूहों और मनुष्यों से एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की दीर्घकालिक बैंकिंग की अनुमति देती है।

आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों ने जटिल सिग्नलिंग मार्गों का खुलासा किया है जो प्रारंभिक गर्भावस्था और निर्णय को नियंत्रित करते हैं, और गर्भावस्था के नुकसान, एंडोमेट्रियल कैंसर और एंडोमेट्रियोसिस के मॉडल के रूप में उपयोग किया गया है। इन आनुवंशिक अध्ययनों को बड़े पैमाने पर महिला प्रजनन ऊतकों में सक्रिय क्रे रिकोम्बिनेस का उपयोग करके लोक्सपी फ्लैंक्ड एलील्स ("फ्लोक्स्ड") के सेल-विशिष्ट विलोपन के साथ हासिल किया गया है। इन माउस मॉडल में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर-सीआरई10 शामिल है, जिसमें एंडोमेट्रियल उपकला और स्ट्रोमल ऊतकों में मजबूत रिकॉम्बिनेस गतिविधि होती है, लैक्टोफेरिन आई-क्रे, जो वयस्क चूहों11, या डब्ल्यूएनटी 7 ए-क्रे में एंडोमेट्रियल उपकला पुनर्संयोजन को प्रेरित करता है, जो मुलेरियन-व्युत्पन्न ऊतकों में उपकला-विशिष्ट विलोपन को ट्रिगर करता है। . आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से एंडोमेट्रियल ऊतकों को 3 डी ऑर्गेनोइड्स के रूप में संवर्धन ने एंडोमेट्रियल जीव विज्ञान की जांच करने और एंडोमेट्रियल सेल नवीकरण और भेदभावको नियंत्रित करने वाले विकास कारकों और सिग्नलिंग मार्गों की पहचान की सुविधा प्रदान करने का एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान किया है। माउस एंडोमेट्रियल ऊतक के अलगाव और संस्कृति के तरीकों को साहित्य में वर्णित किया गया है और एंडोमेट्रियल उपकलाऑर्गेनोइड्स के बाद के संवर्धन के लिए गर्भाशय उपकला के अलगाव के लिए विभिन्न एंजाइमैटिक रणनीतियों के उपयोग की रिपोर्ट करते हैं। जबकि पिछला साहित्य एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनॉइड संस्कृति प्रोटोकॉल 4,5,6 के लिए एक महत्वपूर्ण ढांचा प्रदान करता है, यह पेपर इन ऑर्गेनोइड्स को उत्पन्न करने, बनाए रखने, प्रसंस्करण और विश्लेषण करने के लिए एक स्पष्ट, व्यापक विधि प्रदान करता है। महिलाओं के प्रजनन जीव विज्ञान के क्षेत्र में प्रगति में तेजी लाने के लिए इन तकनीकों का मानकीकरण महत्वपूर्ण है। यहां, हम एक जेल मैट्रिक्स पाड़ में एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की बाद की संस्कृति के लिए माउस एंडोमेट्रियल उपकला ऊतक के एंजाइमेटिक और यांत्रिक शुद्धिकरण के लिए एक विस्तृत पद्धति की रिपोर्ट करते हैं। हम जेल मैट्रिक्स-एनकैप्सुलेटेड माउस एंडोमेट्रियल एपिथेलियल ऑर्गेनोइड्स के डाउनस्ट्रीम हिस्टोलॉजिकल और आणविक विश्लेषण के लिए पद्धतियों का भी वर्णन करते हैं।

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Protocol

माउस हैंडलिंग और प्रयोगात्मक अध्ययन बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड द्वारा स्थापित दिशानिर्देशों के तहत किए गए थे।

1. एंजाइमैटिक और यांत्रिक तरीकों का उपयोग करके चूहों से गर्भाशय उपकला का अलगाव

नोट: यह खंड जेल मैट्रिक्स पाड़ का उपयोग करके चूहों से उपकला एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स को स्थापित करने, पारित करने, फ्रीज करने और पिघलाने के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन करता है। पिछले अध्ययनों ने निर्धारित किया है कि एस्ट्रस चरण4 के दौरान चूहों से माउस एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की इष्टतम संस्कृतियां स्थापित की जाती हैं, जिसे योनि स्वैब15 की साइटोलॉजिकल परीक्षा द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। वयस्क मादा डब्ल्यूटी चूहों (6-8 सप्ताह पुराने, हाइब्रिड C57BL / 6J और 129S5 / SvEvBrd) का उपयोग सभी प्रयोगों के लिए किया गया था। चूहों को आईएसीयूसी-अनुमोदित दिशानिर्देशों के अनुसार आइसोफ्लुरेन बेहोश करने की क्रिया का उपयोग करके मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दी गई थी, जिसके बाद गर्भाशय ग्रीवा की विकृति हुई। एक बार चूहों को इच्छामृत्यु हो जाने के बाद, निम्नलिखित चरणों का पालन किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्री और समाधान से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. उपयोग से पहले जेल मैट्रिक्स को लगभग 1-2 घंटे के लिए बर्फ पर पिघलने दें।
  2. माउस को विच्छेदित करने के लिए, पेट पर मध्य-पंक्ति चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें और अंतर्निहित पेरिटोनियल परत को उजागर करने के लिए धीरे से त्वचा को वापस छीलें। पेरिटोनियल परत को पकड़ने के लिए बल का उपयोग करें और पेट की सामग्री को उजागर करने के लिए कैंची के साथ पार्श्व चीरे लगाएं।
    1. पेट की वसा पैड को धीरे से एक तरफ ले जाकर गर्भाशय के सींगों का पता लगाएं। पहले उन्हें ग्रीवा जंक्शन पर पकड़कर और मेसेंटेरिक वसा के साथ काटने के लिए कैंची का उपयोग करके उन्हें विच्छेदित करें। माउस गर्भाशय के विच्छेदन के बाद, छोटी कैंची के साथ गर्भाशय के सींग से वसा ऊतक को अच्छी तरह से हटा दें।
      नोट: उपयोग से पहले सभी सर्जरी उपकरणों को स्टरलाइज़ करके सेल अलगाव के दौरान बाँझपन बनाए रखें, माउस पेट को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें, और बाँझ ऊतक संस्कृति हुड के तहत विच्छेदन के बाद सभी चरणों का प्रदर्शन करें।
  3. प्रत्येक गर्भाशय के सींग को छोटे टुकड़ों में काटें, प्रत्येक लगभग 4-5 मिमी मापता है।
  4. एक गर्भाशय से गर्भाशय के सभी टुकड़ों को 24-वेल प्लेट के एक कुएं में रखें जिसमें 0.5 एमएल 1% ट्रिप्सिन हो। एंजाइमैटिक समाधान को गर्भाशय लुमेन में प्रवेश करने की अनुमति दें, जिससे अंतर्निहित स्ट्रोमा से एंडोमेट्रियल एपिथेलियम का एंजाइमेटिक पृथक्करण हो।
  5. लगभग 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ह्यूमिडिफाइड टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 24-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  6. 1 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, गर्भाशय के टुकड़ों को 35 मिमी ऊतक संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एमएल डलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड समाधान (डीपीबीएस) होते हैं।
  7. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, गर्भाशय ट्यूब से गर्भाशय उपकला को यांत्रिक रूप से अलग करने के लिए बारीक बल और 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें। गर्भाशय के टुकड़े के एक छोर को बल के साथ पकड़ते हुए, धीरे-धीरे पिपेट टिप को टुकड़े के पार अनुदैर्ध्य रूप से चलाएं, उपकला को गर्भाशय ट्यूब के दूसरे छोर से निचोड़ें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत गर्भाशय के टुकड़े से अलग उपकला चादरों का निरीक्षण करें।
  8. एपिथेलियल शीट को 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करने और धीरे से स्थानांतरित करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें।
  9. शेष गर्भाशय के टुकड़ों के लिए प्रक्रिया को दोहराएं, सभी उपकला चादरों को एक ही संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  10. 375 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किए गए उपकला शीट को पेलेट करें।
  11. सेल पेलेट को परेशान करने से बचने के लिए सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  12. सेल पेलेट को 2.5 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज + 2 मिलीग्राम / एमएल डीएनएस समाधान के 0.5 एमएल में पुन: निलंबित करें। पिपेट लगभग 10x ऊपर और नीचे, या जब तक एकल-सेल निलंबन प्राप्त नहीं हो जाता है।
  13. F12 + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) + एंटीबायोटिक्स के 0.5 एमएल जोड़ें, और 375 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: सेल संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक पर अतिरिक्त जानकारी के लिए, सामग्री की तालिका देखें।
  14. सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें और डीएमईएम / एफ 12 + 10% एफबीएस + एंटीबायोटिक दवाओं के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को 375 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।

2. स्ट्रोमल डिब्बे का प्रसंस्करण

नोट: यह खंड माउस एंडोमेट्रियम के स्ट्रोमल डिब्बे को अलग करने के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है। स्ट्रोमल सह-संस्कृति प्रयोगों में बढ़ती रुचि को देखते हुए, उपकला कोशिकाओं के अलावा स्ट्रोमल सेल आबादी को संसाधित करने में सक्षम होना महत्वपूर्ण है जो ऑर्गेनोइड उत्पन्न करेंगे।

  1. एक बार जब सभी उपकला को गर्भाशय के टुकड़ों से एंजाइमेटिक और यांत्रिक रूप से अलग कर दिया जाता है, तो शेष ट्यूब जैसी संरचनाएं "स्ट्रोमल / मायोमेट्रायल" डिब्बे होती हैं। इस ऊतक को एचबीएसएस समाधान में 2.5 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज + 2 मिलीग्राम / एमएल डीएनएस में इकट्ठा करें।
  2. स्ट्रोमल/मायोमेट्रायल नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस शेकर पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. इनक्यूबेशन बाद, प्रति माउस 500 μL DMEM / F12 + 10% FBS + एंटीबायोटिक्स जोड़ें, और 40 μm सेल फ़िल्टर के माध्यम से गैर-विघटित टुकड़ों को फ़िल्टर करें।
  4. 375 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मार दें।
  5. सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें और डीएमईएम / एफ 12 + 10% एफबीएस + एंटीबायोटिक दवाओं के 1 एमएल में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें। 10 सेमी सेल कल्चर प्लेट में डीएमईएम / एफ 12 + 10% एफबीएस + एंटीबायोटिक दवाओं के 10 एमएल के लिए मिश्रण को ड्रॉपवाइज जोड़ें। एक ह्यूमिडिफाइड सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  6. माउस एंडोमेट्रियल उपकला और स्ट्रोमल कोशिकाओं की सह-संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए, पाड़-मुक्त या कोलेजन मैट्रिक्स सिस्टम 6,8 का उपयोग करके मानव एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स के लिए वर्णित तरीकों का पालन करें।
    नोट: जबकि इन तकनीकों को अभी तक चूहों के लिए प्रकाशित नहीं किया गया है, उन्हें मानव एंडोमेट्रियम के साथ प्रकाशित प्रोटोकॉल के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है।

3. ऑर्गेनोइडस्थापित करने के लिए जेल मैट्रिक्स में गर्भाशय उपकला का एनकैप्सुलेशन

नोट: जेल मैट्रिक्स को बर्फ पर रखें जब तक कि यह उपयोग करने के लिए तैयार न हो।

  1. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और सेल पेलेट को जेल मैट्रिक्स की मात्रा में पुन: निलंबित करें जो सेल पेलेट की मात्रा 20 गुना है (यानी, यदि सेल पेलेट 20 μL है, तो कोशिकाओं को 400 μL जेल मैट्रिक्स के साथ पुन: निलंबित करें)। बुलबुले पेश करने से बचने के लिए गोली को सावधानी से पुन: निलंबित करें।
  2. जेल मैट्रिक्स / सेल निलंबन को ~ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बसने दें।
  3. एक बार जब जेल मैट्रिक्स / सेल निलंबन एक अर्ध-ठोस जेल बन जाता है, तो जेल मैट्रिक्स / सेल निलंबन के धीरे-धीरे 25 μL को एस्पिरेट करने के लिए एक चौड़े बोर 200 μL टिप के साथ P200 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। 12-वेल प्लेट के प्रति कुएं में तीन अलग-अलग 25 μL गुंबद वितरित करें, और जेल मैट्रिक्स को 37 डिग्री सेल्सियस ह्यूमिडिफाइड टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 15 मिनट के लिए ठीक करने की अनुमति दें।
  4. जेल मैट्रिक्स ठीक होने के बाद, जेल मैट्रिक्स गुंबदों वाले प्रत्येक कुएं में 750 μL ऑर्गेनॉइड माध्यम जोड़ें। एक ह्यूमिडिफाइड टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: ऑर्गेनॉइड मीडिया फॉर्मूलेशन सामग्री की तालिका में नोट किया गया है। ऑर्गेनोइड्स आमतौर पर प्रारंभिक संस्कृति के 4 दिनों के भीतर बनते हैं।

4. एस्ट्राडियोल के साथ उपचार के बाद एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण

नोट: यह खंड एस्ट्राडियोल के साथ उपचार के बाद वास्तविक समय क्यूपीसीआर का उपयोग करके एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनोइड्स की जीन अभिव्यक्ति को प्रोफाइल करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों का वर्णन करता है (ई 2; तालिका 1 देखें)। क्योंकि एंडोमेट्रियम डिम्बग्रंथि हार्मोन ई 2 के चक्रीय नियंत्रण में है, ई 2 के लिए ऑर्गेनोइड्स की प्रतिक्रिया का परीक्षण शारीरिक कार्य का एक महत्वपूर्ण उपाय है। हमने उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए प्राप्त किए हैं और हमारे एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनोइड्स से क्यूपीसीआर और / या आरएनए-अनुक्रमण का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को प्रोफाइल करने के लिए पर्याप्त एमआरएनए उत्पन्न किया है। यह खंड वर्णन करता है कि जीन अभिव्यक्ति के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए ऑर्गेनोइड्स को कैसे एकत्र किया जाए और उन्हें संसाधित किया जाए। चयनित उपचार माध्यम सुसंस्कृत एंडोमेट्रियल कोशिकाओं के इलाज के लिए उपयोग किए जाने वाले को दर्शाता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस उपचार माध्यम को तदनुसार अनुकूलित किया जा सकता है, जैसा कि हार्मोन 8,16,17 के साथ मानव एंडोमेट्रियल 3 डी संस्कृतियों के इलाज के लिए किया जाता है।

  1. एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति जैसा कि ऊपर वर्णित है।
  2. ऑर्गेनॉइड माध्यम को हटा दें और बीज बोने के चार दिन बाद इसे 750 μL भुखमरी माध्यम से बदलें। रात भर इनक्यूबेट करें।
  3. अगली सुबह, भुखमरी के माध्यम को हटा दें। वाहन या 10 एनएम ई 2 युक्त उपचार माध्यम का 750 μL जोड़ें। 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. किट निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए आरएनए अलगाव के साथ आगे बढ़ें।

5. एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

नोट: एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की रूपात्मक विशेषताओं की इमेजिंग विकास कारकों, आनुवंशिक जोड़तोड़, या छोटे अणु अवरोधकों के सेलुलर प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह खंड हिस्टोलॉजिकल दाग और एंटीबॉडी इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग का उपयोग करके एंडोमेट्रियल एपिथेलियल ऑर्गेनोइड्स को ठीक करने, संसाधित करने और छवि बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकों का वर्णन करता है।

  1. 1x PBS में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 1 एमएल वाले 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें। उन्हें बर्फ पर रखें।
  2. ऑर्गेनोइड्स युक्त 12-वेल प्लेट के कुओं से माध्यम को एस्पिरेट करें।
  3. कट टिप के साथ 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 500 μL स्थानांतरित करें और धीरे से प्लेट के नीचे से जेल मैट्रिक्स गुंबदों को अलग करें।
  4. धीरे से पूरे जेल मैट्रिक्स गुंबदों को पिपेट टिप में एस्पिरेट करें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. ऑर्गेनोइड्स को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखकर ठीक करें।
  6. अगली सुबह, ऑर्गेनोइड्स को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 600 × ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। धीरे से पिपेट के साथ 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान को हटा दें और छोड़ दें। ऑर्गेनोइड्स 2x को 70% इथेनॉल के साथ धोएं।
  7. अंतिम धोने के बाद, ट्यूब से इथेनॉल के 50-100 μL को छोड़कर सभी को हटा दें। ट्यूब को एक तरफ रख दें।
  8. पानी के स्नान में नमूना प्रसंस्करण जेल की एक ट्यूब रखें और जेल को पिघलाने के लिए ~ 30 सेकंड के लिए माइक्रोवेव करें। सुनिश्चित करें कि नमूना प्रसंस्करण जेल जेल की स्थिरता की निगरानी करके उबलता नहीं है।
    नोट: एक बार नमूना प्रसंस्करण जेल पिघल जाता है, लेकिन गर्म नहीं उबलता है, ऑर्गेनोइड्स को समाहित करने के लिए जल्दी से काम करता है।
  9. मोल्ड की पूरी सतह (लगभग 250 μL) को कवर करने के लिए पर्याप्त नमूना प्रसंस्करण जेल स्थानांतरित करें।
  10. जबकि नमूना प्रसंस्करण जेल अभी भी पिघला हुआ है, जल्दी से ऑर्गेनोइड्स युक्त 70% इथेनॉल समाधान के 50 μL को स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि ऑर्गेनोइड्स धंस गए हैं या मोल्ड के निचले हिस्से में धकेल दिए गए हैं।
  11. हिस्टोलॉजी मोल्ड को बर्फ की बाल्टी पर रखें और नमूना प्रसंस्करण जेल को ठंडा और ठोस होने दें।
  12. एक बार नमूना प्रसंस्करण जेल पूरी तरह से सूख जाने के बाद, सावधानीपूर्वक नमूना प्रसंस्करण जेल स्क्वायर को एक नमूना बैग में स्थानांतरित करें, उस विमान का ट्रैक रखते हुए जहां ऑर्गेनोइड स्थित हैं।
  13. फॉर्मेलिन निर्धारणऔर ऊतकों के पैराफिन एम्बेडिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक तरीकों का उपयोग करके बैग को हिस्टोलॉजी कैसेट और प्रक्रिया में रखें।
  14. पैराफिन में निर्धारण और एम्बेडिंग के बाद, माइक्रोटोम19 का उपयोग करके 5 μm अनुभागों में अनुभाग करें। मानक हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला या इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रियाओं के साथ आगे बढ़ें, जैसा कि नीचे उल्लिखित है।

6. हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन धुंधला होना

  1. अनुभागों को निम्नानुसार डीपैराफिनाइज़ करें: जाइलीन, 2 x 10 मिनट; 100% इथेनॉल, 2 x 3 मिनट; 80% इथेनॉल, 3 मिनट; 60% इथेनॉल, 3 मिनट; डीएच2ओ, 2 x 3 मिनट; हेमटोक्सिलिन में 1 मिनट; नल का पानी (3 x 5 सेकंड); ईओसिन में 1 मिनट।
  2. खंडों को निम्नानुसार निर्जलित करें: 60% इथेनॉल, 3 मिनट; 80% इथेनॉल, 3 मिनट; 95% इथेनॉल, 3 मिनट; 100% इथेनॉल, 2 x 3 मिनट; जाइलीन, 2 x 15 मिनट।
  3. माउंटिंग माध्यम का उपयोग करके माउंट करें।

7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. चरण 6.1 में वर्णित अनुभागों को अलग करें।
  2. एंटीजन पुनर्प्राप्ति निष्पादित करें
    1. माइक्रोवेव-सुरक्षित कंटेनर में एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान में स्लाइड्स को डुबोएं।
    2. 20 मिनट के लिए उच्च गर्मी पर माइक्रोवेव करें, 5 मिनट के अंतराल का उपयोग करके यह सुनिश्चित करने के लिए कि घोल उबलता नहीं है।
  3. 20 मिनट एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरण पूरा होने के बाद, स्लाइड्स को एंटीजन पुनर्प्राप्ति बफर में डूबे हुए 40 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा होने दें।
  4. स्लाइड्स को 1x TBST से 3 मिनट के लिए धो लें
  5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए टीबीएसटी में 3% बीएसए में इनक्यूबेट करके स्लाइड को ब्लॉक करें।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
    1. टीबीएसटी में 3% बीएसए में एंटीबॉडी को पतला करें (एबी के आधार पर 1: 50-1: 1,000)।
    2. एक ह्यूमिडिफ़ायर चैंबर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    3. टीबीएसटी के साथ 3 x 5 मिनट धो लें।
  7. द्वितीयक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
    1. एंटीबॉडी को 3% बीएसए (टीबीएसटी में) (1: 250), या 5% सामान्य गधे के सीरम में पतला करें।
    2. अंधेरे में कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, क्योंकि एंटीबॉडी को फ्लोरोफोरे में संयुग्मित किया जाता है।
  8. परमाणु धुंधलापन
    1. टीबीएसटी में पतला 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) 1: 1,000।
    2. आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. टीबीएसटी के साथ 2 x 5 मिनट धो लें।
  9. बढ़ता हुआ
    1. कवरस्लिप को माउंट करने के लिए माउंटिंग माध्यम की एक बूंद का उपयोग करें।
    2. अगले दिन नेल पॉलिश का उपयोग करके कवरस्लिप को सील करें।

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Representative Results

माउस एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की चरण कंट्रास्ट छवियां
हमने डब्ल्यूटी माउस एंडोमेट्रियल एपिथेलियम से ऑर्गेनोइड्स की स्थापना की, जैसा कि संलग्न प्रोटोकॉल में वर्णित है ( चित्रा 1 में आरेख देखें)। माउस एंडोमेट्रियल एपिथेलियम के एंजाइमैटिक पृथक्करण के बाद, उपकला शीट को यांत्रिक रूप से गर्भाशय स्ट्रोमल कोशिकाओं से अलग किया गया और एकल-कोशिका निलंबन उत्पन्न करने के लिए कोलेजनेज के साथ अलग किया गया। यदि सही तरीके से प्रदर्शन किया जाता है, तो उपकला और स्ट्रोमल सेल पृथक्करण की इस विधि को विपरीत सेल प्रकार के 10% -15% से अधिक संदूषण के साथ नमूने प्राप्त करने चाहिए ( चित्रा 2 में इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां देखें)। उपकला कोशिका गोली को तब जेल मैट्रिक्स में फिर से निलंबित किया गया था, कमरे के तापमान पर जेल करने की अनुमति दी गई थी, और ऊतक संवर्धन प्लेटों पर 25 μL गुंबदों में चढ़ाया गया था। जेल मैट्रिक्स गुंबदों के जमने के बाद, उन्हें ऑर्गेनॉइड माध्यम के साथ जोड़ा गया और बढ़ने की अनुमति दी गई। हमने आमतौर पर देखा कि एंडोमेट्रियल उपकला कोशिकाएं 3-4 दिनों के भीतर ऑर्गेनोइड्स में इकट्ठी होती हैं, जैसा कि चित्र 3 में चित्रित किया गया है। ऑर्गेनोइड्स को संस्कृति में बनाए रखा गया था, जिसमें मीडिया परिवर्तन हर 3 दिनों में होते थे, और हर 5-7 दिनों में पास होते थे।

हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग का उपयोग करके माउस एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की इमेजिंग
माउस उपकला ऑर्गेनोइड्स की आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए, हमने नमूना प्रसंस्करण जेल20 का उपयोग करके सेलुलर फाइन नीडल एस्पाइरेट्स के एनकैप्सुलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों को अनुकूलित किया। यह एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड आकृति विज्ञान और एनकैप्सुलेशन को एक मैट्रिक्स में संरक्षित करने की अनुमति देता है जिसे पैराफिन एम्बेडिंग की तैयारी में प्रसंस्करण के अधीन किया जा सकता है। नमूना प्रसंस्करण जेल एक संशोधित एगर है जिसका व्यापक रूप से नैदानिक पैथोलॉजी प्रयोगशालाओं में ठीक सुई एस्पाइरेट्स के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है और इसका उपयोग योनि ऑर्गेनोइड्स21,22 को समाहित करने के लिए किया जाता है। ऑर्गेनॉइड मिश्रण जमने के बाद, इसे संसाधित, दाग और आमतौर पर ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकों के साथ चित्रित किया जा सकता है। चित्रा 4 ए, बी में, हम दिखाते हैं कि सेक्शनेड फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स को हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन दाग द्वारा देखा जा सकता है, जो एपिथेलियम की एकल परत और खोखले केंद्रों-ऑर्गेनोइड्स के लुमेन को प्रदर्शित करते हैं। कुछ ऑर्गेनोइड्स में लुमेन में स्राव भी होता है, यह दर्शाता है कि ऑर्गेनोइड ग्रंथियों के उपकला कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों को प्राप्त करते हैं। हम इम्यूनोस्टेनिंग (चित्रा 4 सी, डी) का उपयोग करके ऑर्गेनोइड्स की कल्पना करने के लिए तकनीकों का भी वर्णन करते हैं; वर्गीकृत एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स को साइटोकेराटिन 8 प्राथमिक एंटीबॉडी (टीआरओएमए -1) और एक फ्लोरोफोरे-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (द्वितीयक एंटी-रैट -594) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। नाभिक को तब DAPI के साथ कल्पना की गई थी, और स्लाइड्स को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। हमने देखा कि ऑर्गेनोइड्स में सभी कोशिकाएं साइटोकेराटिन 8-पॉजिटिव थीं और इसमें डीएपीआई शामिल था, यह दर्शाता है कि एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स का निर्धारण, एम्बेडिंग और प्रसंस्करण एंटीबॉडी-आधारित इम्यूनोस्टेनिंग के साथ संगत है।

आरएनए निष्कर्षण और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण
एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए, हमने डब्ल्यूटी चूहों से एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स को पहले मार्ग के बाद 4 दिनों तक बढ़ने की अनुमति दी। उपचार से पहले शाम को, एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड माध्यम को भुखमरी माध्यम में बदल दिया गया था। ऑर्गेनोइड्स को तब वाहन (इथेनॉल; एस्ट्राडियोल के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधान में समान मात्रा) या 10 एनएम एस्ट्राडियोल (ई 2) के साथ कुल 48 घंटे के लिए तीन प्रतियों (प्रत्येक कुएं में तीन गुंबद) में इलाज किया गया था। 48 घंटे के बाद, माध्यम को हटा दिया गया था, और ऑर्गेनोइड्स को आरएनए निष्कर्षण के लिए संसाधित किया गया था। प्रत्येक कुएं से कुल दो गुंबदों से लगभग 4 μg RNA प्राप्त किया जा सकता है, और cDNA को रिवर्स करने के लिए 1 μg RNA का उपयोग किया गया था। लिपोकेलिन 2 (एलसीएन 2), लैक्टोफेरिन (एलटीएफ) और प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (पीजीआर) को एन्कोडिंग करने वाले जीन का प्रवर्धन वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (चित्रा 5 और तालिका 1) 23,24,25 का उपयोग करके किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, हमने देखा कि 10 एनएम ई 2 (चित्रा 5) के साथ उत्तेजना के बाद उपकला ऑर्गेनोइड्स में एलसीएन 2, एलटीएफ और पीजीआर की अभिव्यक्ति बढ़ गई। इस प्रकार, इन परिणामों से पता चलता है कि एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनोइड्स का उपयोग ई 2 के जवाब में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों को मापने के लिए सफलतापूर्वक किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स स्थापित करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाएं। आरेख उन प्रमुख चरणों को रेखांकित करता है जो माउस एंडोमेट्रियम से उपकला ऑर्गेनोइड्स को स्थापित करने और (बी) पारित करने के लिए पालन किए गए थे। (ए) विधियों में माउस गर्भाशय से एंडोमेट्रियल एपिथेलियम का एंजाइमेटिक और यांत्रिक पृथक्करण शामिल है, इसके बाद एकल-कोशिका फैलाव और एक जेल मैट्रिक्स में उपकला का एनकैप्सुलेशन शामिल है। एंजाइमैटिक पृथक्करण के लिए गर्भाशय के ऊतकों को प्राप्त करने के लिए, अंडाशय और अंडाणुओं को गर्भाशय के सींगों से बारीक कैंची के साथ हटा दिया जाता है, 4-5 मिमी टुकड़ों में पार्श्व रूप से काटा जाता है, और फिर एंजाइम समाधान में रखा जाता है। एंजाइमेटिक इनक्यूबेशन के बाद, एंडोमेट्रियल एपिथेलियम को यांत्रिक रूप से गर्भाशय ट्यूब से एपिथेलियम को "निचोड़ने" के लिए बल और पिपेट का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के तहत अंतर्निहित स्ट्रोमा से अलग किया जाता है। एपिथेलियम को कोलेजनेज में एक छोटी इनक्यूबेशन का उपयोग करके उपकला कोशिकाओं में पचाया जाता है, इसके बाद जेल मैट्रिक्स में एनकैप्सुलेशन होता है। (बी) एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स को पास करने के लिए ठंडे माध्यम में यांत्रिक पृथक्करण और मैट्रिक्स से ऑर्गेनोइड्स को छोड़ने और छोटे ऑर्गेनोइड टुकड़े उत्पन्न करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता होती है। एक बार जब ऑर्गेनोइड्स को मैट्रिक्स से छोड़ दिया जाता है और यांत्रिक रूप से छोटे टुकड़ों में अलग कर दिया जाता है, तो उन्हें मैट्रिक्स में समझाया जाता है और रिप्लेट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पृथक एंडोमेट्रियल एपिथेलियम और स्ट्रोमल सेल आबादी का इम्यूनोस्टेनिंग। इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां गर्भाशय के एंजाइमेटिक और यांत्रिक पृथक्करण के बाद (ए, बी) उपकला कोशिका और (सी, डी) स्ट्रोमल सेल अंशों के उपकला और स्ट्रोमल सेल आबादी दिखाती हैं। साइटोकेराटिन 8 (एक उपकला कोशिका मार्कर) लाल रंग में दिखाया गया है, विमेंटिन (एक स्ट्रोमल सेल मार्कर) हरे रंग में दिखाया गया है, और डीएपीआई (एक परमाणु मार्कर) नीले रंग में दिखाया गया है। स्केल सलाखों = 100 μm (A, C), 20 μm (B, D)। संक्षेप: सीके 8 = साइटोकेराटिन 8; वीआईएम = विमेंटिन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: 4 दिनों के दौरान डब्ल्यूटी चूहों से एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स का गठन। एंडोमेट्रियल एपिथेलियम को डब्ल्यूटी माउस से अलग किया गया था और ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया था। (ए) पाचन के तुरंत बाद जेल मैट्रिक्स में उपकला कोशिकाओं की चरण कंट्रास्ट छवि (दिन 0)। (बी, सी) संस्कृति के दिन 1 (बी) और दिन 2 (सी) पर कुछ छोटे ऑर्गेनोइड देखे जा सकते हैं। (डी) बड़े और परिपक्व उपकला ऑर्गेनोइड्स को संस्कृति के दिन 3 पर देखा जा सकता है। छवियों को 5x उद्देश्य के साथ कैप्चर किया गया था; स्केल सलाखों = 200 μm. संक्षिप्त नाम: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
(ए, बी) एफएफपीई एंडोमेट्रियल एपिथेलियल ऑर्गेनोइड्स को एच एंड ई के साथ वर्गीकृत और दाग दिया गया था। (सी, डी) एफएफपीई उपकला ऑर्गेनोइड उपकला कोशिका मार्कर साइटोकेराटिन 8 (लाल) के साथ इम्यूनोस्टेन्ड थे। सेल नाभिक DAPI (नीले) से सना हुआ था। स्केल सलाखों = 200 μm (A), 100 μm (C), 50 μm (B, D)। संक्षिप्तीकरण: एफएफपीई = फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड; एच एंड ई = हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन; सीके 8 = साइटोकेराटिन 8; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: माउस एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। डब्ल्यूटी चूहों से माउस एंडोमेट्रियल एपिथेलियल ऑर्गेनोइड्स को ऑर्गेनॉइड विकास माध्यम में 4 दिनों के लिए संवर्धित किया गया था, इसके बाद डीएमईएम / एफ 12 में 48 घंटे के लिए वाहन या 10 एनएम ई 2 के साथ उपचार किया गया था, जिसमें 2% लकड़ी का कोयला-छीन एफबीएस के साथ पूरक किया गया था। (ए, बी) वाहन (ए) या 10 एनएम ई 2 (बी) के साथ उपचार के बाद डब्ल्यूटी माउस ऑर्गेनोइड्स की चरण कंट्रास्ट छवियां। (C-E) वाहन या 10 एनएम ई 2 के साथ इलाज किए गए उपकला एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स का वास्तविक समय क्यूपीसीआर विश्लेषण। ई 2-विनियमित जीन, लिपोकेलिन 2 (एलएनसी 2), लैक्टोफेरिन (एलटीएफ), और प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (पीजीआर) की अभिव्यक्ति। सलाखों का मतलब एसईएम ± प्रतिनिधित्व करता है, जिसका विश्लेषण दो पूंछ वाले टी-टेस्ट द्वारा किया जाता है; *p < 0.033, **p < 0.002, **p < 0.001. प्रति स्थिति एन = 3 डब्ल्यूटी चूहों से प्राप्त ऑर्गेनोइड्स के साथ दोहराया जाता है। स्केल सलाखों = 200 μm (A, B)। संक्षिप्तीकरण: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; ई 2 = एस्ट्राडियोल; qPCR = मात्रात्मक पीसीआर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्राइमर अनुक्रम आगे (5'-3') रिवर्स (5'-3')
लिपोकेलिन 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
लैक्टोफेरिन (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTGT ACCCACTTTTCTCTCCTCGTTC
प्रोजेस्टेरोन (पीजीआर) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
ग्लिसराल्डिहाइड 3 फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (गैपध) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCCTCT
पीसीआर मिश्रण में शामिल हैं:
2x SYBR ग्रीन
0.5 μM Fwd Primer
0.5 μM Rev Primer
सीडीएनए
DNASe-मुक्त H2O
साइकिल चलाने की स्थिति:
तापमान समय चक्र
पकड 95 °C 10 मिनट 1
प्रकृति 95 °C 15 s 40
पसार 60 °C 60 s

तालिका 1: प्राइमर अनुक्रम और पीसीआर स्थितियां।

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Discussion

यहां, हम माउस एंडोमेट्रियम से एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन करते हैं और प्रोटोकॉल नियमित रूप से उनके डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाते हैं। एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स उन तंत्रों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं जो एंडोमेट्रियोसिस, एंडोमेट्रियल कैंसर और आरोपण विफलता जैसे एंडोमेट्रियल से संबंधित बीमारियों को नियंत्रित करते हैं। 2017 में प्रकाशित लैंडमार्क अध्ययनों ने माउस और मानव उपकला 4,5 से एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की दीर्घकालिक और नवीकरणीय संस्कृतियों की संस्कृति की स्थितियों की सूचना दी। यद्यपि ऑर्गेनोइड्स का व्यापक रूप से अन्य प्रणालियों में जैविक मार्गों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है, लेकिन संस्कृति 26 में गैर-रूपांतरित प्राथमिक उपकला का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल की अनुपस्थिति से विट्रो में एंडोमेट्रियल ऊतक का अध्ययन सीमित हो गया है। मानव और माउस एंडोमेट्रियम से प्राप्त एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स को आमतौर पर आंत, गुर्दे और फेफड़ों जैसे अन्य अंग ऊतकों से ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए उपयोग की जाने वाली स्थितियों का उपयोग करके और जेल मैट्रिक्स4 से बने बाह्य मैट्रिक्स पाड़ में एम्बेड करके सफलतापूर्वक स्थापित किया गया था। इन प्रारंभिक रिपोर्टों के बाद से, एंडोमेट्रियम के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स का उपयोग वैज्ञानिक समुदाय में काफी बढ़ गया है।

माउस गर्भाशय27,28 से उपकला अलगाव की पहले प्रकाशित विधि को संशोधित करके, यह प्रोटोकॉल विशिष्ट रूप से ऊतक को सीधे एंजाइम समाधान में रखकर माउस गर्भाशय को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डालता है, गर्भाशय को सही करने की आवश्यकता को दरकिनार करता है, या निस्पंदन का उपयोग करता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने ~ 85% -90% शुद्धता के साथ उपकला प्राप्त की, जैसा कि साइटोकेराटिन 8 और विमेंटिन इम्यूनोस्टेनिंग (चित्रा 2) द्वारा निर्धारित किया गया है। यह प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड्स के उत्पादन, रखरखाव और पासिंग के लिए विकास मैट्रिक्स में पृथक उपकला कोशिकाओं के एनकैप्सुलेशन के लिए प्रमुख विवरणों को स्पष्ट रूप से रेखांकित करता है। चित्रा 4 और हमारे अप्रकाशित अध्ययनों में छवियों ने हमारे ऑर्गेनोइड संस्कृतियों में म्यूसिन और ग्रंथियों की कोशिकाओं (यानी, FOXA2-पॉजिटिव) की उपस्थिति की पहचान कीहै। इनसे संकेत मिलता है कि यहां प्रस्तुत विधि माउस एंडोमेट्रियम से ग्रंथियों और ल्यूमिनल-उपकला कोशिका आबादी दोनों के अलगाव के लिए प्रभावी है।

इन ऑर्गेनोइड्स के विकास के लिए प्रमुख सीमाओं में वाणिज्यिक मैट्रिक्स (यानी, मैट्रिगेल) का उपयोग शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप बैच-टू-बैच भिन्नताएं हो सकती हैं और इसमें विकास कारक शामिल हैं जो ऑर्गेनोइड विकास को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, जबकि इन ऑर्गेनोइड्स में शुद्ध गर्भाशय उपकला होती है, अतिरिक्त एंडोमेट्रियल सेल प्रकारों (यानी, प्रतिरक्षा, स्ट्रोमल) का उपयोग हाल ही में एंडोमेट्रियम 8,30 के मानव ऑर्गेनोइड सिस्टम में वर्णित किया गया है। अन्य समूहों ने माउस गर्भाशय14 से ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के लिए ल्यूमिनल और ग्रंथियों के उपकला कोशिकाओं दोनों को अलग करने की क्षमता दिखाई है।

यह दृष्टिकोण एक छोटे से पशु मॉडल से ऊतकों का उपयोग करता है जो अपेक्षाकृत सामान्य है और अधिकांश शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध है; बड़े पशु मॉडल, या मनुष्यों से एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड उत्पन्न करना, नैतिक या तकनीकी चुनौतियां पैदा कर सकता है, जिसे प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) आधारित तकनीकों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। इस तरह की प्रौद्योगिकियों को पहले एंडोमेट्रियल ऊतकों31, प्रजनन पथ के अन्य ऊतकों32 के लिए वर्णित किया गया है और विट्रो33 में एंडोमेट्रियल / प्लेसेंटल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए प्रभावी ढंग से उपयोग किया गया है। इसलिए, मनुष्यों और अन्य बड़े-पशु मॉडल से एंडोमेट्रियम के एंडोमेट्रियल स्ट्रोमल और उपकला कोशिकाओं के स्रोत के रूप में आईपीएससी का उपयोग एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक नवीकरणीय और सुलभ स्रोत है।

जबकि माउस आरोपण के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मॉडल है, चूहों और मनुष्यों के बीच आरोपण के तंत्र में महत्वपूर्ण विकासात्मक अंतर हैं जिन्हें ध्यान दिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, जबकि अंतरालीय आरोपण को अंतर्निहित स्ट्रोमा में ल्यूमिनल एपिथेलियम के माध्यम से गहरे ट्रोफोब्लास्टिक आक्रमण की विशेषता है, आक्रमण प्रक्रिया का तंत्र चूहों और प्राइमेट्स34 के बीच भिन्न होता है। चूहों में, ल्यूमिनल एपिथेलियम के माध्यम से ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण में एपोप्टोसिस या एंटोसिस35,36 शामिल होता है, जबकि ट्रोफोब्लास्ट्स प्राइमेट्स34,35 में अंतर्निहित स्ट्रोमा में ल्यूमिनल एपिथेलियम के बीच पलायन करते हैं।

स्व-संयोजन और दीर्घकालिक नवीकरण का समर्थन करने के लिए आवश्यक विकास कारकों के साथ एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड प्रदान करना एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है जो देशी ऊतक को पुन: उत्पन्न करते हैं। एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स के लिए जटिल मीडिया संरचना कई सिग्नलिंग मार्गों को इंगित करती है जो उपकला कोशिका विशेषताओं में योगदान करते हैं, और पैराक्रिन और ऑटोक्राइन दोनों स्रोतों से उत्पन्न होंगे। एंडोमेट्रियम का स्ट्रोमल कम्पार्टमेंट कई सेल प्रकारों की एक जटिल विधानसभा है, जिसमें फाइब्रोब्लास्ट जैसी स्ट्रोमल कोशिकाएं, एंडोथेलियम, मैक्रोफेज और अन्य विशेष प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं जो एस्ट्रोजेन और प्रोजेस्टेरोन37 के जवाब में लगातार बदल रही हैं।

उदाहरण के लिए, ऑर्गेनोइड कल्चर माध्यम में ऐसे कारक होते हैं जो ऑर्गेनोइड्स में डब्ल्यूएनटी / β-कैटेनिन सिग्नलिंग को सक्रिय करते हैं, जैसे कि डब्ल्यूएनटी 3 ए और आर-स्पोंडिन। चूहों में अध्ययन से पता चला है कि डब्ल्यूएनटी लिगेंड गर्भाशय के विकास और ग्रंथियों के कार्य के लिए महत्वपूर्ण हैं; इसलिए, इस सिग्नलिंग मार्ग का सक्रियण ऑर्गेनोइड विकास और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है38,39। आर-स्पोंडिन डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग को बढ़ाता है और ल्यूसीन युक्त रिपीट-युक्त जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (एलजीआर 5)40 का लिगैंड है। एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर β (टीजीएफ) और बोन मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) सिग्नलिंग मार्गों के निषेध की भी आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड कल्चर माध्यम में बीएमपी अवरोधक, नोगिन, एक स्रावित प्रोटीन होता है जो बीएमपी 2, बीएमपी 4 और बीएमपी 741 को बांधता है और निष्क्रिय करता है। औषधीय अवरोधक, ए 83-01, एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड माध्यम में भी मौजूद है। ए 83-01 रिसेप्टर्स एएलके 4, एएलके 5 और एएलके 742 के लिए उच्च विशिष्टता के साथ एक छोटा अणु अवरोधक है। एएलके 4/5/7 टीजीएफ सिग्नलिंग परिवार के टाइप 1 रिसेप्टर्स हैं जो टीजीएफ, एक्टिविन या नोडल जैसे लिगेंड द्वारा प्राप्त संकेतों को बांधते हैं और संचारित करते हैं। बीएमपी सिग्नल आंत 43 औरबालों के रोम44 जैसे ऊतकों में स्टेम सेल रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण हैं। टीजीएफ सिग्नलिंग का निषेध एंडोमेट्रियल मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं45 की प्रोलिफेरेटिव क्षमता और कॉलोनी-गठन दक्षता में योगदान देता है, जो क्रोमैटिन46 में प्रमुख क्षेत्रों को रीमॉडेलिंग करके होता है। इस प्रकार, इन दो प्रमुख सिग्नलिंग मार्गों, बीएमपी और टीजीएफ का मॉड्यूलेशन, आत्म-नवीकरण क्षमता के साथ ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए आवश्यक है।

यद्यपि यहां प्रदर्शित नहीं किया गया है, हमने पाया कि एएलके 4/5/7 अवरोधक, ए 83-01 के साथ माउस ऑर्गेनोइड्स की दीर्घकालिक संस्कृति ने तीन या चार निरंतर मार्गों के बाद उपकला ऑर्गेनोइड्स में रूपात्मक परिवर्तन किए (क्रिसमैन एट अल। उपकला ऑर्गेनोइड्स में रूपात्मक परिवर्तन बोरेटो एट अल.4 द्वारा वर्णित "घने" उपकला ऑर्गेनोइड्स की याद दिलाते थे, जहां डब्ल्यूएनटी लिगेंड के पैराक्राइन स्राव में कमी के कारण अधिक स्रावी जैसी कोशिकाओं का विकास हुआ। इस प्रकार, यह संभावना है कि टीजीएफ और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनॉइड पुनर्जनन और भेदभाव को नियंत्रित करने के लिए प्रतिच्छेद करते हैं।

हाल के अध्ययनों ने मानव ऊतकों 7,8,16 से 3 डी एंडोमेट्रियल उपकला / स्ट्रोमल सह-संस्कृति प्रणाली उत्पन्न की है। सह-संवर्धन की एक विधि एक पाड़-मुक्त प्रणाली का उपयोग करती है, जिसमें एंडोमेट्रियल उपकला और स्ट्रोमल कोशिकाओं को जोड़ा जाता है और एक परिभाषित संस्कृति माध्यम का उपयोग करके पाड़-मुक्त कुएं में 3 डी संरचनाओं में इकट्ठा करने की अनुमति दी जाती है। स्ट्रोमल ऑर्गेनोइड्स न केवल एस्ट्रोजेन, प्रोजेस्टेरोन और एण्ड्रोजन के लिए रिसेप्टर्स को व्यक्त करते हैं, बल्कि डिम्बग्रंथि हार्मोन - एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन 6,7 की प्रतिक्रिया को भी ईमानदारी से पुन: उत्पन्न करते हैं। रॉलिंग्स एट अल द्वारा एक अध्ययन में उपयोग की जाने वाली एक अन्य सह-संवर्धन विधि में, एंडोमेट्रियल उपकला ऑर्गेनोइड्स को कोलेजन मैट्रिक्स में स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ जोड़ा जाता है और एक संशोधित ऑर्गेनोइड माध्यम8 में उगाया जाता है। ये उपकला / स्ट्रोमल सह-सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड, या असेंबलोइड, एक निलंबित 3 डी-सिस्टम में व्यवस्थित होते हैं, जहां स्ट्रोमल कोशिकाएं उपकला ग्रंथि जैसी संरचनाओं को घेरती हैं।

एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स के अधिकांश विकास-कारक कम जेल मैट्रिक्स में सुसंस्कृत होते हैं; हालांकि, मैट्रिक्स में सक्रिय यौगिकों की उपस्थिति ऑर्गेनोइड्स के भीतर अवांछित सेलुलर प्रतिक्रियाओं को बढ़ा सकती है। इस सीमा को दूर करने के लिए, ऑर्गेनोइड्स को जेल मैट्रिक्स-मुक्त मचानों में स्थापित किया गया है, जैसे कि 3 डी मुद्रित अगारोस मोल्ड जिसमें व्यक्तिगत ऑर्गेनोइड्स को स्वयं-इकट्ठा करने की अनुमति है। अन्य समूहों ने एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स 47 की संस्कृति के लिए 3 डी मैट्रिसेस के रूप में काम करने के लिए सिंथेटिक हाइड्रोगेल विकसितकिए हैं। ये ऑर्गेनोइड्स एपिकोबेसल ध्रुवीयता के साथ 3 डी संरचनाओं में इकट्ठा होते हैं और जटिल ऑर्गेनोइड्स बनाने के लिए एंडोमेट्रियम के स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ भी जोड़ा जा सकताहै। चूंकि ऑर्गेनोइड्स का उपयोग गैर-रूपांतरित प्राथमिक मानव और माउस एंडोमेट्रियल ऊतकों को उन तरीकों से संवर्धन के लिए सफलतापूर्वक किया जा सकता है जो 2 डी सेल संस्कृतियां नहीं कर सकती हैं, इसमें कोई संदेह नहीं है कि एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड महिलाओं के प्रजनन स्वास्थ्य के क्षेत्र को आगे बढ़ाएंगे और प्रजनन विकृति जैसे आवर्तक गर्भावस्था के नुकसान, एंडोमेट्रियोसिस और एंडोमेट्रियल कैंसर का अध्ययन करने के लिए एक अविश्वसनीय उपकरणहोंगे। 49,50.

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम डॉ स्टेफ़नी पंगास और डॉ मार्टिन एम माटज़ुक (एमएमएम) को हमारी पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादन के लिए धन्यवाद देते हैं। अध्ययनों को यूनिस कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट अनुदान आर00-एचडी096057 (डीएम), आर01-एचडी105800 (डीएम), आर01-एचडी032067 (एमएमएम), और आर01-एचडी110038 (एमएमएम), और एनसीआई-पी 30 कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट (एनसीआई-सीए125123) द्वारा समर्थित किया गया था। डायना मोनसिवाइस, पीएचडी बरोज वेलकम फंड से नेक्स्ट जेन प्रेग्नेंसी अवार्ड रखती हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT

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Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z.,… More

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).

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