Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Создание 3D-органоидов эндометрия из мышиной матки

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64448
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

Summary

Этот протокол описывает методологии установления эпителиальных органоидов эндометрия мышей для экспрессии генов и гистологического анализа.

Abstract

Ткань эндометрия выстилает внутреннюю полость матки и находится под циклическим контролем эстрогена и прогестерона. Это ткань, которая состоит из просветного и железистого эпителия, стромального компартмента, сосудистой сети и сложной популяции иммунных клеток. Мышиные модели были мощным инструментом для изучения эндометрия, выявляя критические механизмы, которые контролируют имплантацию, плацентацию и рак. Недавняя разработка 3D-культур органоидов эндометрия представляет собой современную модель для анализа сигнальных путей, лежащих в основе биологии эндометрия. Создание органоидов эндометрия из генетически модифицированных моделей мышей, анализ их транскриптомов и визуализация их морфологии с одноклеточным разрешением являются важнейшими инструментами для изучения заболеваний эндометрия. В этой статье описываются методы создания 3D-культур эпителия эндометрия у мышей и описываются методы количественной оценки экспрессии генов и анализа гистологии органоидов. Цель состоит в том, чтобы предоставить ресурс, который может быть использован для установления, культивирования и изучения экспрессии генов и морфологических характеристик эпителиальных органоидов эндометрия.

Introduction

Эндометрий - внутренняя слизистая оболочка полости матки - является уникальной и очень динамичной тканью, которая играет решающую роль в репродуктивном здоровье женщины. В течение репродуктивной жизни эндометрий обладает потенциалом для прохождения сотен циклов пролиферации, дифференцировки и распада, координируемых согласованным действием гормонов яичников - эстрогена и прогестерона. Исследования генетически модифицированных мышей выявили основные биологические механизмы, лежащие в основе реакции эндометрия на гормоны и контроля имплантации эмбриона, децидуализации стромальных клеток и беременности1. Исследования in vitro, однако, были ограничены из-за трудностей в поддержании нетрансформированных первичных тканей эндометрия мыши в традиционных 2D клеточных культурах 2,3. Последние достижения в культуре тканей эндометрия как 3D-систем органов или органоидов представляют собой новую возможность исследовать биологические пути, которые контролируют регенерацию и дифференцировку клеток эндометрия. Органоидные системы эндометрия мышей и человека были разработаны из чистого эпителия эндометрия, инкапсулированного в различные матрицы 4,5, в то время как эндометрий человека культивировался как эпителиальные/стромальные кокультуры без каркаса 6,7, а в последнее время как коллаген-инкапсулированные эпителиальные/стромальные ассамблоиды8 . Рост и регенеративный потенциал эпителиальных органоидных культур поддерживается определенным коктейлем факторов роста и ингибиторов малых молекул, которые были эмпирически определены для максимизации роста и регенерации органоидов 4,5,9. Кроме того, способность замораживать и размораживать органоиды эндометрия позволяет долгосрочно хранить органоиды эндометрия у мышей и людей для будущих исследований.

Генетически модифицированные мыши выявили сложные сигнальные пути, которые контролируют раннюю беременность и децидуализацию, и были использованы в качестве моделей потери беременности, рака эндометрия и эндометриоза. Эти генетические исследования были в значительной степени достигнуты с помощью клеточно-специфической делеции боковых аллелей loxP («floxed») с использованием cre recombinases, которые особенно активны в женских репродуктивных тканях. Эти мышиные модели включают широко используемый рецептор прогестерона-cre10, который обладает сильной активностью рекомбиназы в эпителиальных и стромальных тканях эндометрия, лактоферрин i-cre, который индуцирует рекомбинацию эпителия эндометрия у взрослых мышей11, или Wnt7a-cre, который вызывает эпителиально-специфическую делецию в тканях Мюллера12 . Культивирование тканей эндометрия из генетически модифицированных моделей мышей в качестве 3D-органоидов предоставило отличную возможность исследовать биологию эндометрия и облегчить идентификацию факторов роста и сигнальных путей, которые контролируют обновление и дифференцировку клеток эндометрия13,14. Методы выделения и культивирования тканей эндометрия мышей описаны в литературе и сообщают об использовании различных ферментативных стратегий выделения эпителия матки для последующего культивирования органоидов эпителия эндометрия4. В то время как предыдущая литература обеспечивает критическую основу для протоколов 4,5,6 эпителиальных органоидных культур эндометрия, эта статья предоставляет четкий, всеобъемлющий метод генерации, поддержания, обработки и анализа этих органоидов. Стандартизация этих методов имеет важное значение для ускорения прогресса в области репродуктивной биологии женщин. Здесь мы сообщаем подробную методику ферментативной и механической очистки эпителиальной ткани эндометрия мыши для последующей культивирования органоидов эндометрия в каркасе гелевой матрицы. Мы также описываем методологии последующего гистологического и молекулярного анализа инкапсулированных гелевой матрицей эпителиальных органоидов эндометрия мыши.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Обращение с мышами и экспериментальные исследования проводились в соответствии с протоколами, одобренными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского колледжа Бейлора, и руководящими принципами, установленными Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Выделение эпителия матки у мышей ферментативными и механическими методами

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются шаги, необходимые для установления, прохождения, замораживания и размораживания эпителиальных органоидов эндометрия у мышей с использованием каркаса гелевой матрицы. Предыдущие исследования определили, что оптимальные культуры органоидов эндометрия мыши устанавливаются у мышей во время фазы течки4, что может быть определено путем цитологического исследования вагинального тампона15. Для всех экспериментов использовались взрослые самки мышей WT (6-8 недель, гибридные C57BL/6J и 129S5/SvEvBrd). Мышей гуманно усыпляли в соответствии с одобренными IACUC руководящими принципами с использованием седации изофлурана с последующей дисартикуляцией шейки матки. После того, как мыши усыплены, следует выполнить следующие шаги. Подробную информацию о материалах и решениях , используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов.

  1. Дайте гелевой матрице оттаять на льду примерно за 1-2 ч перед использованием.
  2. Чтобы рассечь мышь, используйте ножницы, чтобы сделать разрез средней линии на животе и аккуратно отшелушить кожу, чтобы обнажить нижележащий перитонеальный слой. Используйте щипцы, чтобы удерживать брюшиный слой и делать боковые разрезы ножницами, чтобы обнажить брюшное содержимое.
    1. Найдите рога матки, осторожно отодвинув брюшные жировые подушечки в сторону. Рассекните их, сначала удерживая их в шейном соединении и используя ножницы, чтобы разрезать вдоль брыжеечного жира. После рассечения матки мыши тщательно удалите жировую ткань из рога матки небольшими ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте стерильность во время изоляции клеток, стерилизуя все хирургические инструменты перед использованием, опрыскивайте брюшную полость мыши 70% этанолом и выполняйте все шаги после рассечения под стерильной культуральной оболочкой ткани.
  3. Разрежьте каждый рог матки на небольшие фрагменты, каждый размером примерно 4-5 мм.
  4. Поместите все фрагменты матки из одной матки в одну лунку из 24-луночной пластины, содержащей 0,5 мл 1% трипсина. Позвольте ферментативному раствору проникнуть в просвет матки, вызывая ферментативное отделение эпителия эндометрия от нижележащей стромы.
  5. Инкубируйте 24-луночную пластину в инкубаторе увлажненной культуры тканей при температуре 37 °C в течение приблизительно 1 ч.
  6. После инкубации в течение 1 ч перенесите фрагменты матки на 35-миллиметровую пластину культуры ткани, содержащую 1 мл фосфатно-буферного раствора (DPBS) Дульбекко.
  7. Под рассеченным микроскопом используйте тонкие щипцы и пипетку 1 мл, чтобы механически отделить эпителий матки от маточной трубы. Удерживая щипцами один конец фрагмента матки, осторожно проведите кончиком пипетки продольно по фрагменту, выдавив эпителий из другого конца маточной трубы. Наблюдают за отделенными эпителиальными листами от фрагмента матки под рассеченным микроскопом.
  8. Используйте пипетку 1 мл, чтобы собрать и аккуратно перенести эпителиальные листы в трубку объемом 1,5 мл.
  9. Повторите процесс для оставшихся фрагментов матки, перенеся все эпителиальные листы в одну и ту же коллекторную трубку.
  10. Гранулируют диссоциированные эпителиальные листы центрифугированием в течение 5 мин при 375 × г.
  11. Осторожно удалите супернатант, чтобы не потревожить гранулу клетки.
  12. Повторно суспендировать клеточную гранулу в 0,5 мл 2,5 мг/мл коллагеназы + 2 мг/мл раствора ДНКазы. Пипетка вверх и вниз примерно в 10 раз, или до тех пор, пока не будет достигнута одноэлементная суспензия.
  13. Добавьте 0,5 мл DMEM/F12 + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) + антибиотики и центрифугируйте клетки в течение 5 мин при 375 × г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации об антибиотике широкого спектра действия, используемом для клеточной культуры, обратитесь к Таблице материалов.
  14. Осторожно удаляют супернатант и повторно суспендируют клетки в 1 мл DMEM/F12 + 10% FBS + антибиотики. Центрифугируют клетки в течение 5 мин при 375 × г.

2. Обработка стромального отсека

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются протоколы, необходимые для изоляции стромального компартмента эндометрия мыши. Учитывая растущий интерес к экспериментам с эпителиальной / стромальной кокультурой, важно иметь возможность обрабатывать популяции стромальных клеток в дополнение к эпителиальным клеткам, которые будут генерировать органоиды.

  1. После того, как весь эпителий был ферментативно и механически отделен от фрагментов матки, оставшиеся трубчатые структуры являются «стромальными / миометриальными» отсеками. Соберите эту ткань в 2,5 мг/мл коллагеназы + 2 мг/мл ДНКазы в растворе HBSS.
  2. Инкубируйте стромальный/миометриальный образец на шейкере с температурой 37 °C в течение 15 мин.
  3. После инкубации добавьте 500 мкл DMEM/F12 + 10% FBS + антибиотиков на мышь и фильтруйте недиссоциированные фрагменты через клеточный фильтр 40 мкм.
  4. Гранулируют клетки центрифугированием в течение 5 мин при 375 × г.
  5. Осторожно удаляют надосадочный агент и повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл DMEM/F12 + 10% FBS + антибиотики. Добавьте смесь по каплям в 10 мл DMEM/F12 + 10% FBS + антибиотиков в 10 см клеточную культуральную пластину. Инкубируют пластину при 37 °C в увлажненном инкубаторе клеточной культуры.
  6. Для получения кокультур эпителиальных и стромальных клеток эндометрия мыши следуйте методам, описанным для органоидов эндометрия человека, с использованием бесконтактных или коллагеновых матричных систем 6,8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя эти методы еще не были опубликованы для мышей, они могут быть адаптированы на основе опубликованных протоколов с эндометрием человека.

3. Инкапсуляция эпителия матки в гель-матрицу для установления органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Держите гелевую матрицу на льду до тех пор, пока она не будет готова к использованию.

  1. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в объеме гелевой матрицы, который в 20 раз больше, чем у клеточной гранулы (т. Е. Если ячейка гранулы составляет 20 мкл, повторно суспендируйте клетки 400 мкл гелевой матрицы). Тщательно повторно суспендируйте гранулы, чтобы избежать введения пузырьков.
  2. Дайте суспензии гелевой матрицы/ячейки осесть при комнатной температуре в течение ~10 мин.
  3. Как только гелевая матрица/клеточная суспензия станет полутвердым гелем, используйте микропипетку P200 с широким отверстием 200 мкл, чтобы аккуратно аспирировать 25 мкл гелевой матрицы/клеточной суспензии. Дозируйте три отдельных купола по 25 мкл на лунку 12-луночной пластины и дайте гелевой матрице отверждаться в течение 15 минут в инкубаторе культуры увлажненной ткани при температуре 37 °C.
  4. После того, как гелевая матрица отверждается, добавьте 750 мкл органоидной среды к каждой скважине, содержащей купола гелевой матрицы. Инкубировать при 37 °C в инкубаторе культуры увлажненной ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидная среда рецептура отмечена в Таблице материалов. Органоиды обычно образуются в течение 4 дней после первоначальной культивирования.

4. Анализ экспрессии генов органоидов эндометрия после лечения эстрадиолом

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются методы, используемые для профилирования экспрессии генов эпителиальных органоидов эндометрия с использованием qPCR в режиме реального времени после лечения эстрадиолом (E2; см. Таблицу 1). Поскольку эндометрий находится под циклическим контролем гормона яичников E2, тестирование реакции органоидов на E2 является важной мерой физиологической функции. Мы получили высококачественную РНК и сгенерировали достаточное количество мРНК для профилирования экспрессии генов с использованием qPCR и / или секвенирования РНК из наших органоидов эпителия эндометрия. В этом разделе описывается, как собирать органоиды и обрабатывать их для последующего анализа экспрессии генов. Выбранная среда для лечения отражает ту, которая используется для лечения культивируемых клеток эндометрия. Однако следует отметить, что эта лечебная среда может быть оптимизирована соответствующим образом, как это делается для обработки 3D-культур эндометрия человека гормонами 8,16,17.

  1. Культивируйте органоиды эндометрия, как описано выше.
  2. Удалите органоидную среду и замените ее 750 мкл голодной среды через четыре дня после посева. Инкубировать на ночь.
  3. На следующее утро удалите среду голодания. Добавить 750 мкл среды для обработки, содержащей либо транспортное средство, либо 10 нМ Е2. Инкубировать в течение 48 ч.
  4. Продолжайте изоляцию РНК в соответствии с протоколом производителя комплекта.

5. Гистологический анализ органоидов эндометрия

ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация морфологических особенностей органоидов эндометрия имеет решающее значение для оценки клеточного эффекта факторов роста, генетических манипуляций или ингибиторов малых молекул. В этом разделе описываются методы, используемые для фиксации, обработки и изображения эпителиальных органоидов эндометрия с использованием гистологических пятен и иммунофлуоресцентного окрашивания антителами.

  1. Приготовьте 1,5 мл микроцентрифужных пробирок, содержащих 1 мл 4% параформальдегида в 1x PBS. Поместите их на лед.
  2. Аспирировать среду из лунок 12-луночной пластины, содержащей органоиды.
  3. Используя наконечник пипетки объемом 1 мл с разрезанным наконечником, перенесите 500 мкл 4% параформальдегида в каждую лунку и аккуратно отсоедините купола гелевой матрицы от нижней части пластины.
  4. Аккуратно аспирируйте все купола гелевой матрицы в наконечник пипетки и переложите в трубку микроцентрифуги объемом 1,5 мл.
  5. Зафиксируйте органоиды, поместив их на ротатор при 4 °C в течение ночи.
  6. На следующее утро центрифугируют пробирку при 600 × г в течение 5 мин, чтобы гранулировать органоиды. Аккуратно удалить 4% раствор параформальдегида пипеткой и выбросить. Промыть органоиды в 2 раза 70% этанолом.
  7. После последней промывки удалите из пробирки все, кроме 50-100 мкл этанола. Отложите трубку в сторону.
  8. Поместите тюбик с гелем для обработки образца на водяную баню и микроволновую печь в течение ~ 30 с, чтобы расплавить гель. Убедитесь, что гель для обработки образца не закипает, контролируя консистенцию геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как гель для обработки образца расплавлен, но не закипит горячим, работайте быстро, чтобы инкапсулировать органоиды.
  9. Перенесите достаточное количество геля для обработки образца, чтобы покрыть всю поверхность формы (примерно 250 мкл).
  10. Пока гель для обработки образца все еще расплавлен, быстро переносят 50 мкл 70% раствора этанола, содержащего органоиды. Убедитесь, что органоиды затонули или подтолкнули к нижней части формы.
  11. Поместите гистологическую форму на ведро со льдом и дайте гелю для обработки образца остыть и затвердеть.
  12. Как только гель для обработки образца полностью высохнет, осторожно перенесите квадрат геля для обработки образца в мешок для образца, отслеживая плоскость, в которой расположены органоиды.
  13. Поместите мешок в гистологическую кассету и обработайте с помощью стандартных методов, используемых для фиксации формалина и парафинового встраивания тканей18.
  14. После фиксации и встраивания в парафин, сечение на 5 мкм с помощью микротома19. Продолжайте стандартные процедуры окрашивания гематоксилина и эозина (H & E) или иммуноокрашивания, как описано ниже.

6. Окрашивание гематоксилином и эозином

  1. Депарафинизировать срезы следующим образом: ксилол, 2 х 10 мин; 100% этанол, 2 х 3 мин; 80% этанол, 3 мин; 60% этанол, 3 мин; dH2O, 2 x 3 мин; 1 мин - гематоксилин; водопроводная вода (3 x 5 с); 1 мин - эозин.
  2. Обезвоживать срезы следующим образом: 60% этанол, 3 мин; 80% этанол, 3 мин; 95% этанол, 3 мин; 100% этанол, 2 х 3 мин; ксилол, 2 x 15 мин.
  3. Монтаж с помощью монтажного носителя.

7. Иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Депарафинизируйте разделы, как описано в шаге 6.1.
  2. Извлечение антигена
    1. Погрузите слайды в раствор для извлечения антигена в контейнер, безопасный для микроволновой печи.
    2. Микроволновая печь на сильном огне в течение 20 минут, используя интервалы 5 минут, чтобы убедиться, что раствор не закипит.
  3. После завершения 20-минутного этапа извлечения антигена дайте слайдам остыть на льду в течение 40 минут, все еще погружаясь в буфер извлечения антигена.
  4. Мойте слайды с 1x TBST в течение 3 минут
  5. Блокируют слайды путем инкубации в 3% BSA в TBST в течение 1 ч при комнатной температуре.
  6. Первичная инкубация антител
    1. Разводят антитела в 3% BSA в TBST (1:50-1:1000, в зависимости от Ab).
    2. Инкубировать в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
    3. Стирайте 3 x 5 мин с TBST.
  7. Инкубация вторичных антител
    1. Разводят антитела в 3% BSA (в TBST) (1:250) или в 5% нормальной ослиной сыворотке.
    2. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре (РТ) в темноте, так как антитело конъюгируется с флуорофором.
  8. Ядерное окрашивание
    1. Разбавляют 4′,6-диамидин-2-фенилиндол (DAPI) 1:1000 в TBST.
    2. Инкубировать в течение 5 мин на РТ.
    3. Стирайте 2 x 5 мин с TBST.
  9. Установка
    1. Используйте одну каплю монтажного носителя для крепления крышки.
    2. Запечатайте обшивку лаком для ногтей на следующий день.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Фазоконтрастные изображения органоидов эндометрия мыши
Мы установили органоиды из эпителия эндометрия мыши WT, как описано в прилагаемом протоколе (см. диаграмму на рисунке 1). После ферментативной диссоциации эпителия эндометрия мыши эпителиальные листы механически отделяли от стромальных клеток матки и дополнительно диссоциировали с коллагеназой для получения одноклеточной суспензии. При правильном выполнении этот метод разделения эпителиальных и стромальных клеток должен давать образцы с загрязнением не более 10%-15% противоположного типа клеток (см. иммунофлуоресцентные изображения на фиг.2). Затем гранулу эпителиальной клетки повторно суспендировали в гелевую матрицу, позволяли гелю при комнатной температуре и покрывали куполами объемом 25 мкл на пластинах культуры тканей. После того, как купола гелевой матрицы затвердели, их наложили органоидной средой и дали расти. Мы обычно наблюдали, что эпителиальные клетки эндометрия собираются в органоиды в течение 3-4 дней, как показано на рисунке 3. Органоиды поддерживались в культуре, при этом изменения среды происходили каждые 3 дня и проходили каждые 5-7 дней.

Визуализация органоидов эндометрия мышей с использованием гистологического и иммунофлуоресцентного окрашивания
Чтобы проанализировать морфологию эпителиальных органоидов мыши, мы адаптировали методы, используемые для инкапсуляции клеточных тонкоигольных аспиратов с использованием геля для обработки образцов20. Это позволяет сохранить морфологию органоидов эндометрия и инкапсуляцию в матрицу, которая может быть подвергнута обработке при подготовке к встраиванию парафина. Гель для обработки образцов представляет собой модифицированный агар, который широко используется в лабораториях клинической патологии для анализа тонкоигольных аспиратов и был использован для инкапсуляции вагинальных органоидов21,22. После того, как обработка образца гелем / органоидной смесью затвердевает, ее можно обрабатывать, окрашивать и визуализировать с помощью методов, обычно используемых для анализа тканей. На рисунке 4A, B мы показываем, что секционные органоиды эндометрия, содержащие закрепленный формалином парафин, могут быть визуализированы пятнами гематоксилина и эозина, которые отображают один слой эпителия и полые центры - просветы - органоидов. Некоторые органоиды также содержат секреты в просвете, что указывает на то, что органоиды приобретают функциональные свойства железистых эпителиальных клеток. Мы также описываем методы визуализации органоидов с использованием иммуноокрашивания (рисунок 4C, D); секционные органоиды эндометрия инкубировали с первичным антителом Цитокератин 8 (TROMA-1) и флуорофорно-конъюгированным вторичным антителом (вторичный анти-крыса-594). Затем ядра были визуализированы с помощью DAPI, а слайды были изображены с помощью флуоресцентного микроскопа. Мы заметили, что все клетки в органоидах были цитокератин 8-положительными и содержали DAPI, что указывает на то, что фиксация, встраивание и обработка органоидов эндометрия совместимы с иммуноокрашиванием на основе антител.

Экстракция РНК и анализ экспрессии генов
Чтобы определить реакцию экспрессии генов органоидов эндометрия, мы позволили органоидам эндометрия у мышей WT расти в течение 4 дней после первого прохождения. Вечером перед лечением органоидная среда эндометрия была изменена на среду голодания. Затем органоиды обрабатывали в тройных колодцах (каждая скважина содержала три купола) транспортным средством (этанолом; равным объемом в растворе, используемом для эстрадиола) или 10 нМ эстрадиола (E2) в общей сложности 48 ч. Через 48 ч среду удаляли, а органоиды перерабатывали для экстракции РНК. Приблизительно 4 мкг РНК может быть получено в общей сложности из двух куполов из каждой лунки, а 1 мкг РНК был использован для обратной транскрибации кДНК. Амплификацию генов, кодирующих липокалин 2 (Lcn2), лактоферрин (Ltf) и рецептор прогестерона (Pgr), проводили с использованием количественной ПЦР в реальном времени (рисунок 5 и таблица 1)23,24,25. Как и ожидалось, мы заметили, что экспрессия Lcn2, Ltf и Pgr увеличилась в эпителиальных органоидах после стимуляции 10 нМ E2 (рисунок 5). Таким образом, эти результаты показывают, что органоиды эпителия эндометрия могут быть успешно использованы для измерения изменений экспрессии генов в ответ на E2.

Figure 1
Рисунок 1: Процедуры, используемые для установления органоидов эндометрия. Диаграмма описывает ключевые шаги, которые были выполнены для (А) установления и (В) прохождения эпителиальных органоидов из эндометрия мыши. (А) Методы включают ферментативную и механическую диссоциацию эпителия эндометрия из матки мыши с последующей одноклеточной дисперсией и инкапсуляцией эпителия в гелевую матрицу. Для получения тканей матки для ферментативной диссоциации яичники и яйцеводы удаляют из рогов матки мелкими ножницами, разрезают сбоку на 4-5 мм фрагменты, а затем помещают в раствор фермента. После ферментативной инкубации эпителий эндометрия механически отделяют от подлежащей стромы под микроскопом с помощью щипцов и пипетки для «выдавливания» эпителия из маточной трубы. Эпителий далее переваривается в эпителиальные клетки с помощью короткой инкубации в коллагеназе с последующей инкапсуляцией в гелевую матрицу. (B) Прохождение органоидов эндометрия требует механической диссоциации в холодной среде и центрифугирования для высвобождения органоидов из матрицы и получения более мелких фрагментов органоидов. После того, как органоиды были освобождены из матрицы и механически диссоциированы на более мелкие фрагменты, они инкапсулируются в матрицу и повторно покрываются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Иммуноокрашивание изолированных популяций эпителия эндометрия и стромальных клеток. Иммунофлуоресцентные изображения показывают эпителиальные и стромальные клеточные популяции (A,B) эпителиальных клеток и (C,D) стромальных клеточных фракций после ферментативного и механического разделения матки. Цитокератин 8 (эпителиальный клеточный маркер) показан красным цветом, виментин (маркер стромальных клеток) показан зеленым, а DAPI (ядерный маркер) показан синим. Шкала стержней = 100 мкм (A,C), 20 мкм (B,D). Сокращения: CK8 = цитокератин 8; VIM = виментин; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Образование органоидов эндометрия у мышей WT в течение 4 дней. Эпителий эндометрия был выделен из мыши WT и использовался для генерации органоидов. (А) Фазоконтрастное изображение эпителиальных клеток, инкапсулированных в гель-матрицу сразу после переваривания (день 0). (В,С) Несколько небольших органоидов можно наблюдать на 1 день (В) и день 2 (С) культуры. (D) Более крупные и зрелые эпителиальные органоиды могут наблюдаться на 3-й день культуры. Снимки были сделаны с 5-кратным объективом; шкала стержней = 200 мкм. Аббревиатура: WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Гистологический анализ органоидов эндометрия. (A,B) Эпителиальные органоиды эндометрия FFPE были разделены и окрашены H&E. (C,D) Эпителиальные органоиды FFPE были иммуноокрашены маркером эпителиальных клеток цитокератином 8 (красный). Ядра клеток окрашивали DAPI (синий). Шкала стержней = 200 мкм (A), 100 мкм (C), 50 мкм (B,D). Сокращения: FFPE = формалин-фиксированный парафин встроенный; H&E = гематоксилин и эозин; CK8 = цитокератин 8; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Анализ экспрессии генов органоидов эндометрия мыши. Эпителиальные органоиды эндометрия мыши от мышей WT культивировали в течение 4 дней в органоидной питательной среде с последующим лечением транспортным средством или 10 нМ E2 в течение 48 ч в DMEM / F12 с добавлением 2% FBS, очищенного от древесного угля. (А,Б) Фазоконтрастные изображения органоидов мыши WT после обработки транспортным средством (A) или 10 нМ E2 (B). (С-Е) QPCR-анализ эпителия эндометриальных органоидов, обработанных транспортным средством или 10 нМ Е2. Экспрессия Е2-регулируемых генов, липокалина 2 (Lnc2), лактоферрина (Ltf) и рецептора прогестерона (Pgr). Бары представляют собой среднее ± SEM, анализируемое с помощью двуххвостого t-теста; *p < 0,033, **p < 0,002, ***p < 0,001. Повторяется с органоидами, полученными из n = 3 WT мышей на состояние. Шкала стержней = 200 мкм (A,B). Сокращения: WT = дикий тип; E2 = эстрадиол; qPCR = количественная ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Последовательность праймеров Вперед (5'-3') Реверс (5'-3')
Липокалин 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Лактоферрин (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCGTTC
Прогестерон (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназа (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTTTTTT
ПЦР-смесь содержит:
2x SYBR Зеленый
0.5 мкМ Fwd Грунтовка
0,5 мкМ Rev Primer
кДНК
RNAse/DNAse-Free H2O
Условия цикла:
Температура Время Циклов
Держать 95 °С 10 мин 1
Денатурировать 95 °С 15 с 40
Вытягивать 60 °С 60 с

Таблица 1: Последовательности праймеров и условия ПЦР.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем методы генерации эпителиальных органоидов эндометрия из эндометрия мыши и протоколы, обычно используемые для их последующего анализа. Органоиды эндометрия являются мощным инструментом для изучения механизмов, которые контролируют заболевания, связанные с эндометрием, такие как эндометриоз, рак эндометрия и неудача имплантации. Знаковые исследования, опубликованные в 2017 году, сообщили об условиях культивирования долгосрочных и возобновляемых культур органоидов эндометрия из эпителия мыши и человека 4,5. Хотя органоиды широко использовались для изучения биологических путей в других системах, изучение ткани эндометрия in vitro было ограничено отсутствием подходящей модели для изучения нетрансформированного первичного эпителия в культуре26. Органоиды эндометрия, полученные из эндометрия человека и мыши, были успешно установлены с использованием условий, обычно используемых для культивирования органоидов из других тканей органов, таких как кишечник, почки и легкие, и путем встраивания их во каркас внеклеточного матрикса, состоящий из гелевой матрицы4. Со времени этих первоначальных докладов использование органоидов эндометрия для изучения биологии эндометрия значительно возросло в научном сообществе.

Модифицируя ранее опубликованный метод эпителиального выделения из матки мыши27,28, этот протокол уникально выделяет ключевые шаги по изоляции матки мыши путем непосредственного помещения ткани в раствор фермента, минуя необходимость трансекции матки или использования фильтрации. Используя этот метод, мы получили эпителий с чистотой ~85%-90%, определяемой цитокератином 8 и иммуноокрашиванием виментина (рисунок 2). Этот протокол также четко описывает ключевые детали для инкапсуляции изолированных эпителиальных клеток в матрицу роста для генерации, поддержания и прохождения органоидов. Изображения на рисунке 4 и наши неопубликованные исследования идентифицировали присутствие муцинов и железистых клеток (т.е. FOXA2-положительных) в наших органоидных культурах29. Они указывают на то, что представленный здесь метод эффективен для выделения как железистых, так и люминально-эпителиальных клеточных популяций из эндометрия мыши.

Ключевые ограничения для роста этих органоидов включают использование коммерческой матрицы (т.е. Matrigel), которая может привести к вариациям от партии к партии и содержит факторы роста, которые могут влиять на рост органоидов. Кроме того, хотя эти органоиды содержат чистый эпителий матки, использование дополнительных типов клеток эндометрия (т.е. иммунных, стромальных) было недавно описано в органоидных системах эндометриячеловека 8,30. Другие группы показали способность выделять как просветные, так и железистые эпителиальные клетки для органоидных культур из матки мыши14.

Этот подход использует ткани из модели небольшого животного, которая относительно распространена и доступна для большинства исследователей; генерация органоидов эндометрия из более крупных моделей животных или людей может создавать этические или технические проблемы, которые могут быть преодолены с помощью методов, основанных на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSC). Такие технологии были ранее описаны для тканей эндометрия31, других тканей репродуктивного тракта32 и были эффективно использованы для изучения эндометриальных/плацентарных взаимодействий in vitro33. Следовательно, использование иПСК в качестве источника стромальных и эпителиальных клеток эндометрия у людей и других моделей крупных животных представляет собой возобновляемый и доступный источник для генерации органоидов эндометрия.

Хотя мышь является широко используемой моделью для изучения имплантации, существуют ключевые эволюционные различия в механизме имплантации между мышами и людьми, которые следует отметить. Например, в то время как интерстициальная имплантация характеризуется глубокой трофобластической инвазией через просветный эпителий в подлежащую строму, механизм процесса инвазии различается у мышей и приматов34. У мышей инвазия трофобластов через просветный эпителий включает апоптоз или энтоз35,36, тогда как трофобласты мигрируют между просветным эпителием в подлежащую строму у приматов34,35.

Обеспечение органоидов эндометрия необходимыми факторами роста для поддержки самосборки и долгосрочного обновления имеет важное значение для получения органоидных культур эндометрия, которые рекапитулируют нативную ткань. Сложная средовая композиция для органоидов эндометрия указывает на множественные сигнальные пути, которые способствуют характеристикам эпителиальных клеток и возникают как из паракринных, так и из аутокринных источников. Стромальный компартмент эндометрия представляет собой сложную сборку многочисленных типов клеток, включая фибробластоподобные стромальные клетки, эндотелий, макрофаги и другие специализированные иммунные клетки, которые постоянно меняются в ответ на эстроген и прогестерон37.

Например, органоидная культуральная среда содержит факторы, которые активируют передачу сигналов WNT/β-катенина в органоидах, таких как WNT3a и R-спондин. Исследования на мышах показали, что лиганды WNT имеют решающее значение для развития матки и функции желез; поэтому активация этого сигнального пути имеет решающее значение для развития и поддержания органоидов38,39. R-спондин усиливает передачу сигналов WNT и является лигандом богатого лейцином повторного рецептора, связанного с G-белком (LGR5)40. Органоидные культуры эндометрия также требуют ингибирования сигнальных путей трансформирующего фактора роста β (TGFβ) и костного морфогенетического белка (BMP). Например, органоидная культуральная среда эндометрия содержит ингибитор BMP, Noggin, секретируемый белок, который связывается и инактивирует BMP2, BMP4 и BMP741. Фармакологический ингибитор А83-01 также присутствует в органоидной среде эндометрия. A83-01 представляет собой ингибитор малых молекул с высокой специфичностью к рецепторам ALK4, ALK5 и ALK742. ALK4/5/7 представляют собой рецепторы типа 1 семейства передачи сигналов TGFβ, которые связываются и передают сигналы, вызванные лигандами, такими как TGFβ, активин или узелок. Сигналы BMP имеют решающее значение для поддержания стволовых клеток в тканях, таких как кишечник43 и волосяные фолликулы44. Ингибирование передачи сигналов TGFβ способствует пролиферативной способности и колониеобразующей эффективности эндометриальных мезенхимальных стволовых клеток45, что происходит путем ремоделирования ключевых областей в хроматине46. Таким образом, модуляция этих двух ключевых сигнальных путей, BMP и TGFβ, необходима для поддержания органоидных культур с способностью к самообновлению.

Хотя это не показано здесь, мы обнаружили, что долгосрочная культивирование органоидов мыши с ингибитором ALK4/5/7, A83-01, приводило к морфологическим изменениям эпителиальных органоидов после трех или четырех непрерывных проходов (Kriseman et al., under review). Морфологические изменения в эпителиальных органоидах напоминали «плотные» эпителиальные органоиды, описанные Boretto et al.4, где развитие более секретороподобных клеток происходило из-за снижения паракринной секреции лигандов WNT. Таким образом, вполне вероятно, что сигнальные пути TGFβ и WNT пересекаются для контроля регенерации и дифференцировки органоидов эпителия эндометрия.

Недавние исследования создали 3D-системы эпителия эндометрия / стромальные кокультуры из тканей человека 7,8,16. Один из методов совместного культивирования использует систему без каркаса, в которой эпителиальные и стромальные клетки эндометрия объединяются и позволяют собираться в 3D-структуры в скважине без каркаса с использованием определенной питательной среды. Эти 3D-эпителиальные/стромальные органоиды эндометрия не только экспрессируют рецепторы эстрогена, прогестерона и андрогена, но и точно повторяют ответ на гормоны яичников - эстроген и прогестерон 6,7. В другом методе совместного культивирования, используемом в исследовании Rawlings et al., эпителиальные органоиды эндометрия объединяют со стромальными клетками в коллагеновом матриксе и выращивают в модифицированной органоидной среде8. Эти эпителиальные/стромальные ко-культивируемые органоиды, или ассамблоиды, организуются во взвешенную 3D-систему, где стромальные клетки окружают эпителиальные железоподобные структуры.

Большинство органоидов эндометрия культивируются в гелевой матрице с пониженным фактором роста; однако присутствие активных соединений в матрице может оказывать нежелательные клеточные реакции внутри органоидов. Чтобы преодолеть это ограничение, органоиды были установлены в каркасах без гелевой матрицы, таких как 3D-печатные агарозные формы, в которых отдельным органоидам разрешено самостоятельнособираться 6. Другие группы разработали синтетические гидрогели, которые будут служить 3D-матрицами для культуры органоидов эндометрия47. Эти органоиды собираются в 3D-структуры с апикобазальной полярностью, а также могут быть объединены со стромальными клетками эндометрия с образованием сложных органоидов48. Поскольку органоиды могут быть успешно использованы для культивирования нетрансформированных первичных тканей эндометрия человека и мыши способами, которые не могут 2D-клеточные культуры, нет никаких сомнений в том, что органоиды эндометрия будут продвигать область репродуктивного здоровья женщин и быть невероятным инструментом для изучения репродуктивных патологий, таких как рецидивирующая потеря беременности, эндометриоз и рак эндометрия16, 49,50 грн.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Мы благодарим д-ра Стефани Пангас и д-ра Мартина М. Мацука (M.M.M.) за критическое прочтение и редактирование нашей рукописи. Исследования были поддержаны грантами Национального института детского здоровья и развития человека Юнис Кеннеди Шрайвер R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) и R01-HD110038 (M.M.M.), а также грантом поддержки онкологического центра NCI-P30 (NCI-CA125123). Диана Монсивайс, доктор философии, имеет награду Next Gen Pregnancy Award от Burroughs Wellcome Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987 (2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739 (2021).

Tags

Биология выпуск 191 эндометрий органоиды бесплодие матка регенерация
Создание 3D-органоидов эндометрия из мышиной матки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z.,… More

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter