Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Etablera 3D-endometrieorganoider från musens livmoder

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64448
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

Summary

Detta protokoll beskriver metoder för att etablera epitelorganiska epiteloider för mus för genuttryck och histologiska analyser.

Abstract

Endometrial vävnad leder livmoderns inre hålighet och är under cyklisk kontroll av östrogen och progesteron. Det är en vävnad som består av luminalt och körtelepitel, ett stromalfack, ett vaskulärt nätverk och en komplex immuncellpopulation. Musmodeller har varit ett kraftfullt verktyg för att studera endometrium och avslöjar kritiska mekanismer som styr implantation, placentation och cancer. Den senaste utvecklingen av 3D-endometriella organoidkulturer presenterar en toppmodern modell för att dissekera signalvägarna som ligger till grund för endometriebiologi. Att etablera endometrieorganoider från genetiskt modifierade musmodeller, analysera deras transkriptom och visualisera deras morfologi vid en encellsupplösning är avgörande verktyg för studier av endometriesjukdomar. Denna uppsats beskriver metoder för att etablera 3D-kulturer av endometrieepitel från möss och beskriver tekniker för att kvantifiera genuttryck och analysera organoidernas histologi. Målet är att tillhandahålla en resurs som kan användas för att etablera, odla och studera genuttryck och morfologiska egenskaper hos endometrieepitelorganoider.

Introduction

Endometrium - livmoderhålans inre slemhinnevävnad - är en unik och mycket dynamisk vävnad som spelar kritiska roller i en kvinnas reproduktiva hälsa. Under den reproduktiva livslängden har endometrium potential att genomgå hundratals cykler av spridning, differentiering och nedbrytning, samordnad av den samordnade verkan av äggstockshormonerna - östrogen och progesteron. Studier av genetiskt modifierade möss har avslöjat grundläggande biologiska mekanismer som ligger till grund för endometriesvaret på hormoner och kontroll av embryoimplantation, stromacelldecidualisering och graviditet1. In vitro-studier har dock varit begränsade på grund av svårigheter att upprätthålla icke-transformerade primära musendometrievävnader i traditionella 2D-cellkulturer 2,3. De senaste framstegen inom kulturen av endometriella vävnader som 3D-organsystem, eller organoider, utgör en ny möjlighet att undersöka biologiska vägar som kontrollerar endometrial cellregenerering och differentiering. Mus- och humana endometrieorganoidsystem har utvecklats från rent endometrieepitel inkapslat i olika matriser4,5, medan humant endometrium har odlats som ställningsfria epitel- / stromala samkulturer6,7, och mer nyligen som kollageninkapslade epitel- / stromalsammansättningar8 . Tillväxten och regenerativ potential hos epitelorganoidkulturer stöds av en definierad cocktail av tillväxtfaktorer och småmolekylära hämmare som har bestämts empiriskt för att maximera tillväxt och regenerering av organoiderna 4,5,9. Dessutom tillåter förmågan att frysa och tina endometrieorganoider långsiktig bankning av endometrieorganoider från möss och människor för framtida studier.

Genetiskt modifierade möss har avslöjat de komplexa signalvägarna som styr tidig graviditet och decidualisering och har använts som modeller för graviditetsförlust, endometriecancer och endometrios. Dessa genetiska studier har till stor del uppnåtts med cellspecifik radering av loxP-flankerade alleler ("floxed") med hjälp av cre-rekombinaser som är specifikt aktiva i kvinnliga reproduktionsvävnader. Dessa musmodeller inkluderar den allmänt använda progesteronreceptor-cre 10, som har stark rekombinasaktivitet i endometrieepitel- och stromalvävnaderna, laktoferrin i-cre, som inducerar endometrieepitelrekombination hos vuxna möss11, eller Wnt7a-cre, vilket utlöser epitelspecifik radering i Müllerian-härledda vävnader12 . Odling av endometrievävnader från genetiskt modifierade musmodeller som 3D-organoider har gett ett utmärkt tillfälle att undersöka endometriebiologi och underlätta identifieringen av tillväxtfaktorer och signalvägar som styr endometrial cellförnyelse och differentiering13,14. Metoder för isolering och odling av musens endometrievävnad beskrivs i litteraturen och rapporterar användningen av olika enzymatiska strategier för isolering av livmoderepitel för efterföljande odling av endometrieepitelorganoider4. Medan tidigare litteratur ger en kritisk ram för endometrieepitelorganoidkulturprotokoll 4,5,6, ger detta papper en tydlig, omfattande metod för att generera, underhålla, bearbeta och analysera dessa organoider. Standardisering av dessa tekniker är viktigt för att påskynda framsteg inom kvinnors reproduktionsbiologi. Här rapporterar vi en detaljerad metodik för enzymatisk och mekanisk rening av mus endometrial epitelvävnad för efterföljande odling av endometrieorganoider i en gelmatrisställning. Vi beskriver också metoderna för nedströms histologiska och molekylära analyser av de gelmatrisinkapslade musendometriepitelorganoiderna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mushantering och experimentella studier utfördes enligt protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Baylor College of Medicine och riktlinjer som fastställts av NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Isolering av livmoderepitel från möss med enzymatiska och mekaniska metoder

OBS: Detta avsnitt beskriver de steg som krävs för att etablera, passera, frysa och tina epiteliala endometrieorganoider från möss med hjälp av en gelmatrisställning. Tidigare studier har fastställt att optimala kulturer av musendometrieorganoider etableras från möss under östrusfas4, vilket kan bestämmas genom cytologisk undersökning av en vaginalpinne15. Vuxna kvinnliga WT-möss (6-8 veckor gamla, hybrid C57BL/6J och 129S5/SvEvBrd) användes för alla experiment. Mössen avlivades humant enligt IACUC-godkända riktlinjer med isofluransedering följt av cervikal disartikulation. När mössen har avlivats bör följande steg följas. Se materialförteckningen för detaljer relaterade till material och lösningar som används i detta protokoll.

  1. Låt gelmatrisen tina på is i cirka 1-2 timmar före användning.
  2. För att dissekera musen, använd sax för att göra ett snitt i mitten av buken och dra försiktigt tillbaka huden för att exponera det underliggande peritoneala skiktet. Använd pincett för att hålla upp bukhinnan och gör laterala snitt med saxen för att exponera bukinnehållet.
    1. Leta reda på livmoderhornen genom att försiktigt flytta bukfettkuddarna åt sidan. Dissekera dem genom att först hålla dem vid livmoderhalskorsningen och använda sax för att skära längs det mesenteriska fettet. Efter dissektion av musens livmoder, ta bort fettvävnad från livmoderhornet noggrant med en liten sax.
      OBS: Behåll steriliteten under cellisoleringen genom att sterilisera alla operationsverktyg före användning, spraya musens buk med 70% etanol och utför alla steg efter dissektion under en steril vävnadsodlingshuv.
  3. Skär varje livmoderhorn i små fragment, var och en mäter cirka 4-5 mm.
  4. Placera alla livmoderfragment från en livmoder i en brunn i en 24-brunnsplatta innehållande 0,5 ml 1% trypsin. Låt den enzymatiska lösningen komma in i livmoderns lumen, vilket orsakar enzymatisk separation av endometriepitelivet från den underliggande stroma.
  5. Inkubera 24-brunnsplattan i en 37 °C fuktad vävnadsodlingsinkubator i cirka 1 timme.
  6. Efter inkubationen på 1 timme överför du livmoderfragmenten till en 35 mm vävnadsodlingsplatta innehållande 1 ml av Dulbeccos fosfatbuffrade lösning (DPBS).
  7. Under ett dissektionsmikroskop, använd fina pincett och en 1 ml pipett för att mekaniskt separera livmoderepitelet från livmoderröret. Medan du håller ner ena änden av ett livmoderfragment med pincetten, kör försiktigt pipettspetsen i längdriktningen över fragmentet och pressa epitelet ut ur den andra änden av livmoderröret. Observera de separerade epitelarken från livmoderfragmentet under dissektionsmikroskopet.
  8. Använd 1 ml pipett för att samla upp och försiktigt överföra epitelarken till ett 1,5 ml rör.
  9. Upprepa processen för de återstående livmoderfragmenten och överför alla epitelark till samma uppsamlingsrör.
  10. Pellet de dissocierade epitelbladen genom centrifugering i 5 min vid 375 × g.
  11. Ta försiktigt bort supernatanten för att undvika att störa cellpelleten.
  12. Återsuspendera cellpelleten i 0,5 ml 2,5 mg / ml kollagenas + 2 mg / ml DNas-lösning. Pipettera upp och ner cirka 10x, eller tills en encellssuspension uppnås.
  13. Tillsätt 0,5 ml DMEM/F12 + 10 % fetalt bovint serum (FBS) + antibiotika och centrifugera cellerna i 5 minuter vid 375 × g.
    OBS: För ytterligare information om bredspektrumantibiotikumet som används för cellodling, se materialförteckningen.
  14. Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotika. Centrifugera cellerna i 5 minuter vid 375 × g.

2. Bearbetning av stromalfacket

OBS: Detta avsnitt beskriver de protokoll som är nödvändiga för att isolera stromalfacket i musens endometrium. Med tanke på det ökande intresset för epitel/stromala samodlingsexperiment är det viktigt att kunna bearbeta stromacellpopulationerna utöver de epitelceller som kommer att generera organoider.

  1. När allt epitel har separerats enzymatiskt och mekaniskt från livmoderfragmenten är de återstående rörliknande strukturerna "stromal / myometrial" -facken. Samla denna vävnad i ett 2,5 mg / ml kollagenas + 2 mg / ml DNas i HBSS-lösning.
  2. Inkubera stromal-/myometriprovet på en 37 °C skakare i 15 minuter.
  3. Efter inkubation, tillsätt 500 μL DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotika per mus och filtrera de icke-dissocierade fragmenten genom ett 40 μm cellfilter.
  4. Pellera cellerna genom centrifugering i 5 min vid 375 × g.
  5. Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotika. Tillsätt blandningen droppvis till 10 ml DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotika i en 10 cm cellodlingsplatta. Inkubera plattan vid 37 °C i en fuktad cellodlingsinkubator.
  6. För att generera samkulturer av musendometriepitel- och stromaceller, följ de metoder som beskrivs för humana endometrieorganoider med hjälp av ställningsfria eller kollagenmatrissystem 6,8.
    OBS: Även om dessa tekniker ännu inte har publicerats för möss, kan de anpassas baserat på de publicerade protokollen med humant endometrium.

3. Inkapsling av livmoderepitel i gelmatris för att etablera organoider

OBS: Förvara gelmatrisen på is tills den är klar att användas.

  1. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i en volym gelmatris som är 20x den för cellpelleten (dvs. om cellpelleten är 20 μL, suspendera cellerna igen med 400 μL gelmatris). Återsuspendera pelleten försiktigt för att undvika att införa bubblor.
  2. Låt gelmatrisen/cellsuspensionen sätta sig vid rumstemperatur i ~10 min.
  3. När gelmatrisen/cellsuspensionen blir en halvfast gel, använd en P200-mikropipett med en bred 200 μL-spets för att försiktigt aspirera 25 μL av gelmatrisen/cellsuspensionen. Fördela tre separata 25 μL kupoler per brunn på en 12-brunnsplatta och låt gelmatrisen härda i 15 minuter i en 37 °C fuktad vävnadsodlingsinkubator.
  4. Efter att gelmatrisen har härdat, tillsätt 750 μL organoidmedium till varje brunn innehållande gelmatriskupoler. Inkubera vid 37 °C i en inkubator för befuktad vävnadsodling.
    OBS: Organoid media formulering noteras i materialtabellen. Organoider bildas vanligtvis inom 4 dagar efter den första odlingen.

4. Genuttrycksanalys av endometrieorganoider efter behandling med östradiol

OBS: I detta avsnitt beskrivs de metoder som används för att profilera genuttrycket av endometrieepitelorganoider med hjälp av qPCR i realtid efter behandling med östradiol (E2; se tabell 1). Eftersom endometrium är under cyklisk kontroll av äggstockshormonet E2 är testning av organoidernas lyhördhet för E2 ett viktigt mått på fysiologisk funktion. Vi har erhållit högkvalitativt RNA och genererat tillräckligt med mRNA för att profilera genuttryck med hjälp av qPCR och / eller RNA-sekvensering från våra endometrieepitelorganoider. Detta avsnitt beskriver hur man samlar in organoider och bearbetar dem för nedströmsanalys av genuttryck. Det valda behandlingsmediet återspeglar det som används för att behandla odlade endometrieceller. Det bör dock noteras att detta behandlingsmedium kan optimeras i enlighet därmed, vilket görs för behandling av humana endometriella 3D-kulturer med hormoner 8,16,17.

  1. Kultur endometriella organoider som beskrivits ovan.
  2. Ta bort det organoida mediet och ersätt det med 750 μL svältmedium fyra dagar efter sådd. Inkubera över natten.
  3. Följande morgon, ta bort svältmediet. Tillsätt 750 μl behandlingsmedium som innehåller antingen vehikel eller 10 nM E2. Inkubera i 48 timmar.
  4. Fortsätt med RNA-isolering enligt kittillverkarens protokoll.

5. Histologisk analys av endometrieorganoider

OBS: Avbildning av de morfologiska egenskaperna hos endometrieorganoider är avgörande för att utvärdera den cellulära effekten av tillväxtfaktorer, genetiska manipulationer eller småmolekylära hämmare. Detta avsnitt beskriver de tekniker som används för att fixa, bearbeta och avbilda endometrieepitelorganoider med hjälp av histologiska fläckar och antikroppsimmunofluorescerande färgning.

  1. Förbered 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 1 ml 4% paraformaldehyd i 1x PBS. Lägg dem på is.
  2. Aspirera mediet från brunnarna i 12-brunnsplattan som innehåller organoiderna.
  3. Använd en 1 ml pipettspets med en skuren spets, överför 500 μL 4% paraformaldehyd till varje brunn och lossa försiktigt gelmatriskupolerna från botten av plattan.
  4. Aspirera försiktigt hela gelmatriskupolerna i pipettspetsen och överför till 1,5 ml mikrocentrifugröret.
  5. Fixera organoiderna genom att placera dem på en rotator vid 4 °C över natten.
  6. Följande morgon, centrifugera röret vid 600 × g i 5 minuter för att pelletera organoiderna. Ta försiktigt bort 4% paraformaldehydlösningen med en pipett och kassera. Tvätta organoiderna 2x med 70% etanol.
  7. Efter den sista tvätten, ta bort alla utom 50-100 μL etanol från röret. Ställ röret åt sidan.
  8. Placera ett rör med provbearbetningsgel i ett vattenbad och mikrovågsugn i ~ 30 s för att smälta gelén. Se till att provbearbetningsgelén inte kokar över genom att övervaka gelens konsistens.
    OBS: När provbearbetningsgelén har smält, men inte kokhet, arbeta snabbt för att kapsla in organoiderna.
  9. Överför tillräckligt med provbearbetningsgel för att täcka hela ytan av formen (cirka 250 μl).
  10. Medan provbearbetningsgelén fortfarande är smält, överför snabbt 50 μL 70% etanollösning innehållande organoiderna. Se till att organoiderna sänks eller skjuts till den nedre delen av formen.
  11. Placera histologiformen på en hink med is och låt provbearbetningsgelén svalna och stelna.
  12. När provbearbetningsgelén är helt torr, överför försiktigt provbearbetningsgelkvadraten till en provpåse och håll koll på planet där organoiderna är belägna.
  13. Placera påsen i en histologikassett och bearbeta med standardmetoder som används för formalinfixering och paraffinbäddning av vävnader18.
  14. Efter fixering och inbäddning i paraffin, sektion i 5 μm sektioner med hjälp av en mikrotom19. Fortsätt med standardprocedurer för hematoxylin och eosin (H&E) eller immunfärgning, som beskrivs nedan.

6. Hematoxylin & eosinfärgning

  1. Deparaffinisera sektionerna enligt följande: xylen, 2 x 10 min; 100% etanol, 2 x 3 min; 80% etanol, 3 min; 60% etanol, 3 min; dH 2 O,2x 3 min; 1 min i hematoxylin; kranvatten (3 x 5 s); 1 min i eosin.
  2. Dehydrera sektionerna enligt följande: 60% etanol, 3 min; 80% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 100% etanol, 2 x 3 min; xylen, 2 x 15 min.
  3. Montera med monteringsmedium.

7. Immunofluorescensfärgning

  1. Deparaffinisera avsnitten enligt beskrivningen i steg 6.1.
  2. Utför antigenhämtning
    1. Sänk ned objektglasen i antigenhämtningslösning i en mikrovågssäker behållare.
    2. Mikrovågsugn vid hög värme i 20 minuter, med 5 minuters intervall för att säkerställa att lösningen inte kokar över.
  3. När 20 minuters antigenhämtningssteget är klart, låt bilderna svalna på is i 40 minuter medan de fortfarande är nedsänkta i antigenhämtningsbuffert.
  4. Tvätta bilderna med 1x TBST i 3 min
  5. Blockera objektglasen genom att inkubera i 3% BSA i TBST i 1 h vid rumstemperatur.
  6. Primär antikroppsinkubation
    1. Späd antikroppen i 3% BSA i TBST (1:50-1:1 000, beroende på Ab).
    2. Inkubera över natten vid 4 °C i en fuktad kammare.
    3. Tvätta 3 x 5 min med TBST.
  7. Sekundär antikroppsinkubation
    1. Späd antikroppen i 3% BSA (i TBST) (1:250) eller i 5% normalt åsneserum.
    2. Inkubera i 1 h vid rumstemperatur (RT) i mörkret, eftersom antikroppen konjugeras till en fluorofor.
  8. Nukleär färgning
    1. Späd 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) 1:1,000 i TBST.
    2. Inkubera i 5 minuter vid RT.
    3. Tvätta 2 x 5 min med TBST.
  9. Beslag
    1. Använd en droppe monteringsmedium för att montera täckglaset.
    2. Försegla täckglaset med nagellack dagen efter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Faskontrastbilder av musendometrieorganoider
Vi etablerade organoider från WT-mus endometrieepitel, som beskrivs i det bifogade protokollet (se diagram i figur 1). Efter enzymatisk dissociation av musens endometriepitel separerades epitelark mekaniskt från livmoderstromacellerna och dissocierades ytterligare med kollagenas för att generera en encellssuspension. Om den utförs korrekt bör denna metod för epitel- och stromacellsseparation ge prover med kontaminering av högst 10%-15% av motsatt celltyp (se immunofluorescensbilder i figur 2). Epitelcellpelleten återsuspenderades sedan i gelmatris, fick gelas vid rumstemperatur och pläterades i 25 μL kupoler på vävnadsodlingsplattor. Efter att gelmatriskupolerna stelnat överlagrades de med organoidmedium och fick växa. Vi observerade vanligtvis att endometrieepitelceller samlades i organoider inom 3-4 dagar, som bilden i figur 3. Organoiderna upprätthölls i kulturen, med medieförändringar som inträffade var 3: e dag och passerade var 5-7: e dag.

Avbildning av musendometrieorganoider med hjälp av histologisk och immunofluorescerande färgning
För att analysera morfologin hos musepitelorganoiderna anpassade vi metoder som används för inkapsling av cellulära finnålsaspirater med hjälp av provbearbetningsgel20. Detta möjliggör bevarande av endometrial organoidmorfologi och inkapsling i en matris som kan utsättas för bearbetning som förberedelse för paraffinbäddning. Provbearbetningsgel är en modifierad agar som används i stor utsträckning i kliniska patologilaboratorier för analys av fina nålaspirater och har använts för att kapsla in vaginala organoider21,22. Efter att provbearbetningsgel/organoidblandningen stelnat kan den bearbetas, färgas och avbildas med tekniker som vanligtvis används för att analysera vävnader. I figur 4A,B visar vi att sektionerade formalinfixerade paraffininbäddade endometrieorganoider kan visualiseras av hematoxylin- och eosinfläckar, som visar det enda skiktet av epitel och ihåliga centra - organoidernas lumen. Vissa organoider innehåller också sekret i lumen, vilket indikerar att organoiderna förvärvar de funktionella egenskaperna hos glandulära epitelceller. Vi beskriver också tekniker för att visualisera organoiderna med hjälp av immunfärgning (figur 4C,D); snittade endometrieorganoider inkuberades med en cytokeratin 8 primär antikropp (TROMA-1) och en fluoroforkonjugerad sekundär antikropp (sekundär anti-råtta-594). Kärnor visualiserades sedan med DAPI, och bilderna avbildades med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Vi observerade att alla celler i organoiderna var Cytokeratin 8-positiva och innehöll DAPI, vilket indikerar att fixering, inbäddning och bearbetning av endometrieorganoiderna är kompatibel med antikroppsbaserad immunfärgning.

RNA-extraktion och genuttrycksanalys
För att bestämma genuttryckssvaret hos endometrieorganoider tillät vi endometrieorganoider från WT-möss att växa i 4 dagar efter den första passagen. På kvällen före behandlingen ändrades endometrieorganoidmediet till svältmedium. Organoiderna behandlades sedan i tredubbla brunnar (varje brunn innehållande tre kupoler) med vehikel (etanol; lika stor volym i lösning som används för östradiol) eller 10 nM östradiol (E2) i totalt 48 timmar. Efter 48 timmar avlägsnades mediet och organoiderna bearbetades för RNA-extraktion. Cirka 4 μg RNA kan erhållas från totalt två kupoler från varje brunn, och 1 μg RNA användes för att omvända transkribera cDNA. Förstärkning av generna som kodar för lipocalin 2 (Lcn2), laktoferrin (Ltf) och progesteronreceptorn (Pgr) utfördes med hjälp av kvantitativ PCR i realtid (figur 5 och tabell 1)23,24,25. Som förväntat observerade vi att uttrycket av Lcn2, Ltf och Pgr ökade i epitelorganoiderna efter stimulering med 10 nM E2 (Figur 5). Således visar dessa resultat att endometrieepitelorganoider framgångsrikt kan användas för att mäta genuttrycksförändringarna som svar på E2.

Figure 1
Figur 1: Förfaranden som används för att upprätta endometrieorganoider. Diagram beskriver de viktigaste stegen som följdes för att (A) upprätta och (B) passage epitelorganoider från musens endometrium. (A) Metoderna innefattar enzymatisk och mekanisk dissociation av endometriepitel från musens livmoder, följt av encellsdispersion och inkapsling av epitelet i en gelmatris. För att erhålla livmodervävnaderna för enzymatisk dissociation avlägsnas äggstockarna och äggledarna från livmoderhornen med fin sax, skärs i sidled i 4-5 mm fragment och placeras sedan i enzymlösningen. Efter enzymatisk inkubation separeras endometriepitelimet mekaniskt från den underliggande stroma under ett mikroskop med hjälp av pincett och en pipett för att "pressa" ut epitelet från livmoderröret. Epitelet smälts vidare till epitelceller med hjälp av en kort inkubation i kollagenas, följt av inkapsling i en gelmatris. (B) Passning av endometrieorganoiderna kräver mekanisk dissociation i kallt medium och centrifugering för att frigöra organoiderna från matrisen och generera mindre organoidfragment. När organoiderna har frigjorts från matrisen och mekaniskt dissocierats i mindre fragment, kapslas de in i matrisen och replateras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Immunfärgning av isolerade endometrieepitel och stromacellpopulationer. Immunofluorescensbilder visar epitel- och stromacellpopulationer av (A,B) epitelcellen och (C,D) stromacellfraktionerna efter enzymatisk och mekanisk separation av livmodern. Cytokeratin 8 (en epitelcellmarkör) visas i rött, vimentin (en stromacellmarkör) visas i grönt och DAPI (en kärnmarkör) visas i blått. Skalstänger = 100 μm (A,C), 20 μm (B,D). Förkortningar: CK8 = cytokeratin 8; VIM = vimentin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Bildning av endometrieorganoider från WT-möss under 4 dagar. Endometrieepitel isolerades från en WT-mus och användes för att generera organoider. (A) Faskontrastbild av epitelcellerna inkapslade i gelmatrisen omedelbart efter matsmältningen (dag 0). (B,C) Några små organoider kan observeras på dag 1 (B) och dag 2 (C) av kulturen. (D) Större och mogna epitelorganoider kan observeras på dag 3 av kulturen. Bilder togs med ett 5x mål; skalstänger = 200 μm. Förkortning: WT = vild typ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Histologisk analys av endometrieorganoider . (A,B) FFPE endometrieepitelorganoider sektionerades och färgades med H&E. (C,D) FFPE-epitelorganoider immunbesudlades med epitelcellmarkören cytokeratin 8 (röd). Cellkärnor färgades med DAPI (blå). Skalstänger = 200 μm (A), 100 μm (C), 50 μm (B,D). Förkortningar: FFPE = formalinfixerat paraffin inbäddat; H&E = hematoxylin & eosin; CK8 = cytokeratin 8; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Genuttrycksanalys av musendometrieorganoider. Musendometrieepitelorganoider från WT-möss odlades i 4 dagar i organoidtillväxtmedium, följt av behandling med vehikel eller 10 nM E2 i 48 timmar i DMEM/F12 kompletterat med 2% kolavskalad FBS. (A,B) Faskontrastbilder av WT-musorganoiderna efter behandling med vehikel (A) eller 10 nM E2 (B). (C–E) Realtids qPCR-analys av epiteliala endometrieorganoider behandlade med vehikel eller 10 nM E2. Uttryck av E2-reglerade gener, lipocalin 2 (Lnc2), laktoferrin (Ltf) och progesteronreceptor (Pgr). Staplar representerar medelvärdet ± SEM, analyserat med ett tvåsidigt t-test; *p < 0,033, **p < 0,002, ***p < 0,001. Upprepas med organoider härledda från n = 3 WT-möss per tillstånd. Skalstänger = 200 μm (A,B). Förkortningar: WT = vild typ; E2 = östradiol; qPCR = kvantitativ PCR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Primer sekvens Framåt (5'-3') Omvänd (5'-3')
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Laktoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesteron (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyd 3 fosfatdehydrogenas (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT
PCR-blandningen innehåller:
2x SYBR Grön
0,5 μM Fwd Primer
0,5 μM Rev Primer
cDNA
RNAse/DNAse-fri H2O
Cycler Villkor:
Temperatur Tid Cykler
Hålla 95 °C 10 minuter 1
Denaturera 95 °C 15 sekunder 40
Förlänga 60 °C 60 sekunder

Tabell 1: Primersekvenser och PCR-förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi metoder för att generera endometrieepitelorganoider från musendometrium och de protokoll som rutinmässigt används för deras nedströmsanalys. Endometrieorganoider är ett kraftfullt verktyg för att studera de mekanismer som styr endometrierelaterade sjukdomar, såsom endometrios, endometriecancer och implantationsfel. Landmärkestudier som publicerades 2017 rapporterade villkoren för att odla långsiktiga och förnybara kulturer av endometrieorganoider från mus och humant epitel 4,5. Även om organoider har använts i stor utsträckning för att studera biologiska vägar i andra system, har studien av endometrievävnad in vitro begränsats av frånvaron av en lämplig modell för att studera det icke-transformerade primära epitelet i kultur26. Endometrieorganoider härledda från humant och musendometrium etablerades framgångsrikt med hjälp av förhållanden som vanligtvis används för att odla organoider från andra organvävnader, såsom tarm, njure och lunga, och genom att bädda in dem i en extracellulär matrisställning bestående av gelmatris4. Sedan dessa första rapporter har användningen av endometrieorganoider för att studera endometriumets biologi ökat avsevärt i det vetenskapliga samfundet.

Genom att modifiera en tidigare publicerad metod för epitelisolering från musens livmoder27,28, belyser detta protokoll unikt viktiga steg för att isolera muslivmoder genom att direkt placera vävnaden i en enzymlösning, kringgå behovet av att transektera livmodern eller använda filtrering. Med hjälp av denna metod erhöll vi epitel med ~ 85% -90% renhet, bestämd av cytokeratin 8 och vimentinimmunfärgning (figur 2). Detta protokoll beskriver också tydligt de viktigaste detaljerna för inkapsling av de isolerade epitelcellerna i tillväxtmatrisen för generering, underhåll och passering av organoiderna. Bilderna i figur 4 och våra opublicerade studier har identifierat förekomsten av muciner och körtelceller (dvs. FOXA2-positiva) i våra organoidkulturer29. Dessa indikerar att metoden som presenteras här är effektiv för isolering av både glandulära och luminal-epitelcellpopulationer från musens endometrium.

Viktiga begränsningar för tillväxten av dessa organoider inkluderar användningen av den kommersiella matrisen (dvs. Matrigel), vilket kan resultera i batch-till-batch-variationer och innehåller tillväxtfaktorer som kan påverka organoid tillväxt. Dessutom, medan dessa organoider innehåller rent livmoderepitel, har användningen av ytterligare endometriecelltyper (dvs. immun, stromal) nyligen beskrivits i humana organoidsystem i endometrium 8,30. Andra grupper har visat förmågan att isolera både luminala och glandulära epitelceller för organoidkulturer från musens livmoder14.

Detta tillvägagångssätt använder vävnader från en liten djurmodell som är relativt vanlig och tillgänglig för de flesta forskare; att generera endometrieorganoider från större djurmodeller, eller människor, kan utgöra etiska eller tekniska utmaningar, som kan övervinnas genom att använda inducerade pluripotenta stamcellsbaserade (iPSC) -baserade tekniker. Sådana tekniker har tidigare beskrivits för endometrievävnader31, andra vävnader i reproduktionskanalen32 och har effektivt använts för att studera endometrie-/placentainteraktioner in vitro33. Att använda iPSC som en källa till endometriella stromala och epitelceller i endometrium från människor och andra stora djurmodeller utgör därför en förnybar och tillgänglig källa för att generera endometrieorganoider.

Medan musen är en allmänt använd modell för studier av implantation, finns det viktiga evolutionära skillnader i implantationsmekanismen mellan möss och människor som bör noteras. Till exempel, medan interstitiell implantation kännetecknas av djup trofoblastisk invasion genom det luminala epitelet i den underliggande stroma, skiljer sig invasionsprocessens mekanism mellan möss och primater34. Hos möss involverar trofoblastinvasion genom det luminala epitelet apoptos eller entos 35,36, medan trofoblaster migrerar mellan luminalt epitel till den underliggande stroma hos primater 34,35.

Att tillhandahålla endometrieorganoider med nödvändiga tillväxtfaktorer för att stödja självmontering och långsiktig förnyelse är viktigt för att erhålla endometrieorganoidkulturer som rekapitulerar den ursprungliga vävnaden. Den komplexa mediekompositionen för endometrieorganoiderna indikerar de flera signalvägarna som bidrar till epitelcellegenskaper och skulle uppstå från både parakrina och autokrina källor. Endometriumets stromafack är en komplex sammansättning av många celltyper, inklusive fibroblastliknande stromaceller, endotel, makrofager och andra specialiserade immunceller som ständigt förändras som svar på östrogen och progesteron37.

Till exempel innehåller det organoida odlingsmediet faktorer som aktiverar WNT / β-catenin-signalering i organoiderna, såsom WNT3a och R-Spondin. Studier på möss har visat att WNT-ligander är avgörande för livmoderutveckling och körtelfunktion; Därför är aktivering av denna signalväg avgörande för organoid utveckling och underhåll38,39. R-Spondin förstärker WNT-signalering och är liganden för den leucinrika repeterande G-proteinkopplade receptorn (LGR5)40. Endometrial organoidkulturer kräver också hämning av den transformerande tillväxtfaktorn β (TGFβ) och benmorfogenetiska protein (BMP) signalvägar. Till exempel innehåller endometrial organoid odlingsmedium BMP-hämmaren, Noggin, ett utsöndrat protein som binder till och inaktiverar BMP2, BMP4 och BMP741. Den farmakologiska hämmaren, A83-01, är också närvarande i endometrieorganoidmedium. A83-01 är en småmolekylär hämmare med hög specificitet till receptorerna ALK4, ALK5 och ALK742. ALK4/5/7 är typ 1-receptorer i TGFβ-signalfamiljen som binder till och sänder signaler som framkallas av ligander såsom TGFβ, aktivin eller nodal. BMP-signaler är avgörande för stamcellsunderhåll i vävnader som tarmen43 och hårsäckarna44. Hämning av TGFβ-signalering bidrar till den proliferativa kapaciteten och kolonibildningseffektiviteten hos endometriella mesenkymala stamceller45, vilket sker genom ombyggnad av nyckelregioner i kromatin46. Således är modulering av dessa två viktiga signalvägar, BMP och TGFβ, nödvändig för att upprätthålla organoidkulturer med självförnyelsekapacitet.

Även om det inte visas här, fann vi att långvarig odling av musorganoiderna med ALK4/5/7-hämmaren, A83-01, ledde till morfologiska förändringar i epitelorganoiderna efter tre eller fyra kontinuerliga passager (Kriseman et al., under granskning). De morfologiska förändringarna i epitelorganoiderna påminde om de "täta" epitelorganoiderna som beskrivs av Boretto et al.4, där utvecklingen av mer sekretoriska celler inträffade på grund av minskad parakrin utsöndring av WNT-ligander. Således är det troligt att TGFβ- och WNT-signalvägar skär varandra för att kontrollera endometrieepitelorganoidregenerering och differentiering.

Nya studier har genererat 3D-endometriella epiteliala / stromala samodlingssystem från mänskliga vävnader 7,8,16. En metod för samodling använder ett ställningsfritt system, där endometrieepitel- och stromaceller kombineras och får monteras i 3D-strukturer i en ställningsfri brunn med hjälp av ett definierat odlingsmedium. Dessa 3D-endometrieepiteliala / stromaorganoider uttrycker inte bara receptorer för östrogen, progesteron och androgen, utan rekapitulerar också troget svaret på äggstockshormoner - östrogen och progesteron 6,7. I en annan samodlingsmetod, som används i en studie av Rawlings et al., kombineras endometrieepitelorganoider med stromaceller i en kollagenmatris och odlas i ett modifierat organoidmedium8. Dessa epiteliala / stromala samodlade organoider, eller assembloider, organiserar sig i ett suspenderat 3D-system, där stromaceller omger epitelkörtelliknande strukturer.

Majoriteten av endometrieorganoider odlas i tillväxtfaktorreducerad gelmatris; Närvaron av aktiva föreningar i matrisen kan emellertid utöva oönskade cellulära svar inom organoiderna. För att övervinna denna begränsning har organoider etablerats i gelmatrisfria byggnadsställningar, såsom 3D-tryckta agarosformar där enskilda organoider får självmontera6. Andra grupper har utvecklat syntetiska hydrogeler för att fungera som 3D-matriser för odling av endometrieorganoider47. Dessa organoider samlas i 3D-strukturer med apikobasal polaritet och kan också kombineras med stromaceller i endometrium för att bilda komplexa organoider48. Eftersom organoider framgångsrikt kan användas för att odla icke-transformerade primära mänskliga och musendometriala vävnader på sätt som 2D-cellkulturer inte kan, råder det ingen tvekan om att endometrieorganoider kommer att främja kvinnors reproduktiva hälsa och vara ett otroligt verktyg för att studera reproduktiva patologier som återkommande graviditetsförlust, endometrios och endometriecancer16, 49,50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Stephanie Pangas och Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) för kritisk läsning och redigering av vårt manuskript. Studier stöddes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development bidrag R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) och R01-HD110038 (M.M.M.) och av NCI- P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. har ett Next Gen Pregnancy Award från Burroughs Wellcome Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987 (2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739 (2021).

Tags

Biologi Utgåva 191 endometrium organoider infertilitet livmoder regenerering
Etablera 3D-endometrieorganoider från musens livmoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z.,… More

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter