Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Het vaststellen van 3D-endometriumorganoïden uit de baarmoeder van de muis

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64448
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

Summary

Dit protocol beschrijft methodologieën om endometriumepitheelorganoïden van muizen vast te stellen voor genexpressie en histologische analyses.

Abstract

Endometriumweefsel bekleedt de binnenholte van de baarmoeder en staat onder de cyclische controle van oestrogeen en progesteron. Het is een weefsel dat is samengesteld uit luminaal en klierepitheel, een stromaal compartiment, een vasculair netwerk en een complexe immuuncelpopulatie. Muismodellen zijn een krachtig hulpmiddel geweest om het baarmoederslijmvlies te bestuderen en onthullen kritieke mechanismen die implantatie, placentatie en kanker beheersen. De recente ontwikkeling van 3D-endometriumorganoïde culturen presenteert een state-of-the-art model om de signaalroutes te ontleden die ten grondslag liggen aan endometriumbiologie. Het vaststellen van endometriumorganoïden uit genetisch gemanipuleerde muismodellen, het analyseren van hun transcriptomen en het visualiseren van hun morfologie met een resolutie van één cel zijn cruciale hulpmiddelen voor de studie van endometriumziekten. Dit artikel schetst methoden om 3D-culturen van endometriumepitheel van muizen vast te stellen en beschrijft technieken om genexpressie te kwantificeren en de histologie van de organoïden te analyseren. Het doel is om een bron te bieden die kan worden gebruikt om de genexpressie en morfologische kenmerken van endometriumepitheelorganoïden vast te stellen, te kweken en te bestuderen.

Introduction

Het endometrium - het binnenste bekledingsslijmvliesweefsel van de baarmoederholte - is een uniek en zeer dynamisch weefsel dat een cruciale rol speelt in de reproductieve gezondheid van een vrouw. Tijdens de reproductieve levensduur heeft het endometrium het potentieel om honderden cycli van proliferatie, differentiatie en afbraak te ondergaan, gecoördineerd door de gecoördineerde werking van de eierstokhormonen - oestrogeen en progesteron. Studies van genetisch gemanipuleerde muizen hebben fundamentele biologische mechanismen blootgelegd die de endometriumrespons op hormonen en de controle van embryo-implantatie, stromale celdecidualisatie en zwangerschap ondersteunen1. In vitro studies zijn echter beperkt geweest vanwege problemen bij het handhaven van niet-getransformeerde primaire endometriumweefsels van muizen in traditionele 2D-celculturen 2,3. Recente ontwikkelingen in de cultuur van endometriumweefsels als 3D-orgaansystemen, of organoïden, bieden een nieuwe kans om biologische routes te onderzoeken die de regeneratie en differentiatie van endometriumcellen regelen. Muis- en humaan endometriumorganoïde systemen zijn ontwikkeld uit zuiver endometriumepitheel ingekapseld in verschillende matrices 4,5, terwijl menselijk endometrium is gekweekt als steigervrije epitheliale / stromale co-culturen 6,7, en meer recent als collageen-ingekapselde epitheliale / stromale assembloïden8 . De groei en het regeneratieve potentieel van epitheliale organoïde culturen wordt ondersteund door een gedefinieerde cocktail van groeifactoren en kleine molecuulremmers die empirisch zijn vastgesteld om de groei en regeneratie van de organoïden te maximaliseren 4,5,9. Bovendien maakt het vermogen om endometriumorganoïden te bevriezen en te ontdooien het langdurig bankieren van endometriumorganoïden van muizen en mensen mogelijk voor toekomstige studies.

Genetisch gemanipuleerde muizen hebben de complexe signaalroutes onthuld die de vroege zwangerschap en decidualisatie regelen, en zijn gebruikt als modellen van zwangerschapsverlies, endometriumkanker en endometriose. Deze genetische studies zijn grotendeels bereikt met celspecifieke deletie van loxP geflankeerde allelen ("floxed") met behulp van cre-recombinasen die specifiek actief zijn in vrouwelijke voortplantingsweefsels. Deze muismodellen omvatten de veelgebruikte progesteronreceptor-cre10, die een sterke recombinase-activiteit heeft in de endometriumepitheel- en stromale weefsels, lactoferrine i-cre, dat endometriumepitheelrecombinatie induceert bij volwassen muizen11, of Wnt7a-cre, dat epitheliale-specifieke deletie veroorzaakt in van Müller afgeleide weefsels12 . Het kweken van endometriumweefsels uit genetisch gemanipuleerde muismodellen als 3D-organoïden heeft een uitstekende gelegenheid geboden om endometriumbiologie te onderzoeken en de identificatie van groeifactoren en signaalroutes te vergemakkelijken die de vernieuwing en differentiatie van endometriumcellen regelen13,14. Methoden voor de isolatie en kweek van muizenslijmbeenweefsel worden beschreven in de literatuur en rapporteren het gebruik van verschillende enzymatische strategieën voor de isolatie van baarmoederepitheel voor het daaropvolgende kweken van endometriumepitheelorganoïden4. Terwijl eerdere literatuur een kritisch kader biedt voor endometriumepitheel organoïde cultuurprotocollen 4,5,6, biedt dit artikel een duidelijke, uitgebreide methode voor het genereren, onderhouden, verwerken en analyseren van deze organoïden. Standaardisatie van deze technieken is belangrijk voor het versnellen van de vooruitgang op het gebied van reproductieve biologie van vrouwen. Hier rapporteren we een gedetailleerde methodologie voor de enzymatische en mechanische zuivering van endometriumepitheelweefsel van muizen voor de daaropvolgende kweek van endometriumorganoïden in een gelmatrixsteiger. We beschrijven ook de methodologieën voor downstream histologische en moleculaire analyses van de gelmatrix-ingekapselde muis endometriumepitheel organoïden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Muisbehandeling en experimentele studies werden uitgevoerd onder protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Baylor College of Medicine en richtlijnen die zijn vastgesteld door de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Isolatie van baarmoederepitheel van muizen met behulp van enzymatische en mechanische methoden

OPMERKING: In dit gedeelte worden de stappen beschreven die nodig zijn om epitheliale endometriumorganoïden van muizen vast te stellen, door te laten, te bevriezen en te ontdooien met behulp van een gelmatrixsteiger. Eerdere studies hebben vastgesteld dat optimale culturen van muizenendometriumorganoïden worden vastgesteld uit muizen tijdens de oestrusfase4, die kan worden bepaald door cytologisch onderzoek van een vaginaal uitstrijkje15. Volwassen vrouwelijke WT-muizen (6-8 weken oud, hybride C57BL/6J en 129S5/SvEvBrd) werden gebruikt voor alle experimenten. De muizen werden humaan geëuthanaseerd volgens door de IACUC goedgekeurde richtlijnen met behulp van isofluraan sedatie gevolgd door cervicale disarticulatie. Zodra de muizen zijn geëuthanaseerd, moeten de volgende stappen worden gevolgd. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over materialen en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.

  1. Laat de gelmatrix voor gebruik ongeveer 1-2 uur op ijs ontdooien.
  2. Om de muis te ontleden, gebruikt u een schaar om een middenlijnincisie op de buik te maken en de huid voorzichtig af te pellen om de onderliggende peritoneale laag bloot te leggen. Gebruik een tang om de peritoneale laag omhoog te houden en laterale incisies te maken met de schaar om de buikinhoud bloot te leggen.
    1. Lokaliseer de baarmoederhoorns door de buikvetkussens voorzichtig opzij te bewegen. Ontleed ze door ze eerst op de cervicale kruising te houden en een schaar te gebruiken om langs het mesenteriale vet te snijden. Verwijder na de dissectie van de baarmoeder van de muis grondig vetweefsel uit de baarmoederhoorn met een kleine schaar.
      OPMERKING: Handhaaf de steriliteit tijdens de celisolatie door alle chirurgische hulpmiddelen voor gebruik te steriliseren, de buik van de muis te besproeien met 70% ethanol en alle stappen na dissectie uit te voeren onder een steriele weefselkweekkap.
  3. Snijd elke baarmoederhoorn in kleine fragmenten van ongeveer 4-5 mm.
  4. Plaats alle baarmoederfragmenten van één baarmoeder in één putje van een 24-wellsplaat met 0,5 ml 1% Trypsine. Laat de enzymatische oplossing het baarmoederlumen binnendringen, waardoor enzymatische scheiding van het endometriumepitheel van het onderliggende stroma ontstaat.
  5. Incubeer de 24-wells plaat in een 37 °C bevochtigde weefselkweek incubator gedurende ongeveer 1 uur.
  6. Breng na de incubatie van 1 uur de baarmoederfragmenten over naar een weefselkweekplaat van 35 mm met 1 ml Dulbecco's fosfaatbufferoplossing (DPBS).
  7. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een fijne tang en een pipet van 1 ml om het baarmoederepitheel mechanisch van de baarmoederbuis te scheiden. Terwijl u het ene uiteinde van een baarmoederfragment met de tang vasthoudt, laat u de pipetpunt voorzichtig in de lengterichting over het fragment lopen en knijpt u het epitheel uit het andere uiteinde van de baarmoederbuis. Observeer de gescheiden epitheliale vellen van het baarmoederfragment onder de dissectiemicroscoop.
  8. Gebruik de pipet van 1 ml om de epitheliale vellen te verzamelen en voorzichtig over te brengen in een buis van 1,5 ml.
  9. Herhaal het proces voor de resterende baarmoederfragmenten en breng alle epitheliale vellen over naar dezelfde verzamelbuis.
  10. Pelleteer de gedissocieerde epitheelplaten door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 375 × g.
  11. Verwijder het supernatant voorzichtig om te voorkomen dat de celpellet wordt verstoord.
  12. Resuspendeer de celpellet in 0,5 ml collageenase van 2,5 mg/ml collagenase + 2 mg/ml DNase-oplossing. Pipetteer ongeveer 10x op en neer, of totdat een eencellige suspensie is bereikt.
  13. Voeg 0,5 ml DMEM/F12 + 10% foetaal runderserum (FBS) + antibiotica toe en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 375 × g.
    OPMERKING: Voor meer informatie over het breedspectrumantibioticum dat wordt gebruikt voor celkweek, raadpleegt u de tabel met materialen.
  14. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotica. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 375 × g.

2. Verwerking van het stromale compartiment

OPMERKING: In dit gedeelte worden de protocollen beschreven die nodig zijn voor het isoleren van het stromale compartiment van het muizenslijmvlies. Gezien de toenemende belangstelling voor epitheliale/stromale co-kweekexperimenten is het belangrijk om naast de epitheelcellen die organoïden genereren ook de stromale celpopulaties te kunnen verwerken.

  1. Zodra al het epitheel enzymatisch en mechanisch is gescheiden van de baarmoederfragmenten, zijn de resterende buisachtige structuren de "stromale / myometriale" compartimenten. Verzamel dit weefsel in een collageenase van 2,5 mg/ml + 2 mg/ml DNase in HBSS-oplossing.
  2. Incubeer het stromale/myometriale monster gedurende 15 minuten op een schudder van 37 °C.
  3. Voeg na incubatie 500 μL DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotica per muis toe en filter de niet-gedissocieerde fragmenten door een celfilter van 40 μm.
  4. Pelleteer de cellen door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 375 × g.
  5. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotica. Voeg het mengsel druppelsgewijs toe aan 10 ml DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotica in een celkweekplaat van 10 cm. Incubeer de plaat bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator.
  6. Om coculturen van endometriumepitheel- en stromale cellen van muizen te genereren, volgt u de methoden die zijn beschreven voor menselijke endometriumorganoïden met behulp van steigervrije of collageenmatrixsystemen 6,8.
    OPMERKING: Hoewel deze technieken nog niet zijn gepubliceerd voor muizen, kunnen ze worden aangepast op basis van de gepubliceerde protocollen met humaan endometrium.

3. Inkapseling van baarmoederepitheel in gelmatrix om organoïden vast te stellen

OPMERKING: Bewaar de gelmatrix op ijs totdat deze klaar is voor gebruik.

  1. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in een volume gelmatrix dat 20x dat is van dat van de celpellet (d.w.z. als de celpellet 20 μL is, resuspendeer de cellen met 400 μL gelmatrix). Resuspendeer de pellet zorgvuldig om te voorkomen dat er bubbels ontstaan.
  2. Laat de gelmatrix/celsuspensie gedurende ~10 min bij kamertemperatuur bezinken.
  3. Zodra de gelmatrix/celsuspensie een halfvaste gel wordt, gebruikt u een P200-micropipette met een brede boring van 200 μL om voorzichtig 25 μL van de gelmatrix/celsuspensie op te zuigen. Doseer drie afzonderlijke 25 μL domes per put van een 12-well plaat en laat de gelmatrix gedurende 15 minuten uitharden in een 37 °C bevochtigde weefselkweekincubator.
  4. Nadat de gelmatrix is uitgehard, voegt u 750 μL organoïde medium toe aan elke put met gelmatrixkoepels. Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde weefselkweekincubator.
    OPMERKING: Organoïde mediaformulering wordt vermeld in de tabel met materialen. Organoïden vormen zich meestal binnen 4 dagen na de eerste kweek.

4. Genexpressieanalyse van endometriumorganoïden na behandeling met oestradiol

OPMERKING: In dit gedeelte worden de methoden beschreven die worden gebruikt om de genexpressie van endometriumepitheelorganoïden te profileren met behulp van real-time qPCR na behandeling met oestradiol (E2; zie tabel 1). Omdat het endometrium onder de cyclische controle van het eierstokhormoon E2 staat, is het testen van de responsiviteit van de organoïden op E2 een belangrijke maat voor fysiologische functie. We hebben hoogwaardig RNA verkregen en voldoende mRNA gegenereerd om genexpressie te profileren met behulp van qPCR en/of RNA-sequencing van onze endometriumepitheelorganoïden. In deze sectie wordt beschreven hoe organoïden kunnen worden verzameld en verwerkt voor downstream-analyse van genexpressie. Het geselecteerde behandelingsmedium weerspiegelt het medium dat wordt gebruikt om gekweekte endometriumcellen te behandelen. Er moet echter worden opgemerkt dat dit behandelingsmedium dienovereenkomstig kan worden geoptimaliseerd, zoals gedaan voor de behandeling van menselijke endometrium 3D-culturen met hormonen 8,16,17.

  1. Kweek de endometriumorganoïden zoals hierboven beschreven.
  2. Verwijder het organoïde medium en vervang het vier dagen na het zaaien door 750 μL uithongeringsmedium. 's Nachts incuberen.
  3. Verwijder de volgende ochtend het uithongeringsmedium. Voeg 750 μL behandelingsmedium toe dat een medium of 10 nM E2 bevat. Incubeer gedurende 48 uur.
  4. Ga verder met RNA-isolatie volgens het protocol van de fabrikant van de kit.

5. Histologische analyse van endometriumorganoïden

OPMERKING: Het in beeld brengen van de morfologische kenmerken van endometriumorganoïden is van cruciaal belang voor het evalueren van het cellulaire effect van groeifactoren, genetische manipulaties of kleine molecuulremmers. Deze sectie beschrijft de technieken die worden gebruikt om endometriumepitheelorganoïden te fixeren, te verwerken en in beeld te brengen met behulp van histologische vlekken en antilichaamimmunofluorescente kleuring.

  1. Bereid 1,5 ml microcentrifugebuizen met 1 ml 4% paraformaldehyde in 1x PBS. Leg ze op ijs.
  2. Aspirateer het medium uit de putten van de 12-well plaat die de organoïden bevat.
  3. Breng met behulp van een pipetpunt van 1 ml met een gesneden punt 500 μL 4% paraformaldehyde over naar elke put en maak de gelmatrixkoepels voorzichtig los van de onderkant van de plaat.
  4. Zuig de volledige gelmatrixkoepels voorzichtig in de pipetpunt en breng over naar de microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  5. Bevestig de organoïden door ze 's nachts op een rotator bij 4 °C te plaatsen.
  6. De volgende ochtend centrifugeer je de buis op 600 × g gedurende 5 minuten om de organoïden te pelleteren. Verwijder de 4% paraformaldehyde-oplossing voorzichtig met een pipet en gooi deze weg. Was de organoïden 2x met 70% ethanol.
  7. Verwijder na de laatste wasbeurt alle behalve 50-100 μL ethanol uit de buis. Zet de buis opzij.
  8. Plaats een tube monsterverwerkingsgel in een waterbad en magnetron gedurende ~ 30 s om de gel te smelten. Zorg ervoor dat de monsterverwerkingsgel niet overkookt door de consistentie van de gel te controleren.
    OPMERKING: Zodra de monsterverwerkingsgel is gesmolten, maar niet kokend heet, werkt u snel om de organoïden in te kapselen.
  9. Breng voldoende monsterverwerkingsgel over om het hele oppervlak van de mal (ongeveer 250 μL) te bedekken.
  10. Terwijl de monsterverwerkingsgel nog steeds gesmolten is, brengt u snel de 50 μL 70% ethanoloplossing over die de organoïden bevat. Zorg ervoor dat de organoïden zijn verzonken of naar het onderste gedeelte van de mal zijn geduwd.
  11. Plaats de histologievorm op een emmer ijs en laat de monsterverwerkingsgel afkoelen en stollen.
  12. Zodra de monsterverwerkingsgel volledig droog is, brengt u het monsterverwerkingsgel vierkant zorgvuldig over naar een monsterzak en houdt u het vlak bij waar de organoïden zich bevinden.
  13. Plaats de zak in een histologiecassette en verwerk met behulp van standaardmethoden die worden gebruikt voor formalinefixatie en paraffine-inbedding van weefsels18.
  14. Na fixatie en inbedding in paraffine, sectie in secties van 5 μm met behulp van een microtoom19. Ga verder met standaard hematoxyline en eosine (H &E) kleuring of immunostaining procedures, zoals hieronder beschreven.

6. Hematoxyline &eosine kleuring

  1. Deparaffiniseer de secties als volgt: xyleen, 2 x 10 min; 100% ethanol, 2 x 3 min; 80% ethanol, 3 min; 60% ethanol, 3 min; dH2O, 2 x 3 min; 1 min in hematoxyline; kraanwater (3 x 5 s); 1 min in eosine.
  2. Droog de secties als volgt uit: 60% ethanol, 3 min; 80% ethanol, 3 min; 95% ethanol, 3 min; 100% ethanol, 2 x 3 min; xyleen, 2 x 15 min.
  3. Monteer met behulp van montagemedium.

7. Immunofluorescentiekleuring

  1. Deparaffiniseer de secties zoals beschreven in stap 6.1.
  2. Voer het ophalen van antigeen uit
    1. Dompel de dia's onder in een antigeen ophaaloplossing in een magnetronveilige container.
    2. Magnetron op hoog vuur gedurende 20 minuten, met intervallen van 5 minuten om ervoor te zorgen dat de oplossing niet overkookt.
  3. Nadat de antigeen ophaalstap van 20 minuten is voltooid, laat u de dia's gedurende 40 minuten op ijs afkoelen terwijl u nog steeds ondergedompeld bent in de buffer voor het ophalen van antigeen.
  4. Was de dia's met 1x TBST gedurende 3 min
  5. Blokkeer de dia's door 3% BSA in TBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te incuberen.
  6. Primaire antilichaam incubatie
    1. Verdun het antilichaam in 3% BSA in TBST (1:50-1:1.000, afhankelijk van Ab).
    2. Incubeer een nacht bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
    3. Wassen 3 x 5 min met TBST.
  7. Secundaire antilichaam incubatie
    1. Verdun het antilichaam in 3% BSA (in TBST) (1:250), of in 5% normaal ezelserum.
    2. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT) in het donker, omdat het antilichaam is geconjugeerd aan een fluorofoor.
  8. Nucleaire kleuring
    1. Verdun 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) 1:1.000 in TBST.
    2. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
    3. Was 2 x 5 min met TBST.
  9. Montage
    1. Gebruik één druppel montagemedium om de coverslip te monteren.
    2. Sluit de coverslip de volgende dag af met nagellak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fasecontrastbeelden van endometriumorganoïden van muizen
We hebben organoïden vastgesteld uit WT-muizenendometriumepitheel, zoals beschreven in het bijgevoegde protocol (zie diagram in figuur 1). Na enzymatische dissociatie van het endometriumepitheel van de muis werden epitheliale vellen mechanisch gescheiden van de stromale cellen van de baarmoeder en verder gedissocieerd met collagenase om een eencellige suspensie te genereren. Indien correct uitgevoerd, zou deze methode van epitheliale en stromale celscheiding monsters moeten opleveren met een verontreiniging van niet meer dan 10% -15% van het tegenovergestelde celtype (zie immunofluorescentiebeelden in figuur 2). De epitheelcelpellet werd vervolgens geresuspendeerd in gelmatrix, toegestaan om bij kamertemperatuur te gelen en verguld in 25 μL koepels op weefselkweekplaten. Nadat de gelmatrixkoepels waren gestold, werden ze bedekt met organoïde medium en mochten ze groeien. We zagen meestal dat endometriumepitheelcellen zich binnen 3-4 dagen tot organoïden verzamelden, zoals afgebeeld in figuur 3. De organoïden werden in cultuur gehouden, waarbij mediaveranderingen om de 3 dagen optraden en elke 5-7 dagen passeerden.

Beeldvorming van endometriumorganoïden bij muizen met behulp van histologische en immunofluorescente kleuring
Om de morfologie van de muisepitheelorganoïden te analyseren, hebben we methoden aangepast die worden gebruikt voor de inkapseling van cellulaire fijne naaldaspiraten met behulp van specimenverwerkingsgel20. Dit maakt het behoud van de endometrium organoïde morfologie en inkapseling in een matrix mogelijk die kan worden onderworpen aan verwerking ter voorbereiding op paraffine-inbedding. Specimen processing gel is een gemodificeerde agar die veel wordt gebruikt in klinische pathologie laboratoria voor de analyse van fijne naald aspiraten en is gebruikt om vaginale organoïdenin te kapselen 21,22. Nadat het monsterverwerkingsgel / organoïde mengsel stolt, kan het worden verwerkt, gekleurd en afgebeeld met technieken die meestal worden gebruikt om weefsels te analyseren. In figuur 4A, B, laten we zien dat gesegmenteerde formaline-vaste paraffine-ingebedde endometriumorganoïden kunnen worden gevisualiseerd door hematoxyline- en eosinevlekken, die de enkele laag epitheel en holle centra - de lumens - van de organoïden weergeven. Bepaalde organoïden bevatten ook afscheidingen in het lumen, wat aangeeft dat de organoïden de functionele eigenschappen van glandulaire epitheelcellen verwerven. We beschrijven ook technieken om de organoïden te visualiseren met behulp van immunostaining (figuur 4C,D); gesegmenteerde endometriumorganoïden werden geïncubeerd met een cytokeratine 8 primair antilichaam (TROMA-1) en een fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam (secundair anti-rat-594). Kernen werden vervolgens gevisualiseerd met DAPI en de dia's werden afgebeeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop. We zagen dat alle cellen in de organoïden Cytokeratine 8-positief waren en DAPI bevatten, wat aangeeft dat fixatie, inbedding en verwerking van de endometriumorganoïden compatibel is met op antilichamen gebaseerde immunostaining.

RNA-extractie en genexpressieanalyse
Om de genexpressierespons van endometriumorganoïden te bepalen, lieten we endometriumorganoïden van WT-muizen groeien gedurende 4 dagen na de eerste passage. Op de avond voor de behandeling werd het endometrium organoïde medium veranderd in uithongeringsmedium. De organoïden werden vervolgens behandeld in drievoudige putten (elk putje met drie koepels) met vehikel (ethanol; gelijk volume in oplossing als gebruikt voor oestradiol) of 10 nM oestradiol (E2) gedurende een totaal van 48 uur. Na 48 uur werd het medium verwijderd en werden de organoïden verwerkt voor RNA-extractie. Ongeveer 4 μg RNA kan worden verkregen uit in totaal twee koepels uit elke put, en 1 μg RNA werd gebruikt om cDNA om te keren. Amplificatie van de genen die coderen voor lipocaline 2 (Lcn2),lactoferrine (Ltf) en de progesteronreceptor (Pgr) werd uitgevoerd met behulp van real-time kwantitatieve PCR (figuur 5 en tabel 1)23,24,25. Zoals verwacht zagen we dat de expressie van Lcn2, Ltf en Pgr toenam in de epitheliale organoïden na stimulatie met 10 nM E2 (figuur 5). Deze resultaten tonen dus aan dat endometriumepitheelorganoïden met succes kunnen worden gebruikt om de genexpressieveranderingen als reactie op E2 te meten.

Figure 1
Figuur 1: Procedures die worden gebruikt om endometriumorganoïden vast te stellen. Diagram schetst de belangrijkste stappen die werden gevolgd om (A) epitheliale organoïden uit het muizenslijmvlies vast te stellen en (B) door te laten. (A) Methoden omvatten de enzymatische en mechanische dissociatie van endometriumepitheel uit de baarmoeder van de muis, gevolgd door eencellige dispersie en inkapseling van het epitheel in een gelmatrix. Om de baarmoederweefsels voor enzymatische dissociatie te verkrijgen, worden de eierstokken en eileiders met een fijne schaar uit de baarmoederhoorns verwijderd, zijdelings in fragmenten van 4-5 mm gesneden en vervolgens in de enzymoplossing geplaatst. Na enzymatische incubatie wordt het endometriumepitheel mechanisch gescheiden van het onderliggende stroma onder een microscoop met behulp van een tang en een pipet om het epitheel uit de baarmoederbuis te "persen". Het epitheel wordt verder verteerd in epitheelcellen met behulp van een korte incubatie in collagenase, gevolgd door inkapseling in een gelmatrix. (B) Het passeren van de endometriumorganoïden vereist mechanische dissociatie in koud medium en centrifugatie om de organoïden uit de matrix vrij te maken en kleinere organoïde fragmenten te genereren. Zodra de organoïden uit de matrix zijn vrijgegeven en mechanisch zijn gedissocieerd in kleinere fragmenten, worden ze ingekapseld in matrix en opnieuw geplateerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Immunostaining van geïsoleerde endometriumepitheel- en stromale celpopulaties. Immunofluorescentiebeelden tonen epitheliale en stromale celpopulaties van de (A,B) epitheelcel en (C,D) stromale celfracties na enzymatische en mechanische scheiding van de baarmoeder. Cytokeratine 8 (een epitheelcelmarker) wordt weergegeven in rood, vimentine (een stromale celmarker) wordt weergegeven in groen en DAPI (een nucleaire marker) wordt weergegeven in blauw. Schaalstaven = 100 μm (A,C), 20 μm (B,D). Afkortingen: CK8 = cytokeratine 8; VIM = vimentine; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Vorming van endometriumorganoïden uit WT-muizen in de loop van 4 dagen. Endometriumepitheel werd geïsoleerd uit een WT-muis en gebruikt om organoïden te genereren. (A) Fasecontrastbeeld van de epitheelcellen ingekapseld in de gelmatrix onmiddellijk na de spijsvertering (dag 0). (B,C) Een paar kleine organoïden kunnen worden waargenomen op dag 1 (B) en dag 2 (C) van de cultuur. (D) Grotere en volwassen epitheliale organoïden kunnen worden waargenomen op dag 3 van de kweek. Beelden zijn gemaakt met een 5x objectief; schaalstaven = 200 μm. Afkorting: WT = wild type. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Histologische analyse van endometriumorganoïden. (A,B) FFPE endometriumepitheelorganoïden werden doorsneden en gekleurd met H&E. (C,D) FFPE epitheliale organoïden werden immunostained met de epitheliale celmarker cytokeratine 8 (rood). Celkernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Schaalstaven = 200 μm (A), 100 μm (C), 50 μm (B,D). Afkortingen: FFPE = formaline-fixed paraffin embedded; H &E = hematoxyline & eosine; CK8 = cytokeratine 8; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Genexpressieanalyse van endometriumorganoïden bij muizen. Muis endometriumepitheelorganoïden van WT-muizen werden gedurende 4 dagen gekweekt in organoïde groeimedium, gevolgd door behandeling met vehikel of 10 nM E2 gedurende 48 uur in DMEM / F12 aangevuld met 2% houtskool-gestripte FBS. (A,B) Fasecontrastbeelden van de WT-muisorganoïden na behandeling met vehikel (A) of 10 nM E2 (B). (C-E) Real-time qPCR-analyse van epitheliale endometriumorganoïden behandeld met vehikel of 10 nM E2. Expressie van E2-gereguleerde genen, lipocaline 2 (Lnc2), lactoferrine (Ltf) en progesteronreceptor (Pgr). Staven vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM, geanalyseerd door een tweestaartige t-test; *p < 0,033, **p < 0,002, ***p < 0,001. Herhaald met organoïden afgeleid van n = 3 WT muizen per aandoening. Schaalstaven = 200 μm (A,B). Afkortingen: WT = wild type; E2 = oestradiol; qPCR = kwantitatieve PCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Primervolgorde Vooruit (5'-3') Achterzijde (5'-3')
Lipocaline 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrine (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesteron (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 fosfaatdehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT
PCR mengsel bevat:
2x SYBR Groen
0,5 μM Fwd Primer
0,5 μM Rev Primer
cDNA
RNAse/DNAse-vrij H2O
Cycler Voorwaarden:
Temperatuur Tijd Cycli
Houden 95 °C 10 min. 1
Denaturatie 95 °C 15 s 40
Verlengen 60 °C 60 s

Tabel 1: Primersequenties en PCR-condities.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschrijven we methoden om endometriumepitheelorganoïden te genereren uit muizenslijmvlies en de protocollen die routinematig worden gebruikt voor hun downstream-analyse. Endometriumorganoïden zijn een krachtig hulpmiddel om de mechanismen te bestuderen die endometriumgerelateerde ziekten beheersen, zoals endometriose, endometriumkanker en implantatiefalen. Baanbrekende studies gepubliceerd in 2017 rapporteerden de omstandigheden om langdurige en hernieuwbare culturen van endometriumorganoïden uit muis en humaan epitheelte kweken 4,5. Hoewel organoïden op grote schaal zijn gebruikt om biologische routes in andere systemen te bestuderen, is de studie van endometriumweefsel in vitro beperkt door de afwezigheid van een geschikt model om het niet-getransformeerde primaire epitheel in cultuur te bestuderen26. Endometriumorganoïden afgeleid van het endometrium van mens en muis werden met succes vastgesteld met behulp van aandoeningen die doorgaans worden gebruikt om organoïden te kweken uit andere orgaanweefsels, zoals darm, nieren en longen, en door ze in te bedden in een extracellulaire matrixsteiger bestaande uit gelmatrix4. Sinds deze eerste rapporten is het gebruik van endometriumorganoïden om de biologie van het baarmoederslijmvlies te bestuderen aanzienlijk toegenomen in de wetenschappelijke gemeenschap.

Door een eerder gepubliceerde methode van epitheliale isolatie van de baarmoeder van de muiste wijzigen 27,28, belicht dit protocol op unieke wijze de belangrijkste stappen om de baarmoeder van de muis te isoleren door het weefsel rechtstreeks in een enzymoplossing te plaatsen, de noodzaak om de baarmoeder te transecteren of filtratie te gebruiken te omzeilen. Met behulp van deze methode verkregen we epitheel met ~85%-90% zuiverheid, zoals bepaald door cytokeratine 8 en vimentine immunostaining (figuur 2). Dit protocol schetst ook duidelijk de belangrijkste details voor inkapseling van de geïsoleerde epitheelcellen in de groeimatrix voor generatie, onderhoud en passaging van de organoïden. De afbeeldingen in figuur 4 en onze ongepubliceerde studies hebben de aanwezigheid van mucines en glandulaire cellen (d.w.z. FOXA2-positief) in onze organoïde culturen geïdentificeerd29. Deze geven aan dat de hier gepresenteerde methode effectief is voor de isolatie van zowel glandulaire als luminaal-epitheelcelpopulaties uit het muizenslijmvlies.

Belangrijke beperkingen voor de groei van deze organoïden zijn het gebruik van de commerciële matrix (d.w.z. Matrigel), die kan resulteren in batch-tot-batch variaties en groeifactoren bevat die de groei van organoïden kunnen beïnvloeden. Bovendien, terwijl deze organoïden zuiver baarmoederepitheel bevatten, is het gebruik van extra endometriumceltypen (d.w.z. immuun, stromaal) onlangs beschreven in menselijke organoïde systemen van het endometrium 8,30. Andere groepen hebben het vermogen aangetoond om zowel luminale als glandulaire epitheelcellen voor organoïde culturen uit de baarmoeder van de muis te isoleren14.

Deze aanpak maakt gebruik van weefsels uit een klein diermodel dat relatief vaak voorkomt en beschikbaar is voor de meeste onderzoekers; het genereren van endometriumorganoïden uit grotere diermodellen, of mensen, kan ethische of technische uitdagingen opleveren, die kunnen worden overwonnen door gebruik te maken van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) -gebaseerde technieken. Dergelijke technologieën zijn eerder beschreven voor endometriumweefsels31, andere weefsels van het voortplantingskanaal32 en zijn effectief gebruikt om endometrium/placentale interacties in vitro te bestuderen 33. Vandaar dat het gebruik van iPSC's als een bron van endometriumstromale en epitheelcellen van het endometrium van mensen en andere modellen met grote dieren een hernieuwbare en toegankelijke bron vormt voor het genereren van endometriumorganoïden.

Hoewel de muis een veel gebruikt model is voor de studie van implantatie, zijn er belangrijke evolutionaire verschillen in het mechanisme van implantatie tussen muizen en mensen die moeten worden opgemerkt. Bijvoorbeeld, terwijl interstitiële implantatie wordt gekenmerkt door diepe trofoblastische invasie door het luminale epitheel in het onderliggende stroma, verschilt het mechanisme van het invasieproces tussen muizen en primaten34. Bij muizen omvat trofoblastinvasie door het luminale epitheel apoptose of entosis35,36, terwijl trofoblasten migreren tussen luminaal epitheel in het onderliggende stroma bij primaten34,35.

Het verstrekken van endometriumorganoïden met de nodige groeifactoren om zelfassemblage en langdurige vernieuwing te ondersteunen, is essentieel om endometriumorganoïde culturen te verkrijgen die het inheemse weefsel samenvatten. De complexe mediasamenstelling voor de endometriumorganoïden geeft de meerdere signaalroutes aan die bijdragen aan epitheelcelkenmerken en zouden voortkomen uit zowel paracriene als autocriene bronnen. Het stromale compartiment van het endometrium is een complexe verzameling van talrijke celtypen, waaronder fibroblastachtige stromale cellen, endotheel, macrofagen en andere gespecialiseerde immuuncellen die voortdurend veranderen als reactie op oestrogeen en progesteron37.

Het organoïde kweekmedium bevat bijvoorbeeld factoren die WNT/β-catenine signalering in de organoïden activeren, zoals WNT3a en R-Spondin. Studies bij muizen hebben aangetoond dat WNT-liganden van cruciaal belang zijn voor de ontwikkeling van de baarmoeder en de klierfunctie; daarom is activering van deze signaalroute van cruciaal belang voor de ontwikkeling en het onderhoud van organoïden38,39. R-Spondin versterkt de WNT-signalering en is het ligand van de leucinerijke repeat-containing G-protein coupled receptor (LGR5)40. Endometrium organoïde culturen vereisen ook remming van de transformerende groeifactor β (TGFβ) en botmorfogenetische eiwit (BMP) signaleringsroutes. Endometrium organoïde kweekmedium bevat bijvoorbeeld de BMP-remmer Noggin, een uitgescheiden eiwit dat bindt aan en inactiveert BMP2, BMP4 en BMP741. De farmacologische remmer, A83-01, is ook aanwezig in endometrium organoïde medium. A83-01 is een kleine molecuulremmer met een hoge specificiteit voor de receptoren ALK4, ALK5 en ALK742. ALK4/5/7 zijn type 1 receptoren van de TGFβ signaleringsfamilie die binden aan en signalen uitzenden die worden opgewekt door liganden zoals TGFβ, activine of nodaal. BMP-signalen zijn van cruciaal belang voor stamcelonderhoud in weefsels zoals dedarm 43 en haarzakjes44. Remming van TGFβ-signalering draagt bij aan de proliferatieve capaciteit en kolonievormingsefficiëntie van endometrium mesenchymale stamcellen45, die optreedt door het remodelleren van belangrijke gebieden in het chromatine46. Modulatie van deze twee belangrijke signaalroutes, BMP en TGFβ, is dus noodzakelijk om organoïde culturen met zelfvernieuwingscapaciteit te behouden.

Hoewel hier niet weergegeven, vonden we dat langdurige cultuur van de muisorganoïden met de ALK4/5/7-remmer, A83-01, leidde tot morfologische veranderingen in de epitheliale organoïden na drie of vier continue passages (Kriseman et al., besproken). De morfologische veranderingen in de epitheliale organoïden deden denken aan de "dichte" epitheliale organoïden beschreven door Boretto et al.4, waar de ontwikkeling van meer secretoire cellen optrad als gevolg van verminderde paracriene secretie van WNT-liganden. Het is dus waarschijnlijk dat TGFβ- en WNT-signaleringsroutes elkaar kruisen om de regeneratie en differentiatie van endometriumepitheel organoïden te beheersen.

Recente studies hebben 3D endometriumepitheel / stromale co-kweeksystemen gegenereerd uit menselijke weefsels 7,8,16. Een methode van co-kweken maakt gebruik van een steigervrij systeem, waarbij endometriumepitheel- en stromale cellen worden gecombineerd en in een steigervrije put kunnen worden samengevoegd tot 3D-structuren met behulp van een gedefinieerd kweekmedium. Deze 3D-endometriumepitheel / stromale organoïden drukken niet alleen receptoren uit voor oestrogeen, progesteron en androgeen, maar recapituleren ook getrouw de reactie op eierstokhormonen - oestrogeen en progesteron 6,7. In een andere co-kweekmethode, gebruikt in een studie van Rawlings et al., worden endometriumepitheelorganoïden gecombineerd met stromale cellen in een collageenmatrix en gekweekt in een gemodificeerd organoïde medium8. Deze epitheliale / stromale co-gekweekte organoïden, of assembloïden, organiseren zich in een opgeschort 3D-systeem, waar stromale cellen epitheliale klierachtige structuren omringen.

De meeste endometriumorganoïden worden gekweekt in groeifactor-gereduceerde gelmatrix; de aanwezigheid van actieve verbindingen in de matrix kan echter ongewenste cellulaire reacties in de organoïden uitoefenen. Om deze beperking te overwinnen, zijn organoïden vastgesteld in gelmatrixvrije steigers, zoals 3D-geprinte agarose-mallen waarin individuele organoïden zelf mogen assembleren6. Andere groepen hebben synthetische hydrogels ontwikkeld om te dienen als 3D-matrices voor de kweek van endometriumorganoïden47. Deze organoïden assembleren zich tot 3D-structuren met apicobasale polariteit en kunnen ook worden gecombineerd met stromale cellen van het endometrium om complexe organoïden te vormen48. Aangezien organoïden met succes kunnen worden gebruikt voor het kweken van niet-getransformeerde primaire menselijke endometriumweefsels op manieren die 2D-celculturen niet kunnen, lijdt het geen twijfel dat endometriumorganoïden het gebied van de reproductieve gezondheid van vrouwen zullen bevorderen en een ongelooflijk hulpmiddel zullen zijn voor het bestuderen van reproductieve pathologieën zoals terugkerend zwangerschapsverlies, endometriose en endometriumkanker16, 49,50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

We bedanken Dr. Stephanie Pangas en Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) voor het kritisch lezen en redigeren van ons manuscript. Studies werden ondersteund door Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development subsidies R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) en R01-HD110038 (M.M.), en door NCI- P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. heeft een Next Gen Pregnancy Award van het Burroughs Wellcome Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987 (2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739 (2021).

Tags

Biologie Nummer 191 endometrium organoïden onvruchtbaarheid baarmoeder regeneratie
Het vaststellen van 3D-endometriumorganoïden uit de baarmoeder van de muis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z.,… More

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter