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Biology

Établissement d’organoïdes endométriaux 3D à partir de l’utérus de souris

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64448
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

Summary

Ce protocole décrit des méthodologies pour établir des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris pour l’expression génique et les analyses histologiques.

Abstract

Le tissu endométrial tapisse la cavité interne de l’utérus et est sous le contrôle cyclique de l’œstrogène et de la progestérone. C’est un tissu composé d’épithélium luminal et glandulaire, d’un compartiment stromal, d’un réseau vasculaire et d’une population complexe de cellules immunitaires. Les modèles murins ont été un outil puissant pour étudier l’endomètre, révélant des mécanismes critiques qui contrôlent l’implantation, la placentation et le cancer. Le développement récent de cultures organoïdes endométriales 3D présente un modèle de pointe pour disséquer les voies de signalisation qui sous-tendent la biologie de l’endomètre. L’établissement d’organoïdes endométriaux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés, l’analyse de leurs transcriptomes et la visualisation de leur morphologie à une résolution unicellulaire sont des outils cruciaux pour l’étude des maladies de l’endomètre. Cet article décrit les méthodes permettant d’établir des cultures 3D d’épithélium endométrial à partir de souris et décrit des techniques pour quantifier l’expression des gènes et analyser l’histologie des organoïdes. L’objectif est de fournir une ressource qui peut être utilisée pour établir, cultiver et étudier l’expression génique et les caractéristiques morphologiques des organoïdes épithéliaux de l’endomètre.

Introduction

L’endomètre - le tissu muqueux interne de la muqueuse de la cavité utérine - est un tissu unique et très dynamique qui joue un rôle essentiel dans la santé reproductive d’une femme. Au cours de la vie reproductive, l’endomètre a le potentiel de subir des centaines de cycles de prolifération, de différenciation et de dégradation, coordonnés par l’action concertée des hormones ovariennes - œstrogènes et progestérone. Des études sur des souris génétiquement modifiées ont révélé des mécanismes biologiques de base qui sous-tendent la réponse endométriale aux hormones et le contrôle de l’implantation des embryons, de la décidualisation des cellules stromales et de la grossesse1. Les études in vitro, cependant, ont été limitées en raison des difficultés à maintenir les tissus primaires de l’endomètre de souris non transformés dans les cultures cellulaires 2D traditionnelles 2,3. Les progrès récents dans la culture de tissus endométriaux en tant que systèmes d’organes 3D, ou organoïdes, présentent une nouvelle opportunité d’étudier les voies biologiques qui contrôlent la régénération et la différenciation des cellules endométriales. Des systèmes organoïdes de l’endomètre de souris et d’homme ont été développés à partir d’épithélium endométrial pur encapsulé dans diverses matrices4,5, tandis que l’endomètre humain a été cultivé sous forme de co-cultures épithéliales/stromales sans échafaudage6,7, et plus récemment sous forme d’assemblages épithéliaux/stromaux encapsulés dans du collagène8 . Le potentiel de croissance et de régénération des cultures organoïdes épithéliales est soutenu par un cocktail défini de facteurs de croissance et d’inhibiteurs de petites molécules qui ont été déterminés empiriquement pour maximiser la croissance et la régénération des organoïdes 4,5,9. De plus, la capacité de congeler et de décongeler les organoïdes de l’endomètre permet la mise en banque à long terme d’organoïdes endométriaux provenant de souris et d’humains pour des études futures.

Des souris génétiquement modifiées ont révélé les voies de signalisation complexes qui contrôlent la grossesse précoce et la décidualisation, et ont été utilisées comme modèles de perte de grossesse, de cancer de l’endomètre et d’endométriose. Ces études génétiques ont été réalisées en grande partie avec la délétion spécifique à la cellule des allèles flanqués de loxP (« floxed ») en utilisant des recombinases cre qui sont spécifiquement actives dans les tissus reproducteurs femelles. Ces modèles murins comprennent le récepteur de progestérone-cre 10 largement utilisé, qui a une forte activité de recombinase dans les tissus épithéliaux et stromaux de l’endomètre, la lactoferrine i-cre, qui induit la recombinaison épithéliale de l’endomètre chez les souris adultes11, ou Wnt7a-cre, qui déclenche une délétion épithéliale spécifique dans les tissus dérivés de Müller12 . La culture de tissus endométriaux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés en tant qu’organoïdes 3D a fourni une excellente occasion d’étudier la biologie de l’endomètre et de faciliter l’identification des facteurs de croissance et des voies de signalisation qui contrôlent le renouvellement et la différenciation des cellules endométriales13,14. Les méthodes d’isolement et de culture du tissu endométrial de souris sont décrites dans la littérature et rapportent l’utilisation de diverses stratégies enzymatiques pour l’isolement de l’épithélium utérin pour la culture ultérieure d’organoïdes épithéliaux de l’endomètre4. Alors que la littérature précédente fournit un cadre critique pour les protocoles de culture organoïde épithéliale de l’endomètre 4,5,6, cet article fournit une méthode claire et complète pour générer, maintenir, traiter et analyser ces organoïdes. La normalisation de ces techniques est importante pour accélérer les progrès dans le domaine de la biologie de la reproduction des femmes. Ici, nous rapportons une méthodologie détaillée pour la purification enzymatique et mécanique du tissu épithélial de l’endomètre de souris pour la culture ultérieure d’organoïdes de l’endomètre dans un échafaudage à matrice de gel. Nous décrivons également les méthodologies pour les analyses histologiques et moléculaires en aval des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris encapsulés dans la matrice de gel.

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Protocol

La manipulation de souris et les études expérimentales ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine et aux lignes directrices établies par le Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Isolement de l’épithélium utérin de souris à l’aide de méthodes enzymatiques et mécaniques

REMARQUE : Cette section décrit les étapes requises pour établir, passer, congeler et décongeler les organoïdes épithéliaux de l’endomètre provenant de souris à l’aide d’un échafaudage à matrice de gel. Des études antérieures ont déterminé que des cultures optimales d’organoïdes endométriaux de souris sont établies à partir de souris pendant la phase4 de l’oestrus, ce qui peut être déterminé par l’examen cytologique d’un écouvillonnage vaginal15. Des souris WT femelles adultes (âgées de 6 à 8 semaines, hybrides C57BL/6J et 129S5/SvEvBrd) ont été utilisées pour toutes les expériences. Les souris ont été euthanasiées sans cruauté selon les directives approuvées par l’IACUC en utilisant une sédation à l’isoflurane suivie d’une désarticulation cervicale. Une fois les souris euthanasiées, les étapes suivantes doivent être suivies. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les matériaux et les solutions utilisés dans ce protocole.

  1. Laisser la matrice de gel décongeler sur la glace pendant environ 1-2 h avant utilisation.
  2. Pour disséquer la souris, utilisez des ciseaux pour faire une incision médiane sur l’abdomen et décollez doucement la peau pour exposer la couche péritonéale sous-jacente. Utilisez des pinces pour maintenir la couche péritonéale et faites des incisions latérales avec les ciseaux pour exposer le contenu abdominal.
    1. Localisez les cornes utérines en déplaçant doucement les coussinets graisseux abdominaux de côté. Disséquez-les en les tenant d’abord à la jonction cervicale et en utilisant des ciseaux pour couper le long de la graisse mésentérique. Après la dissection de l’utérus de souris, retirez soigneusement le tissu adipeux de la corne utérine avec de petits ciseaux.
      REMARQUE: Maintenir la stérilité pendant l’isolement cellulaire en stérilisant tous les outils chirurgicaux avant utilisation, pulvériser l’abdomen de la souris avec de l’éthanol à 70% et effectuer toutes les étapes suivant la dissection sous une capuche de culture tissulaire stérile.
  3. Coupez chaque corne utérine en petits fragments, chacun mesurant environ 4-5 mm.
  4. Placez tous les fragments utérins d’un utérus dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant 0,5 mL de trypsine à 1%. Permettre à la solution enzymatique de pénétrer dans la lumière utérine, provoquant une séparation enzymatique de l’épithélium endométrial du stroma sous-jacent.
  5. Incuber la plaque de 24 puits dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 °C pendant environ 1 h.
  6. Après 1 h d’incubation, transférer les fragments utérins dans une plaque de culture tissulaire de 35 mm contenant 1 mL de solution tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco.
  7. Au microscope à dissection, utiliser une pince fine et une pipette de 1 mL pour séparer mécaniquement l’épithélium utérin de la trompe utérine. Tout en maintenant enfoncée une extrémité d’un fragment utérin avec la pince, passez doucement l’embout de la pipette longitudinalement sur le fragment, en pressant l’épithélium hors de l’autre extrémité de la trompe utérine. Observez les feuillets épithéliaux séparés du fragment utérin au microscope à dissection.
  8. Utilisez la pipette de 1 mL pour recueillir et transférer délicatement les feuillets épithéliaux dans un tube de 1,5 mL.
  9. Répétez le processus pour les fragments utérins restants, en transférant toutes les feuilles épithéliales dans le même tube de collecte.
  10. Enduire les feuillets épithéliaux dissociés par centrifugation pendant 5 min à 375 × g.
  11. Retirez délicatement le surnageant pour éviter de déranger la pastille de cellule.
  12. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 0,5 mL de collagénase à 2,5 mg/mL + 2 mg/mL de solution de DNase. Pipeter de haut en bas environ 10x, ou jusqu’à ce qu’une suspension unicellulaire soit obtenue.
  13. Ajouter 0,5 mL de DMEM/F12 + 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) + antibiotiques, et centrifuger les cellules pendant 5 min à 375 × g.
    REMARQUE : Pour obtenir de plus amples renseignements sur l’antibiotique à large spectre utilisé pour la culture cellulaire, veuillez consulter le tableau des matériaux.
  14. Retirez délicatement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de DMEM/F12 + 10 % FBS + antibiotiques. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 375 × g.

2. Traitement du compartiment stromal

REMARQUE: Cette section décrit les protocoles nécessaires pour isoler le compartiment stromal de l’endomètre de souris. Compte tenu de l’intérêt croissant pour les expériences de co-culture épithéliale/stromale, il est important de pouvoir traiter les populations de cellules stromales en plus des cellules épithéliales qui généreront des organoïdes.

  1. Une fois que tout l’épithélium a été séparé enzymatiquement et mécaniquement des fragments utérins, les structures restantes en forme de trompe sont les compartiments « stromaux / myométrial ». Recueillir ce tissu dans une collagénase de 2,5 mg/mL + 2 mg/mL de DNase dans une solution HBSS.
  2. Incuber l’échantillon stromal/myométrial sur un agitateur à 37 °C pendant 15 min.
  3. Après l’incubation, ajouter 500 μL de DMEM/F12 + 10 % FBS + antibiotiques par souris et filtrer les fragments non dissociés à travers un filtre cellulaire de 40 μm.
  4. Enduire les cellules par centrifugation pendant 5 min à 375 × g.
  5. Retirez délicatement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de DMEM/F12 + 10 % FBS + antibiotiques. Ajouter le mélange goutte à goutte à 10 mL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotiques dans une plaque de culture cellulaire de 10 cm. Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié.
  6. Pour générer des co-cultures de cellules épithéliales et stromales de l’endomètre de souris, suivre les méthodes décrites pour les organoïdes de l’endomètre humain utilisant des systèmes matriciels sans échafaudage ou de collagène 6,8.
    NOTE: Bien que ces techniques n’aient pas encore été publiées pour les souris, elles peuvent être adaptées en fonction des protocoles publiés avec l’endomètre humain.

3. Encapsulation de l’épithélium utérin dans une matrice de gel pour établir des organoïdes

REMARQUE: Gardez la matrice de gel sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.

  1. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume de matrice de gel 20 fois celui de la pastille de cellule (c.-à-d. si la pastille de cellule est de 20 μL, remettre les cellules en suspension avec 400 μL de matrice de gel). Remettez soigneusement le granulé en suspension pour éviter d’introduire des bulles.
  2. Laisser la suspension de la matrice/cellule de gel se déposer à température ambiante pendant ~10 min.
  3. Une fois que la suspension de matrice/cellule de gel devient un gel semi-solide, utilisez une micropipette P200 avec une pointe de 200 μL de large alésage pour aspirer doucement 25 μL de la suspension de matrice/cellule de gel. Distribuer trois dômes distincts de 25 μL par puits d’une plaque de 12 puits et laisser durcir la matrice de gel pendant 15 minutes dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 °C.
  4. Une fois que la matrice de gel a durci, ajouter 750 μL de milieu organoïde à chaque puits contenant des dômes de matrice de gel. Incuber à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire humidifié.
    REMARQUE : La formulation des milieux organoïdes est indiquée dans le tableau des matériaux. Les organoïdes se forment généralement dans les 4 jours suivant la culture initiale.

4. Analyse de l’expression génique des organoïdes de l’endomètre après un traitement à l’œstradiol

REMARQUE : Cette section décrit les méthodes utilisées pour établir le profil de l’expression génique des organoïdes épithéliaux de l’endomètre à l’aide de la qPCR en temps réel après un traitement à l’œstradiol (E2; voir le tableau 1). Parce que l’endomètre est sous le contrôle cyclique de l’hormone ovarienne E2, tester la réactivité des organoïdes à E2 est une mesure importante de la fonction physiologique. Nous avons obtenu un ARN de haute qualité et généré suffisamment d’ARNm pour profiler l’expression génique en utilisant la qPCR et / ou le séquençage de l’ARN de nos organoïdes épithéliaux de l’endomètre. Cette section décrit comment collecter des organoïdes et les traiter pour l’analyse en aval de l’expression génique. Le milieu de traitement choisi reflète celui utilisé pour traiter les cellules endométriales en culture. Cependant, il convient de noter que ce milieu de traitement peut être optimisé en conséquence, comme pour le traitement des cultures 3D de l’endomètre humain avec des hormones 8,16,17.

  1. Culture des organoïdes de l’endomètre comme décrit ci-dessus.
  2. Retirer le milieu organoïde et le remplacer par 750 μL de milieu de famine quatre jours après l’ensemencement. Incuber pendant la nuit.
  3. Le lendemain matin, retirez le milieu de famine. Ajouter 750 μL de milieu de traitement contenant soit du véhicule, soit 10 nM d’E2. Incuber pendant 48 h.
  4. Procéder à l’isolement de l’ARN en suivant le protocole du fabricant du kit.

5. Analyse histologique des organoïdes endométriaux

REMARQUE: L’imagerie des caractéristiques morphologiques des organoïdes de l’endomètre est essentielle pour évaluer l’effet cellulaire des facteurs de croissance, des manipulations génétiques ou des inhibiteurs de petites molécules. Cette section décrit les techniques utilisées pour fixer, traiter et imager les organoïdes épithéliaux de l’endomètre à l’aide de colorations histologiques et de coloration immunofluorescente par anticorps.

  1. Préparer des tubes microcentrifuges de 1,5 mL contenant 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans 1x PBS. Placez-les sur de la glace.
  2. Aspirer le milieu des puits de la plaque de 12 puits contenant les organoïdes.
  3. À l’aide d’un embout de pipette de 1 mL avec un embout coupé, transférer 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits et détacher délicatement les dômes de la matrice de gel du fond de la plaque.
  4. Aspirer doucement les dômes entiers de la matrice de gel dans l’embout de la pipette et transférer dans le tube microcentrifuge de 1,5 mL.
  5. Fixez les organoïdes en les plaçant sur un rotateur à 4 °C pendant une nuit.
  6. Le lendemain matin, centrifuger le tube à 600 × g pendant 5 min pour enduire les organoïdes. Retirer délicatement la solution de paraformaldéhyde à 4 % à l’aide d’une pipette et jeter. Lavez les organoïdes 2x avec de l’éthanol à 70%.
  7. Après le dernier lavage, retirez tout sauf 50-100 μL d’éthanol du tube. Mettez le tube de côté.
  8. Placez un tube de gel de traitement des échantillons dans un bain-marie et micro-ondes pendant ~30 s pour faire fondre le gel. Assurez-vous que le gel de traitement de l’échantillon ne déborde pas en surveillant la consistance du gel.
    REMARQUE: Une fois que le gel de traitement de l’échantillon est fondu, mais pas bouillant, travaillez rapidement pour encapsuler les organoïdes.
  9. Transférer suffisamment de gel de traitement d’échantillon pour couvrir toute la surface du moule (environ 250 μL).
  10. Pendant que le gel de traitement de l’échantillon est encore fondu, transférer rapidement la solution d’éthanol à 50 μL à 70 % contenant les organoïdes. Assurez-vous que les organoïdes sont enfoncés ou poussés vers la partie inférieure du moule.
  11. Placez le moule histologique sur un seau de glace et laissez le gel de traitement de l’échantillon refroidir et se solidifier.
  12. Une fois que le gel de traitement de l’échantillon est complètement sec, transférez soigneusement le carré de gel de traitement de l’échantillon dans un sac à échantillons, en gardant une trace du plan où se trouvent les organoïdes.
  13. Placer le sac dans une cassette histologique et procéder en utilisant des méthodes standard utilisées pour la fixation du formol et l’incorporation de paraffine dans les tissus18.
  14. Après fixation et encastrement dans la paraffine, couper en sections de 5 μm à l’aide d’un microtome19. Procéder aux procédures standard de coloration ou d’immunomarquage à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E), comme indiqué ci-dessous.

6. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine

  1. Déparaffiner les sections comme suit : xylène, 2 x 10 min; 100% éthanol, 2 x 3 min; 80% d’éthanol, 3 min; 60% d’éthanol, 3 min; dH2O, 2 x 3 min; 1 min dans l’hématoxyline; eau du robinet (3 x 5 s); 1 min en éosine.
  2. Déshydrater les sections comme suit: 60% d’éthanol, 3 min; 80% d’éthanol, 3 min; 95% d’éthanol, 3 min; 100% éthanol, 2 x 3 min; xylène, 2 x 15 min.
  3. Montage à l’aide d’un support de montage.

7. Coloration par immunofluorescence

  1. Déparaffinisez les sections comme décrit à l’étape 6.1.
  2. Effectuer la récupération de l’antigène
    1. Immergez les lames dans une solution de récupération d’antigène dans un récipient allant au micro-ondes.
    2. Micro-ondes à feu vif pendant 20 min, en utilisant des intervalles de 5 minutes pour s’assurer que la solution ne déborde pas.
  3. Une fois l’étape de récupération de l’antigène de 20 minutes terminée, laissez les lames refroidir sur la glace pendant 40 minutes tout en étant immergées dans un tampon de récupération de l’antigène.
  4. Lavez les lames avec 1x TBST pendant 3 min
  5. Bloquer les lames en incubant dans 3% BSA dans TBST pendant 1 h à température ambiante.
  6. Incubation d’anticorps primaires
    1. Diluer l’anticorps dans 3% BSA dans TBST (1:50-1:1 000, selon Ab).
    2. Incuber pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
    3. Laver 3 x 5 min avec TBST.
  7. Incubation d’anticorps secondaires
    1. Diluer l’anticorps dans 3% BSA (dans TBST) (1:250), ou dans 5% de sérum d’âne normal.
    2. Incuber pendant 1 h à température ambiante (RT) dans l’obscurité, car l’anticorps est conjugué à un fluorophore.
  8. Coloration nucléaire
    1. Diluer le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) 1:1 000 dans le TBST.
    2. Incuber pendant 5 min à TA.
    3. Lavez 2 x 5 min avec TBST.
  9. Montage
    1. Utilisez une goutte de support de montage pour monter la lame.
    2. Scellez le couvercle à l’aide de vernis à ongles le lendemain.

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Representative Results

Images à contraste de phase d’organoïdes endométriaux de souris
Nous avons établi des organoïdes à partir de l’épithélium de l’endomètre de souris WT, comme décrit dans le protocole ci-joint (voir schéma de la figure 1). Après la dissociation enzymatique de l’épithélium de l’endomètre de souris, les feuillets épithéliaux ont été séparés mécaniquement des cellules stromales utérines et dissociés avec la collagénase pour générer une suspension unicellulaire. Si elle est effectuée correctement, cette méthode de séparation des cellules épithéliales et stromales devrait produire des échantillons avec une contamination ne dépassant pas 10% à 15% du type cellulaire opposé (voir les images d’immunofluorescence à la figure 2). La pastille de cellule épithéliale a ensuite été remise en suspension dans une matrice de gel, laissée geler à température ambiante et plaquée en dômes de 25 μL sur des plaques de culture tissulaire. Une fois les dômes de la matrice de gel solidifiés, ils ont été recouverts d’un milieu organoïde et autorisés à se développer. Nous avons généralement observé que les cellules épithéliales de l’endomètre s’assemblaient en organoïdes dans les 3-4 jours, comme illustré à la figure 3. Les organoïdes ont été maintenus en culture, avec des changements de milieux se produisant tous les 3 jours et passant tous les 5-7 jours.

Imagerie d’organoïdes endométriaux de souris à l’aide de coloration histologique et immunofluorescente
Pour analyser la morphologie des organoïdes épithéliaux de souris, nous avons adapté les méthodes utilisées pour l’encapsulation des aspirations cellulaires à l’aiguille fine à l’aide du gel de traitement des échantillons20. Cela permet de préserver la morphologie organoïde de l’endomètre et de l’encapsuler dans une matrice qui peut être soumise à un traitement en préparation de l’incorporation de paraffine. Le gel de traitement des échantillons est une gélose modifiée qui est largement utilisée dans les laboratoires de pathologie clinique pour l’analyse des aspirations à l’aiguille fine et qui a été utilisée pour encapsuler les organoïdes vaginaux21,22. Une fois que le mélange gel/organoïde de traitement de l’échantillon s’est solidifié, il peut être traité, coloré et imagé avec des techniques généralement utilisées pour analyser les tissus. Dans la figure 4A, B, nous montrons que les organoïdes endométriaux sectionnés fixés au formol et incorporés à la paraffine peuvent être visualisés par des colorations à l’hématoxyline et à l’éosine, qui présentent la couche unique d’épithélium et les centres creux - les lumières - des organoïdes. Certains organoïdes contiennent également des sécrétions dans la lumière, ce qui indique que les organoïdes acquièrent les propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales glandulaires. Nous décrivons également des techniques pour visualiser les organoïdes à l’aide de l’immunomarquage (Figure 4C,D); Les organoïdes endométriaux sectionnés ont été incubés avec un anticorps primaire de cytokératine 8 (TROMA-1) et un anticorps secondaire conjugué au fluorophore (anti-rat secondaire 594). Les noyaux ont ensuite été visualisés avec DAPI, et les lames ont été imagées à l’aide d’un microscope à fluorescence. Nous avons observé que toutes les cellules des organoïdes étaient positives à la cytokératine 8 et contenaient du DAPI, ce qui indique que la fixation, l’incorporation et le traitement des organoïdes de l’endomètre sont compatibles avec l’immunomarquage à base d’anticorps.

Extraction d’ARN et analyse de l’expression génique
Pour déterminer la réponse d’expression génique des organoïdes de l’endomètre, nous avons permis aux organoïdes de l’endomètre de souris WT de se développer pendant 4 jours après le premier passage. La veille du traitement, le milieu organoïde de l’endomètre a été changé en milieu de famine. Les organoïdes ont ensuite été traités dans des puits triples (chaque puits contenant trois dômes) avec du véhicule (éthanol; volume égal en solution comme celui utilisé pour l’œstradiol) ou 10 nM d’œstradiol (E2) pour un total de 48 h. Après 48 h, le milieu a été retiré et les organoïdes ont été traités pour l’extraction de l’ARN. Environ 4 μg d’ARN peuvent être obtenus à partir d’un total de deux dômes de chaque puits, et 1 μg d’ARN a été utilisé pour inverser la transcription de l’ADNc. L’amplification des gènes codant pour la lipocaline 2 (Lcn2), la lactoferrine (Ltf) et le récepteur de la progestérone (Pgr) a été réalisée par PCR quantitative en temps réel (Figure 5 et Tableau 1)23,24,25. Comme prévu, nous avons observé que l’expression de Lcn2, Ltf et Pgr augmentait dans les organoïdes épithéliaux suite d’une stimulation avec 10 nM E2 (Figure 5). Ainsi, ces résultats montrent que les organoïdes épithéliaux de l’endomètre peuvent être utilisés avec succès pour mesurer les changements d’expression génique en réponse à E2.

Figure 1
Figure 1 : Procédures utilisées pour établir les organoïdes de l’endomètre. Le diagramme décrit les étapes clés qui ont été suivies pour (A) établir et (B) passer les organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris. (A) Les méthodes comprennent la dissociation enzymatique et mécanique de l’épithélium de l’endomètre de l’utérus de souris, suivie de la dispersion unicellulaire et de l’encapsulation de l’épithélium dans une matrice de gel. Pour obtenir les tissus utérins pour la dissociation enzymatique, les ovaires et les oviductes sont retirés des cornes utérines avec de fins ciseaux, coupés latéralement en fragments de 4-5 mm, puis placés dans la solution enzymatique. Après l’incubation enzymatique, l’épithélium endométrial est séparé mécaniquement du stroma sous-jacent au microscope à l’aide d’une pince et d’une pipette pour « presser » l’épithélium de la trompe utérine. L’épithélium est ensuite digéré dans les cellules épithéliales en utilisant une courte incubation dans la collagénase, suivie d’une encapsulation dans une matrice de gel. (B) Le passage des organoïdes de l’endomètre nécessite une dissociation mécanique en milieu froid et une centrifugation pour libérer les organoïdes de la matrice et générer des fragments organoïdes plus petits. Une fois que les organoïdes ont été libérés de la matrice et dissociés mécaniquement en fragments plus petits, ils sont encapsulés dans la matrice et replaqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Immunomarquage de populations isolées d’épithélium endométrial et de cellules stromales. Les images d’immunofluorescence montrent les populations de cellules épithéliales et stromales des fractions de cellules épithéliales (A, B) et de cellules stromales (C, D) après séparation enzymatique et mécanique de l’utérus. La cytokératine 8 (un marqueur des cellules épithéliales) est représentée en rouge, la vimentine (un marqueur des cellules stromales) en vert et le DAPI (marqueur nucléaire) en bleu. Barres d’échelle = 100 μm (A,C), 20 μm (B,D). Abréviations : CK8 = cytokératine 8; VIM = vimentine; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Formation d’organoïdes endométriaux à partir de souris WT sur une période de 4 jours. L’épithélium de l’endomètre a été isolé d’une souris WT et utilisé pour générer des organoïdes. (A) Image de contraste de phase des cellules épithéliales encapsulées dans la matrice de gel immédiatement après la digestion (jour 0). (B,C) Quelques petits organoïdes peuvent être observés le jour 1 (B) et le jour 2 (C) de la culture. (D) Des organoïdes épithéliaux plus grands et matures peuvent être observés le jour 3 de la culture. Les images ont été capturées avec un objectif 5x; barres d’échelle = 200 μm. Abréviation : WT = type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse histologique des organoïdes de l’endomètre. (A,B) Les organoïdes épithéliales de l’endomètre FFPE ont été sectionnés et colorés avec H&E. (C,D) Les organoïdes épithéliaux FFPE ont été immunocolorés avec le marqueur de cellules épithéliales cytokératine 8 (rouge). Les noyaux cellulaires ont été colorés avec DAPI (bleu). Barres d’échelle = 200 μm (A), 100 μm (C), 50 μm (B,D). Abréviations : FFPE = paraffine fixée au formol incorporée; H & E = hématoxyline et éosine; CK8 = cytokératine 8; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Analyse de l’expression génique des organoïdes endométriaux de souris. Des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris provenant de souris WT ont été cultivés pendant 4 jours dans un milieu de croissance organoïde, suivis d’un traitement avec un véhicule ou 10 nM E2 pendant 48 heures dans du DMEM / F12 complété par du FBS dénudé à 2% de charbon de bois. (A,B) Images à contraste de phase des organoïdes de souris WT après traitement avec le véhicule (A) ou 10 nM E2 (B). (C-E) Analyse qPCR en temps réel d’organoïdes épithéliaux de l’endomètre traités avec véhicule ou 10 nM E2. Expression des gènes régulés par E2, lipocaline 2 (Lnc2), lactoferrine (Ltf) et récepteur de la progestérone (Pgr). Les barres représentent la moyenne ± SEM, analysée par un test t bilatéral; *p < 0,033, **p < 0,002, ***p < 0,001. Répété avec des organoïdes dérivés de n = 3 WT souris par condition. Barres d’échelle = 200 μm (A,B). Abréviations : WT = type sauvage; E2 = œstradiol; qPCR = PCR quantitative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Séquence d’amorce Avant (5'-3') Inverse (5'-3')
Lipocaline 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrine (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCTCGTTC
Progestérone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glycéraldéhyde 3 phosphate déshydrogénase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCTTCTT
Le mélange PCR contient:
2x SYBR Vert
0,5 μM d’amorce à traction avant
0,5 μM d’amorce Rev
ADNc
ARNase/ADNH2Olibre
Conditions du cycleur:
Température Heure Cycles
Tenir 95 °C 10 min 1
Dénaturer 95 °C 15 s 40
Étendre 60 °C 60 s

Tableau 1 : Séquences d’amorce et conditions de PCR.

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Discussion

Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de l’endomètre de souris et les protocoles couramment utilisés pour leur analyse en aval. Les organoïdes de l’endomètre sont un outil puissant pour étudier les mécanismes qui contrôlent les maladies liées à l’endomètre, telles que l’endométriose, le cancer de l’endomètre et l’échec de l’implantation. Des études marquantes publiées en 2017 ont rapporté les conditions de culture à long terme et renouvelables de cultures d’organoïdes endométriaux à partir d’épithélium de souris et d’humain 4,5. Bien que les organoïdes aient été largement utilisés pour étudier les voies biologiques dans d’autres systèmes, l’étude du tissu endométrial in vitro a été limitée par l’absence d’un modèle approprié pour étudier l’épithélium primaire non transformé en culture26. Les organoïdes endométriaux dérivés de l’endomètre humain et murin ont été établis avec succès en utilisant des conditions généralement utilisées pour cultiver des organoïdes à partir d’autres tissus organiques, tels que l’intestin, les reins et les poumons, et en les incorporant dans un échafaudage de matrice extracellulaire composé de la matrice de gel4. Depuis ces premiers rapports, l’utilisation des organoïdes de l’endomètre pour étudier la biologie de l’endomètre a considérablement augmenté dans la communauté scientifique.

En modifiant une méthode précédemment publiée d’isolement épithélial de l’utérus de souris27,28, ce protocole met en évidence de manière unique les étapes clés pour isoler l’utérus de souris en plaçant directement le tissu dans une solution enzymatique, en contournant le besoin de transecter l’utérus ou en utilisant la filtration. En utilisant cette méthode, nous avons obtenu un épithélium avec une pureté de ~85%-90%, déterminée par la cytokératine 8 et l’immunomarquage à la vimentine (Figure 2). Ce protocole décrit également clairement les détails clés pour l’encapsulation des cellules épithéliales isolées dans la matrice de croissance pour la génération, le maintien et le passage des organoïdes. Les images de la figure 4 et nos études non publiées ont identifié la présence de mucines et de cellules glandulaires (c.-à-d. FOXA2-positif) dans nos cultures organoïdes29. Ceux-ci indiquent que la méthode présentée ici est efficace pour l’isolement des populations de cellules glandulaires et épithéliales luminales de l’endomètre de souris.

Les principales limites de la croissance de ces organoïdes comprennent l’utilisation de la matrice commerciale (c.-à-d. Matrigel), qui peut entraîner des variations d’un lot à l’autre et contient des facteurs de croissance qui peuvent affecter la croissance des organoïdes. De plus, bien que ces organoïdes contiennent de l’épithélium utérin pur, l’utilisation d’autres types de cellules endométriales (immunitaires, stromales) a été récemment décrite dans les systèmes organoïdes humains de l’endomètre 8,30. D’autres groupes ont montré la capacité d’isoler à la fois les cellules épithéliales luminales et glandulaires pour les cultures organoïdes de l’utérusde souris 14.

Cette approche utilise des tissus provenant d’un modèle de petit animal qui est relativement commun et accessible à la plupart des chercheurs; La génération d’organoïdes endométriaux à partir de modèles animaux plus grands, ou d’humains, peut poser des défis éthiques ou techniques, qui peuvent être surmontés en utilisant des techniques basées sur les cellules souches pluripotentes induites (CSPi). De telles technologies ont déjà été décrites pour les tissus endométriaux31, d’autres tissus de l’appareil reproducteur 32 et ont été utilisées efficacement pour étudier les interactions endomètre/placentaire in vitro33. Par conséquent, l’utilisation des CSPi comme source de cellules stromales et épithéliales de l’endomètre de l’endomètre provenant d’humains et d’autres modèles de grands animaux constitue une source renouvelable et accessible pour la génération d’organoïdes endométrial.

Bien que la souris soit un modèle largement utilisé pour l’étude de l’implantation, il existe des différences évolutives clés dans le mécanisme d’implantation entre les souris et les humains qui doivent être notées. Par exemple, alors que l’implantation interstitielle est caractérisée par une invasion trophoblastique profonde à travers l’épithélium luminal dans le stroma sous-jacent, le mécanisme du processus d’invasion diffère entre les souris et les primates34. Chez la souris, l’invasion trophoblastique à travers l’épithélium luminal implique l’apoptose ou l’entose 35,36, tandis que les trophoblastes migrent entre l’épithélium luminal dans le stroma sous-jacent chez les primates 34,35.

Fournir aux organoïdes de l’endomètre les facteurs de croissance nécessaires pour soutenir l’auto-assemblage et le renouvellement à long terme est essentiel pour obtenir des cultures organoïdes de l’endomètre qui récapitulent le tissu natif. La composition complexe des milieux pour les organoïdes de l’endomètre indique les multiples voies de signalisation qui contribuent aux caractéristiques des cellules épithéliales et proviendrait à la fois de sources paracrines et autocrines. Le compartiment stromal de l’endomètre est un assemblage complexe de nombreux types de cellules, y compris les cellules stromales de type fibroblaste, l’endothélium, les macrophages et d’autres cellules immunitaires spécialisées qui changent constamment en réponse à l’œstrogène et à la progestérone37.

Par exemple, le milieu de culture organoïde contient des facteurs qui activent la signalisation WNT/β-caténine dans les organoïdes, tels que WNT3a et R-Spondin. Des études chez la souris ont démontré que les ligands WNT sont essentiels au développement utérin et à la fonction glandulaire; Par conséquent, l’activation de cette voie de signalisation est essentielle pour le développement et le maintien des organoïdes38,39. La R-Spondine amplifie la signalisation WNT et est le ligand du récepteur couplé à la protéine G (LGR5)40 riche en répétitions et contenant des répétitions. Les cultures organoïdes de l’endomètre nécessitent également l’inhibition des voies de signalisation du facteur de croissance transformant β (TGFβ) et de la protéine morphogénétique osseuse (BMP). Par exemple, le milieu de culture organoïde de l’endomètre contient l’inhibiteur de BMP, Noggin, une protéine sécrétée qui se lie et inactive BMP2, BMP4 et BMP741. L’inhibiteur pharmacologique, A83-01, est également présent dans le milieu organoïde de l’endomètre. A83-01 est un inhibiteur de petite molécule avec une spécificité élevée aux récepteurs ALK4, ALK5 et ALK742. ALK4/5/7 sont des récepteurs de type 1 de la famille de signalisation TGFβ qui se lient et transmettent des signaux induits par des ligands tels que TGFβ, l’activine ou le nodal. Les signaux BMP sont essentiels au maintien des cellules souches dans les tissus tels que l’intestin43 et les follicules pileux44. L’inhibition de la signalisation TGFβ contribue à la capacité de prolifération et à l’efficacité de la formation de colonies des cellules souches mésenchymateuses de l’endomètre45, ce qui se produit en remodelant des régions clés de la chromatine46. Ainsi, la modulation de ces deux voies de signalisation clés, BMP et TGFβ, est nécessaire pour maintenir des cultures organoïdes avec une capacité d’auto-renouvellement.

Bien que cela ne soit pas affiché ici, nous avons constaté que la culture à long terme des organoïdes de souris avec l’inhibiteur ALK4/5/7, A83-01, entraînait des changements morphologiques dans les organoïdes épithéliaux après trois ou quatre passages continus (Kriseman et al., en cours d’examen). Les changements morphologiques dans les organoïdes épithéliaux rappelaient les organoïdes épithéliaux « denses » décrits par Boretto et al.4, où le développement de cellules plus sécrétoires s’est produit en raison de la diminution de la sécrétion paracrine de ligands WNT. Ainsi, il est probable que les voies de signalisation TGFβ et WNT se croisent pour contrôler la régénération et la différenciation organoïdes épithéliales de l’endomètre.

Des études récentes ont généré des systèmes de co-culture épithéliale / stromale 3D de l’endomètre à partir de tissus humains 7,8,16. Une méthode de co-culture utilise un système sans échafaudage, dans lequel les cellules épithéliales et stromales de l’endomètre sont combinées et autorisées à s’assembler en structures 3D dans un puits sans échafaudage en utilisant un milieu de culture défini. Ces organoïdes épithéliaux / stromaux endométriaux 3D expriment non seulement les récepteurs des œstrogènes, de la progestérone et des androgènes, mais récapitulent également fidèlement la réponse aux hormones ovariennes - œstrogène et progestérone 6,7. Dans une autre méthode de co-culture, utilisée dans une étude de Rawlings et al., les organoïdes épithéliaux de l’endomètre sont combinés avec des cellules stromales dans une matrice de collagène et cultivés dans un milieu organoïde modifié8. Ces organoïdes épithéliaux / stromaux co-cultivés, ou assemblages, s’organisent en un système 3D suspendu, où les cellules stromales entourent des structures ressemblant à des glandes épithéliales.

La majorité des organoïdes de l’endomètre sont cultivés dans une matrice de gel réduite en facteur de croissance; Cependant, la présence de composés actifs dans la matrice peut exercer des réponses cellulaires indésirables au sein des organoïdes. Pour surmonter cette limitation, des organoïdes ont été établis dans des échafaudages sans matrice de gel, tels que des moules d’agarose imprimés en 3D dans lesquels les organoïdes individuels sont autorisés à s’auto-assembler6. D’autres groupes ont développé des hydrogels synthétiques pour servir de matrices 3D pour la culture d’organoïdes endométriaux47. Ces organoïdes s’assemblent en structures 3D à polarité apicobasale et peuvent également être combinés avec des cellules stromales de l’endomètre pour former des organoïdes complexes48. Étant donné que les organoïdes peuvent être utilisés avec succès pour cultiver des tissus primaires de l’endomètre humain et de souris non transformés d’une manière que les cultures cellulaires 2D ne peuvent pas, il ne fait aucun doute que les organoïdes de l’endomètre feront progresser le domaine de la santé reproductive des femmes et constitueront un outil incroyable pour étudier les pathologies de la reproduction telles que les pertes de grossesse récurrentes, l’endométriose et le cancer de l’endomètre16, 49,50.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions la Dre Stephanie Pangas et le Dr Martin M. Matzuk (M.M.M.) pour la lecture critique et la révision de notre manuscrit. Les études ont été soutenues par les subventions R00-HD00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.) et R01-HD110038 (M.M.M.), et par la subvention de soutien du centre de cancérologie NCI-P30 (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. est titulaire d’un prix Next Gen Pregnancy du Burroughs Wellcome Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT

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Biologie numéro 191 endomètre organoïdes infertilité utérus régénération
Établissement d’organoïdes endométriaux 3D à partir de l’utérus de souris
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Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z.,… More

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).

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