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Bioengineering

Hydrogels de collagène 3D Microtechnique avec alignement de fibres à longue portée

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

Ce protocole démontre l’utilisation d’un canal microfluidique avec une géométrie changeante le long de la direction d’écoulement du fluide pour générer une déformation d’extension (étirement) afin d’aligner les fibres dans un hydrogel de collagène 3D (<250 μm d’épaisseur). L’alignement résultant s’étend sur plusieurs millimètres et est influencé par la vitesse de déformation extensionnelle.

Abstract

Les fibres de collagène I alignées (COL1) guident la motilité des cellules tumorales, influencent la morphologie des cellules endothéliales, contrôlent la différenciation des cellules souches et sont une caractéristique des tissus cardiaques et musculo-squelettiques. Pour étudier la réponse cellulaire aux microenvironnements alignés in vitro, plusieurs protocoles ont été développés pour générer des matrices COL1 avec un alignement défini des fibres, y compris des méthodes magnétiques, mécaniques, cellulaires et microfluidiques. Parmi celles-ci, les approches microfluidiques offrent des capacités avancées telles que le contrôle précis des flux de fluides et du microenvironnement cellulaire. Cependant, les approches microfluidiques pour générer des matrices COL1 alignées pour les plateformes de culture in vitro avancées ont été limitées à de minces « tapis » (<40 μm d’épaisseur) de fibres de COL1 qui s’étendent sur des distances inférieures à 500 μm et ne sont pas propices aux applications de culture cellulaire 3D. Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer des matrices COL1 3D (130-250 μm d’épaisseur) avec des régions millimétriques d’alignement de fibres définies dans un dispositif microfluidique. Cette plate-forme fournit des capacités avancées de culture cellulaire pour modéliser des microenvironnements tissulaires structurés en fournissant un accès direct à la matrice de micro-ingénierie pour la culture cellulaire.

Introduction

Les cellules résident dans un réseau fibreux 3D complexe appelé matrice extracellulaire (ECM), dont la majeure partie est composée de la protéine structurelle collagène de type I (COL1)1,2. Les propriétés biophysiques de l’ECM fournissent des indices de guidage aux cellules et, en réponse, les cellules remodèlent la microarchitecture ECM 3,4,5. Ces interactions réciproques cellule-matrice peuvent donner naissance à des domaines fibreux COL1 alignés6 qui favorisent l’angiogenèse et l’invasion cellulaire dans l’environnement tumoral 7,8,9 et influencent la morphologie cellulaire 10,11,12, la polarisation 13 et la différenciation 14. Les fibres de collagène alignées favorisent également la cicatrisation des plaies 15, jouent un rôle clé dans le développement des tissus16 et contribuent à la communication cellulaire à longue distance17,18. Par conséquent, la réplication in vitro de la microarchitecture native de la fibre COL1 est une étape importante vers le développement de modèles structurés pour étudier les réponses cellulaires aux microenvironnements alignés.

Les systèmes de culture cellulaire microfluidique ont été établis comme une technologie privilégiée pour développer des systèmes microphysiologiques (MPS)19,20,21,22,23. Tirant parti des effets de mise à l’échelle microscopique favorables, ces systèmes fournissent un contrôle précis des écoulements de fluides, soutiennent l’introduction contrôlée de forces mécaniques et définissent le microenvironnement biochimique dans un microcanal 21,24,25,26,27. Les plateformes MPS ont été utilisées pour modéliser des microenvironnements spécifiques aux tissus et étudier les interactions multi-organes28. Simultanément, les hydrogels ont été largement explorés pour récapituler la mécanique 3D et l’influence biologique de l’ECM que l’on observe in vivo29,30. Avec un accent croissant sur l’intégration de la culture 3D avec des plates-formes microfluidiques, de nombreuses approches peuvent combiner des hydrogels COL1 dans des dispositifs microfluidiques31,32,33. Cependant, les méthodes d’alignement des hydrogels de COL1 dans les canaux microfluidiques ont été limitées à de minces « tapis » 2D (<40 μm d’épaisseur) dans des canaux de <1 mm de large, offrant un potentiel limité pour modéliser les réponses cellulaires dans des microenvironnements 3D alignés31,34,35,36.

Pour obtenir des hydrogels COL1 3D alignés dans un système microfluidique, il a été démontré que, lorsqu’une solution de COL1 auto-assemblée est exposée à des flux d’extension locaux (changement de vitesse le long de la direction du cours d’eau), les hydrogels COL1 résultants présentent un degré d’alignement des fibres directement proportionnel à l’ampleur de la vitesse de déformation d’extensionqu’ils subissent 37, 38. La conception du microcanal dans ce protocole est unique à deux égards ; premièrement, la conception segmentée introduit une contrainte d’extension locale à la solution COL1, et deuxièmement, sa construction en deux parties permet à l’utilisateur d’aligner les fibres COL1, puis de désassembler le canal pour accéder directement aux fibres alignées dans un format ouvert. Cette approche peut également être adoptée pour développer des plates-formes microfluidiques modulaires qui développent des systèmes microphysiologiques avec des matrices COL1 ordonnées. Le protocole suivant décrit le processus de fabrication de microcanaux segmentés et détaille l’utilisation des canaux pour aligner l’atelo COL1 bovin. Ce protocole fournit également des instructions pour la culture de cellules sur COL1 dans un format de puits ouvert et discute de l’ajout de fonctionnalités à la plate-forme à l’aide d’une couche de base modulaire et magnétique.

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Protocol

1. Fabrication du canal en deux parties et de la base de plate-forme modulaire

REMARQUE: Le canal microfluidique est construit en deux parties: le canal microfluidique « découpe », qui est coupé au rasoir à partir d’une feuille de polydiméthylsiloxane (PDMS) d’épaisseur définie, et le couvercle du canal, qui se lie de manière réversible à la découpe et forme le canal. Le canal est entouré d’un cadre en poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA) qui agira comme un réservoir de média (Figure 1). Le cadre en PMMA peut également être utilisé pour verrouiller magnétiquement des modules spécialisés pour plus de fonctionnalités.

  1. Canaux de coupe de rasoir à partir de feuilles PDMS:
    REMARQUE : La conception du canal microfluidique pour cette étape est fournie à la figure supplémentaire 1. Le canal se compose de cinq segments de 5 mm de longueur chacun et de largeurs de 10 mm, 5 mm, 2,5 mm, 1,25 mm et 0,75 mm. La vitesse de la solution de collagène, injectée à un débit constant (50-400 μL·min−1), augmente localement le long du canal à mesure que la largeur du canal diminue pour générer un flux d’extension.
    1. Montez une feuille PDMS de 250 μm d’épaisseur sur une feuille de support en plastique et découpez la conception microfluidique à l’aide d’une fraise artisanale à une profondeur de lame de 0,5 mm, une vitesse de 1 cm·s−1 et une force élevée.
    2. À l’aide d’un bain à ultrasons, nettoyez les découpes du canal microfluidique pendant 5 min. Rincer les canaux soniqués dans de l’eau désionisée (DI) et les sécher sur une plaque chauffante propre à 100 °C pendant 5 min.
    3. Conservez les canaux dans une boîte de Petri propre et couverte jusqu’à utilisation.
  2. Fabrication du couvercle PDMS et de la passivation de surface :
    REMARQUE : La découpe du canal de la section 1.1 nécessite un couvercle qui peut être placé sur celui-ci pour créer un canal fermé dans lequel une solution de COL1 peut être injectée (Figure 1 supplémentaire). Le couvercle peut être retiré après que le COL1 s’est auto-assemblé. Pour minimiser les risques que la COL1 dans le canal se lie à la couverture, la couverture est passivée à l’aide d’albumine sérique bovine (BSA). La conception du moule pour le couvercle PDMS est fournie. Le moule doit avoir une épaisseur d’au moins 2 mm et doit avoir une empreinte au sol égale à l’empreinte de la découpe du canal microfluidique. Dans ce protocole, l’empreinte du moule était de 35 mm x 15 mm.
    1. Pour préparer le moule, fixez une feuille d’adhésif sensible à la pression (PSA) sur une feuille de PMMA de 2,5 mm d’épaisseur et découpez au laser la forme de moule souhaitée.
    2. Nettoyez le moule en PMMA découpé au laser avec une lingette humide non pelucheuse et retirez le support du film PSA. Fixez le moule à une plaquette de silicium de 100 mm de diamètre en appuyant fermement vers le bas.
    3. Préparez PDMS dans un rapport de 10:1 (base:réticulation). Mélanger vigoureusement pendant 1 min pour assurer un bon mélange et dégazer le mélange dans une chambre à vide pour éliminer les bulles d’air.
    4. Verser la solution PDMS dégazée dans le moule en PMMA/silicium et durcir sur une plaque chauffante à 100 °C pendant 20 min. Laissez le moule refroidir, retirez le PDMS durci et coupez tout excès avec une lame de rasoir.
      REMARQUE: Assurez-vous que les côtés de la plaquette de silicium (côtés plats) des couvercles PDMS sont orientés vers le haut tout au long des étapes suivantes.
    5. Utilisez un poinçon de biopsie de 1 mm de diamètre pour créer des trous d’entrée et de sortie qui correspondent aux extrémités du canal microfluidique. La découpe du canal de l’étape 1.1 peut être utilisée comme gabarit pour guider la position des trous.
    6. Sonicer le couvercle dans de l’isopropanol (IPA) pendant 5 min, rincer à l’eau DI, sécher avec une source d’air comprimé, puis conserver dans une boîte de Petri propre et couverte. Placez la boîte de Petri dans une chambre de stérilisation UV (découverte) pendant 1 min pour stériliser.
    7. Couvercle et transférer dans une enceinte de biosécurité (ESB).
    8. Introduire à la pipette 300 μL de 40 mg•mL-1 d’albumine sérique bovine (BSA) dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur les couvercles PDMS et étaler la solution uniformément à l’aide d’un embout de pipette. Placer au réfrigérateur à 4 °C pendant au moins 4 h avant utilisation.
    9. Déplacez les couvercles du réfrigérateur dans une ESB, lavez 5x avec 1x PBS et laissez-les sécher à l’air pendant 10 min.
      REMARQUE: Les couvercles PDMS peuvent être conservés au réfrigérateur jusqu’à 1 semaine après les avoir recouverts de BSA.
  3. Traitement au glutaraldéhyde des lamelles de couverture
    REMARQUE: La fonctionnalisation des lamelles de couverture avec du glutaraldéhyde lie de manière covalente COL1 à la lamelle de couverture et empêche l’hydrogel de se détacher.
    1. Préparer une solution de triéthoxysilane aminopropylique à 2 % (v/v) (APTES) dans un bécher en verre en ajoutant 1 mL d’APTES à 49 mL d’acétone.
    2. Diluer une solution de glutaraldéhyde à 25% à 5% dans de l’eau DI. Faire 2 mL de solution pour chaque lamelle de couverture de 24 mm x 50 mm. Pour les lamelles de couverture de 24 mm x 24 mm ou 22 mm x 22 mm, préparer 1 mL de solution pour chacune.
    3. Nettoyez les lamelles de couverture dans un sonicateur de bain pendant 5 min en utilisant de l’IPA. Rincez l’IPA des lamelles de couverture à l’aide d’eau DI. L’IPA est complètement rincée lorsqu’une pellicule d’eau lisse peut être vue sur la lame.
    4. Sécher les lames de couverture sur une plaque chauffante pendant 5 min à 100 °C. Placez les lamelles de couverture séchées dans des boîtes de Petri propres, en veillant à ce qu’elles ne se chevauchent pas.
    5. À l’aide d’une baguette de décharge corona, exposez les lamelles de couverture à une décharge corona pendant 1 min chacune.
      REMARQUE: Cette étape doit être effectuée dans un endroit bien ventilé ou une hotte chimique.
    6. Retirez les lamelles de couverture de la boîte de Pétri, puis immergez-les dans la solution APTES pendant 10 s dans les 5 minutes suivant l’exposition corona, en veillant à ce que la lamelle de couverture soit immergée.
      REMARQUE: Assurez-vous de garder une trace du côté qui a été traité avec du plasma et de le garder orienté vers le haut.
    7. Ensuite, plongez la lamelle de couverture dans l’acétone pendant 10 s et séchez-la à l’air comprimé. Replacez la housse sèche dans la boîte de Pétri, côté traité vers le haut.
      REMARQUE : Répétez les étapes 1.3.5 à 1.3.7 pour tous les bordereaux de couverture.
    8. Introduire à la pipette 1 mL de solution de glutaraldéhyde sur la surface de chaque lamelle de couverture. Couvrez autant de surface que possible sans laisser la solution se répandre sur le bord de la lamelle de couverture. Plus de solution de glutaraldéhyde peut être ajouté si nécessaire. Assurez-vous de ne pas rayer la surface avec l’embout de la pipette.
    9. Laisser les lames de couverture au contact de la solution pendant 30 min, puis rincer à l’eau DI pendant 20 s. Sécher les lamelles de couverture à l’air comprimé et les remettre dans les boîtes de Pétri, côté plasma traité vers le haut.
      REMARQUE: Les lamelles de couverture peuvent être conservées jusqu’à 1 semaine à température ambiante (RT).
  4. Découpe laser de la base magnétique modulaire
    REMARQUE : La conception de la base magnétique modulaire est fournie à la figure supplémentaire 1. La base modulaire sert de puits pour maintenir le support et peut également être utilisée pour fixer magnétiquement des modules spécialisés, comme décrit dans les travaux précédemment publiés 22,37,38,39.
    1. Découpez les conceptions de la couche de PMMA à l’aide des réglages laser appropriés tels que le nombre de passes et la puissance.
      REMARQUE: Les réglages laser doivent être ajustés de manière à ce que les aimants puissent être insérés dans la couche de PMMA. Chaque laser est différent et les paramètres de coupe doivent être optimisés expérimentalement. Pour un laser de 45 W, une vitesse de 100%, une puissance de 100% et 3 passes sont recommandées pour couper du PMMA de 2 mm à 2 mm d’épaisseur.
    2. Lavez la pièce découpée au laser à l’eau et au savon pour éliminer les débris du processus de découpe au laser.
      REMARQUE: N’utilisez pas de solvants pour nettoyer les pièces découpées au laser. Les solvants peuvent entraîner la propagation de microfissures dans les bords découpés au laser.
  5. Assemblage de la plateforme
    1. Poussez les aimants (3/16 de diamètre, 1/16 de pouce d’épaisseur) à la main dans la base découpée au laser. Un marteau souple ou une extrémité de tournevis peut être utilisé pour aider à pousser l’aimant. L’épaisseur des aimants doit être inférieure à l’épaisseur de la base en PMMA pour s’assurer que les aimants affleurent la surface de la base.
      REMARQUE: Les aimants permettent à l’utilisateur d’ajouter des fonctionnalités à la plate-forme en attachant des modules supplémentaires.
    2. Décollez le support de la feuille de PSA et fixez la base à une lamelle de couverture traitée au glutaraldéhyde avec le côté fonctionnalisé vers le haut.
    3. Placez délicatement la découpe du canal PDMS dans la cavité définie par le cadre. Appuyez avec une pince à épiler à bout large pour éliminer les bulles d’air et assurer le contact conforme.
    4. Placez le couvercle du canal traité BSA sur le dessus de la découpe du canal, avec le côté BSA vers le bas. Assurez-vous que les orifices d’entrée et de sortie du fluide sont alignés avec le canal.
    5. L’appareil est prêt pour l’injection de COL1.

2. Injection de la solution de COL1 dans le microcanal et retrait du couvercle pour les applications de culture cellulaire

  1. Préparation de la solution COL1
    1. Placez tous les réactifs requis (solution mère de COL1 [6 mg·mL−1], eau ultrapure, 10x PBS, 0,1 M NaOH) sur de la glace dans l’enceinte de biosécurité.
    2. Calculer le volume de réactifs comme suit
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      Equation 4
      REMARQUE : Par conséquent, pour obtenir 1 mL de collagène neutralisé de 2,5 mg·mL−1 à partir d’un stock de 6 mg·mL−1, ajoutez 416,67 μL de collagène, 429,16 μL d’eau DI, 100 μL de 10x PBS et 54,16 μL de NaOH 0,1 M pour un pH final de 7. Ajouter 20 μL de NaOH 0,1 M pour atteindre un pH de 9,0.
    3. Ajouter les réactifs dans un flacon vide de 5 mL dans l’ordre suivant : i) stock de COL1, ii) eau DI, iii) 10x PBS, iv) 0,1 M NaOH.
      REMARQUE : Utilisez une pipette de déplacement pour manipuler la solution COL1. Une perte importante de l’échantillon peut se produire si une pipette ordinaire est utilisée, ce qui entraîne des fluctuations de la concentration de la solution finale.
    4. Augmentez le pH de la solution au pH désiré (généralement entre 7 et 9).
  2. Injection de la solution de COL1
    1. Placer une pompe à seringue, une seringue stérile réfrigérée, une solution de COL1 neutralisée réfrigérée et une aiguille de verrouillage Luer stérile à 20 G à 90° dans une enceinte de biosécurité. Chargez la solution de COL1 dans la seringue en prenant soin d’éviter l’introduction de bulles.
    2. Fixez l’embout de l’aiguille à 90° 20 G à la seringue, chargez la seringue dans la pompe à seringue, aiguille tournée vers le bas, et amorcez l’aiguille avec la solution COL1.
    3. Réglez la pompe à seringue au débit requis, entre 50 et 2 000 μL/min.
    4. Placez les canaux PDMS préparés (section 1) sur une prise de laboratoire et mettez-les au niveau de l’aiguille.
    5. Insérez l’aiguille dans l’orifice d’entrée du canal PDMS (côté large). Injecter le canal jusqu’à ce qu’une goutte de ~30 μL de COL1 s’accumule du côté de la sortie.
    6. Abaissez la prise de laboratoire et séparez doucement l’aiguille du canal nouvellement rempli.
    7. Répétez les étapes 2.2.5-2.2.9 jusqu’à ce que tous les canaux aient été remplis avec la solution COL1.
    8. Chargez les canaux remplis dans les boîtes de Petri à côté d’une lingette propre et non pelucheuse saturée d’eau DI pour éviter la déshydratation du gel COL1 nouvellement formé.
    9. Couvrir la boîte de Petri et placer les canaux chargés dans l’incubateur (37 °C, 95% d’humidité) pendant 2 h avant l’étape de décollage.
  3. Décollement et équilibrage du milieu
    1. Exposez le gel COL1 polymérisé en soulevant le couvercle PDMS à l’aide d’une pince à épiler. Le traitement BSA empêche COL1 de se fixer au couvercle.
    2. Ajouter 650 μL d’EGM au puits.
    3. Laisser les appareils dans l’incubateur (37 °C, 95% d’humidité) pendant au moins 4 h pour équilibrer le gel et le média. Remplacez le média avant l’ensemencement par des cellules
  4. Cellules d’ensemencement
    1. Placer tiède 0,25 % de trypsine et de milieux de culture avec le nombre requis de pipettes de 5 mL et 10 mL dans l’enceinte de biosécurité.
    2. Culture de cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines (HUVEC) à 80% de confluence dans les milieux de croissance endothéliale (EGM) à 37 °C, dans 95% d’humidité. Placer la fiole de culture tissulaire contenant des HUVECs dans l’ESB après vérification de la confluence au microscope.
    3. Jeter le média dans la fiole T25 et laver les cellules 2x avec 1x PBS. Ajouter 1 mL de trypsine dans la fiole et la placer dans l’incubateur (37 °C, 95 % d’humidité) pendant 3 min.
    4. Vérifiez la fiole au microscope après 3 min pour vous assurer que les cellules sont complètement détachées de la surface.
    5. Ajouter 3 mL d’EGM (avec sérum) dans la fiole pour neutraliser la trypsine. Ensuite, transférez la solution cellulaire à l’aide d’une pipette de 5 mL dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger le tube conique contenant les cellules à 150 x g pendant 5 min.
    6. Placez le tube conique dans l’enceinte de biosécurité et jetez le surnageant sans perturber la pastille de cellule. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de milieux de culture frais.
    7. Ajouter et mélanger 15 μL de bleu de trypan et 15 μL de la solution cellulaire remise en suspension dans un tube conique de 1 mL.
    8. Injecter du bleu trypan et une solution cellulaire des deux côtés d’une lame de comptage de cellules et insérer la lame dans un dispositif de comptage de cellules.
    9. Diluer la solution cellulaire dans un milieu de croissance endothélial à la concentration requise en fonction de la concentration cellulaire obtenue à partir du dispositif de comptage cellulaire.
      REMARQUE : Une fiole T25 de HUVECs à 80 % de confluence donnera ~750 000 cellules·ml−1 si elle est diluée dans 1 mL de milieu. Le volume de la suspension cellulaire à ensemencer est calculé en fonction de la surface de culture × de la densité/concentration cellulaire de la suspension cellulaire. Exemple : Pour ensemencer 20 000 cellules·cm−2 dans le puits de 35 mm x 15 mm, il faudra ~140 μL de suspension cellulaire.
    10. Aspirez le média sur la matrice COL1 modifiée.
    11. Ajouter le volume requis de la solution cellulaire sur le substrat COL1 et laisser les cellules se déposer pendant au moins 4 heures avant l’imagerie.
  5. Marquage du noyau cellulaire et du cytosquelette
    1. Aspirer le média des cellules et laver 3x avec 1x PBS, 500 μL à chaque lavage. Couvrir la couche cellulaire avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 min à TA.
    2. Aspirer le paraformaldéhyde et laver avec 1x PBS Tween-20 pendant 5 min.
    3. Perméabiliser la membrane cellulaire en utilisant 500 μL de solution de Triton-X à 0,1% dans du PBS pendant 15 min. Laver avec 1x PBS Tween-20 pendant 5 min.
    4. Bloquer les sites de liaison non spécifiques avec 500 μL de BSA à 4% dans PBS pendant 30 minutes à TA.
    5. Diluer la solution de marquage fluorescent phalloïdine-actine dans 4% BSA (1 μL de stock dans 400 μL de BSA).
    6. Aspirer la solution BSA, ajouter la solution de phalloïdine aux cellules et attendre 30 minutes à TA.
    7. Diluer la coloration nucléaire dans 4% BSA (1 μL dans 500 μL), aspirer la phalloïdine, ajouter la solution de coloration nucléaire fonctionnelle et attendre 15 minutes à TA.
    8. Aspirer la solution de travail de coloration nucléaire, laver avec PBS Tween-20 3x pendant 5 min chacun, et remplacer par 1x PBS avant l’imagerie.
    9. Image à l’aide d’un microscope épifluorescent utilisant le canal FITC (ex 491 nm/em 516 nm) et le canal DAPI (ex 360 nm/em 460 nm) avec une lentille 40x. Imagez le collagène à l’aide d’une confocale à balayage laser en mode réflectance en utilisant la ligne laser 488 nm (puissance 15%) et l’objectif d’immersion dans l’eau 40x.

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Representative Results

Lorsqu’une solution de COL1 auto-assemblée s’écoule dans un canal dont la section transversale diminue, la vitesse du flux (v x) de la solution de COL1 augmente localement d’une magnitude, ∂v x, le long de la constriction entre les deux segments (∂x), ce qui entraîne une vitesse de déformation d’extension (ε̇) où ε̇ = ∂v x/∂x. Le taux de déformation d’extension peut être calculé à partir de la vitesse du fluide, qui est mesurée à l’aide de la vélocimétrie par image de particules (PIV), comme le montre la figure 2.

Auparavant, il a été démontré que la déformation d’extension locale favorise l’alignement à longue distance des fibres COL137,38,40 (Figure 3). L’alignement du COl1 est directement influencé par l’ampleur de la vitesse de déformation d’extension dans la constriction et peut être observé comme s’étendant uniformément sur toute la longueur de 5 mm du segment. Pour mesurer l’alignement des fibres, des images de microscopie à réflectance confocale (CRM) des fibres ont été utilisées pour créer un histogramme de l’alignement des fibres. Le coefficient d’alignement (CoA) est la fraction de fibres alignées à moins de ±15° de la valeur du mode dans l’histogramme 38,42,43,44. Les plages de CoA vont de 0 à 1 avec des valeurs >0,5 ont été considérées comme alignées.

L’injection d’un hydrogel 3D dans des microcanaux traditionnels et scellés limite les limites où les milieux et les cellules peuvent être introduits dans la matrice. Le canal en deux parties de ce protocole surmonte la limitation de l’accès à un hydrogel dans un canal en permettant à l’utilisateur de soulever le couvercle du canal et d’accéder directement à l’ensemble de la matrice COL1. Le décollage du canal est activé en fonctionnalisant la lamelle de couverture en verre avec du glutaraldéhyde pour favoriser la fixation de COL1 à l’aide d’interactions amine-aldéhyde-amine et en fonctionnalisant le couvercle PDMS avec BSA pour empêcher l’adsorption de COL1 sur le couvercle. L’alignement de la fibre COL1 n’est pas affecté après le décollage du couvercle, comme le montre visuellement la figure 4.

Les substrats COL1 alignés sont connus pour influencer l’alignement cellulaire en dirigeant les protubérances 9,12,45,46 et, à leur tour, l’organisation des filaments de contrainte. Les cellules endothéliales des segments COL1 non alignés et alignés ont été imagées pour étudier la réponse cellulaire aux matrices COL1 développées à l’aide de ce protocole. Les cellules ont été fixées et colorées 4 h après l’ensemencement. Des images représentatives des HUVECs cultivées sur le segment aligné de la matrice ont montré une augmentation de l’alignement des fibres d’actine par rapport aux HUVECs sur le segment avec des fibres aléatoires (Figure 5).

Figure 1
Figure 1 : Schéma montrant l’assemblage des couches. Cette figure a été adaptée avec la permission d’Ahmed et al.38. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Taux de déformation du canal étagé et de la déformation d’extension. (A) Schéma du canal étagé avec dimensions. Le début montre le calcul de la vitesse de déformation d’extension. Le taux de déformation d’extension dans chaque constriction est calculé à partir de la vitesse mesurée par vélocimétrie par image de particules (PIV). (B) Les vitesses de déformation d’extension dans chaque constriction. Cette figure a été adaptée avec la permission d’Ahmed et al.38. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Images confocales de réflectance des fibres COL1 dans chaque segment de microcanaux après polymérisation de COL1. L’augmentation du degré d’alignement des fibres du segment (a) au segment (e) peut être observée visuellement. Barre d’échelle = 25 μm. Cette figure a été adaptée avec la permission d’Ahmed et al.38. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Images confocales de réflectance des fibres COL1 montrant que l’alignement des fibres n’est pas affecté par le retrait du couvercle du canal. Barre d’échelle = 25 μm. Cette figure a été adaptée avec la permission d’Ahmed et al.38. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Images représentatives des cellules et des fibres COL1. Images représentatives des cellules et des fibres COL1 dans le segment (e) de la matrice COL1 et le segment (a) de la matrice COL1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Figure montrant des composants découpés au laser avec des dimensions. (A) Canal, (B) base magnétique et (C) moule de couvercle de canal. Toutes les dimensions en millimètres. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Les protocoles de génération de matrices COL1 avec des fibres alignées ont été décrits à l’aide de méthodes magnétiques, de l’application directe de contraintes mécaniques et de techniques microfluidiques47. Les approches microfluidiques sont couramment utilisées pour créer des systèmes microphysiologiques en raison de leurs caractéristiques d’écoulement et de transport bien définies, qui permettent un contrôle précis du microenvironnement biochimique. Étant donné que les fibres COL1 alignées fournissent des indices instructifs clés pendant les processus physiopathologiques tels que la cicatrisation des plaies, l’invasion des cellules tumorales et le développement des tissus, la génération de matrices COL1 alignées dans les systèmes microfluidiques est une étape vers le développement de systèmes microphysiologiques biologiquement pertinents.

Ce protocole offre la possibilité de fabriquer des matrices COL1 alignées à l’échelle millimétrique avec des régions d’alignement de fibre définies. Pour induire l’alignement, un canal microfluidique avec des réductions de largeur par étapes est utilisé. Lorsqu’une solution de COL1 auto-assemblée circule dans le canal à un débit constant, la vitesse d’écoulement de la solution augmente aux constrictions, ce qui entraîne une déformation d’extension locale et un alignement à longue distance des fibres COL1 auto-assemblées. Par rapport à l’alignement des fibres induit par le cisaillement, nous avons observé l’alignement des fibres dans des canaux jusqu’à 250 μm d’épaisseur, ce qui nous a permis de créer des hydrogels 3D dans un canal microfluidique. Étant donné que l’alignement de la fibre COL1 repose sur le taux de déformation extensionnel, les utilisateurs peuvent modifier le canal fourni ou développer des conceptions de canal personnalisées pour générer un flux d’extension et créer des matrices COL1 de la taille et de la forme souhaitées. Une flexibilité supplémentaire est fournie grâce à la fabrication sans lithographie douce des canaux, ce qui permet le prototypage rapide des conceptions de canaux.

L’approche de canal en deux parties présentée dans ce protocole surmonte les limites de l’accès à un hydrogel 3D dans les microcanaux. Un canal en deux parties fournit un accès direct à l’hydrogel COL1, dans lequel le couvercle du canal peut être soulevé pour révéler la matrice COL1 dans le canal. L’accès direct à la COL1 après polymérisation élimine le besoin de mélanger les cellules dans la solution de précurseur de COL1, ce qui permet à un utilisateur de manipuler la solution de précurseur de COL1 pendant de longues périodes à un pH non physiologique et à de basses températures. De plus, une approche modulaire peut être utilisée pour positionner les cellules et fournir des capacités de biofabrication couche par couche, comme le montrent nos travaux précédents. Les modules peuvent être utilisés pour introduire des membranes pour la co-culture, introduire la perfusion continue et créer des constructions ECM multicouches 22,38,39. Des modules personnalisés peuvent également être fabriqués en fonction des besoins expérimentaux. Couplée au verrouillage magnétique, l’approche modulaire est également bien adaptée aux expériences qui nécessitent d’ajouter des fonctionnalités avec le temps.

Certaines étapes critiques doivent être prises en compte dans ce protocole. Tous les composants, y compris la découpe du canal, le couvercle, les lamelles de recouvrement et la base modulaire, doivent être nettoyés de manière appropriée pour assurer une liaison et une fonctionnalisation chimique appropriées. Le collagène doit être préparé sur de la glace et tous les composants doivent être conservés au froid pour assurer la consistance. Une fois préparée, la solution de collagène doit être utilisée dans les 10 minutes suivant la préparation. Le pH final de la solution de collagène doit être mesuré à l’aide d’une sonde de pH pour assurer la cohérence. Une lingette propre et humide doit être placée dans la boîte de Petri avec le collagène pour s’assurer que le collagène ne sèche pas dans l’incubateur chaud.

Certaines modifications et dépannages du protocole sont les suivants. i) Si le milieu fuit pendant la culture cellulaire, il faut s’assurer que le cadre en PMMA et les lamelles de recouvrement sont fixés sans aucun espace dans la couche adhésive. ii) Si les aimants ne sont pas placés au ras de la couche de base, ils empêcheront la glissière d’adhérer à la base, ce qui entraînera des lacunes. (iii) Le revêtement de glutaraldéhyde sur la lamelle de couverture peut également être d’une concentration plus faible si nécessaire (jusqu’à 0,1%). La concentration optimale de glutaraldéhyde pour prévenir la toxicité doit être déterminée expérimentalement pour chaque lignée cellulaire à utiliser dans l’expérience, car le glutaraldéhyde peut présenter une toxicité pour les cellules. (iv) On peut inclure des matériaux supplémentaires tels que l’acide hyaluronique, la fibronectine ou les billes fluorescentes avec du collagène pour personnaliser davantage la matrice. (v) Si nécessaire, la conception du canal peut être modifiée pour avoir des segments plus longs ou plus courts afin d’éviter les effets de limite et de bord48.

Ce protocole présente les limitations suivantes. Le collagène bovin Atelo est un matériau mou (G' <100 Pa) à 2,5 mg·mL−1. Pour augmenter la rigidité du gel, les chercheurs peuvent utiliser des concentrations plus élevées de collagène ou introduire des agents de réticulation. Bien que ce protocole n’ait été validé que pour l’alignement de matrices de collagène jusqu’à 250 μm d’épaisseur, des matrices plus épaisses peuvent être développées en augmentant l’épaisseur du canal et en optimisant les débits pour introduire des vitesses de déformation d’extension adéquates.

On s’attend à ce que ce protocole soit utile aux chercheurs qui cherchent à développer des microenvironnements ordonnés spécifiques aux tissus. Il peut également être utilisé comme guide pour créer des plates-formes fluidiques modulaires afin d’établir des systèmes microphysiologiques.

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Disclosures

Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par le National Institute of Health sous le numéro d’attribution R21GM143658 et par la National Science Foundation sous le numéro de subvention 2150798. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des organismes de financement.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) Sigma Aldrich 440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip Jensen Global JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet KJ Magnetics D31
3M (TC) 12X12-6-467MP DigiKey 3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% Signa Aldrich 179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER Electro-Technic Products 12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar VWR AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet McMaster-Carr 8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested VWR 45000-666
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CT-FIRE software LOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL Lonza CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL VWR VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50 Graphtec CE LITE-50
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer McMaster-Carr 87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells Thermo Fisher Scientific C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
Isopropanol Fisher Scientific A4154
Laser cutter Full Spectrum 20x12 H-series
Microfluidics Syringe pump New Era Syringe Pumps NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E Gilson FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen Advanced BioMatrix 5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4 VWR 70011044.00
PBS pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 Alfa Aesar J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 USCUTTER GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip Restek 22766.00
Silicon wafer University wafer 452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g VWR BDH9292-500G
Sylgard 184 VWR 102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 Thermo Fisher Scientific 28352.00

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rétractation fascicule 187
Hydrogels de collagène 3D Microtechnique avec alignement de fibres à longue portée
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Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M.… More

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M. R., Vidas, J. A., Byerley, A. M., Mansouri, M., Day, S. W., Abhyankar, V. V. Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment. J. Vis. Exp. (187), e64457, doi:10.3791/64457 (2022).

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