Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Моделирование развития мозжечка человека in vitro в 2D структуре

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64462
Automatic Translation
1,3,4,5, 1,3,4,5, 1,3, 1,2,3,4,5, 1,3,4,5, 1,3,4,5
1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

Summary

Настоящий протокол объясняет генерацию 2D-монослоя мозжечковых клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для исследования ранних стадий развития мозжечка.

Abstract

Точное и своевременное развитие мозжечка имеет решающее значение не только для точной координации и равновесия движений, но и для познания. Кроме того, нарушение развития мозжечка было связано со многими расстройствами нервного развития, включая аутизм, синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) и шизофрению. Исследования развития мозжечка у людей ранее были возможны только с помощью посмертных исследований или нейровизуализации, но этих методов недостаточно для понимания молекулярных и клеточных изменений, происходящих in vivo во время раннего развития, когда возникают многие нарушения нервного развития. Появление методов генерации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из соматических клеток и способность к дальнейшей редифференцировке иПСК в нейроны проложили путь для моделирования in vitro раннего развития мозга. Настоящее исследование предлагает упрощенные шаги к созданию мозжечковых клеток для приложений, требующих 2-мерной (2D) монослойной структуры. Мозжечковые клетки, представляющие ранние стадии развития, получают из человеческих ИПСК с помощью следующих этапов: сначала эмбриоидные тела создаются в 3-мерной (3D) культуре, затем их обрабатывают FGF2 и инсулином для содействия спецификации мозжечковой судьбы, и, наконец, они терминально дифференцируются как монослой на поли-l-орнитиновых (PLO) / ламининовых субстратах. Через 35 дней дифференцировки культуры мозжечковых клеток, полученные из iPSC, экспрессируют мозжечковые маркеры, включая ATOH1, PTF1α, PAX6 и KIRREL2, предполагая, что этот протокол генерирует глутаматергические и ГАМКергические предшественники мозжечковых нейронов, а также предшественников клеток Пуркинье. Кроме того, дифференцированные клетки демонстрируют отчетливую морфологию нейронов и являются положительными для иммунофлуоресцентных маркеров нейронной идентичности, таких как TUBB3. Эти клетки экспрессируют аксональные направляющие молекулы, включая семафорин-4C, плексин-B2 и нейропилин-1, и могут служить моделью для исследования молекулярных механизмов роста нейритов и синаптической связности. Этот метод генерирует мозжечковые нейроны человека, полезные для последующих применений, включая экспрессию генов, физиологические и морфологические исследования, требующие 2D-монослойных форматов.

Introduction

Понимание развития мозжечка человека и критических временных окон этого процесса важно не только для расшифровки возможных причин нарушений развития нервной системы, но и для выявления новых целей терапевтического вмешательства. Моделирование развития мозжечка человека in vitro было сложной задачей, но со временем появилось множество протоколов, дифференцирующих человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) или IPSCs с судьбами мозжечковой линии, 1,2,3,4,5,6,7,8 . Кроме того, важно разработать протоколы, которые генерируют воспроизводимые результаты, относительно просты (для уменьшения ошибок) и не являются тяжелыми для денежных затрат.

Первые протоколы дифференцировки мозжечка были сгенерированы из 2D-культур из покрытых эмбриоидных тел (ЭБ), вызывая судьбу мозжечка с различными факторами роста, аналогичными развитию in vivo, включая WNT, BMP и FGF 1,9. Более поздние опубликованные протоколы индуцировали дифференцировку в основном в 3D органоидной культуре с FGF2 и инсулином, за которыми следовали FGF19 и SDF1 для ромбических губоподобных структур 3,4, или использовали комбинацию FGF2, FGF4 и FGF85. Оба метода индукции мозжечковых органоидов привели к получению аналогичных 3D-органоидов мозжечка, поскольку оба протокола сообщали о сходной экспрессии мозжечковых маркеров в одинаковые моменты времени. Холмс и Гейне расширили свой 3D-протокол5, чтобы показать, что 2D-мозжечковые клетки могут быть сгенерированы из hESCs и iPSCs, которые начинаются как 3D-агрегаты. Кроме того, Silva et al.7 продемонстрировали, что клетки, представляющие зрелые мозжечковые нейроны в 2D, могут быть сгенерированы с помощью аналогичного подхода Холмса и Гейне, используя другую точку времени для переключения с 3D на 2D и продления времени роста и созревания.

Текущий протокол индуцирует мозжечковую судьбу в IPSC без кормушек путем генерации свободно плавающих эмбриональных тел (ЭБ) с использованием инсулина и FGF2, а затем покрытия ЭБ на посуде с покрытием PLO / ламинином на 14-й день для 2D-роста и дифференцировки. К 35 дню получают клетки с мозжечковой идентичностью. Способность повторять ранние стадии развития мозжечка, особенно в 2D-среде, позволяет исследователям отвечать на конкретные вопросы, требующие экспериментов с однослойной структурой. Этот протокол также поддается дальнейшим модификациям, таким как микроструктурированные поверхности, анализы аксонального роста и сортировка клеток для обогащения желаемых клеточных популяций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Исследование на людях было одобрено в соответствии с номером одобрения Совета по институциональному обзору Университета Айовы 201805995 и номером одобрения Комитета по плюрипотентным стволовым клеткам человека Университета Айовы 2017-02. Биопсия кожи была получена от испытуемых после получения письменного информированного согласия. Фибробласты культивировали в ДМЭМ с 15% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% раствором MEM-заменимых аминокислот при 37 °C и 5% CO2. Фибробласты перепрограммировались с использованием набора эписомального перепрограммирования в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов) с использованием нуклеофектора для электропорации. Все процедуры проводились в шкафу биологической безопасности класса II типа А2 («капюшон» для краткости). Все клеточные культуральные среды не содержали антибиотиков; поэтому каждый компонент, попавший в вытяжку, очищался 70% этанолом. Все клеточные питательные среды и компоненты были стерильно отфильтрованы или открыты в вытяжке для поддержания их стерильности.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Подготовьте пластины с покрытием базальной мембранной матрицы (BMM).
    ПРИМЕЧАНИЕ: BMM затвердевает быстрее при более высоких температурах. Пластины должны быть быстро подготовлены и немедленно помещены при температуре 4 °C для хранения.
    1. Разморозить БММ (см. Таблицу материалов) на льду при 4 °C в течение не менее 2 ч или на ночь.
    2. Смешайте DMEM/F12 и BMM до конечной концентрации 80 мкг/мл. Распределить раствор БММ в посуде для культивирования тканей (1 мл на 35 мм и 2 мл на посуду по 60 мм) и инкубировать при 37°С в течение не менее 1 ч или на ночь перед покрытием клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неиспользованная посуда может храниться при температуре 4 °C в течение 2 недель.
  2. Приготовьте пластины с поли-L-орнитиновым/ламининовым (PLO/ламининовым) покрытием.
    1. Приготовьте 20 мкг/мл PLO (см. Таблицу материалов) в стерильном DPBS+/+ и добавьте 1 мл в каждую лунку 6-луночной пластины. Инкубировать на ночь при 37 °C в инкубаторе.
    2. На следующий день аспирируйте PLO вакуумным аспиратором и дважды помойте DPBS+/+. Воздух сухой в вытяжке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные на воздухе пластины можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель, завернув в алюминиевую фольгу, для будущего использования.
    3. Приготовьте 10 мкг/мл ламинина (см. Таблицу материалов) в DPBS+/+ и добавьте по 1 мл в каждую лунку 6-луночной пластины. Инкубировать не менее 3 ч или на ночь при 37 °C в инкубаторе.
    4. Аспирировать ламинин вакуумным аспиратором и добавить либо 1 мл среднего, либо стерильного DPBS+/+.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ламининовое покрытие не должно высыхать. PBS или соответствующая культуральная среда должны быть немедленно добавлены, чтобы предотвратить это. Пластины с покрытием можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
  3. Подготовьте раствор для пассажа PSC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для изготовления раствора 10 PSC требуется осмометр (см. Таблицу материалов).
    1. Растворить 11,49 г хлорида калия (KCl) и 0,147 г дигидрата цитрата натрия (HOC(COONa)(CH2COONa)2*2H2O) в 400 мл стерильной воды для культивирования клеток (см. Таблицу материалов).
    2. Измерьте объем раствора и запишите его как начальный объем (Vi).
    3. Измерьте осмолярность и отрегулируйте ее до 570 мОсм, добавив стерильную воду для культивирования клеток с использованием формулы Vi × Oi = Vf × 570 мОсм.
    4. Фильтруют-стерилизуют раствор фильтром 0,20 мкм и делают аликвоты по 10 мл. Храните аликвоты при комнатной температуре (РТ) до 6 месяцев.
  4. Готовят плюрипотентную среду стволовых клеток (ПСК).
    ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК поддерживаются в среде, содержащей термостабильный FGF2 (см. Таблицу материалов), обеспечивая график кормления без выходных. Другие коммерчески доступные носители PSC не были опробованы для этого протокола.
    1. Разморозьте добавку PSC medium в течение ночи при 4 °C.
    2. Добавьте 10 мл добавки среды PSC к 500 мл базальной среды PSC. Сделайте аликвоты по 25 мл и храните при −20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные аликвоты можно хранить при −20 °C в течение 6 месяцев. Размороженные аликвоты необходимо хранить при температуре 4 °C и использовать в течение 2 недель. Клетки могут быть заморожены для длительного хранения в среде PSC с 10% (v/v) диметилсульфоксидом (DMSO).
  5. Подготовьте Таяние среды PSC.
    1. Добавка среды PSC с 50 нМ хромана, 1,5 мкМ эмриказана, 1x полиаминовой добавки и 0,7 мкМ транс-ISRIB (коктейль CEPT11) (см. Таблицу материалов).
    2. Фильтруют-стерилизуют фильтром 0,20 мкм и хранят при 4 °C до 4 недель.
  6. Приготовьте вытянутые стеклянные пипетки.
    1. Потяните стеклянные пипетки Пастера размером 22,9 см (9 дюймов) на две части над горелкой Бунзена, ~ 2 см ниже шеи, создав две пипетки, причем более тонкая сторона будет ~ 4 см короче другой.
    2. С помощью пламени согните кончики вытянутой стороны, чтобы создать плавную «р».
    3. Поместите вытянутые пипетки в рукава автоклава и автоклав для стерилизации.
  7. Подготовьте мозжечковую дифференцирующую среду (CDM).
    1. Смешайте IMDM и питательную смесь F12 ветчины в соотношении 1:1. Дополните смесь 1x добавкой L-аланина-L-глутамина, 1% (v/v) химически определенного липидного концентрата, 0,45 мМ 1-тио-глицерина, 15 мкл/мл апо-трансферрина, 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 7 мкг/мл инсулина (см. Таблицу материалов).
    2. Фильтр-стерилизуют фильтром 0,20 мкм, хранят при 4 °C и используют в течение 1 месяца.
  8. Подготовьте мозжечковую среду созревания (КИМ).
    1. Дополнить нейробазальную среду 1x добавкой L-аланин-L-глутамина и 1x добавкой N-2 (см. Таблицу материалов).
    2. Фильтруют-стерилизуют фильтром 0,20 мкм, хранят при 4 °C и используют в течение 2 недель.

2. Культура iPSC без фидеров

  1. Разморозьте клетки, выполнив следующие действия.
    1. Поместите пластину BMM (стадия 1.1) в инкубатор при температуре 37 °C для геля в течение не менее 1 ч или на ночь перед размораживанием клеток.
    2. Предварительно прогреть 10 мл оттаивающей среды PSC (шаг 1,5) при 37 °C.
    3. Перенесите криовиаль с клетками из жидкого азота на водяную баню при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать создания источника загрязнения в пространстве клеточной культуры, использование стандартной водяной бани не рекомендуется. Вместо этого пресную воду можно нагревать в небольшом стакане до 37 ° C для создания одноразовой водяной бани.
    4. Когда в трубке останется небольшой кусочек льда, извлеките его из водяной бани, высушите трубку и опрыскайте 70% этанола. Перенесите трубку в капот и используйте серологическую пипетку 2 мл или 5 мл (см. Таблицу материалов), чтобы аккуратно перенести клетки в коническую трубку объемом 15 мл.
    5. Добавьте 8 мл размораживающей среды PSC к ячейкам по каплям, одновременно закручивая коническую трубку. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при РТ.
    6. Осторожно аспирируйте супернатант с помощью вакуумного аспиратора, не нарушая ячейку гранулы. Повторное суспендирование клеток в 2 мл оттаивающей среды PSC.
    7. Аспирируйте BMM с пластины и добавьте повторно суспендированные ячейки по каплям по всей пластине для равномерного распределения.
    8. Поместите пластину в инкубатор при 37 °C, 5% CO2. Обновите носитель на следующий день с помощью PSC medium. После этого меняйте среду ежедневно.
  2. Сохраните ячейки, выполнив следующие действия.
    1. Предварительно нагрейте необходимый объем среды PSC при 37 °C (например, 1 мл среды на пластину 35 мм).
    2. Исследуйте пластины для дифференцированных клеток или колоний и удалите дифференцированные клетки с помощью вытянутой стеклянной пипетки (шаг 1.6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: колонии iPSC имеют гладкие края с морфологически идентичными клетками.
    3. Меняйте израсходованный средний суточный и проход каждые 3-4 дня или при достижении 70% слияния.
  3. Прохождение клеток.
    1. Поместите необходимое количество пластин BMM в инкубатор не менее чем на 1 ч или на ночь перед пассажированием. Предварительно прогрейте необходимое количество среды PSC (стадия 1.3) при 37 °C.
    2. Используя вытянутую стеклянную пипетку, очистите любые дифференцированные клетки или колонии.
    3. Аспирировать отработанную среду вакуумным аспиратором и добавить среду диссоциации ПСК, 1 мл на тарелку 35 мм. Инкубировать при 37 °C в течение 1-3 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если колонии взлетают в растворе пропускания PSC перед добавлением среды PSC, время инкубации может быть сокращено.
    4. Аспирируйте раствор для пассирования PSC и добавьте предварительно нагретую среду PSC.
    5. Используя стерильный наконечник пипетки объемом 200 мкл, поцарапайте параллельные друг другу линии в одном направлении, поверните пластину на 90° и сделайте второй набор линий царапин перпендикулярно предыдущим (делая перекрестно заштрихованный узор поперек пластины).
    6. Аспирируйте раствор BMM из установленных пластин. Соберите колонии с помощью серологической пипетки и распределите их по новым пластинам BMM.
    7. Инкубировать при 37 °C, 5% CO2. Меняйте среду ежедневно.
  4. Заморозьте клетки.
    1. Приготовьте криовиалы, маркируя содержимое, и стерилизуйте под ультрафиолетовым (УФ) светом в вытяжке (см. Таблицу материалов) в течение 30 минут.
    2. Приготовьте замораживающую среду PSC, добавив 10% (v/v) DMSO. Выполните шаги 2.3.2-2.3.5.
    3. Переведите клетки в коническую трубку объемом 15 мл с серологической пипеткой 5 мл и центрифугой при 200 х г в течение 5 мин при РТ.
    4. Осторожно аспирируйте среду и повторно суспендируйте ячейку гранулы в морозильной среде PSC.
    5. Распределите по криовиалам. Поместите флаконы в морозильную емкость и поместите контейнер в морозильную камеру с температурой −80 °C.
    6. На следующий день переведите криовиалы в жидкий азот для длительного хранения.

3. Дифференциация мозжечка

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом дифференциации иПСК проходят к шести 35-миллиметровым тарелкам и готовы к дифференциации, когда они находятся при 70% слиянии. Каждая 35-миллиметровая плита будет перенесена в одну скважину из 6-луночного листа.

  1. На 0-й день поднимите здоровые колонии iPSC для образования EB.
    1. Добавить 1 мл CDM (стадия 1.7), дополненную 10 мкМ Y-27632 и 10 мкМ SB431542 (см. Таблицу материалов) в каждую скважину из 6-луночной пластины сверхнизкого прикрепления (ULA), и поместить в инкубатор до тех пор, пока поднятые колонии не будут готовы к добавлению в скважины.
    2. Очистите дифференцированные клетки с помощью вытянутой стеклянной пипетки. Аспирировать среду и добавить 1 мл раствора PSC для прохождения на каждую посуду размером 35 мм. Инкубировать в течение 3 мин при 37 °C, аспирировать и добавлять 2 мл CDM, дополненных 10 мкМ Y-27632 и 10 мкМ SB431542.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если колонии взлетают в растворе PSC перед добавлением CDM, время инкубации может быть сокращено.
    3. Под перевернутым микроскопом, проходящим светом, осторожно поднимите колонии, используя изогнутый край вытянутой стеклянной пипетки, используя 4-кратное увеличение. Как только каждая колония будет поднята, аккуратно переложите все в один колодец 6-луночной пластины ULA, используя серологическую пипетку объемом 10 мл. Повторите этот процесс для каждой пластины iPSC. Инкубируют клетки при 37 °C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если колонии слишком велики или объединены, их можно нарезать кончиком вытянутой стеклянной пипетки, чтобы создать меньшие ЭБ.
  2. На 2-й день добавьте FGF2 в каждую лунку до конечной концентрации 50 нг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: FGF2, используемый для дифференциации мозжечка, не является термостабильным. Этот протокол не был протестирован с термостабильным FGF2.
  3. На 7 день сделайте 1/3 среднего изменения. Для 3 мл общей среды в скважине с пипетром 1000 мкл осторожно аспирировать 1 мл отработанной среды и заменить ее 1 мл свежего CDM. Инкубируйте ЭБ в течение 7 дней.
  4. На 14-й день осторожно аспирируйте почти всю отработанную среду, используя пипеттор объемом 1000 мкл. Чтобы обеспечить минимальное повреждение ЭБ, закрутите пластину, чтобы собрать все ЭБ в центре пластины, а затем наклоните пластину и медленно аспирируйте от края.
    1. Когда среднее количество уменьшится, медленно положите пластину плоско и продолжайте аспирировать. Оставьте достаточное количество среды, чтобы избежать высыхания ЭБ. После этого добавьте 3 мл свежего CDM, дополненного 10 мкМ Y-27632. Переложите ЭБ с помощью серологической пипетки объемом 10 мл в посуду, покрытую ПЛО/ламинином (шаг 1.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от последующего применения, ЭБ могут быть перенесены на 6-луночную пластину PLO/laminin или одиночные ЭБ могут быть перенесены в одну скважину 24-луночной пластины или крышки с покрытием PLO/ламинином.
  5. На 15-й день аспирируйте среду и замените ее свежим CDM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно добавить достаточное количество среды в скважины, чтобы обеспечить достаточное количество среды между подачами, так как со временем произойдет испарение (например, для скважины в 6-луночной плите добавьте 3 мл среды). Если среда начала подкисляться (становиться прозрачной и желтой), освежите среду, даже если ее нет в графике кормления до конца протокола.
  6. На 21-й день аспирируйте отработанную среду и замените ее ШМ. На 28-й день замените среду свежей ШМ. На 35-й день соберите клетки для дальнейшего применения.

4. Пробоподготовка к выделению РНК

  1. Аспирировать среду и добавить 500 мкл реагента диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) в каждую лунку 6-луночной пластины. Оставьте его включенным на пару секунд и аспирируйте.
  2. Инкубировать пластину, с крышкой, при комнатной температуре в течение 2 мин. Коснитесь боковых сторон пластины, чтобы отсоединить ячейки.
  3. Добавьте 1 мл КИМ (этап 1,8) и соберите ячейки в трубку объемом 1,5 мл.
  4. Гранулируйте ячейки центрифугированием с помощью настольной мини-центрифуги (см. Таблицу материалов) в течение 30 с при RT (максимальная скорость 2000 x g), отбросьте среду и добавьте 1 мл 1x PBS pH 7,4 для промывки ячейки гранулы.
  5. Снова гранулируйте ячейки с помощью настольной мини-центрифуги в течение 30 с на RT и снова мойте PBS.
  6. Гранулируйте ячейки и выбросьте PBS. Лизируйте клетки фенолом и гуанидином изотиоцианатом, содержащим реагент (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, содержащие фенол и изотиоцианат гуанидина, могут храниться при температуре −80 °C до 1 года. Клетки могут быть лизированы непосредственно в чашке в зависимости от метода выделения РНК и используемых реагентов. Из-за низкого количества клеток в чашке выделение РНК с использованием спиновых колонок кремнезема (см. Таблицу материалов) приведет к более высоким выходам РНК.

5. Подготовка клеток к иммунофлуоресцентному окрашиванию

ПРИМЕЧАНИЕ: Для плиты с 24 скважинами достаточно одного ЭБ на скважину.

  1. На 35-й день аспирируйте отработанную среду и промывайте клетки, добавляя 1 мл DPBS+/+ на лунку (для одной лунки из 24-луночной пластины).
  2. Аспирировать DPBS+/+ и добавить 500 мкл холодного 4% параформальдегида (PFA, см. Таблицу материалов), приготовленного в DPBS+/+ на скважину. Инкубировать в течение 20 мин на РТ.
  3. Удалите 4% PFA и дважды промойте ячейки с помощью DPBS+/+, как на шаге 5.1. Добавьте 1 мл DPBS+/+ и храните ячейки при 4 °C до окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется делать иммунофлуоресцентное окрашивание в течение 1 недели после фиксации, чтобы избежать отслоения клеток и потери антигенов. Однако, в зависимости от антитела и клеточного расположения мишени, окрашивание может быть сделано в более поздние сроки до 4 недель после фиксации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Обзор дифференциации мозжечка от 3D до 2D
Мозжечковые клетки генерируются начиная с иПСК. На рисунке 1А показан общий рабочий процесс и добавление основных компонентов для дифференциации. На 0-й день ЭБ производятся путем осторожного подъема колоний iPSC (рисунок 1B) с использованием вытянутой стеклянной пипетки в CDM, содержащей SB431542 и Y-27632, и помещают в пластины со сверхнизким креплением. FGF2 добавляется на 2 день. На 7-й день изменяется треть среды, и наблюдается формирование ЭБ (рисунок 1С). На 14-й день увеличенные ЭБ (рисунок 1D) наносятся на посуду с покрытием PLO/ламинином в CDM, дополненную Y-27632. На 15-й день носитель заменяется cdm без Y-27632. Клетки начинают мигрировать наружу от ЭБ (рисунок 1Е) вдоль покрытой поверхности. На 21-й день выполняется полная смена среды, и среда переключается на КИМ. После этого среду меняют один раз в неделю (или чаще, если среда быстро подкисляется). К 35-му дню образуется монослой клеток с нейроноподобной морфологией и сложностью (рисунок 1F,G).

2D-клетки экспрессируют маркеры мозжечковых клеток
Клетки собирают на 35-й день для выделения РНК и иммунофлуоресцентной маркировки. Экспрессия генов, которые, как известно, присутствуют во время развития мозжечка, измеряется с помощью RT-qPCR (рисунок 2). Клетки экспрессируют ранние маркеры-предшественники мозжечка, такие как ATOH112,13 (ромбическая губа, глутаматергические предшественники) и PTF1α14 (желудочковая зона, ГАМКергические предшественники), а также клеточные маркеры-предшественники Пуркинье KIRREL215 и SKOR215. В дополнение к маркерам клеток мозжечка раннего развития также наблюдается экспрессия генов более поздней стадии развития, OTX2 и SIX3. Иммунофлуоресцентная маркировка клеток показывает положительное окрашивание для мозжечковых маркеров EN2 и PTF1α (Рисунок 3A,D), нейронального маркера TUBB3 (Рисунок 3G), а также для маркера пролиферации Ki67 (Рисунок 3J). Ядерное окрашивание 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) показывает клеточные ядра (рисунок 3B,E,H,K). Для дальнейшей проверки этого протокола иПСК, полученные от пациентов с нервно-психическим расстройством, использовались для генерации мозжечковых клеток и анализа экспрессии маркеров мозжечковых клеток на 35-й день. Данные RT-qPCR указывают на профиль выражений, аналогичный профилю контрольных iPSCs (дополнительный рисунок 1). Кроме того, экспрессия аксональных направляющих молекул, имеющих отношение к развитию мозжечка, присутствует как в контрольных, так и в полученных от пациента мозжечковых клетках (дополнительный рисунок 2).

Figure 1
Рисунок 1: Обзор временной шкалы протокола и репрезентативных изображений. (A) Схематический контур протокола дифференцировки мозжечка, изображающий тип питательной среды, добавки, добавляемые в культуральную среду, дни, когда требуется изменение среды (обозначено вертикальными линиями), и поверхностное покрытие чашки для культивирования. (B) Репрезентативные изображения яркого поля ИПСК на 0-й день и дифференцированные ячейки, которые будут очищены перед созданием ЭБ (показаны красным кругом), (С) ЭБ на 7-й день и (D) день 14, (Е) на следующий день после покрытия ЭБ и (F,G) созревающие клетки на 35-й день. Шкала (B-D): 1 мм; (E-G): 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Экспрессия маркеров мозжечковых клеток в 2D мозжечковых клетках на 35-й день. Результаты экспрессии гена RT-qPCR на 35-й день для выбранных генов, представляющих различные маркеры развития мозжечка и типы клеток, нормализованные до GAPDH. Значения -ΔCt представляют собой значения GAPDH-Ct, вычитаемые из значений target-Ct; значения, близкие к нулю, указывают на более высокое выражение. Любое значение ниже отмеченной строки представляет собой выражение ниже предела обнаружения. N = 2 строки iPSC, данные представлены как среднее ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Иммунофлуоресцентная маркировка 2D мозжечковых клеток на 35 день. Клетки фиксируются 4% PFA на 35-й день и окрашиваются ядерными веществами DAPI и иммуномаркируются для (A) EN2 (зеленый), (B) DAPI (синий), (C) EN2-DAPI объединены; (D) PTF1α (красный), (E) DAPI (синий), (F) PTF1α-DAPI объединены; (G) TUBB3 (зеленый), (H) DAPI (синий), (I) TUBB3-DAPI объединены; и (J) Ki67 (красный), (K) DAPI (синий), (L) Ki67-DAPI объединены. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Репрезентативные изображения дифференциации мозжечка с использованием иПСК, полученные от пациентов с диагнозом шизофрения. (A) колонии iPSC, (B) EB на 7-й день, (C) 14-й день, (D) клетки, растущие из покрытых ЭБ на чашке, покрытой PLO/ламинином, на 15-й день, и (E) мозжечковые клетки на 35-й день. (F) Результаты RT-qPCR для экспрессии генов на 35-й день для маркеров мозжечковых клеток, нормализованные до GAPDH. Значения -ΔCt представляют собой значения GAPDH-Ct, вычитаемые из значений target-Ct; значения, близкие к нулю, указывают на более высокое выражение. Любое значение ниже отмеченной строки представляет собой выражение ниже предела обнаружения. N = 2 линии iPSC, данные представлены в виде среднего ± SD. Шкала (A-C): 1 мм; (D,E): 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Генная экспрессия аксональных направляющих молекул 2D мозжечковых клеток на 35-й день. Результаты экспрессии гена RT-qPCR на 35-й день для выбранных молекул, участвующих в передаче сигналов ориентации аксонов, нормализованных до GAPDH. Известно, что все показанные гены экспрессируются в мозжечке, за исключением PlxnB3, который имеет низкую экспрессию в мозжечке на протяжении всего развития. Значения -ΔCt представляют собой значения GAPDH-Ct, вычитаемые из значений target-Ct; значения, близкие к нулю, указывают на более высокое выражение. Любое значение ниже отмеченной строки представляет собой выражение ниже предела обнаружения. N (контроль) = 1, N (SCZ) = 1, и показано среднее значение экспериментов, проведенных в трех экземплярах. Аббревиатура: SCZ = шизофрения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Способность моделировать развитие мозжечка человека in vitro важна для моделирования заболеваний, а также для дальнейшего понимания нормального развития мозга. Менее сложные и экономичные протоколы создают больше возможностей для генерации реплицируемых данных и широкого внедрения в нескольких научных лабораториях. Протокол дифференцировки мозжечка описан здесь с использованием модифицированного метода генерации ЭБ, который не требует ферментов или диссоциационных агентов, с использованием факторов роста, о которых сообщает Muguruma et al. 4 и модифицированный 2D-протокол роста монослойных клеток, аналогичный методу Holmes et al. 5.

Общий протокол начинается с генерации ЭБ из иПСК, за которым следует индукция дифференцировки мозжечка и, наконец, покрытие для 2D-монослойной культуры. Во время этого процесса наблюдалось значительное количество гибели клеток между днями 7-14. Из-за этой потери клеток рекомендуется начинать с большого количества ЭБ; для 6-луночной пластины из 2D-ячеек рекомендуется начинать как минимум с шести пластин (либо 35 мм, либо 60 мм пластин) iPSCs. Кроме того, добавление Y-27632 во время нанесения ЭБ на PLO/ламинин значительно увеличивает прикрепление ЭБ к подложке. Важно проверять среду в культурах периодически визуально. Если среда желтеет (подкисляет), рекомендуется менять среду, даже если ее нет в схеме кормления. Общее количество клеток, которые прикрепляются, будет варьироваться от эксперимента к эксперименту, что требует более частого или менее частого обновления питательных веществ в среде.

Результаты RT-qPCR показали, что ИПСК дифференцировались в клетки, представляющие ранние стадии развития мозжечка. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что на 35-й день дифференцировки имеются клетки, экспрессирующие маркер судьбы нейрональных клеток (TUBB3 16,17), глутаматергические и ГАМКергические маркеры-предшественники (ATOH1 12,13 и PTF1α14 соответственно), пограничные маркеры среднего мозга и заднего мозга (EN1 18, EN218, GBX219), маркеры истмического органиста (WNT118, FGF819), маркер ромбного производного губы (PAX618 ) и маркеры предшественников клеток Пуркинье (KIRREL215, SKOR220). Также наблюдалась экспрессия ромбического губного маркераOTX2 21. Предыдущие мозжечковые органоидные протоколы с использованием hESCs наблюдали, что индукция FGF2 приводит к тому, что клетки, экспрессирующие GBX2, но очень мало положительных клеток OTX2, в то время как аналогичный протокол с использованием iPSCs показал идентичную экспрессию мРНК GBX2 и OTX2 в мозжечковых органоидах8. Тем не менее, мозжечковые нейроны, полученные из эмбриональных стволовых клеток мышей (mESC), содержат отдельные кластеры положительных клеток OTX2 и GBX24, и было показано, что OTX2 экспрессируется на протяжении всего мозжечкового развития мыши22 и человека 21,23. Дифференциальный профиль выражения OTX2 между протоколами, использующими одни и те же факторы спецификации судьбы, может быть обусловлен другими различиями между протоколами или индивидуальными различиями между hESCs и iPSCs; это заслуживает дальнейшего изучения. Выражение SIX3 также наблюдалось в культуре на 35-й день. SIX3 экспрессируется в передней нервной трубке во время развития, и его экспрессия в мозжечке человека остается низкой на протяжении всего развития и взрослого возраста23,24; однако он выражен в неонатальном и взрослом мозжечке мыши25. Это говорит о том, что может существовать субпопуляция клеток, которые дифференцируются в сторону передней судьбы, или они могут представлять собой субпопуляцию мозжечковых клеток, экспрессирующих SIX3 во время развития. Эти клетки могут быть дополнительно изучены.

Протоколы дифференциации часто разрабатываются с использованием hESCs или IPSCs от здоровых субъектов, но важно подтвердить, что эти протоколы могут быть применены к IPSC, полученным от пациента, для препарирования молекулярных и клеточных изменений заболевания. Для дальнейшего тестирования нашего протокола, наряду с нашими контрольными линиями iPSC, мы дифференцировали линии iPSC, которые были перепрограммированы из фибробластов, полученных от пациентов с диагнозом шизофрения. Предыдущая литература показала, что пациенты с диагнозом шизофрения имеют функциональные и анатомические мозжечковые аномалии 26,27,28. Эти изменения наблюдаются у взрослых пациентов, но могут начаться во время развития и потребовать дальнейшего исследования. В целом, было отмечено, что мозжечковые клетки пациентов с шизофренией экспрессировали мозжечковые маркеры, протестированные на 35-й день, и морфологически не отличались от мозжечковых клеток, полученных из контрольных ИПСК (Дополнительный рисунок 1). Это говорит о том, что этот протокол может исследовать развитие мозжечка человека в контексте заболевания. Кроме того, была также изучена экспрессия аксональных маркеров руководства на 35-й день, как в контрольных, так и в шизофренических клеточных линиях, поскольку одним из основных компонентов развития является аксональное поиск путей и нейронная связность 29,30,31,32. Действительно, на 35-й день были проверены аксональные направляющие молекулы, которые показаны в развитии мозжечка, включая семафорин-4C, плексин-B2 и нейропилин-1 (дополнительный рисунок 2). Во время развития экспрессия плексина-B3 низкая в мозжечке человека23, и также наблюдалась более низкая экспрессия плексина-B3 по сравнению с другими аксональными направляющими молекулами для дифференцировки. Вместе с экспрессией мозжечковых маркеров это является убедительным признаком того, что этот протокол дифференцировки генерирует мозжечковые клетки, которые экспрессируют правильные сигналы для нейронной связности в этой структуре.

Важно отметить, что типы клеток, генерируемые с использованием этого FGF2 и инсулин-индуцированного протокола дифференцировки мозжечка, не были идентифицированы с помощью анализа одной клетки. Nayler et al.8 недавно опубликовали набор данных одноклеточного профилирования мозжечковых органоидов, полученных с использованием аналогичного протокола индукции, и ожидается, что в будущих исследованиях будут все чаще использоваться одноклеточные методы для решения этих вопросов. Клетки после 35-го дня также не были протестированы на экспрессию или морфологию. Экспрессия мозжечковых маркеров в более поздние моменты времени и то, как они меняются с течением времени, даст больше понимания зрелости клеток. Было показано, что совместное культивирование мозжечковых клеток, полученных из стволовых клеток, с предшественниками гранул мозжечка мыши4 или срезами мозжечка33 плода человека генерирует зрелые мозжечковые клетки, особенно нейроны Пуркинье, которые часто отсутствуют в органоидах мозжечка. Примечательно, что недавнее исследование показало, что мозжечковые органоиды, диссоциированные на 35-й день дифференциации и покрытые для 2D-роста, также дают начало зрелым мозжечковым нейронам без необходимости совместного культивирования7. Эти приложения направлены на исследование более поздних стадий развития мозжечка и созревания нейронов по сравнению с этим протоколом, который может быть использован для исследования более ранних стадий развития. Еще одно интересное сравнение может возникнуть при сравнении культивируемых эмбриональных мозжечковых нейронов мыши34 с мозжечковыми нейронами человека, полученными из iPSC, что потенциально подчеркивает различия в развитии и спецификации судьбы между двумя видами.

Таким образом, настоящий протокол может быть использован для приложений, требующих in vitro 2D мозжечковых клеток, генерируемых из IPSCs. Этот протокол не включает сложные этапы или материалы, является экономически эффективным и может быть использован в качестве модели для раннего развития мозжечка для исследования экспрессии генов, морфологии клеток и физиологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

Мы благодарим Дженни Грингер Ричардс за ее тщательную работу по проверке наших контрольных субъектов, из которых мы создали контрольные iPSC. Эта работа была поддержана NIH T32 MH019113 (D.A.M. и K.A.K.), Nellie Ball Trust (T.H.W. и A.J.W.), NIH R01 MH111578 (V.A.M. и J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (A.J.W.) и Roy J. Carver Charitable Trust (V.A.M., J.A.W. и A.J.W.). Фигуры создавались с BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26D
1-thio-glycerol Sigma M6145
2 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia Fisher Scientific FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish Falcon 353001
4D Nucleofector core unit Lonza 276885 Nucleofector
5 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish Falcon 353004
6-well ultra-low attachment plates Corning 3471
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Apo-transferrin Sigma T1147
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell culture grade water Cytiva SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905031
Chroman 1 Cayman 34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet NuAire, Inc. NU-540-600 Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated Corning 3526
Costar 6-well plate, TC treated Corning 3516
DAPI solution Thermo Scientific 62248
DMEM Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide) Sigma D2438
DPBS+/+ Gibco 14040133
Emricasan Cayman 22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit Life Technologies A15960
Essential 8-Flex Gibco A2858501 PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system Life Technologies AMEX1000
Fetal bovine serum - Premium Select Atlanta Biologicals S11150
FGF2 Peprotech 100-18B
GlutaMAX supplement Gibco 35050061 L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix Gibco 11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 50144906
Human Anti-EN2, mouse Santa Cruz Biotechnology sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit R&D Systems MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit Novus Biologicals NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse Biolegend 801213
IMDM Gibco 12440053
Insulin Gibco 12585
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Matrigel Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
MEM-NEAA Gibco 11140050
Mini Centrifuge Labnet International C1310 Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) New England BioLabs T2040 Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit New England BioLabs T2010 Silica spin columns
N-2 supplement Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103049
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
PFA 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Polyamine supplement Sigma P8483
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma 3655
Potassium chloride Sigma 746436
SB431542 Sigma 54317
See through self-sealable pouches Steriking SS-T2 (90x250) Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate  Fisher Scientific S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia Research Products International 256131
Trans-ISRIB Cayman 16258
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018 Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x) Gibco 12604039 Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometer Wescor, Inc. Model 5520 Osmometer
Y-27632 Biogems 1293823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).

Tags

Неврология Выпуск 187 Мозжечок развитие от 3D до 2D индуцированная плюрипотентная стволовая клетка дифференцировка модель заболевания
Моделирование развития мозжечка человека <em>in vitro</em> в 2D структуре
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madencioglu, D. A., Kruth, K. A.,… More

Madencioglu, D. A., Kruth, K. A., Wassink, T. H., Magnotta, V. A., Wemmie, J. A., Williams, A. J. Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure. J. Vis. Exp. (187), e64462, doi:10.3791/64462 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter