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Neuroscience

2 डी संरचना में विट्रो में मानव अनुमस्तिष्क विकास मॉडलिंग

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64462
Automatic Translation
1,3,4,5, 1,3,4,5, 1,3, 1,2,3,4,5, 1,3,4,5, 1,3,4,5
1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल अनुमस्तिष्क विकास के शुरुआती चरणों की जांच के लिए प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से अनुमस्तिष्क कोशिकाओं के 2 डी मोनोलेयर की पीढ़ी की व्याख्या करता है।

Abstract

सेरिबैलम का सटीक और समय पर विकास न केवल सटीक मोटर समन्वय और संतुलन के लिए बल्कि अनुभूति के लिए भी महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, अनुमस्तिष्क विकास में व्यवधान को ऑटिज़्म, ध्यान घाटे-अति सक्रियता विकार (एडीएचडी), और सिज़ोफ्रेनिया सहित कई न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों में फंसाया गया है। मनुष्यों में अनुमस्तिष्क विकास की जांच पहले केवल पोस्टमार्टम अध्ययन या न्यूरोइमेजिंग के माध्यम से संभव हुई है, फिर भी ये विधियां प्रारंभिक विकास के दौरान विवो में होने वाले आणविक और सेलुलर परिवर्तनों को समझने के लिए पर्याप्त नहीं हैं, जब कई न्यूरोडेवलपमेंटल विकार उत्पन्न होते हैं। दैहिक कोशिकाओं से मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) उत्पन्न करने की तकनीकों के उद्भव और न्यूरॉन्स में आईपीएससी को फिर से अलग करने की क्षमता ने प्रारंभिक मस्तिष्क विकास के इन विट्रो मॉडलिंग का मार्ग प्रशस्त किया है। वर्तमान अध्ययन उन अनुप्रयोगों के लिए अनुमस्तिष्क कोशिकाओं को उत्पन्न करने की दिशा में सरलीकृत कदम प्रदान करता है जिनके लिए 2-आयामी (2 डी) मोनोलेयर संरचना की आवश्यकता होती है। प्रारंभिक विकास चरणों का प्रतिनिधित्व करने वाली अनुमस्तिष्क कोशिकाओं को निम्नलिखित चरणों के माध्यम से मानव आईपीएससी से प्राप्त किया जाता है: सबसे पहले, भ्रूण निकायों को 3-आयामी (3 डी) संस्कृति में बनाया जाता है, फिर उन्हें अनुमस्तिष्क भाग्य विनिर्देश को बढ़ावा देने के लिए एफजीएफ 2 और इंसुलिन के साथ इलाज किया जाता है, और अंत में, उन्हें पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीएलओ)/लैमिनिन-लेपित सब्सट्रेट्स पर मोनोलेयर के रूप में अंतिम रूप से विभेदित किया जाता है। भेदभाव के 35 दिनों में, आईपीएससी-व्युत्पन्न अनुमस्तिष्क सेल संस्कृतियां एटीओएच 1, पीटीएफ 1, पैक्स 6 और किर्रेल 2 सहित अनुमस्तिष्क मार्करों को व्यक्त करती हैं, यह सुझाव देते हुए कि यह प्रोटोकॉल ग्लूटामेटर्जिक और जीएबीएर्जिक अनुमस्तिष्क न्यूरोनल अग्रदूतों के साथ-साथ पर्किन्जे सेल पूर्वजों को उत्पन्न करता है। इसके अलावा, विभेदित कोशिकाएं अलग-अलग न्यूरोनल आकृति विज्ञान दिखाती हैं और न्यूरोनल पहचान के इम्यूनोफ्लोरेसेंस मार्करों जैसे टीयूबीबी 3 के लिए सकारात्मक होती हैं। ये कोशिकाएं सेमाफोरिन -4 सी, प्लेक्सिन-बी 2 और न्यूरोपिलिन -1 सहित अक्षीय मार्गदर्शन अणुओं को व्यक्त करती हैं, और न्यूराइट आउटग्रोथ और सिनैप्टिक कनेक्टिविटी के आणविक तंत्र की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में काम कर सकती हैं। यह विधि डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी मानव अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स उत्पन्न करती है, जिसमें जीन अभिव्यक्ति, शारीरिक और रूपात्मक अध्ययन शामिल हैं जिनके लिए 2 डी मोनोलेयर प्रारूपों की आवश्यकता होती है।

Introduction

मानव अनुमस्तिष्क विकास और इस प्रक्रिया की महत्वपूर्ण समय खिड़कियों को समझना न केवल न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के संभावित कारणों को डिकोड करने के लिए बल्कि चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए नए लक्ष्यों की पहचान करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। विट्रो में मानव अनुमस्तिष्क विकास का मॉडलिंग चुनौतीपूर्ण रहा है, फिर भी समय के साथ, अनुमस्तिष्क वंश भाग्य के साथ मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) या आईपीएससी को अलग करने वाले कई प्रोटोकॉल उभरे हैं 1,2,3,4,5,6,7,8 . इसके अलावा, प्रोटोकॉल विकसित करना महत्वपूर्ण है जो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करते हैं, अपेक्षाकृत सरल हैं (त्रुटि को कम करने के लिए), और मौद्रिक लागत पर भारी नहीं हैं।

अनुमस्तिष्क विभेदन के लिए पहले प्रोटोकॉल प्लेटेड भ्रूण निकायों (ईबी) से 2 डी संस्कृतियों से उत्पन्न हुए थे, जो विवो विकास के समान विभिन्न विकास कारकों के साथ अनुमस्तिष्क भाग्य को प्रेरित करते थे, जिसमें डब्ल्यूएनटी, बीएमपी और एफजीएफ 1,9 शामिल थे। हाल ही में प्रकाशित प्रोटोकॉल ने मुख्य रूप से एफजीएफ 2 और इंसुलिन के साथ 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृति में भेदभाव को प्रेरित किया, इसके बाद एफजीएफ 19 और एसडीएफ 1 के लिए रोडम्बिक होंठ जैसी संरचनाओं 3,4, या एफजीएफ 2, एफजीएफ 4 और एफजीएफ 85 के संयोजन का उपयोग किया। दोनों अनुमस्तिष्क ऑर्गेनोइड प्रेरण विधियों के परिणामस्वरूप समान 3 डी अनुमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स थे क्योंकि दोनों प्रोटोकॉल ने समान समय बिंदुओं पर समान अनुमस्तिष्क मार्कर अभिव्यक्ति की सूचना दी थी। होम्स और हेन ने अपने 3 डी प्रोटोकॉल5 को यह दिखाने के लिए विस्तारित किया कि 2 डी अनुमस्तिष्क कोशिकाओं को एचईएससी और आईपीएससी से उत्पन्न किया जा सकता है, जो 3 डी समुच्चय के रूप में शुरू होते हैं। इसके अलावा, सिल्वा एट अल.7 ने प्रदर्शित किया कि 2 डी में परिपक्व अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स का प्रतिनिधित्व करने वाली कोशिकाओं को होम्स और हेन के समान दृष्टिकोण के साथ उत्पन्न किया जा सकता है, 3 डी से 2 डी तक स्विच करने और विकास और परिपक्वता के समय का विस्तार करने के लिए एक अलग समय बिंदु का उपयोग करके।

वर्तमान प्रोटोकॉल इंसुलिन और एफजीएफ 2 का उपयोग करके मुक्त-फ्लोटिंग भ्रूण निकायों (ईबी) का उत्पादन करके फीडर-मुक्त आईपीएससी में अनुमस्तिष्क भाग्य को प्रेरित करता है और फिर 2 डी विकास और भेदभाव के लिए 14 वें दिन पीएलओ / लैमिनिन-लेपित व्यंजनों पर ईबी चढ़ाता है। दिन 35 तक, अनुमस्तिष्क पहचान वाली कोशिकाएं प्राप्त की जाती हैं। अनुमस्तिष्क विकास के शुरुआती चरणों को पुन: उत्पन्न करने की क्षमता, विशेष रूप से 2 डी वातावरण में, शोधकर्ताओं को मोनोलेयर संरचना के साथ प्रयोगों की आवश्यकता वाले विशिष्ट प्रश्नों का उत्तर देने की अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल वांछित सेल आबादी को समृद्ध करने के लिए माइक्रोपैटर्न सतहों, अक्षीय आउटग्रोथ परख और सेल सॉर्टिंग जैसे आगे के संशोधनों के लिए भी उत्तरदायी है।

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Protocol

मानव विषय अनुसंधान को आयोवा संस्थागत समीक्षा बोर्ड अनुमोदन संख्या 201805995 विश्वविद्यालय और आयोवा विश्वविद्यालय मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल समिति अनुमोदन संख्या 2017-02 के तहत अनुमोदित किया गया था। लिखित सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद विषयों से त्वचा बायोप्सी प्राप्त की गई थी। फाइब्रोब्लास्ट्स को डीएमईएम में 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% एमईएम-गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर सुसंस्कृत कियागया था। फाइब्रोब्लास्ट्स को इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए न्यूक्लियोफेक्टर का उपयोग करके निर्माता के प्रोटोकॉल ( सामग्री की तालिका देखें) का पालन करते हुए एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग किट का उपयोग करके पुन: प्रोग्राम किया गया था। सभी प्रक्रियाओं को क्लास II टाइप ए 2 जैविक सुरक्षा कैबिनेट (संक्षेप में "हुड") में किया गया था। सभी सेल कल्चर मीडिया एंटीबायोटिक मुक्त थे; इसलिए, हुड में प्रवेश करने वाले प्रत्येक घटक को 70% इथेनॉल के साथ साफ किया गया था। सभी सेल कल्चर मीडिया और घटकों को बाँझ फ़िल्टर किया गया था या उनकी बाँझता को बनाए रखने के लिए हुड में खोला गया था।

1. प्रयोगात्मक तैयारी

  1. बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स (बीएमएम) -लेपित प्लेटें तैयार करें।
    नोट: बीएमएम गर्म तापमान पर अधिक तेज़ी से जम जाता है। प्लेटों को तेजी से तैयार किया जाना चाहिए और भंडारण के लिए तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए।
    1. बर्फ पर बीएमएम ( सामग्री की तालिका देखें) को कम से कम 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, या रात भर पिघलाएं।
    2. DMEM/F12 और BMM को 80 μg/mL की अंतिम सांद्रता में मिलाएं। बीएमएम समाधान को टिशू कल्चर व्यंजनों (35 मिमी के लिए 1 एमएल और 60 मिमी व्यंजनों के लिए 2 एमएल) में वितरित करें और कोशिकाओं को चढ़ाने से पहले कम से कम 1 घंटे या रात भर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: अप्रयुक्त व्यंजन 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. पॉली-एल-ऑर्निथिन/लैमिनिन (पीएलओ/लैमिनिन)-लेपित प्लेटें तैयार करें।
    1. बाँझ DPBS+/+ में 20 μg/mL PLO ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें और 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 एमएल जोड़ें। इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    2. अगले दिन, पीएलओ को वैक्यूम एस्पिरेटर के साथ एस्पिरेट करें और डीपीबीएस + / + के साथ दो बार धोएं। हवा हुड में सूख जाती है।
      नोट: हवा में सूखने वाली प्लेटों को भविष्य के उपयोग के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. DPBS+/+ में 10 μg/mL लैमिनिन ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें और 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 एमएल जोड़ें। इनक्यूबेटर में कम से कम 3 घंटे या रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. लैमिनिन को वैक्यूम एस्पिरेटर के साथ एस्पिरेट करें और मध्यम या बाँझ डीपीबीएस + के 1 एमएल जोड़ें।
      नोट: लैमिनिन कोटिंग को सूखना नहीं चाहिए। इसे रोकने के लिए पीबीएस या एक उपयुक्त संस्कृति माध्यम को तुरंत जोड़ा जाना चाहिए। लेपित प्लेटों को 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. पीएससी पासिंग समाधान तैयार करें।
    नोट: पीएससी पासिंग समाधान10 बनाने के लिए एक ऑस्मोमीटर (सामग्री की तालिका देखें) की आवश्यकता होती है।
    1. बाँझ सेल कल्चर ग्रेड पानी के 400 एमएल में 11.49 ग्राम पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल) और 0.147 ग्राम सोडियम साइट्रेट डाइहाइड्रेट (एचओसी(सीओओएनए) (सीएच 2 सीओओएनए)2 * 2 एच 2ओ) को घोलें (सामग्री की तालिका देखें)।
    2. समाधान की मात्रा को मापें और इसे प्रारंभिक मात्रा (VI) के रूप में रिकॉर्ड करें।
    3. ऑस्मोलरिटी को मापें और फॉर्मूला VI × Oi = Vf × 570 mOsm का उपयोग करके बाँझ सेल कल्चर ग्रेड पानी जोड़कर इसे 570 mOsm तक समायोजित करें।
    4. 0.20 μm फ़िल्टर के साथ घोल को फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें और 10 mL एलिकोट बनाएं। 6 महीने तक कमरे के तापमान (आरटी) पर एलिकोट स्टोर करें।
  4. प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) माध्यम तैयार करें।
    नोट: आईपीएससी को गर्मी-स्थिर एफजीएफ 2 ( सामग्री की तालिका देखें) युक्त माध्यम में बनाए रखा जाता है, जो सप्ताहांत-मुक्त भोजन अनुसूची प्रदान करता है। अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीएससी मीडिया को इस प्रोटोकॉल के लिए आज़माया नहीं गया है।
    1. पीएससी माध्यम पूरक को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं।
    2. बेसल पीएससी माध्यम के 500 एमएल के लिए 10 एमएल पीएससी माध्यम पूरक जोड़ें। 25 एमएल एलिकोट बनाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: जमे हुए एलिकोट को 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। पिघले हुए एलिकोट को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और 2 सप्ताह के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए। कोशिकाओं को 10% (वी / वी) डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ पीएससी माध्यम में दीर्घकालिक भंडारण के लिए जमे हुए किया जा सकता है।
  5. पीएससी पिघलने का माध्यम तैयार करें।
    1. 50 एनएम क्रोमैन, 1.5 μM emricasan, 1x पॉलीमाइन पूरक, और 0.7 μM ट्रांस-ISRIB (CEPT कॉकटेल11) के साथ पूरक पीएससी माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. 0.20 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें और 4 °C पर 4 सप्ताह तक स्टोर करें।
  6. खींचे गए ग्लास पिपेट तैयार करें।
    1. 22.9 सेमी (9 इंच) ग्लास पाश्चर पिपेट को एक बनसेन बर्नर के ऊपर दो टुकड़ों में खींचें, गर्दन से ~ 2 सेमी नीचे, दो पिपेट बनाएं, जिसमें पतला पक्ष दूसरे की तुलना में ~ 4 सेमी छोटा हो।
    2. लौ की मदद से, एक चिकनी "आर" बनाने के लिए खींचे गए पक्ष की युक्तियों को मोड़ें।
    3. नसबंदी के लिए खींचे गए पिपेट को ऑटोक्लेव आस्तीन और ऑटोक्लेव में रखें।
  7. अनुमस्तिष्क विभेदन माध्यम (सीडीएम) तैयार करें।
    1. आईएमडीएम और हैम के एफ 12 पोषक तत्व मिश्रण को 1: 1 अनुपात में मिलाएं। मिश्रण को 1x L-alanine-L-glutamine पूरक, 1% (v/v) रासायनिक रूप से परिभाषित लिपिड एकाग्रता, 0.45 mM 1-थायो-ग्लिसरॉल, 15 μL/mL apo-transferrin, 5 mg/mL गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), और 7 μg/mL इंसुलिन ( सामग्री तालिका देखें) के साथ पूरक करें।
    2. 0.20 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें, 4 °C पर स्टोर करें, और 1 महीने के भीतर उपयोग करें।
  8. अनुमस्तिष्क परिपक्वता माध्यम (सीएमएम) तैयार करें।
    1. 1x L-Alanine-L-Glutamine पूरक और 1x N-2 पूरक के साथ न्यूरोबेसल माध्यम पूरक करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. 0.20 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें, 4 °C पर स्टोर करें, और 2 सप्ताह के भीतर उपयोग करें।

2. फीडर मुक्त आईपीएससी संस्कृति

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए कोशिकाओं को पिघलाएं।
    1. कोशिकाओं को पिघलाने से पहले कम से कम 1 घंटे या रात भर जेल करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक बीएमएम प्लेट (चरण 1.1) रखें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर पीएससी पिघलने माध्यम (चरण 1.5) के 10 एमएल को पूर्व-गर्म करें।
    3. तरल नाइट्रोजन से कोशिकाओं के साथ क्रायोवियल को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में स्थानांतरित करें।
      नोट: सेल कल्चर स्पेस में संदूषण के स्रोत को उत्पन्न करने से बचने के लिए, एक मानक जल स्नान का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है। इसके बजाय, ताजे पानी को एक बार उपयोग किए जाने वाले पानी के स्नान को उत्पन्न करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक एक छोटे बीकर में गर्म किया जा सकता है।
    4. जब ट्यूब में बर्फ का एक छोटा टुकड़ा बच जाए, तो इसे पानी के स्नान से निकालें, ट्यूब को सुखाएं, और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। ट्यूब को हुड में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को धीरे से 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए 2 एमएल या 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
    5. शंक्वाकार ट्यूब को घुमाते हुए कोशिकाओं में 8 एमएल पीएससी पिघलने का माध्यम जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    6. सेल पेलेट को परेशान किए बिना वैक्यूम एस्पिरेटर के साथ सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। पीएससी पिघलने के माध्यम के 2 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    7. प्लेट से बीएमएम को एस्पिरेट करें और वितरण के लिए प्लेट पर पुनर्निलंबित कोशिकाओं को ड्रॉपवाइज जोड़ें।
    8. प्लेट को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर रखें। पीएससी माध्यम के साथ अगले दिन माध्यम को ताज़ा करें। उसके बाद रोजाना माध्यम बदलें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए कोशिकाओं को बनाए रखें।
    1. पीएससी माध्यम की आवश्यक मात्रा को 37 डिग्री सेल्सियस (उदाहरण के लिए, प्रति 35 मिमी प्लेट में 1 एमएल माध्यम) पर प्री-वार्म करें।
    2. विभेदित कोशिकाओं या कॉलोनियों के लिए प्लेटों की जांच करें और एक खींचे गए ग्लास पिपेट (चरण 1.6) के साथ विभेदित कोशिकाओं को हटा दें।
      नोट: आईपीएससी कॉलोनियों में रूपात्मक रूप से समान कोशिकाओं के साथ चिकनी किनारे होते हैं।
    3. खर्च किए गए माध्यम को दैनिक रूप से बदलें और हर 3-4 दिनों में या जब 70% की कमी तक पहुंच जाए।
  3. कोशिकाओं को पारित करें।
    1. पासिंग से पहले कम से कम 1 घंटे या रात भर के लिए इनक्यूबेटर में बीएमएम प्लेटों की आवश्यक मात्रा रखें। पीएससी माध्यम (चरण 1.3) की आवश्यक मात्रा को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-वार्म करें।
    2. खींचे गए ग्लास पिपेट का उपयोग करके, किसी भी विभेदित कोशिकाओं या कॉलोनियों को साफ करें।
    3. एक वैक्यूम एस्पिरेटर के साथ खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और पीएससी पृथक्करण माध्यम जोड़ें, 1 एमएल प्रति 35 मिमी डिश। 1-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि कॉलोनियां पीएससी माध्यम जोड़ने से पहले पीएससी पासिंग समाधान में उठा रही हैं, तो इनक्यूबेशन समय को कम किया जा सकता है।
    4. पीएससी पासिंग समाधान को एस्पिरेट करें और प्री-वार्मेड पीएससी माध्यम जोड़ें।
    5. बाँझ 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके, एक दिशा में एक दूसरे के समानांतर स्क्रैच लाइनें, प्लेट को 90 ° घुमाएं, और पिछले लोगों के लंबवत खरोंच लाइनों का एक दूसरा सेट बनाएं (प्लेट में एक क्रॉस-हैच पैटर्न बनाना)।
    6. सेट प्लेटों से बीएमएम समाधान को एस्पिरेट करें। सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके कॉलोनियों को इकट्ठा करें और उन्हें नए बीएमएम प्लेटों में वितरित करें।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। माध्यम को प्रतिदिन बदलें।
  4. कोशिकाओं को फ्रीज करें।
    1. सामग्री को लेबल करके क्रायोवियल तैयार करें और 30 मिनट के लिए हुड में पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत निष्फल करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. 10% (v/v) DMSO के साथ पीएससी माध्यम को पूरक करके पीएससी फ्रीजिंग माध्यम तैयार करें। चरण 2.3.2-2.3.5 का पालन करें।
    3. कोशिकाओं को 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और आरटी में 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सावधानी से माध्यम को एस्पिरेट करें और पीएससी फ्रीजिंग माध्यम में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
    5. क्रायोवियल्स में वितरित करें। शीशियों को एक फ्रीजिंग कंटेनर में रखें और कंटेनर को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
    6. अगले दिन, क्रायोवियल्स को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

3. अनुमस्तिष्क भेदभाव

नोट: भेदभाव शुरू करने से पहले, आईपीएससी को छह 35 मिमी व्यंजनों में पारित किया जाता है और जब वे 70% संयोजन पर होते हैं तो भेदभाव के लिए तैयार होते हैं। प्रत्येक 35 मिमी प्लेट को 6-वेल प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित किया जाएगा।

  1. दिन 0 पर, ईबी गठन के लिए स्वस्थ आईपीएससी कॉलोनियों को उठाएं।
    1. 6-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट (यूएलए) प्लेट के प्रत्येक कुएं में 10 μM Y-27632 और 10 μM SB431542 ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक 1 एमएल CDM (चरण 1.7) जोड़ें और इनक्यूबेटर में तब तक रखें जब तक कि उठाए गए उपनिवेश कुओं में जोड़ने के लिए तैयार न हों।
    2. खींचे गए ग्लास पिपेट का उपयोग करके विभेदित कोशिकाओं को साफ करें। माध्यम को एस्पिरेट करें और प्रत्येक 35 मिमी डिश के लिए 1 एमएल पीएससी पासिंग समाधान जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और 10 μM Y-27632 और 10 μM SB431542 के साथ पूरक 2 एमएल CDM जोड़ें।
      नोट: यदि सीडीएम जोड़ने से पहले कॉलोनियां पीएससी पासिंग समाधान में उठा रही हैं, तो इनक्यूबेशन समय को कम किया जा सकता है।
    3. एक संचारित-प्रकाश उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत, 4x आवर्धन का उपयोग करके खींचे गए ग्लास पिपेट के मुड़े हुए किनारे का उपयोग करके कॉलोनियों को धीरे से उठाएं। एक बार जब हर कॉलोनी को उठा लिया जाता है, तो धीरे से 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके 6-वेल यूएलए प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें। प्रत्येक आईपीएससी प्लेट के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। कोशिकाओं को 5% CO2 के साथ 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि कॉलोनियां बहुत बड़ी हैं या विलय कर दी गई हैं, तो उन्हें छोटे ईबी बनाने के लिए खींचे गए ग्लास पिपेट की नोक के साथ काटा जा सकता है।
  2. दिन 2 पर, 50 एनजी / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक कुएं में एफजीएफ 2 जोड़ें।
    नोट: अनुमस्तिष्क भेदभाव के लिए उपयोग किया जाने वाला एफजीएफ 2 गर्मी-स्थिर नहीं है। इस प्रोटोकॉल को गर्मी-स्थिर एफजीएफ 2 के साथ परीक्षण नहीं किया गया है।
  3. दिन 7 पर, 1/3 मध्यम परिवर्तन करें। एक कुएं में कुल माध्यम के 3 एमएल के लिए, 1,000 μL पाइपेटर के साथ, धीरे से खर्च किए गए माध्यम के 1 एमएल को एस्पिरेट करें और इसे 1 एमएल ताजा सीडीएम के साथ बदलें। ईबी को 7 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. 14 वें दिन, धीरे से 1,000 μL पाइपेटर का उपयोग करके लगभग सभी खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें। ईबी को न्यूनतम नुकसान सुनिश्चित करने के लिए, प्लेट के केंद्र में सभी ईबी को इकट्ठा करने के लिए प्लेट को घुमाएं, और फिर प्लेट को झुकाएं और किनारे से धीरे-धीरे एस्पिरेट करें।
    1. जैसे-जैसे मध्यम मात्रा कम होती जाती है, धीरे-धीरे प्लेट को सपाट रखें और एस्पिरेट करना जारी रखें। ईबी को सूखने से बचने के लिए पर्याप्त माध्यम छोड़ दें। बाद में, 10 μM Y-27632 के साथ पूरक 3 एमएल ताजा सीडीएम जोड़ें। 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके ईबी को पीएलओ / लैमिनिन-लेपित डिश (चरण 1.2) में स्थानांतरित करें।
      नोट: डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के आधार पर, ईबी को 6-वेल पीएलओ / लैमिनिन प्लेट में स्थानांतरित किया जा सकता है या एकल ईबी को पीएलओ / लैमिनिन-लेपित 24-वेल प्लेट या कवरस्लिप के एकल कुएं में स्थानांतरित किया जा सकता है।
  5. 15 वें दिन, माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे ताजा सीडीएम के साथ बदलें।
    नोट: फीडिंग के बीच पर्याप्त माध्यम सुनिश्चित करने के लिए कुओं में पर्याप्त माध्यम जोड़ना महत्वपूर्ण है, क्योंकि समय के साथ, वाष्पीकरण होगा (उदाहरण के लिए, 6-वेल प्लेट में एक कुएं के लिए, 3 एमएल माध्यम जोड़ें)। यदि माध्यम ने अम्लीकरण करना शुरू कर दिया है (स्पष्ट और पीला हो जाता है), तो माध्यम को ताज़ा करें, भले ही यह प्रोटोकॉल के अंत तक फीडिंग शेड्यूल पर न हो।
  6. 21 वें दिन, खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे सीएमएम के साथ बदलें। 28 वें दिन, ताजा सीएमएम के साथ माध्यम बदलें। 35 वें दिन, आगे के अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं की कटाई करें।

4. आरएनए अलगाव के लिए नमूना तैयार करना

  1. माध्यम को एस्पिरेट करें और 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 500 μL सेल पृथक्करण अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। इसे कुछ सेकंड के लिए छोड़ दें और एस्पिरेट करें।
  2. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ढक्कन के साथ प्लेट को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्लेट के किनारों को टैप करें।
  3. सीएमएम के 1 एमएल (चरण 1.8) जोड़ें और कोशिकाओं को 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें।
  4. आरटी (अधिकतम गति 2000 x g) पर 30 सेकंड के लिए बेंचटॉप मिनी सेंट्रीफ्यूज (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को छर्रेट करें, माध्यम को छोड़ दें, और सेल पेलेट को धोने के लिए 1 x PBS pH 7.4 का 1 एमएल जोड़ें।
  5. आरटी में 30 सेकंड के लिए बेंचटॉप मिनी सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से पेलेट करें और पीबीएस के साथ एक बार फिर धो लें।
  6. कोशिकाओं को गोली मार दें और पीबीएस को छोड़ दें। फिनोल और गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट युक्त अभिकर्मक में कोशिकाओं को लाइस करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: फिनोल और गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट युक्त अभिकर्मक में लीस्ड कोशिकाओं को 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। आरएनए अलगाव विधि और उपयोग किए जा रहे अभिकर्मकों के आधार पर कोशिकाओं को सीधे डिश में रखा जा सकता है। एक डिश में कोशिकाओं की कम संख्या के कारण, सिलिका स्पिन कॉलम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके आरएनए को अलग करने से आरएनए की उच्च पैदावार होगी।

5. इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने के लिए कोशिकाओं को तैयार करना

नोट: 24-वेल प्लेट के लिए, प्रति कुएं एक ईबी पर्याप्त है।

  1. 35 वें दिन, खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और प्रति कुएं (24-वेल प्लेट के एक कुएं के लिए) 1 एमएल डीपीबीएस + / + जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  2. DPBS+/+ को एस्पायरेट करें और डीपीबीएस+/+ प्रति अच्छी तरह से तैयार 500 μL ठंडा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (PFA, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। आरटी में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. चरण 5.1 के अनुसार, 4% पीएफए निकालें और कोशिकाओं को डीपीबीएस +/+ के साथ दो बार धोएं। 1 एमएल डीपीबीएस +/+ जोड़ें और कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर तब तक स्टोर करें जब तक कि धुंधला न हो जाए।
    नोट: सेल डिटेचमेंट और एंटीजन के नुकसान से बचने के लिए निर्धारण के बाद 1 सप्ताह के भीतर इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला करने की सलाह दी जाती है। हालांकि, एंटीबॉडी और लक्ष्य के सेलुलर स्थान के आधार पर, निर्धारण के बाद 4 सप्ताह तक बाद के समय में धुंधला किया जा सकता है।

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Representative Results

3 डी से 2 डी अनुमस्तिष्क भेदभाव का अवलोकन
अनुमस्तिष्क कोशिकाएं आईपीएससी से शुरू होती हैं। चित्रा 1 ए समग्र वर्कफ़्लो और भेदभाव के लिए प्रमुख घटकों को जोड़ता है। दिन 0 पर, एसबी 431542 और वाई -27632 युक्त सीडीएम में खींचे गए ग्लास पिपेट का उपयोग करके आईपीएससी कॉलोनियों (चित्रा 1 बी) को धीरे से उठाकर ईबी बनाए जाते हैं और अल्ट्रा-लो-अटैचमेंट प्लेटों में रखे जाते हैं। FGF2 को दूसरे दिन जोड़ा जाता है। दिन 7 पर, माध्यम का एक तिहाई हिस्सा बदल जाता है, और ईबी गठन देखा जाता है (चित्रा 1 सी)। 14 वें दिन, बढ़े हुए ईबी (चित्रा 1 डी) को वाई -27632 के साथ पूरक सीडीएम में पीएलओ / लैमिनिन-लेपित व्यंजनों पर चढ़ाया जाता है। 15 वें दिन, माध्यम को वाई -27632 के बिना सीडीएम के साथ बदल दिया जाता है। कोशिकाएं लेपित सतह के साथ ईबी (चित्रा 1 ई) से बाहर की ओर पलायन करना शुरू कर देती हैं। 21 वें दिन, एक पूर्ण मध्यम परिवर्तन किया जाता है, और माध्यम को सीएमएम में बदल दिया जाता है। उसके बाद, माध्यम को साप्ताहिक रूप से एक बार बदल दिया जाता है (या अधिक बार यदि माध्यम जल्दी से अम्लीय हो जाता है)। दिन 35 तक, न्यूरोनल जैसी आकृति विज्ञान और जटिलता (चित्रा 1 एफ, जी) के साथ कोशिकाओं का एक मोनोलेयर होता है।

2 डी कोशिकाएं अनुमस्तिष्क सेल मार्कर ों को व्यक्त करती हैं
आरएनए अलगाव और इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए 35 वें दिन कोशिकाओं की कटाई की जाती है। अनुमस्तिष्क विकास के दौरान मौजूद जीन की अभिव्यक्ति आरटी-क्यूपीसीआर (चित्रा 2) द्वारा मापी जाती है। कोशिकाएं प्रारंभिक अनुमस्तिष्क पूर्वज मार्करों जैसे एटीओएच1 12,13 (रोम्बिक होंठ, ग्लूटामेटर्जिक पूर्वज) और पीटीएफ 1:14 (वेंट्रिकुलर ज़ोन, जीबीएर्जिक पूर्वज), साथ ही पर्किन्जे पूर्वज सेल मार्कर KIRREL215 और SKOR215 को व्यक्त करती हैं। प्रारंभिक विकासात्मक अनुमस्तिष्क सेल मार्करों के अलावा, बाद के चरण के विकास जीन, ओटीएक्स 2 और सिक्स 3 की अभिव्यक्ति भी देखी जाती है। कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग अनुमस्तिष्क मार्कर EN2 और PTF1 ( चित्रा 3A, D), न्यूरोनल मार्कर TUBB3 (चित्रा 3G), साथ ही प्रसार मार्कर Ki67 (चित्रा 3J) के लिए सकारात्मक धुंधलापन दिखाता है। 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (DAPI) के साथ परमाणु धुंधलापन सेल नाभिक (चित्रा 3 बी, ई, एच, के) को दर्शाता है। इस प्रोटोकॉल को और मान्य करने के लिए, न्यूरोसाइकियाट्रिक विकार वाले रोगियों से प्राप्त आईपीएससी का उपयोग अनुमस्तिष्क कोशिकाओं को उत्पन्न करने और 35 वें दिन अनुमस्तिष्क सेल मार्कर अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। आरटी-क्यूपीसीआर डेटा नियंत्रण आईपीएससी (पूरक चित्रा 1) के समान अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को इंगित करता है। इसके अतिरिक्त, अनुमस्तिष्क विकास के लिए प्रासंगिक अक्षीय मार्गदर्शन अणुओं की अभिव्यक्ति नियंत्रण और रोगी-व्युत्पन्न अनुमस्तिष्क कोशिकाओं (पूरक चित्रा 2) दोनों में मौजूद है।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल टाइमलाइन और प्रतिनिधि छवियों का अवलोकन। (ए) अनुमस्तिष्क विभेदन प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध रूपरेखा जिसमें संस्कृति माध्यम के प्रकार को दर्शाया गया है, संस्कृति माध्यम में जोड़े गए पूरक, उन दिनों जब मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता होती है (ऊर्ध्वाधर रेखाओं के साथ इंगित), और संस्कृति डिश की सतह कोटिंग। (बी) दिन 0 पर आईपीएससी की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां और विभेदित कोशिकाएं जिन्हें ईबी बनाने से पहले साफ किया जाएगा (लाल सर्कल में दिखाया गया है), (सी) दिन 7 और (डी) दिन 14 पर ईबी, (ई) ईबी चढ़ाने के एक दिन बाद, और (एफ, जी) 35 वें दिन परिपक्व कोशिकाएं। स्केल बार (बी-डी): 1 मिमी; (E-G): 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: दिन 35 पर 2 डी अनुमस्तिष्क कोशिकाओं में अनुमस्तिष्क सेल मार्करों की अभिव्यक्ति। आरटी-क्यूपीसीआर जीन अभिव्यक्ति परिणाम 35 वें दिन विभिन्न अनुमस्तिष्क विकास मार्करों और सेल प्रकारों का प्रतिनिधित्व करने वाले चयनित जीनों के लिए होता है, जिसे जीएपीडीएच में सामान्यीकृत किया जाता है। -3सीटी मान लक्ष्य-सीटी मानों से घटाए गए जीएपीडीएच-सीटी मानों का प्रतिनिधित्व करते हैं; शून्य के करीब मूल्य उच्च अभिव्यक्ति का संकेत देते हैं। टिक लाइन के नीचे कोई भी मान पता लगाने योग्य सीमा से नीचे अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है। N = 2 iPSC लाइनें, डेटा को SD ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: 35 वें दिन 2 डी अनुमस्तिष्क कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग। कोशिकाओं को 35 वें दिन 4% पीएफए के साथ तय किया जाता है और डीएपीआई के साथ परमाणु दाग होता है और (ए) ईएन 2 (हरा), (बी) डीएपीआई (नीला), (सी) ईएन 2-डीएपीआई विलय के लिए इम्यूनोलेबल किया जाता है; (D) PTF1α (लाल), (E) DAPI (नीला), (F) PTF1α-DAPI विलय; (छ) TUBB3 (हरा), (H) DAPI (नीला), (I) TUBB3-DAPI का विलय; और (जे) Ki67 (लाल), (K) DAPI (नीला), (L) Ki67-DAPI विलय हो गया। स्केल पट्टियाँ: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: स्किज़ोफ्रेनिया के निदान वाले रोगियों से प्राप्त आईपीएससी का उपयोग करके अनुमस्तिष्क भेदभाव की प्रतिनिधि छवियां। (ए) आईपीएससी कॉलोनियां, (बी) 7 वें दिन ईबी, (सी) दिन 14, (डी) 15 वें दिन पीएलओ / लैमिनिन-लेपित डिश पर प्लेटेड ईबी से निकलने वाली कोशिकाएं, और (ई) 35 वें दिन अनुमस्तिष्क कोशिकाएं। (च) अनुमस्तिष्क सेल मार्करों के लिए 35 वें दिन जीन अभिव्यक्ति के लिए आरटी-क्यूपीसीआर परिणाम, जीएपीडीएच के लिए सामान्यीकृत। -3सीटी मान लक्ष्य-सीटी मानों से घटाए गए जीएपीडीएच-सीटी मानों का प्रतिनिधित्व करते हैं; शून्य के करीब मूल्य उच्च अभिव्यक्ति का संकेत देते हैं। टिक लाइन के नीचे कोई भी मान पता लगाने योग्य सीमा से नीचे अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है। एन = 2 आईपीएससी लाइनें, डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। स्केल बार (ए-सी): 1 मिमी; (D, E): 500 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: दिन 35 पर 2 डी अनुमस्तिष्क कोशिकाओं के अक्षीय मार्गदर्शन अणुओं की जीन अभिव्यक्ति। आरटी-क्यूपीसीआर जीन अभिव्यक्ति के परिणाम एक्सॉन मार्गदर्शन सिग्नलिंग में शामिल चयनित अणुओं के लिए 35 वें दिन होते हैं, जिन्हें जीएपीडीएच के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। दिखाए गए सभी जीनों को PxnB3 को छोड़कर सेरिबैलम में व्यक्त किया जाता है, जिसमें विकास में सेरिबैलम में कम अभिव्यक्ति होती है। -3सीटी मान लक्ष्य-सीटी मानों से घटाए गए जीएपीडीएच-सीटी मानों का प्रतिनिधित्व करते हैं; शून्य के करीब मूल्य उच्च अभिव्यक्ति का संकेत देते हैं। टिक लाइन के नीचे कोई भी मान पता लगाने योग्य सीमा से नीचे अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है। N (नियंत्रण) = 1, N (SCZ) = 1, और तीन प्रतियों में चलाए जाने वाले प्रयोगों का माध्य दिखाया गया है। संक्षिप्त नाम: एससीजेड = सिज़ोफ्रेनिया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

विट्रो में मानव अनुमस्तिष्क विकास को मॉडल करने की क्षमता रोग मॉडलिंग के साथ-साथ सामान्य मस्तिष्क के विकास की समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। कम जटिल और लागत प्रभावी प्रोटोकॉल कई वैज्ञानिक प्रयोगशालाओं में प्रतिकृति डेटा उत्पादन और व्यापक कार्यान्वयन के लिए अधिक अवसर पैदा करते हैं। एक अनुमस्तिष्क विभेदन प्रोटोकॉल को यहां ईबी उत्पन्न करने की एक संशोधित विधि का उपयोग करके वर्णित किया गया है, जिसमें मुगुरुमा एट अल द्वारा रिपोर्ट किए गए विकास कारकों का उपयोग करके एंजाइम या पृथक्करण एजेंटों की आवश्यकता नहीं होती है। होम्स एट अल की विधि के समान एक संशोधित 2 डी मोनोलेयर सेल विकास प्रोटोकॉल। 5.

समग्र प्रोटोकॉल आईपीएससी से ईबी उत्पन्न करके शुरू होता है, इसके बाद अनुमस्तिष्क भेदभाव का प्रेरण होता है, और अंत में, 2 डी मोनोलेयर संस्कृति के लिए चढ़ाना होता है। इस प्रक्रिया के दौरान, 7-14 दिनों के बीच कोशिका मृत्यु की एक महत्वपूर्ण मात्रा देखी गई थी। इस सेल हानि के कारण, बड़ी संख्या में ईबी के साथ शुरू करने की सलाह दी जाती है; 2 डी कोशिकाओं की 6-वेल प्लेट के लिए, आईपीएससी की न्यूनतम छह प्लेटों (या तो 35 मिमी या 60 मिमी प्लेटों) से शुरू करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, पीएलओ / लैमिनिन पर ईबी चढ़ाने के समय वाई -27632 के अलावा सब्सट्रेट के लिए ईबी के लगाव में काफी वृद्धि होती है। संस्कृतियों में माध्यम को रुक-रुक कर देखना महत्वपूर्ण है। यदि माध्यम पीला (अम्लीय) हो रहा है, तो माध्यम को बदलने की सलाह दी जाती है, भले ही यह फीडिंग स्कीम में न हो। संलग्न कोशिकाओं की कुल संख्या प्रयोग से प्रयोग में भिन्न होगी, जिससे माध्यम में पोषक तत्वों की अधिक लगातार या कम लगातार ताजगी की आवश्यकता होती है।

आरटी-क्यूपीसीआर परिणामों से पता चला कि आईपीएससी विकासशील सेरिबैलम के शुरुआती चरणों का प्रतिनिधित्व करने वाली कोशिकाओं में विभेदित होते हैं। वर्तमान आंकड़ों से पता चलता है कि, विभेदन के 35 वें दिन, न्यूरोनल सेल भाग्य मार्कर (TUBB316,17), ग्लूटामेटर्जिक और GABArgic पूर्वज मार्कर (ATOH112,13 और PTF1:14, क्रमशः), मिडब्रेन-हिंडब्रेन सीमा मार्कर (EN1 18, EN218, GBX219), इस्थमिक आयोजक मार्कर (WNT118, FGF819), Rhombic lip व्युत्पन्न सेल मार्कर (PAX618) व्यक्त करने वाली कोशिकाएं हैं। ), और पर्किन्जे सेल पूर्वज मार्कर (KIRREL215, SKOR220)। रोम्बिक लिप मार्कर ओटीएक्स 221 की अभिव्यक्ति भी देखी गई। एचईएससी का उपयोग करके पिछले अनुमस्तिष्क ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल ने देखा है कि एफजीएफ 2 प्रेरण के परिणामस्वरूप जीबीएक्स 2 कोशिकाओं को व्यक्त करता है लेकिन बहुत कम ओटीएक्स 2 सकारात्मक कोशिकाएं होती हैं, जबकि आईपीएससी का उपयोग करने वाले एक समान प्रोटोकॉल ने अनुमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स8 में जीबीएक्स 2 और ओटीएक्स 2 की समान एमआरएनए अभिव्यक्ति दिखाई। हालांकि, माउस भ्रूण स्टेम सेल (एमईएससी) -व्युत्पन्न अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स में अलग-अलग ओटीएक्स 2 और जीबीएक्स 2 पॉजिटिव सेल क्लस्टर4 होते हैं, और यह दिखाया गया है कि ओटीएक्स 2 माउस22 और मानव21,23 अनुमस्तिष्क विकास में व्यक्त किया जाता है। समान भाग्य विनिर्देश कारकों का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल के बीच ओटीएक्स 2 की विभेदक अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल प्रोटोकॉल के बीच अन्य अंतरों या एचईएससी और आईपीएससी के बीच व्यक्तिगत अंतर के कारण हो सकती है; यह आगे की जांच के योग्य है। 35 वें दिन संस्कृति में सिक्स3 अभिव्यक्ति भी देखी गई। सिक्स 3 को विकास के दौरान पूर्ववर्ती तंत्रिका ट्यूब में व्यक्त किया जाता है, और मानव सेरिबैलम में इसकी अभिव्यक्ति पूरे विकास और वयस्कता में कम रहती है23,24; हालांकि, यह नवजात और वयस्क माउस सेरिबैलम25 में व्यक्त किया गया है। इससे पता चलता है कि कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या हो सकती है जो एक पूर्ववर्ती भाग्य की ओर अंतर करती है, या वे विकास के दौरान सिक्स 3 व्यक्त करने वाली अनुमस्तिष्क कोशिकाओं की उप-जनसंख्या का प्रतिनिधित्व कर सकती हैं। इन कोशिकाओं का और अधिक पता लगाया जा सकता है।

भेदभाव प्रोटोकॉल अक्सर स्वस्थ विषयों से एचईएससी या आईपीएससी का उपयोग करके विकसित किए जाते हैं, लेकिन यह पुष्टि करना महत्वपूर्ण है कि इन प्रोटोकॉल को रोग में आणविक और सेलुलर परिवर्तनों को विच्छेदित करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी पर लागू किया जा सकता है। हमारे प्रोटोकॉल का और परीक्षण करने के लिए, हमारे नियंत्रण आईपीएससी लाइनों के साथ, हमने आईपीएससी लाइनों को विभेदित किया जो स्किज़ोफ्रेनिया के निदान वाले रोगियों से प्राप्त फाइब्रोब्लास्ट से पुन: प्रोग्राम किए गए थे। पिछले साहित्य से पता चला है कि स्किज़ोफ्रेनिया के निदान वाले रोगियों में कार्यात्मक और शारीरिक अनुमस्तिष्क असामान्यताएं 26,27,28 हैं। ये परिवर्तन वयस्क रोगियों में देखे जाते हैं लेकिन विकास के दौरान शुरू हो सकते हैं और आगे की जांच की आवश्यकता होती है। कुल मिलाकर, यह देखा गया कि स्किज़ोफ्रेनिया रोगियों से अनुमस्तिष्क कोशिकाओं ने 35 वें दिन परीक्षण किए गए अनुमस्तिष्क मार्करों को व्यक्त किया और रूपात्मक रूप से नियंत्रण आईपीएससी (पूरक चित्रा 1) से प्राप्त अनुमस्तिष्क कोशिकाओं से अलग नहीं थे। इससे पता चलता है कि यह प्रोटोकॉल रोग के संदर्भ में मानव अनुमस्तिष्क विकास की जांच कर सकता है। इसके अलावा, 35 वें दिन अक्षीय मार्गदर्शन मार्करों की अभिव्यक्ति की भी जांच की गई थी, दोनों नियंत्रण और स्किज़ोफ्रेनिया सेल लाइनों में, क्योंकि विकास के प्रमुख घटकों में से एक अक्षीय पाथफाइंडिंग और न्यूरोनल कनेक्टिविटी 29,30,31,32 है। दरअसल, 35 वें दिन, अक्षीय मार्गदर्शन अणुओं को सत्यापित किया गया था जो अनुमस्तिष्क विकास में इंगित किए गए हैं, जिसमें सेमाफोरिन -4 सी, प्लेक्सिन-बी 2 और न्यूरोपिलिन -1 (पूरक चित्रा 2) शामिल हैं। विकास के दौरान, मानव सेरिबैलम23 में प्लेक्सिन-बी 3 अभिव्यक्ति कम होती है, और भेदभाव के लिए अन्य अक्षीय मार्गदर्शन अणुओं की तुलना में प्लेक्सिन-बी 3 की कम अभिव्यक्ति भी देखी गई थी। अनुमस्तिष्क मार्करों की अभिव्यक्ति के साथ, यह एक मजबूत संकेत है कि यह भेदभाव प्रोटोकॉल अनुमस्तिष्क कोशिकाओं को उत्पन्न करता है जो उस संरचना में न्यूरोनल कनेक्टिविटी के लिए सही संकेत व्यक्त करते हैं।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस एफजीएफ 2 और इंसुलिन-प्रेरित अनुमस्तिष्क भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न सेल प्रकारों को एकल-सेल विश्लेषण के माध्यम से पहचाना नहीं गया था। नेलर एट अल .8 ने हाल ही में एक समान प्रेरण प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न अनुमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के एकल-सेल प्रोफाइलिंग का एक डेटासेट प्रकाशित किया, और यह अनुमान लगाया गया है कि भविष्य के शोध इन सवालों को हल करने के लिए एकल-सेल विधियों को तेजी से नियोजित करेंगे। 35 वें दिन से परे कोशिकाओं को भी अभिव्यक्ति या आकृति विज्ञान के लिए परीक्षण नहीं किया गया था। बाद के समय में अनुमस्तिष्क मार्करों की अभिव्यक्ति और वे समय के साथ कैसे बदलते हैं, कोशिकाओं की परिपक्वता में अधिक अंतर्दृष्टि देगा। माउस अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल सेल अग्रदूत4 या मानव भ्रूण अनुमस्तिष्क स्लाइस33 के साथ स्टेम सेल-व्युत्पन्न अनुमस्तिष्क कोशिकाओं को परिपक्व अनुमस्तिष्क कोशिकाओं, विशेष रूप से पर्किन्जे न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है, जो अक्सर अनुमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स में अनुपस्थित होते हैं। विशेष रूप से, एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि अनुमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स भेदभाव दिवस 35 पर अलग हो जाते हैं और 2 डी विकास के लिए चढ़ाए जाते हैं, जो सह-संवर्धन की आवश्यकता के बिना परिपक्व अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स को भी जन्म देतेहैं। इन अनुप्रयोगों का उद्देश्य इस प्रोटोकॉल की तुलना में अनुमस्तिष्क विकास और तंत्रिका परिपक्वता के बाद के चरणों की जांच करना है, जिसका उपयोग विकास के पहले चरणों की जांच के लिए किया जा सकता है। एक और दिलचस्प तुलना सुसंस्कृत भ्रूण माउस अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स34 की तुलना आईपीएससी-व्युत्पन्न मानव अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स से करने से उत्पन्न हो सकती है, जो संभावित रूप से दो प्रजातियों के बीच विकास और भाग्य विनिर्देश में अंतर को उजागर करती है।

सारांश में, वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग आईपीएससी से उत्पन्न इन विट्रो 2 डी अनुमस्तिष्क कोशिकाओं की आवश्यकता वाले अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में जटिल चरण या सामग्री शामिल नहीं है, लागत कुशल है, और जीन अभिव्यक्ति, सेल आकृति विज्ञान और शरीर विज्ञान की जांच के लिए प्रारंभिक अनुमस्तिष्क विकास के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम जेनी ग्रिंगर रिचर्ड्स को हमारे नियंत्रण विषयों को मान्य करने में उनके गहन काम के लिए धन्यवाद देते हैं, जिससे हमने नियंत्रण आईपीएससी उत्पन्न किया। इस काम को एनआईएच टी 32 एमएच 019113 (डीएएम और केएके), नेल्ली बॉल ट्रस्ट (टीएचडब्ल्यू और एजेडब्ल्यू), एनआईएच आर 01 एमएच 111578 (वीएएम और जेएडब्ल्यू के लिए), एनआईएच केएल 2 टीआर 002536 (एजेडब्ल्यू के लिए), और रॉय जे कार्वर चैरिटेबल ट्रस्ट (जेडब्ल्यू के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26D
1-thio-glycerol Sigma M6145
2 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia Fisher Scientific FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish Falcon 353001
4D Nucleofector core unit Lonza 276885 Nucleofector
5 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish Falcon 353004
6-well ultra-low attachment plates Corning 3471
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Apo-transferrin Sigma T1147
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell culture grade water Cytiva SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905031
Chroman 1 Cayman 34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet NuAire, Inc. NU-540-600 Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated Corning 3526
Costar 6-well plate, TC treated Corning 3516
DAPI solution Thermo Scientific 62248
DMEM Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide) Sigma D2438
DPBS+/+ Gibco 14040133
Emricasan Cayman 22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit Life Technologies A15960
Essential 8-Flex Gibco A2858501 PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system Life Technologies AMEX1000
Fetal bovine serum - Premium Select Atlanta Biologicals S11150
FGF2 Peprotech 100-18B
GlutaMAX supplement Gibco 35050061 L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix Gibco 11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 50144906
Human Anti-EN2, mouse Santa Cruz Biotechnology sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit R&D Systems MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit Novus Biologicals NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse Biolegend 801213
IMDM Gibco 12440053
Insulin Gibco 12585
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Matrigel Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
MEM-NEAA Gibco 11140050
Mini Centrifuge Labnet International C1310 Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) New England BioLabs T2040 Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit New England BioLabs T2010 Silica spin columns
N-2 supplement Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103049
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
PFA 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Polyamine supplement Sigma P8483
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma 3655
Potassium chloride Sigma 746436
SB431542 Sigma 54317
See through self-sealable pouches Steriking SS-T2 (90x250) Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate  Fisher Scientific S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia Research Products International 256131
Trans-ISRIB Cayman 16258
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018 Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x) Gibco 12604039 Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometer Wescor, Inc. Model 5520 Osmometer
Y-27632 Biogems 1293823

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References

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Madencioglu, D. A., Kruth, K. A., Wassink, T. H., Magnotta, V. A., Wemmie, J. A., Williams, A. J. Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure. J. Vis. Exp. (187), e64462, doi:10.3791/64462 (2022).

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