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Neuroscience

Modélisation du développement cérébelleux humain in vitro en structure 2D

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64462
Automatic Translation
1,3,4,5, 1,3,4,5, 1,3, 1,2,3,4,5, 1,3,4,5, 1,3,4,5
1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

Summary

Le présent protocole explique la génération d’une monocouche 2D de cellules cérébelleuses à partir de cellules souches pluripotentes induites pour étudier les premiers stades du développement cérébelleux.

Abstract

Le développement précis et opportun du cervelet est crucial non seulement pour une coordination motrice et un équilibre précis, mais aussi pour la cognition. En outre, la perturbation du développement cérébelleux a été impliquée dans de nombreux troubles neurodéveloppementaux, notamment l’autisme, le trouble déficitaire de l’attention avec hyperactivité (TDAH) et la schizophrénie. Les études sur le développement cérébelleux chez l’homme n’étaient auparavant possibles que par des études post-mortem ou la neuroimagerie, mais ces méthodes ne sont pas suffisantes pour comprendre les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent in vivo au cours du développement précoce, qui est à l’origine de nombreux troubles neurodéveloppementaux. L’émergence de techniques pour générer des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) à partir de cellules somatiques et la capacité de redifférencier davantage les CSPi en neurones ont ouvert la voie à la modélisation in vitro du développement précoce du cerveau. La présente étude fournit des étapes simplifiées vers la génération de cellules cérébelleuses pour des applications nécessitant une structure monocouche en 2 dimensions (2D). Les cellules cérébelleuses représentant les premiers stades de développement sont dérivées de CSPi humaines via les étapes suivantes: premièrement, les corps embryoïdes sont fabriqués en culture 3 dimensions (3D), puis ils sont traités avec FGF2 et insuline pour promouvoir la spécification du devenir cérébelleux, et enfin, ils sont différenciés en phase terminale en tant que monocouche sur des substrats recouverts de poly-l-ornithine (PLO) / laminine. À 35 jours de différenciation, les cultures de cellules cérébelleuses dérivées de l’iPSC expriment des marqueurs cérébelleux, notamment ATOH1, PTF1α, PAX6 et KIRREL2, ce qui suggère que ce protocole génère des précurseurs neuronaux cérébelleux glutamatergiques et GABAergiques, ainsi que des progéniteurs cellulaires de Purkinje. De plus, les cellules différenciées présentent une morphologie neuronale distincte et sont positives pour les marqueurs d’immunofluorescence de l’identité neuronale tels que TUBB3. Ces cellules expriment des molécules de guidage axonal, y compris la sémaphorine-4C, la plexine-B2 et la neuropiline-1, et pourraient servir de modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de la croissance des neurites et de la connectivité synaptique. Cette méthode génère des neurones cérébelleux humains utiles pour des applications en aval, y compris l’expression génique, les études physiologiques et morphologiques nécessitant des formats monocouches 2D.

Introduction

Comprendre le développement cérébelleux humain et les fenêtres temporelles critiques de ce processus est important non seulement pour décoder les causes possibles des troubles neurodéveloppementaux, mais aussi pour identifier de nouvelles cibles pour une intervention thérapeutique. La modélisation du développement cérébelleux humain in vitro a été difficile, mais au fil du temps, de nombreux protocoles différenciant les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ou les CSPi avec le destin de la lignée cérébelleuse ont émergé 1,2,3,4,5,6,7,8 . De plus, il est important de développer des protocoles qui génèrent des résultats reproductibles, qui sont relativement simples (pour réduire les erreurs) et qui ne sont pas lourds en coûts monétaires.

Les premiers protocoles de différenciation cérébelleuse ont été générés à partir de cultures 2D de corps embryoïdes plaqués (EB), induisant le devenir cérébelleux avec divers facteurs de croissance similaires au développement in vivo, y compris WNT, BMP et FGF 1,9. Des protocoles publiés plus récents ont induit une différenciation principalement dans la culture organoïde 3D avec FGF2 et insuline, suivie de FGF19 et SDF1 pour les structures rhombiques ressemblant à des lèvres3,4, ou ont utilisé une combinaison de FGF2, FGF4 et FGF85. Les deux méthodes d’induction organoïde cérébelleuse ont abouti à des organoïdes cérébelleux 3D similaires, car les deux protocoles ont rapporté une expression similaire du marqueur cérébelleux à des moments identiques. Holmes et Heine ont étendu leur protocole 3D5 pour montrer que les cellules cérébelleuses 2D peuvent être générées à partir d’hESCs et d’iPSCs, qui commencent sous forme d’agrégats 3D. En outre, Silva et al.7 ont démontré que les cellules représentant des neurones cérébelleux matures en 2D peuvent être générées avec une approche similaire à celle de Holmes et Heine, en utilisant un point temporel différent pour passer de la 3D à la 2D et prolonger le temps de croissance et de maturation.

Le protocole actuel induit le devenir cérébelleux dans les CSPi sans alimentation en générant des corps embryoïdes flottants à l’aide d’insuline et de FGF2, puis en plaquant les EB sur des plats enrobés de PLOL / laminine au jour 14 pour une croissance et une différenciation 2D. Au jour 35, les cellules ayant une identité cérébelleuse sont obtenues. La capacité de récapituler les premières étapes du développement cérébelleux, en particulier dans un environnement 2D, permet aux chercheurs de répondre à des questions spécifiques nécessitant des expériences avec une structure monocouche. Ce protocole se prête également à d’autres modifications telles que des surfaces micropatternées, des tests de croissance axonale et le tri cellulaire pour enrichir les populations cellulaires souhaitées.

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Protocol

La recherche sur des sujets humains a été approuvée sous le numéro d’approbation 201805995 du comité d’examen institutionnel de l’Université de l’Iowa et le numéro d’approbation 2017-02 du comité des cellules souches pluripotentes humaines de l’Université de l’Iowa. Des biopsies cutanées ont été obtenues des sujets après avoir obtenu un consentement éclairé écrit. Les fibroblastes ont été cultivés dans du DMEM avec 15% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de solution d’acides aminés MEM non essentiels à 37 °C et 5% de CO2. Les fibroblastes ont été reprogrammés à l’aide d’un kit de reprogrammation épisomique suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un nucléofector pour l’électroporation. Toutes les procédures ont été effectuées dans une enceinte de sécurité biologique de classe II de type A2 (« capot » en abrégé). Tous les milieux de culture cellulaire étaient exempts d’antibiotiques; Par conséquent, chaque composant qui est entré dans la hotte a été nettoyé avec de l’éthanol à 70%. Tous les milieux et composants de culture cellulaire ont été filtrés stériles ou ouverts dans la hotte pour maintenir leur stérilité.

1. Préparation expérimentale

  1. Préparer les plaques revêtues de matrice membranaire basale (BMM).
    REMARQUE: BMM se solidifie plus rapidement à des températures plus chaudes. Les plaques doivent être préparées rapidement et immédiatement placées à 4 °C pour le stockage.
    1. Décongeler le BMM (voir le tableau des matériaux) sur la glace, à 4 °C pendant au moins 2 h, ou pendant la nuit.
    2. Mélanger DMEM/F12 et BMM jusqu’à une concentration finale de 80 μg/mL. Distribuer la solution de BMM dans des boîtes de culture tissulaire (1 mL pour 35 mm et 2 mL pour des boîtes de 60 mm) et incuber à 37 °C pendant au moins 1 h ou toute la nuit avant de plaquer les cellules.
      NOTE: La vaisselle non utilisée peut être conservée à 4 ° C pendant 2 semaines.
  2. Préparer des plaques revêtues de poly-L-ornithine/laminine (OLP/laminine).
    1. Préparer 20 μg/mL de PLO (voir le tableau des matières) dans du DPBS+/+ stérile et ajouter 1 mL à chaque puits d’une plaque à 6 puits. Incuber pendant la nuit à 37 °C dans l’incubateur.
    2. Le lendemain, aspirez l’OLP avec un aspirateur sous vide et lavez-le deux fois avec DPBS+/+. Sécher à l’air libre dans la hotte.
      REMARQUE: Les plaques séchées à l’air peuvent être conservées à 4 ° C jusqu’à 2 semaines, enveloppées dans du papier d’aluminium, pour une utilisation ultérieure.
    3. Préparer 10 μg/mL de laminine (voir le tableau des matières) dans DPBS+/+ et ajouter 1 mL à chaque puits d’une plaque de 6 puits. Incuber au moins pendant 3 h ou toute la nuit à 37 °C dans l’incubateur.
    4. Aspirer la laminine avec un aspirateur à vide et ajouter 1 mL de DPBS+/+ moyen ou stérile.
      REMARQUE: Le revêtement de laminine ne doit pas sécher. PBS ou un milieu de culture approprié doit être ajouté immédiatement pour éviter cela. Les plaques revêtues peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
  3. Préparer la solution de passage PSC.
    NOTA : Un osmomètre (voir le tableau des matériaux) est nécessaire pour préparer la solution de passage des CSP10.
    1. Dissoudre 11,49 g de chlorure de potassium (KCl) et 0,147 g de citrate de sodium dihydraté (HOC(COONa)(CH2 COONa)2*2H2O) dans 400 mL d’eau de culture cellulaire stérile (voir le tableau des matières).
    2. Mesurez le volume de la solution et enregistrez-le comme volume initial (Vi).
    3. Mesurez l’osmolarité et ajustez-la à 570 mOsm en ajoutant de l’eau de culture cellulaire stérile en utilisant la formule Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
    4. Filtrer-stériliser la solution avec un filtre de 0,20 μm et faire des aliquotes de 10 mL. Conservez les aliquotes à température ambiante (RT) jusqu’à 6 mois.
  4. Préparer le milieu de cellules souches pluripotentes (CSP).
    REMARQUE : Les CSPi sont maintenues dans un milieu contenant du FGF2 thermostable (voir le tableau des matières), ce qui permet d’obtenir un horaire d’alimentation sans fin de semaine. D’autres supports PSC disponibles dans le commerce n’ont pas été essayés pour ce protocole.
    1. Décongeler le supplément moyen PSC pendant une nuit à 4 °C.
    2. Ajouter 10 mL de supplément de milieu PSC à 500 mL de milieu PSC basal. Préparer 25 mL d’aliquotes et conserver à −20 °C.
      NOTA : Les aliquotes congelées peuvent être conservées à −20 °C pendant 6 mois. Les aliquotes décongelées doivent être conservées à 4 °C et utilisées dans un délai de 2 semaines. Les cellules peuvent être congelées pour un stockage à long terme dans un milieu PSC avec 10% (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO).
  5. Préparer le milieu de décongélation du PSC.
    1. Compléter le milieu PSC avec 50 nM de chroman, 1,5 μM d’emricasan, 1x supplément de polyamine et 0,7 μM trans-ISRIB (cocktailCEPT 11) (voir tableau des matériaux).
    2. Filtrer-stériliser avec un filtre de 0,20 μm et conserver à 4 °C jusqu’à 4 semaines.
  6. Préparez des pipettes en verre tiré.
    1. Tirez des pipettes Pasteur en verre de 22,9 cm (9 po) en deux morceaux au-dessus d’un brûleur Bunsen, ~2 cm sous le col, en créant deux pipettes, le côté le plus mince étant ~4 cm plus court que l’autre.
    2. À l’aide de la flamme, pliez les extrémités du côté tiré pour créer un « r » lisse.
    3. Placez les pipettes tirées dans les manchons de l’autoclave et de l’autoclave pour la stérilisation.
  7. Préparer le milieu de différenciation cérébelleuse (MDP).
    1. Mélanger IMDM et le mélange nutritif F12 de Ham dans un rapport de 1:1. Compléter le mélange avec 1x supplément de L-alanine-L-glutamine, 1 % (v/v) concentré lipidique chimiquement défini, 0,45 mM de 1-thio-glycérol, 15 μL/mL d’apotransférrine, 5 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et 7 μg/mL d’insuline (voir le tableau des matières).
    2. Filtrer-stériliser avec un filtre de 0,20 μm, conserver à 4 °C et utiliser dans un délai de 1 mois.
  8. Préparer le milieu de maturation cérébelleuse (MMT).
    1. Compléter le milieu neurobasal avec 1x supplément de L-alanine-L-glutamine et 1x supplément de N-2 (voir le tableau des matériaux).
    2. Filtrer-stériliser avec un filtre de 0,20 μm, conserver à 4 °C et utiliser dans les 2 semaines.

2. Culture iPSC sans alimentation

  1. Décongelez les cellules en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Placer une plaque BMM (étape 1.1) dans l’incubateur à 37 °C pour geler pendant au moins 1 h ou toute la nuit avant de décongeler les cellules.
    2. Préchauffer 10 mL de milieu décongélateur PSC (étape 1.5) à 37 °C.
    3. Transférer le cryovial avec les cellules de l’azote liquide au bain-marie à 37 °C.
      REMARQUE: Pour éviter de générer une source de contamination dans l’espace de culture cellulaire, l’utilisation d’un bain-marie standard n’est pas recommandée. Au lieu de cela, l’eau douce peut être chauffée dans un petit bécher à 37 ° C pour générer un bain-marie à usage unique.
    4. Lorsqu’il reste un petit morceau de glace dans le tube, retirez-le du bain-marie, séchez le tube et vaporisez avec de l’éthanol à 70%. Transférer le tube dans la hotte et utiliser une pipette sérologique de 2 ml ou 5 ml (voir le tableau des matériaux) pour transférer doucement les cellules dans un tube conique de 15 ml.
    5. Ajouter 8 ml de milieu décongélateur PSC aux cellules goutte à goutte tout en faisant tourbillonner le tube conique. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à TA.
    6. Aspirer soigneusement le surnageant avec un aspirateur à vide sans déranger la pastille de cellule. Remettez les cellules en suspension dans 2 mL de milieu de décongélation des CSP.
    7. Aspirez le BMM de la plaque et ajoutez les cellules en suspension goutte à goutte sur toute la plaque pour une répartition uniforme.
    8. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C, 5% CO2. Rafraîchissez le support le lendemain avec PSC medium. Après cela, changez le support tous les jours.
  2. Conservez les cellules en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Préchauffer le volume nécessaire de milieu PSC à 37 °C (p. ex., 1 mL de milieu par plaque de 35 mm).
    2. Examinez les plaques à la recherche de cellules ou de colonies différenciées et retirez les cellules différenciées à l’aide d’une pipette en verre tiré (étape 1.6).
      REMARQUE: Les colonies iPSC ont des bords lisses avec des cellules morphologiquement identiques.
    3. Changez le milieu passé quotidiennement et le passage tous les 3-4 jours ou lorsque 70% de confluence est atteint.
  3. Passage des cellules.
    1. Placez la quantité nécessaire de plaques BMM dans l’incubateur pendant au moins 1 h ou toute la nuit avant de passer. Préchauffer la quantité nécessaire de milieu PSC (étape 1.3) à 37 °C.
    2. À l’aide d’une pipette en verre tiré, nettoyez toutes les cellules ou colonies différenciées.
    3. Aspirer le milieu usé avec un aspirateur sous vide et ajouter le milieu de dissociation PSC, 1 mL par boîte de 35 mm. Incuber à 37 °C pendant 1-3 min.
      REMARQUE: Si les colonies se décollent dans la solution de passage PSC avant d’ajouter un milieu PSC, le temps d’incubation peut être réduit.
    4. Aspirer la solution de passage PSC et ajouter un milieu PSC préchauffé.
    5. À l’aide d’une pointe de pipette stérile de 200 μL, rayez les lignes parallèles les unes aux autres dans une direction, tournez la plaque de 90° et faites une deuxième série de lignes de grattage perpendiculaires aux précédentes (en faisant un motif hachuré croisé sur la plaque).
    6. Aspirer la solution BMM des plaques de consignement. Recueillir les colonies à l’aide d’une pipette sérologique et les distribuer sur de nouvelles plaques BMM.
    7. Incuber à 37 °C, 5% CO2. Changez le support tous les jours.
  4. Congeler les cellules.
    1. Préparer les cryoviales en étiquetant le contenu et stériliser sous la lumière ultraviolette (UV) dans la hotte (voir le tableau des matériaux) pendant 30 minutes.
    2. Préparer le milieu de congélation PSC en complétant le milieu PSC avec 10% (v / v) DMSO. Suivez les étapes 2.3.2-2.3.5.
    3. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à TA.
    4. Aspirer soigneusement le milieu et remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu de congélation PSC.
    5. Distribuer dans des cryovials. Placez les flacons dans un récipient de congélation et placez-le dans un congélateur à −80 °C.
    6. Le lendemain, transférer les cryovials dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.

3. Différenciation cérébelleuse

REMARQUE: Avant de commencer la différenciation, les CSPi sont passées à six boîtes de 35 mm et sont prêtes pour la différenciation lorsqu’elles sont à 70% de confluence. Chaque plaque de 35 mm sera transférée dans un puits de la plaque de 6 puits.

  1. Le jour 0, soulevez les colonies saines d’iPSC pour la formation d’EB.
    1. Ajouter 1 mL de MDP (étape 1.7) complété par 10 μM Y-27632 et 10 μM SB431542 (voir le tableau des matériaux) à chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse (ULA) à 6 puits et placer dans l’incubateur jusqu’à ce que les colonies levées soient prêtes à être ajoutées aux puits.
    2. Nettoyez les cellules différenciées à l’aide d’une pipette en verre tiré. Aspirer le milieu et ajouter 1 mL de solution de passage de PSC pour chaque boîte de 35 mm. Incuber pendant 3 min à 37 °C, aspirer et ajouter 2 mL de MDP additionné de 10 μM Y-27632 et 10 μM SB431542.
      REMARQUE: Si les colonies se décollent dans la solution de passage PSC avant d’ajouter CDM, le temps d’incubation peut être réduit.
    3. Sous un microscope inversé à lumière transmise, soulevez doucement les colonies à l’aide du bord courbé de la pipette en verre tiré à l’aide d’un grossissement 4x. Une fois chaque colonie soulevée, transférer doucement le tout dans un puits de la plaque ULA à 6 puits à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml. Répétez ce processus pour chaque plaque iPSC. Incuber les cellules à 37 °C avec 5% de CO2.
      REMARQUE: Si les colonies sont trop grandes ou sont fusionnées, elles peuvent être tranchées avec l’extrémité de la pipette en verre tiré pour créer des EB plus petits.
  2. Le jour 2, ajouter FGF2 à chaque puits jusqu’à une concentration finale de 50 ng/mL.
    REMARQUE: Le FGF2 utilisé pour la différenciation cérébelleuse n’est pas stable à la chaleur. Ce protocole n’a pas été testé avec FGF2 thermostable.
  3. Le jour 7, faites un changement moyen de 1/3. Pour 3 mL de milieu total dans un puits, avec un pipetor de 1 000 μL, aspirer doucement 1 mL de milieu usé et le remplacer par 1 mL de MDP frais. Incuber les EB pendant 7 jours.
  4. Le jour 14, aspirer doucement presque tout le milieu usé à l’aide d’un pipeteur de 1 000 μL. Pour minimiser les dommages aux EB, faites tourner la plaque pour rassembler tous les EB au centre de la plaque, puis inclinez la plaque et aspirez lentement à partir du bord.
    1. Au fur et à mesure que la quantité moyenne diminue, posez lentement la plaque à plat et continuez à aspirer. Laissez suffisamment de milieu pour éviter de dessécher les EB. Ensuite, ajoutez 3 mL de MDP frais complété par 10 μM Y-27632. Transférer les EB à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml dans une boîte enrobée d’OLP ou de laminine (étape 1.2).
      REMARQUE: Selon l’application en aval, les EB peuvent être transférés sur une plaque OLP / laminine à 6 puits ou les EB simples peuvent être transférés dans un seul puits d’une plaque OLP / laminine à 24 puits ou d’une lamelle de couverture.
  5. Le jour 15, aspirez le milieu et remplacez-le par du MDP frais.
    REMARQUE : Il est important d’ajouter suffisamment de milieu aux puits pour assurer suffisamment de milieu entre les tétées car, avec le temps, il y aura évaporation (p. ex., pour un puits dans une plaque de 6 puits, ajouter 3 mL de milieu). Si le milieu a commencé à s’acidifier (devenir clair et jaune), rafraîchissez-le même s’il ne figure pas sur le calendrier d’alimentation avant la fin du protocole.
  6. Le jour 21, aspirez le milieu usé et remplacez-le par CMM. Le jour 28, changer le milieu avec une nouvelle MMT. Le jour 35, récoltez les cellules pour d’autres applications.

4. Préparation de l’échantillon pour l’isolement de l’ARN

  1. Aspirer le milieu et ajouter 500 μL de réactif de dissociation cellulaire (voir Tableau des matériaux) à chaque puits de la plaque à 6 puits. Laissez-le pendant quelques secondes et aspirez.
  2. Incuber la plaque, avec le couvercle, à température ambiante pendant 2 min. Tapotez les côtés de la plaque pour détacher les cellules.
  3. Ajouter 1 mL de MMT (étape 1.8) et recueillir les cellules dans un tube de 1,5 mL.
  4. Enduire les cellules par centrifugation à l’aide d’une mini-centrifugeuse de paillasse (voir le tableau des matériaux) pendant 30 s à TA (vitesse maximale 2000 x g), jeter le milieu et ajouter 1 mL de 1x PBS pH 7,4 pour laver la pastille de cellule.
  5. Enduisez à nouveau les cellules à l’aide d’une mini-centrifugeuse de paillasse pendant 30 s à TA et lavez à nouveau avec du PBS.
  6. les cellules et jetez le PBS. Lyser les cellules dans le réactif contenant du phénol et de l’isothiocyanate de guanidine (voir le tableau des matières).
    REMARQUE : Les cellules lysées dans du phénol et du réactif contenant de l’isothiocyanate de guanidine peuvent être conservées à -80 °C jusqu’à 1 an. Les cellules peuvent être lysées directement dans la boîte en fonction de la méthode d’isolement de l’ARN et des réactifs utilisés. En raison du faible nombre de cellules dans une boîte, l’isolement de l’ARN à l’aide de colonnes de spin de silice (voir le tableau des matériaux) entraînera des rendements plus élevés d’ARN.

5. Préparation des cellules pour la coloration immunofluorescente

NOTE: Pour une plaque de 24 puits, un EB par puits est suffisant.

  1. Le jour 35, aspirer le milieu usé et laver les cellules en ajoutant 1 mL de DPBS+/+ par puits (pour un puits d’une plaque de 24 puits).
  2. Aspirer le DPBS+/+ et ajouter 500 μL de paraformaldéhyde froid à 4% (PFA, voir le tableau des matières) préparé dans DPBS+/+ par puits. Incuber pendant 20 min à TA.
  3. Retirer 4% PFA et laver les cellules deux fois avec DPBS+/+, comme à l’étape 5.1. Ajouter 1 mL de DPBS+/+ et conserver les cellules à 4 °C jusqu’à coloration.
    REMARQUE: Il est conseillé de faire la coloration immunofluorescente dans les 1 semaine après la fixation pour éviter le décollement cellulaire et la perte d’antigènes. Cependant, en fonction de l’anticorps et de l’emplacement cellulaire de la cible, la coloration peut être effectuée ultérieurement jusqu’à 4 semaines après la fixation.

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Representative Results

Vue d’ensemble de la différenciation cérébelleuse 3D à 2D
Les cellules cérébelleuses sont générées à partir des CSPi. La figure 1A montre le flux de travail global et l’ajout de composants majeurs pour la différenciation. Le jour 0, les EB sont fabriqués en soulevant doucement les colonies d’iPSC (Figure 1B) à l’aide d’une pipette en verre tiré dans CDM contenant SB431542 et Y-27632 et placés dans des plaques de fixation ultra-basses. FGF2 est ajouté le jour 2. Au jour 7, un tiers du milieu est modifié et la formation d’EB est observée (Figure 1C). Le jour 14, les EB élargis (Figure 1D) sont plaqués sur des boîtes enduites de PLO/laminine dans le MDP complété par Y-27632. Le jour 15, le support est remplacé par CDM sans Y-27632. Les cellules commencent à migrer vers l’extérieur à partir des EB (Figure 1E) le long de la surface revêtue. Le jour 21, un changement complet de milieu est effectué et le milieu passe à la MMT. Après cela, le milieu est changé une fois par semaine (ou plus fréquemment si le milieu s’acidifie rapidement). Au jour 35, il y a une monocouche de cellules avec une morphologie et une complexité de type neuronal (Figure 1F, G).

Les cellules 2D expriment des marqueurs cellulaires cérébelleux
Les cellules sont récoltées au jour 35 pour l’isolement de l’ARN et le marquage par immunofluorescence. L’expression des gènes connus pour être présents au cours du développement cérébelleux est mesurée par RT-qPCR (Figure 2). Les cellules expriment des marqueurs progéniteurs cérébelleux précoces tels que ATOH1 12,13 (lèvre rhombique, progéniteurs glutamatergiques) et PTF1α 14 (zone ventriculaire, progéniteurs GABAergiques), ainsi que les marqueurs cellulaires progéniteurs de Purkinje KIRREL2 15 et SKOR2 15. En plus des marqueurs cellulaires cérébelleux du développement précoce, l’expression de gènes de développement ultérieur, OTX2 et SIX3, est également observée. Le marquage immunofluorescent des cellules montre une coloration positive pour les marqueurs cérébelleux EN2 et PTF1α (Figure 3A,D), le marqueur neuronal TUBB3 (Figure 3G), ainsi que pour le marqueur de prolifération Ki67 (Figure 3J). La coloration nucléaire au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) montre des noyaux cellulaires (Figure 3B,E,H,K). Pour valider davantage ce protocole, des CSPi dérivées de patients atteints d’un trouble neuropsychiatrique ont été utilisées pour générer des cellules cérébelleuses et analyser l’expression des marqueurs cellulaires cérébelleux au jour 35. Les données RT-qPCR indiquent un profil d’expression similaire à celui des CSPi témoins (figure supplémentaire 1). De plus, l’expression de molécules de guidage axonale pertinentes pour le développement cérébelleux est présente à la fois dans les cellules témoins et les cellules cérébelleuses dérivées du patient (Figure supplémentaire 2).

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble de la chronologie du protocole et des images représentatives. (A) Un aperçu schématique du protocole de différenciation cérébelleuse illustrant le type de milieu de culture, les suppléments ajoutés au milieu de culture, les jours où un changement de milieu est nécessaire (indiqués par des lignes verticales) et le revêtement de surface de la boîte de culture. (B) Images représentatives en champ clair des CSPi au jour 0 et des cellules différenciées qui seront nettoyées avant de fabriquer des EB (indiquées en cercle rouge), (C) EB le jour 7 et (J) jour 14, (E) le lendemain du placage des EB, et (F,G) cellules en maturation le jour 35. Barre d’échelle (B-D): 1 mm; (E-G): 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Expression des marqueurs cellulaires cérébelleux dans les cellules cérébelleuses 2D au jour 35. Résultats de l’expression génique RT-qPCR au jour 35 pour des gènes sélectionnés représentant différents marqueurs du développement cérébelleux et types de cellules, normalisés à GAPDH. Les valeurs -ΔCt représentent les valeurs GAPDH-Ct soustraites des valeurs cibles-Ct ; Les valeurs plus proches de zéro indiquent une expression plus élevée. Toute valeur inférieure à la ligne cochée représente une expression inférieure à la limite détectable. N = 2 lignes iPSC, les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Marquage immunofluorescent des cellules cérébelleuses 2D au jour 35. Les cellules sont fixées avec 4% de PFA au jour 35 et sont colorées au nucléaire avec DAPI et immunomarquées pour (A) EN2 (vert), (B) DAPI (bleu), (C) EN2-DAPI fusionné; (D) PTF1α (rouge), (E) DAPI (bleu), (F) PTF1α-DAPI fusionné; G) TUBB3 (vert), H) DAPI (bleu), I) TUBB3-DAPI fusionné; et (J) Ki67 (rouge), (K) DAPI (bleu), (L) Ki67-DAPI fusionné. Barres d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Images représentatives de la différenciation cérébelleuse à l’aide de CSPi dérivées de patients atteints de schizophrénie. (A) colonies de CSPi, (B) EB le jour 7, (C) jour 14, (D) cellules poussant à partir de EB plaqués sur la boîte enrobée de PLO / laminine le jour 15, et (E) cellules cérébelleuses le jour 35. (F) Résultats RT-qPCR pour l’expression génique au jour 35 pour les marqueurs cellulaires cérébelleux, normalisés à GAPDH. Les valeurs -ΔCt représentent les valeurs GAPDH-Ct soustraites des valeurs cibles-Ct ; Les valeurs plus proches de zéro indiquent une expression plus élevée. Toute valeur inférieure à la ligne cochée représente une expression inférieure à la limite détectable. N = 2 lignes iPSC, les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Barre d’échelle (A-C): 1 mm; (D,E): 500 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Expression génique des molécules de guidage axonale des cellules cérébelleuses 2D au jour 35. Résultats de l’expression génique RT-qPCR au jour 35 pour des molécules sélectionnées impliquées dans la signalisation du guidage axonal, normalisées à GAPDH. Tous les gènes montrés sont connus pour être exprimés dans le cervelet à l’exception de PlxnB3, qui a une faible expression dans le cervelet à travers le développement. Les valeurs -ΔCt représentent les valeurs GAPDH-Ct soustraites des valeurs cibles-Ct ; Les valeurs plus proches de zéro indiquent une expression plus élevée. Toute valeur inférieure à la ligne cochée représente une expression inférieure à la limite détectable. N (témoin) = 1, N (SCZ) = 1, et la moyenne des expériences réalisées en triple exemplaire est indiquée. Abréviation : SCZ = schizophrénie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La capacité de modéliser le développement cérébelleux humain in vitro est importante pour la modélisation de la maladie ainsi que pour approfondir la compréhension du développement normal du cerveau. Des protocoles moins compliqués et moins rentables créent plus d’opportunités pour la génération de données reproductibles et une large mise en œuvre dans plusieurs laboratoires scientifiques. Un protocole de différenciation cérébelleuse est décrit ici en utilisant une méthode modifiée de génération d’EB qui ne nécessite pas d’enzymes ou d’agents de dissociation, en utilisant des facteurs de croissance rapportés par Muguruma et al. 4 et un protocole de croissance cellulaire monocouche 2D modifié similaire à la méthode de Holmes et al. 5.

Le protocole global commence par la génération d’EB à partir d’iPSC, suivie de l’induction de la différenciation cérébelleuse et, enfin, du placage pour la culture monocouche 2D. Au cours de ce processus, une quantité importante de mort cellulaire a été observée entre les jours 7 et 14. En raison de cette perte cellulaire, il est conseillé de commencer avec un grand nombre d’EB; pour une plaque de cellules 2D à 6 puits, il est recommandé de commencer avec un minimum de six plaques (plaques de 35 mm ou 60 mm) de CSPi. De plus, l’ajout de Y-27632 au moment du placage des EB sur l’OLP/laminine augmente considérablement la fixation des EB au substrat. Il est important de vérifier le milieu dans les cultures par intermittence visuellement. Si le milieu jaunit (acidifiant), il est conseillé de changer le milieu même s’il n’est pas dans le schéma d’alimentation. Le nombre total de cellules qui s’attachent variera d’une expérience à l’autre, ce qui nécessitera un rafraîchissement plus ou moins fréquent des nutriments dans le milieu.

Les résultats de la RT-qPCR ont révélé que les CSPi se différenciaient en cellules représentant les premiers stades du cervelet en développement. Les données actuelles suggèrent qu’au jour 35 de la différenciation, il existe des cellules exprimant le marqueur du destin cellulaire neuronal (TUBB3 16,17), les marqueurs progéniteurs glutamatergiques et GABAergiques (ATOH1 12,13 et PTF1α14, respectivement), les marqueurs de limite mésencéphale-cerveau (EN1 18, EN2 18, GBX2 19), les marqueurs organisateurs isthmiques (WNT1 18, FGF8 19), les marqueurs cellulaires dérivés de la lèvre rhombique (PAX6 18 ) et les marqueurs progéniteurs des cellules de Purkinje (KIRREL215, SKOR220). L’expression du marqueur de lèvre rhombique OTX221 a également été observée. Les protocoles organoïdes cérébelleux précédents utilisant des CSEh ont observé que l’induction de FGF2 entraîne des cellules exprimant GBX2 mais très peu de cellules OTX2 positives, tandis qu’un protocole similaire utilisant des CSPi a montré une expression identique de l’ARNm de GBX2 et OTX2 dans les organoïdes cérébelleux8. Cependant, les neurones cérébelleux dérivés de cellules souches embryonnaires de souris (CSEm) contiennent des groupes de cellules positives OTX2 et GBX24 distincts, et il a été démontré qu’OTX2 est exprimé tout au long du développement cérébelleux de souris 22 ethumain 21,23. Le profil d’expression différentielle d’OTX2 entre les protocoles utilisant les mêmes facteurs de spécification de devenir pourrait être dû à d’autres différences entre les protocoles ou à des différences individuelles entre les CSPh et les CSPi; Cela mérite une enquête plus approfondie. L’expression de SIX3 a également été observée dans la culture au jour 35. SIX3 est exprimé dans le tube neural antérieur au cours du développement, et son expression dans le cervelet humain reste faible tout au long du développement et de l’âge adulte23,24; Cependant, il est exprimé dans le cervelet de souris néonatale et adulte25. Cela suggère qu’il pourrait y avoir une sous-population de cellules qui se différencient vers un destin antérieur, ou elles peuvent représenter une sous-population de cellules cérébelleuses exprimant SIX3 au cours du développement. Ces cellules pourraient être explorées plus avant.

Les protocoles de différenciation sont souvent développés à l’aide de CSEh ou de CSPi provenant de sujets sains, mais il est important de confirmer que ces protocoles peuvent être appliqués aux CSPi dérivées de patients pour disséquer les changements moléculaires et cellulaires de la maladie. Pour tester davantage notre protocole, en plus de nos lignes iPSC de contrôle, nous avons différencié les lignées iPSC qui ont été reprogrammées à partir de fibroblastes obtenus chez des patients diagnostiqués schizophrénie. La littérature précédente a montré que les patients diagnostiqués avec la schizophrénie ont des anomalies cérébrales fonctionnelles et anatomiques26,27,28. Ces changements sont observés chez les patients adultes, mais peuvent commencer au cours du développement et nécessiter des investigations plus approfondies. Dans l’ensemble, il a été observé que les cellules cérébelleuses de patients schizophrènes exprimaient les marqueurs cérébelleux testés au jour 35 et morphologiquement n’étaient pas différentes des cellules cérébelleuses dérivées des CSPi témoins (Figure supplémentaire 1). Cela suggère que ce protocole peut étudier le développement cérébelleux humain dans le contexte de la maladie. De plus, l’expression des marqueurs de guidage axonal au jour 35 a également été examinée, à la fois dans les lignées cellulaires témoins et schizophréniques, car l’une des principales composantes du développement est la recherche axonale et la connectivité neuronale 29,30,31,32. En effet, au jour 35, les molécules de guidage axonale indiquées dans le développement cérébelleux ont été vérifiées, notamment la sémaphorine-4C, la plexine-B2 et la neuropiline-1 (Figure supplémentaire 2). Au cours du développement, l’expression de la plexine-B3 est faible dans le cervelethumain 23, et une expression plus faible de la plexine-B3 a également été observée par rapport aux autres molécules de guidage axonale pour les différenciations. Avec l’expression des marqueurs cérébelleux, c’est une forte indication que ce protocole de différenciation génère des cellules cérébelleuses qui expriment les signaux corrects pour la connectivité neuronale dans cette structure.

Il est important de noter que les types de cellules générées à l’aide de ce FGF2 et du protocole de différenciation cérébelleuse induite par l’insuline n’ont pas été identifiés par analyse unicellulaire. Nayler et coll.8 ont récemment publié un ensemble de données sur le profilage unicellulaire des organoïdes cérébelleux générés à l’aide d’un protocole d’induction similaire, et on s’attend à ce que les recherches futures utilisent de plus en plus des méthodes unicellulaires pour répondre à ces questions. Les cellules au-delà du jour 35 n’ont pas non plus été testées pour l’expression ou la morphologie. L’expression des marqueurs cérébelleux à des moments ultérieurs et leur évolution au fil du temps donneront plus d’informations sur la maturité des cellules. Il a été démontré que la co-culture de cellules cérébelleuses dérivées de cellules souches dérivées de cellules cérébelleuses de souris4 ou de tranches cérébelleuses fœtales humaines33 génère des cellules cérébelleuses matures, en particulier les neurones de Purkinje, qui sont souvent absents dans les organoïdes cérébelleux. Notamment, une étude récente a montré que les organoïdes cérébelleux dissociés au jour de différenciation 35 et plaqués pour la croissance 2D donnent également naissance à des neurones cérébelleux matures sans avoir besoin de co-culture7. Ces applications visent à étudier les étapes ultérieures du développement cérébelleux et de la maturation neuronale par rapport à ce protocole, qui peut être utilisé pour étudier les premiers stades du développement. Une autre comparaison intéressante pourrait découler de la comparaison des neurones cérébelleux embryonnaires embryonnaires de souris en culture34 aux neurones cérébelleux humains dérivés de l’iPSC, mettant potentiellement en évidence les différences de développement et de spécification du devenir entre les deux espèces.

En résumé, le présent protocole peut être utilisé pour des applications nécessitant des cellules cérébelleuses 2D in vitro générées à partir de CSPi. Ce protocole n’inclut pas d’étapes ou de matériaux complexes, est rentable et peut être utilisé comme modèle pour le développement cérébelleux précoce pour étudier l’expression génique, la morphologie cellulaire et la physiologie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Nous remercions Jenny Gringer Richards pour son travail approfondi dans la validation de nos sujets témoins, à partir desquels nous avons généré les CSPi de contrôle. Ce travail a été soutenu par NIH T32 MH019113 (à D.A.M. et K.A.K.), le Nellie Ball Trust (à T.H.W. et A.J.W.), NIH R01 MH111578 (à V.A.M. et J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (à A.J.W.) et le Roy J. Carver Charitable Trust (à V.A.M., J.A.W. et A.J.W.). Les figurines ont été créées avec BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26D
1-thio-glycerol Sigma M6145
2 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia Fisher Scientific FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish Falcon 353001
4D Nucleofector core unit Lonza 276885 Nucleofector
5 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish Falcon 353004
6-well ultra-low attachment plates Corning 3471
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Apo-transferrin Sigma T1147
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell culture grade water Cytiva SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905031
Chroman 1 Cayman 34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet NuAire, Inc. NU-540-600 Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated Corning 3526
Costar 6-well plate, TC treated Corning 3516
DAPI solution Thermo Scientific 62248
DMEM Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide) Sigma D2438
DPBS+/+ Gibco 14040133
Emricasan Cayman 22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit Life Technologies A15960
Essential 8-Flex Gibco A2858501 PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system Life Technologies AMEX1000
Fetal bovine serum - Premium Select Atlanta Biologicals S11150
FGF2 Peprotech 100-18B
GlutaMAX supplement Gibco 35050061 L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix Gibco 11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 50144906
Human Anti-EN2, mouse Santa Cruz Biotechnology sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit R&D Systems MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit Novus Biologicals NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse Biolegend 801213
IMDM Gibco 12440053
Insulin Gibco 12585
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Matrigel Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
MEM-NEAA Gibco 11140050
Mini Centrifuge Labnet International C1310 Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) New England BioLabs T2040 Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit New England BioLabs T2010 Silica spin columns
N-2 supplement Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103049
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
PFA 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Polyamine supplement Sigma P8483
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma 3655
Potassium chloride Sigma 746436
SB431542 Sigma 54317
See through self-sealable pouches Steriking SS-T2 (90x250) Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate  Fisher Scientific S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia Research Products International 256131
Trans-ISRIB Cayman 16258
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018 Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x) Gibco 12604039 Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometer Wescor, Inc. Model 5520 Osmometer
Y-27632 Biogems 1293823

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References

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Neurosciences numéro 187 Cervelet développement 3D à 2D cellules souches pluripotentes induites différenciation modèle de maladie
Modélisation du développement cérébelleux <em>humain in vitro</em> en structure 2D
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