Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

आर्टेमिया सैलिना एल का उपयोग करके घातक बायोसेसे।

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64472
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2, 1, 2, 1,3
1CBIOS - Lusófona University's Center for Research in Biosciences & Health Technologies, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias, 2Facultad de Farmacia, Departamento de Ciencias Biomédicas (Área de Farmacologia; Nuevos agentes antitumorales, Acción tóxica sobre células leucémicas), Universidad de Alcalá de Henares, 3Instituto de Investigação do Medicamento (iMed.ULisboa), Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa
* These authors contributed equally

Summary

इस काम का उद्देश्य आर्टेमिया सैलिना घातकता बायोएसे प्रक्रिया का मूल्यांकन और समीक्षा करना है, जिसे ब्राइन झींगा घातकता परख के रूप में भी पहचाना जाता है। यह सरल और सस्ता तरीका नमूनों की सामान्य विषाक्तता (प्रारंभिक विषाक्तता मूल्यांकन के रूप में माना जाता है) के बारे में जानकारी देता है, अर्थात्, प्राकृतिक उत्पाद।

Abstract

दवाओं के उत्पादन के लिए प्राचीन काल से प्राकृतिक उत्पादों का उपयोग किया जाता रहा है। आजकल, प्राकृतिक स्रोतों से प्राप्त बहुत सारी कीमोथेरेपी दवाएं हैं और बीमारियों की अधिकता के खिलाफ उपयोग की जाती हैं। दुर्भाग्य से, इनमें से अधिकांश यौगिक अक्सर प्रणालीगत विषाक्तता और प्रतिकूल प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। चयनित संभावित बायोएक्टिव नमूनों की सहनशीलता का बेहतर मूल्यांकन करने के लिए, ब्राइन झींगा (आर्टेमिया सैलिना) का उपयोग आमतौर पर घातक अध्ययन में एक मॉडल के रूप में किया जाता है। ए सलीना परीक्षण अध्ययन किए गए बायोएक्टिव यौगिकों की क्षमता पर आधारित है ताकि वे अपने लार्वा चरण (नौपली) में माइक्रोक्रस्टेशियन को मार सकें। यह विधि साइटोटॉक्सिसिटी अध्ययन के साथ-साथ सिंथेटिक, अर्धसिंथेटिक और प्राकृतिक उत्पादों की सामान्य विषाक्तता स्क्रीनिंग के लिए एक सुविधाजनक प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करती है। इसे कई अन्य परखों (इन विट्रो कोशिकाओं या खमीर उपभेदों, ज़ेबराफिश, कृन्तकों) की तुलना में एक सरल, त्वरित और कम लागत वाली परख माना जा सकता है, जो आमतौर पर उपरोक्त उद्देश्यों के लिए उपयुक्त होते हैं; इसके अलावा, यह किसी भी विशिष्ट प्रशिक्षण के बिना भी आसानी से किया जा सकता है। कुल मिलाकर, ए सलीना परख चयनित यौगिकों के प्रारंभिक विषाक्तता मूल्यांकन और प्राकृतिक उत्पाद अर्क के जैव-निर्देशित विभाजन के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

Introduction

पौधों, जानवरों या सूक्ष्मजीवों के प्राकृतिक उत्पाद जैविक और औषधीयगतिविधियों की अपनी विविध श्रृंखला के कारण नए बायोएक्टिव अणुओं के विकास में वर्षों से रुचि का एक बढ़ता हुआ क्षेत्र रहे हैं। हालांकि, संबंधित दुष्प्रभाव, दवा प्रतिरोध, या एजेंटों की अपर्याप्त विशिष्टता, खासकर जब एंटीकैंसर दवाओं के रूप में उपयोग किया जाता है, तो प्रमुख कारकों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो अप्रभावी उपचारका कारण बन सकते हैं 1,2.

पिछले कुछ दशकों में, कई पौधे-व्युत्पन्न साइटोटोक्सिक एजेंटों की खोज की गई है, उनमें से कुछ का उपयोग एंटीकैंसर एजेंट 1,2,3 के रूप में किया जाता है। इस संदर्भ में, पैक्लिटैक्सेल को प्राकृतिक मूल3,4 की सबसे प्रसिद्ध और सबसे सक्रिय कीमोथेरेपी दवाओं में से एक के रूप में बताया गया है। वर्तमान में, यह अनुमान लगाया गया है कि बाजार पर सभी दवाओं में से 35% से अधिकप्राकृतिक उत्पादों से प्राप्त या प्रेरित हैं। इन यौगिकों की संभावित उच्च विषाक्तता को सभी अध्ययन चरणों के दौरान विचार करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि विभिन्न प्रकार के दूषित पदार्थ या यहां तक कि पौधे के चयापचय घटक भी विषाक्त प्रभाव पैदा कर सकते हैं। इस कारण से, नए संभावित पौधे-आधारित उपचारों की जैविक गतिविधि और सुरक्षा का आकलन करने के लिए प्रारंभिक चरण में औषधीय और विष विज्ञान प्रोफाइल किया जाना चाहिए। नए बायोएक्टिव नमूनों की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए, अकशेरुकी जानवरों को अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा मॉडल माना जा सकता है। वे न्यूनतम नैतिक आवश्यकताओं की मांग करते हैं और कशेरुक 1,6 में परीक्षण के अगले दौर के लिए सबसे आशाजनक उत्पादों को प्राथमिकता देने के लिए प्रारंभिक इन विट्रो परखकी अनुमति देते हैं।

सैलिना एक छोटा हेलोफिलिक अकशेरुकी है जो जीनस आर्टेमिया (परिवार आर्टेमिडे, ऑर्डर एनोस्ट्राका, सबफिलम क्रस्टेसिया) से संबंधित है; चित्र 1)। समुद्री और जलीय खारा पारिस्थितिक तंत्र में, नमकीन झींगा एक महत्वपूर्ण पोषण भूमिका निभाते हैं क्योंकि वे सूक्ष्म शैवाल पर फ़ीड करते हैं और मछली को खिलाने के लिए उपयोग किए जाने वाले ज़ोप्लांकटन के घटक हैं। इसके अलावा, प्रारंभिक अध्ययन 1,3,7 के दौरान सामान्य विषाक्तता के आकलन में उनके लार्वा (नौपली के रूप में जाना जाता है) का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

आर्टेमिया एसपीपी का व्यापक रूप से घातक अध्ययन में उपयोग किया जाता है और प्रयोगशाला 1,8 में उगाए गए नौपली को मारने की उनकी क्षमता के आधार पर संभावित बायोएक्टिव यौगिकों की विषाक्तता को ट्रैक करके विषाक्तता आकलन के लिए एक सुविधाजनक प्रारंभिक बिंदु भी है। इस कारण से, ए सलीना के उपयोग ने सामान्य विषाक्तता अध्ययनों में आकर्षण प्राप्त किया, क्योंकि यह पशु मॉडल9 पर अन्य परीक्षणों की तुलना में एक बहुत ही कुशल और उपयोग में आसान विधि है।

उनके सरल शरीर रचना विज्ञान, छोटे आकार और छोटे जीवन चक्र के कारण, एक ही प्रयोग में बड़ी संख्या में अकशेरुकी जीवों का अध्ययन किया जा सकता है। जैसे, वे बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के साथ आनुवंशिक अनुकूलन और कम लागत वाली संगतताको जोड़ते हैं। इस संदर्भ में, एक सामान्य विषाक्तता परख में ब्राइन झींगा का उपयोग कई फायदे दिखाता है, जैसे कि तेजी से विकास (पहले परिणामों से 28-72 घंटे की आवश्यकता होती है), लागत-प्रभावशीलता, और वाणिज्यिक अंडों का लंबा शेल्फ-जीवन, जिसका उपयोग पूरे वर्ष 3,10 के आसपास किया जा सकता है। दूसरी ओर, चूंकि अकशेरुकी जीवों में एक आदिम अंग प्रणाली होती है और एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी होती है, इसलिए वे मानव कोशिकाओंके लिए एक आदर्श और विश्वसनीय मॉडल का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं।

हालांकि, यह चयनित नमूनों की सामान्य विषाक्तता के लिए एक प्रारंभिक मूल्यांकन विधि प्रदान करता है। चूंकि यह व्यापक रूप से एक घातक परख के रूप में उपयोग किया जाता है, इसलिए यह संभावित एंटीकैंसर एजेंटों के विषाक्त प्रभावों के बारे में अनंतिम संकेत प्रदान कर सकता है। इसका उपयोग अक्सर किसी भी अन्य जैविक गतिविधियों के साथ संपन्न यौगिकों की सामान्य विषाक्तता के बारे में प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए भी किया जाता है, जिसके लिए आर्टेमिया झींगा के बीच सबसे कम मृत्यु दर दिखाना आवश्यक है।

हमारे समूह से चल रहे एक अध्ययन में, प्लेक्ट्रान्थस प्रजातियों के विभिन्न अर्क ने एंटीऑक्सिडेंट और रोगाणुरोधी गतिविधियों (अप्रकाशित परिणाम) को दिखाया। समानांतर में, पृथक यौगिकों को अर्क के शुद्धिकरण द्वारा प्राप्त किया गया था और फिर रासायनिक रूप से संशोधित किया गया था। अर्क, शुद्ध यौगिकों और अर्धसिंथेटिक डेरिवेटिव को तब सामान्य विषाक्तता के संदर्भ में परीक्षण किया गया था। इस संदर्भ में, वर्तमान कार्य का उद्देश्य जीनस प्लेक्ट्रैंथस11 के विभिन्न पौधों से बायोएक्टिव अर्क और पृथक यौगिकों की सामान्य विषाक्तता और संभावित साइटोटोक्सिक गतिविधि के मूल्यांकन के लिए आर्टेमिया घातकता बायोसेसे के उपयोग का अवलोकन करना है।

Figure 1
चित्र 1: माइक्रोस्कोप के नीचे आर्टेमिया सैलिना । ए सलीना की नई हैच की गई नौपली जैसा कि माइक्रोस्कोप (आवर्धन 12x) के तहत देखा गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. उपकरण तैयार करना

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैचिंग उपकरण प्राप्त करें। हैचिंग उपकरण स्थापित करने के लिए एक उपयुक्त स्थान का चयन करें (चित्रा 2 ए)। फ़नल के आकार के कंटेनर को काले समर्थन (सेट में शामिल) में रखें और स्तर चिह्न और नल देखने के लिए फ़नल को उपयुक्त दिशा में घुमाएं।
  2. हाथ से बने माइग्रेशन उपकरण बनाने के लिए, 12 सेमी की अंतिम ऊंचाई प्राप्त करने के लिए दो 0.5 एल (5.8 सेमी व्यास) प्लास्टिक की बोतलों के शीर्ष को काटें। प्रत्येक बोतल में नीचे से 7 सेमी पर एक तरफ 1.5 सेमी व्यास का छेद बनाएं और दो उद्घाटनों के बीच 13 सेमी रबर ट्यूब (1.3 सेमी बाहरी और 0.9 सेमी आंतरिक व्यास) डालें। गर्म गोंद के साथ उद्घाटन को सील करें (चित्रा 2 बी) और 15 मिनट के लिए सूखने के लिए छोड़ दें; बोतलों को एक सपाट सतह पर रखें और उन्हें पानी से भरें ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि कोई रिसाव नहीं है।

2. कृत्रिम नमक समाधान की तैयारी

  1. एक ग्लास बीकर में, 35 ग्राम / एल की एकाग्रता पर एक कृत्रिम नमक समाधान (ब्राइन झींगा नमक) तैयार करें। ऐसा करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, 800 एमएल नल के पानी में 28 ग्राम नमक जोड़ें। इसे एक हिलाने वाली रॉड के साथ मिलाएं जब तक कि सभी नमक अच्छी तरह से घुल न जाएं।
    नोट: उपलब्ध कंटेनरों के आकार के अनुसार तैयार खारा समाधान की मात्रा समायोजित करें।

3. नमूना तैयार करना

  1. अर्क की उपयुक्त मात्रा को भंग करके एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सभी नमूने तैयार करें (प्लेक्ट्रैंथस अर्क, पीए- पी। पीबी-पी बार्बैटस; पीसी- पी. सिलिंडरसस; और पे-पी. एक्लोनी) या यौगिक 1-5 (दो प्राकृतिक यौगिक [1 और 2] प्लेक्ट्रेंथस एसपीपी से प्राप्त और तीन अर्ध-सिंथेटिक डेरिवेटिव [3, 4, 5]; चित्र 3) डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) 12 में, ताकि 10 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त की जा सके (यदि नमूना पानी में घुलनशील है, तो डीएमएसओ का उपयोग आवश्यक नहीं है)।
  2. चरण 2.1 में तैयार कृत्रिम खारा घोल के 990 μL का उपयोग करके एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रत्येक नमूने (और नकारात्मक नियंत्रण के लिए DMSO) के 10 μL को पतला करें, ताकि 0.1 mg/ mL की अंतिम सांद्रता प्राप्त की जा सके।
  3. एक फ्यूमहुड के तहत, एक एर्लेनमेयर फ्लास्क में, 1 मिलीग्राम / एमएल 13,14,15 की एकाग्रता पर आसुत जल में पोटेशियम डाइक्रोमेट (के2 सीआर 2ओ7) का घोल तैयार करें।

4. ब्राइन झींगा घातकता जैवपरख्या

नोट: यह परख संशोधन 1,16,17,18,19 के साथ कई लेखकों के कार्यों से विकसित की गई है।

  1. चरण 2.1 में तैयार किए गए माध्यम से हैचिंग पोत को स्तर चिह्न (500 एमएल) (चित्रा 2 सी) तक भरें।
  2. नमक के घोल में ब्राइन झींगा अल्सर का एक चम्मच (लगभग 0.75 ग्राम) रखें, और फिर कंटेनर को बंद करें। 8 W, 4,000 K, 830 lm के एलईडी लाइट बल्ब के साथ एक लैंप (टेबल लैंप, 40 W, 230 V, 50 Hz) रखें जो सीधे उपकरण (चित्रा 2A) की ओर इशारा करता है और इसे चालू करता है।
  3. उपकरण के शीर्ष पर रखे कनेक्टर पर एयर सप्लायर सिस्टम (3 डब्ल्यू आउटपुट, 50 हर्ट्ज, 230 वी) संलग्न करें और पंप को चालू करें।
  4. कमरे का तापमान 25 ± 3 डिग्री सेल्सियस रखें। नमकीन झींगा अल्सर कृत्रिम नमक समाधान में, जोरदार वातन, निरंतर प्रकाश व्यवस्था और स्थिर तापमान के तहत, 24 घंटे से 48 घंटे के बाद निकलते हैं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक ऊर्ध्वाधर इनक्यूबेटर का उपयोग किया जा सकता है।
  5. एक बार अंडे निकल जाने के बाद, एयर पंप को बंद कर दें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि नौपली (फ़नल के तल की ओर बढ़ना) खाली अंडे के मामलों (शीर्ष पर तैरते हुए) से अलग न हो जाए।
  6. जीवित नौपली से अनहैच किए गए अंडों को अलग करने के लिए, आउटलेट नल को नीचे खोलें और हाथ से बने माइग्रेशन उपकरण कंटेनर (चरण 1.2 में वर्णित) के कंटेनरों में से एक में फ़नल की सामग्री का निर्वहन करें। सुनिश्चित करें कि नौपली और अवशिष्ट बिना अंडे वाला घोल ट्यूब के स्तर से नीचे है। दूसरे कंटेनर में, ट्यूब की ऊंचाई से ऊपर चरण 2.1 से अवशिष्ट नमक समाधान जोड़ें।
  7. एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करके कंटेनर को नौपली और अवशिष्ट अनहैच अंडे के साथ कवर करें। दीपक को केवल नमक के घोल के साथ दूसरे कंटेनर पर रखें। ब्राइन झींगा प्रकाश से आकर्षित होगा और एक कंटेनर से दूसरे (कटाई कंटेनर) में स्थानांतरित हो जाएगा, जिससे अंडे (धीरे-धीरे नीचे तलछट) और जीवित आर्टेमिया के बीच कुशल पृथक्करण होगा।
  8. फिर, उपकरण को इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए चरण 4.4 में उपयोग की जाने वाली समान परिस्थितियों में रखें (चित्रा 2 ई)। कटाई के कंटेनर से, 10 से 15 नौपली युक्त 900 μL खारा घोल एकत्र करें। 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में नौपली के साथ खारा घोल रखें (चित्रा 2 एफ); सभी नमूनों को चतुष्कोणीय में परीक्षण किया जाता है।
  9. नकारात्मक नियंत्रण (डीएमएसओ), सकारात्मक नियंत्रण (के2 सीआर 2ओ7, पोटेशियम डाइक्रोमेट), कृत्रिम नमक समाधान, और प्रत्येकनमूने को संबंधित अच्छी तरह से 100 μL जोड़ें (चित्रा 2 एफ) 13,14।
    नोट: प्रत्येक कुएं में नमूने 0.01 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर होंगे। नमक के घोल में सकारात्मक नियंत्रण की अंतिम एकाग्रता 0.1 मिलीग्राम / एमएल होगी, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कुएं में सभी नौपली पोटेशियम डाइक्रोमेट के विषाक्त प्रभाव के संपर्क में हैं और मर जाते हैं। कृत्रिम नमक समाधान रिक्त के रूप में कार्य करेगा।
  10. 24 घंटे के लिए रोशनी के तहत 25 ± 3 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें (चित्रा 2 जी)। 24 घंटे के बाद, दूरबीन माइक्रोस्कोप (12x)20 (चित्रा 2H) के तहत प्रत्येक कुएं में मृत लार्वा (5 सेकंड के लिए गैर-मोबाइल नौपली) की संख्या दर्ज करें। वैकल्पिक रूप से, हाथ लेंस का उपयोग करें।
  11. शेष जीवित लार्वा की मृत्यु को प्रेरित करने के लिए पोटेशियम डाइक्रोमेट समाधान के 100 μL जोड़ें, और 6 घंटे तक प्रतीक्षा करें। माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक कुएं में कुल मृत लार्वा की गणना करें। निम्नलिखित समीकरण के अनुसार मृत्यु दर ज्ञात कीजिए।
    Equation 1
  12. सभी परख को तीन प्रतियों में निष्पादित करें। मानक विचलन (एसडी) की गणना करें, और परिणामों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत के रूप में व्यक्त करें, जिनमें से प्रत्येक आंतरिक चतुर्भुज (एन = 12), ± एसडी के साथ है। जैसा कि मेयर एट अल द्वारा उल्लेख किया गया है, एलसी50< 1,000 μg / mL के साथ कच्चे अर्क और शुद्ध यौगिकों को विषाक्त मानते हैं; इसके अलावा, ध्यान रखें कि ब्राइन झींगा की मृत्यु दर परीक्षण किएगए नमूनों की एकाग्रता के समानुपाती है।

Figure 2
चित्र 2: आर्टेमिया सैलिना घातकता जैवपरख विधि। (ए) ब्राइन झींगा अल्सर सेने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरण; (बी) हाथ से बने माइग्रेशन उपकरण; (सी) खारा घोल से भरा जहाज सेने वाला बर्तन; (डी) बिना अंडे और नौपली का संग्रह; (ई) माइग्रेशन चरण के दौरान इनक्यूबेटर में हाथ से बने उपकरण। दीपक से दूर कंटेनर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जाना चाहिए; हालांकि, यहां सेट इंस्टॉलेशन के बेहतर दृश्य के लिए इसे हटा दिया गया था; (च) परख करने से पहले कुओं में आर्टेमिया की कटाई। यौगिकों को दिखाए गए अनुसार रखा जाना चाहिए: - नकारात्मक नियंत्रण (डीएमएसओ), + सकारात्मक नियंत्रण (के2सीआर2ओ7), कृत्रिम नमक समाधान के लिए नमक, और परीक्षण करने के लिए नमूनों के लिए 1 से 3 (इस मामले में यौगिक 1-3); (छ) आर्टेमिया युक्त 24-वेल प्लेट और चयनित नमूनों की इनक्यूबेशन; (एच) दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत आर्टेमिया गिनती। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: चयनित यौगिकों की संरचनाएं। यौगिकों की संरचना 1-2, प्लेक्ट्रैंथस प्रजातियों से निकाली गई, और यौगिक 3-5, अर्ध-संश्लेषण द्वारा प्राप्त। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हमारे समूह द्वारा हाल ही में अध्ययन किए गए कुछ प्राकृतिक उत्पादों की सामान्य विषाक्तता का मूल्यांकन ब्राइन झींगा घातकता बायोसेसे के माध्यम से किया गया था। चार अर्क (पीए- पी। पीबी-पी बार्बैटस; पीसी- पी. सिलिंडरसस; और प्लेक्ट्रान्थस जीनस से पे-पी एकलोनी) का परीक्षण किया गया, जो उनकी एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि (अप्रकाशित परिणामों) के लिए जाना जाता है। इसके अतिरिक्त, दो प्राकृतिक यौगिक (1 और 2) प्लेक्ट्रेंथस एसपीपी से प्राप्त होते हैं, और तीन अर्ध-सिंथेटिक डेरिवेटिव (3, 4, 5; चित्रा 3), एक अन्य कार्य3 में वर्णित सभी की भी जांच की गई थी। यहां, संभावित साइटोटोक्सिक गतिविधि के संदर्भ में उनका प्रारंभिक मूल्यांकन बताया गया है।

सभी परीक्षण किए गए अर्क ने बहुत कम मृत्यु दर के साथ बहुत उत्साहजनक परिणाम दिखाए, जो रिक्त (नमक समाधान) और नकारात्मक नियंत्रण (डीएमएसओ) के लिए पंजीकृत लोगों के बराबर थे; चित्र 4)। इसके विपरीत, शुद्ध यौगिकों 1-5 के बीच, केवल व्युत्पन्न 5 ने कम मृत्यु दर (100 पीपीएम की एकाग्रता पर 2.30%) प्रदर्शित की, जिसमें कोई सामान्य विषाक्तता नहीं थी (चित्रा 5)।

Figure 4
चित्रा 4: आर्टेमिया सलीना पर अर्क की घातकता। प्लेक्ट्रान्थस एसपीपी के चार मेथनॉलिक अर्क के 24 घंटे के संपर्क में आने के बाद ए. सलीना (%) की मृत्यु दर 0.1 मिलीग्राम / एमएल (पीए- पी। पीबी-पी बार्बैटस; पीसी- पी. सिलिंडरसस; पे- पी. एकलोनी)। इस परख का उपयोग करके सामान्य विषाक्तता के संदर्भ में सभी अर्क स्वीकार्य थे। नमक नमक के घोल (रिक्त) से मेल खाता है; K2Cr2O7 को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में और DMSO को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। परिणामों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य के रूप में व्यक्त किया गया था, जिनमें से प्रत्येक में आंतरिक चतुर्भुज (एन = 12) ± एसडी थे। डंनेट के पोस्ट-टेस्ट के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके भिन्नता के विश्लेषण द्वारा समूहों के भीतर तुलना की गई थी। नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का मूल्यांकन एक वाणिज्यिक सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। सांख्यिकीय महत्व को इंगित करने के लिए एक संभाव्यता स्तर पी < 0.01 माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: आर्टेमिया सलीना पर यौगिकों की घातकता। 0.1 मिलीग्राम / एमएल पर पांच शुद्ध यौगिकों के संपर्क में 24 घंटे के बाद ए सलीना (%) की मृत्यु दर (1 और 2 प्राकृतिक उत्पाद हैं और 3-5 1 और 2 से तैयार डेरिवेटिव हैं)। यह स्पष्ट है कि केवल 5 इस परख का उपयोग करके बहुत सीमित विषाक्तता दिखाता है। नमक नमक के घोल (रिक्त) से मेल खाता है; K2Cr2O7 को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में और DMSO को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। परिणामों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य के रूप में व्यक्त किया गया था, जिनमें से प्रत्येक में आंतरिक चतुर्भुज (एन = 12) ± एसडी थे। डंनेट के पोस्ट-टेस्ट के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके भिन्नता के विश्लेषण द्वारा समूहों के भीतर तुलना की गई थी। नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का मूल्यांकन एक वाणिज्यिक सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। सांख्यिकीय महत्व को इंगित करने के लिए एक संभाव्यता स्तर पी < 0.01 माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्राकृतिक उत्पाद 1 और 2 ने मध्यम घातकता (100 पीपीएम पर क्रमशः 36.68% और 30.95%) दिखाई, जबकि अर्धसिंथेटिक डेरिवेटिव 3 और 4, क्रमशः 1 और 2 से प्राप्त, मूल पाड़ की तुलना में अधिक विषाक्त थे (क्रमशः 100 पीपीएम पर 64.02% और 36.64%); चित्र 5)।

कुल मिलाकर डेटा ने सुझाव दिया कि सभी परीक्षण किए गए अर्क, जो उनकी एंटीऑक्सिडेंट गतिविधि के लिए जाने जाते हैं और कोई सामान्य विषाक्तता नहीं दिखाते हैं, को चयनित सेल लाइनों पर आगे इन विट्रो गतिविधि और विषाक्तता अध्ययन के लिए उम्मीदवारों के रूप में माना जा सकता है। यदि विषाक्तता की अनुपस्थिति त्वचीय मॉडल में भी प्रदर्शित की जाती है, तो त्वचीय अनुप्रयोग के लिए नए बायोएक्टिव उत्पादों का विकास किया जा सकता है। दूसरी ओर, यौगिक 1-4 के लिए देखे गए विषाक्त प्रभाव उन्हें एंटीकैंसर एजेंटों के रूप में अतिरिक्त मूल्यांकन के लिए उपयुक्त उम्मीदवार बना सकते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पिछले वर्षों के दौरान, वैज्ञानिक समुदाय ने विषाक्तता स्क्रीनिंग21 के लिए वैकल्पिक मॉडल की ओर अपना ध्यान बढ़ाया है। ए सलीना घातकता बायोसेसे के अलावा, अन्य पद्धतियों को आमतौर पर नमूना सहनशीलता के मूल्यांकन के लिए किया जाता है और इसमें कशेरुक बायोएस (जैसे कृन्तक), अकशेरुकी (जैसे ज़ेब्राफिश), खमीर उपभेदों या कोशिकाओं का उपयोग करके इन विट्रो विधियां और सिलिको विधियोंमें 22,23,24,25 शामिल हैं। . इन सभी विधियों के स्पष्ट फायदे और नुकसान हैं, खर्च किए गए धन और समय, परिणामों की प्रजनन क्षमता और विश्लेषण किए जाने वाले नमूने के प्रकार को ध्यान में रखते हुए। उदाहरण के लिए, इन सिलिको दृष्टिकोण एक मानकीकृत कम लागत वाली पद्धति का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें न्यूनतम उपकरण की आवश्यकता होती है। बहरहाल, जब इस तरह के अध्ययन एक लक्ष्य पर केंद्रित होते हैं, तो खराब गुणवत्ता वाले परिणाम प्राप्त होते हैं, जिससे यह विकल्प प्रारंभिक स्क्रीनिंग के दायरे से बाहर हो जाता है, जैसा कि हम इस अध्ययन में प्रस्तुत करते हैं। जब सूक्ष्मजीवों की बात आती है, तो सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया को विषाक्त यौगिकों के मूल्यांकन के लिए सबसे बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किए जाने वालेमॉडलों में से एक माना जाता है। वास्तव में, इन विट्रो खमीर का उपयोग आम तौर पर तेज और करने में आसान होता है; हालांकि, यह महंगा हो सकता है, क्योंकि इसके लिए विशिष्ट रासायनिक उत्पादों और उपकरणों की आवश्यकता होती है, और साइटोटोक्सिक यौगिकों की न्यूनतम खुराक के लिए कम संवेदनशीलतादिखाता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में, मानव कोशिकाओं को एक तेज, सरल और सस्ती तरीके से नियोजित किया जा सकता है। फिर भी, ये एक पूरे जीव का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं; इस प्रकार, विभिन्न सेल प्रकारों और शारीरिक स्थितियों में होने वाली प्रणालीगत गड़बड़ी के बीच बातचीत को उचित रूप सेध्यान में नहीं रखा जाता है। दूसरी ओर, विवो परख में पूरे जीव को ध्यान में रखने के लिए बहुत लाभ है, लेकिन पशु मॉडल (जैसे कृंतकों) को परख निष्पादन के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है, अधिक महंगे होते हैं और जटिल नैतिकविचारों को दर्शाते हैं। इसके विपरीत, विषाक्तता स्क्रीनिंग के लिए जलीय जीवों को नियोजित करने वाले विवो परखों में आम तौर पर अच्छी तरह से स्वीकार किया जाता है, यह भी देखते हुए कि समुद्री अकशेरुकी जीवों का उपयोग कम नैतिक चिंताओं से गुजरता है, और कार्यप्रणाली प्रदर्शन करना आसान है, तेज और सस्ता21,24। इस संदर्भ में, सामान्य विषाक्तता के अध्ययन के लिए ज़ेबराफ़िश का उपयोग अक्सर क्षेत्र में पहली पसंद का प्रतिनिधित्व करता है। वास्तव में, अन्य पशु परीक्षणों की तुलना में, इसे कम लागत वाला विकल्प माना जा सकता है, क्योंकि ज़ेबराफिश तेजी से विकसित होती है और निषेचन के बाद 72 घंटे से 13 दिनों के आसपास प्रारंभिक लार्वा चरण तक पहुंच जाती है। फिर भी, एक ज़ेबराफिश के रखरखाव के लिए अच्छी तरह से प्रशिक्षित ऑपरेटरों और विशिष्ट स्थितियों की आवश्यकता होती है, जैसे कि परिसंचारी प्रणाली के साथ एक मछली टैंक, समग्र गुणवत्ता को बनाए रखने के लिए सिस्टम के पानी को वारेट और फ़िल्टर करने में सक्षम; इसके अलावा, कई ढक्कन और नाली कवर आवश्यक हैं, क्योंकि ज़ेबराफिश कूद सकता है, साथ ही विशिष्ट प्रकाश की स्थिति (14 घंटे प्रकाश, 10 घंटे अंधेरा), और पीएच स्तर को दैनिक रूप से जांचने की आवश्यकता है, दूसरोंके बीच 29,30। कुल मिलाकर, ये विचार ज़ेब्राफिश मॉडल को यहां रिपोर्ट किए गए आर्टेमिया मॉडल की तुलना में अधिक समय लेने वाला और महंगा बनाते हैं, क्योंकि ये माइक्रोक्रस्टेशियन प्रयोगशाला विधियों का उपयोग करके बड़ी आबादी में खेती के लिए संभालना और व्यवहार्य हैं। सलीना निस्संदेह सबसे अधिक नियोजित स्क्रीनिंग टूल में से एक बनाता है, जिसका उपयोग मुख्य रूप से विभिन्न नमूनों की सामान्य विषाक्तता का परीक्षण करने के लिए किया जाता है, जैसे कि दवाएं और औषधीय पौधे के अर्क1.

प्रोटोकॉल में, ए सलीना नौपली को 24 घंटे के लिए उपयुक्त नमूनों के साथ पाला, एकत्र और इनक्यूबेट किया गया है, ताकि प्रत्येक नमूने द्वारा प्रेरित नौपली मृत्यु दर का अनुमान लगाया जा सके। पहले चरण में, अंडे सेने का आयोजन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ़नल के आकार के प्रजनन पोत में किया जाता है, जिसमें जोरदार बुदबुदाहट पेश की गई थी (चित्रा 2 ए)। यह मजबूर वातन आवश्यक है क्योंकि यह नमकीन झींगा सेने को यथासंभव सफलतापूर्वक होने की अनुमति देता है। हैचिंग लगभग 24 घंटे में 25 ± 3 डिग्री सेल्सियस पर होती है, जबकि कम तापमान पर 48 घंटे तक आवश्यक हो सकती है। एक बार अंडे निकलने के बाद, पंप को बंद कर दिया जाता है ताकि खाली अंडे के मामलों को शीर्ष पर तैरने की अनुमति मिल सके, जबकि नौपली और अनहैच अंडे आसानी से नीचे की ओर फ़नल टैप खोलकर एकत्र किए जाते हैं। हमारे प्रयोगों के दौरान, एकत्र किए गए समाधान में नौपली और गैर-परिपक्व अंडे की उपस्थिति के साथ, पूर्ण अंडे सेने को कभी हासिल नहीं किया गया था। इस कारण से, आर्टेमिया के दो रूपों को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए, ब्राइन झींगा के प्रवास के लिए एक हाथ से बनाया गया उपकरण तैयार किया जाता है (चरण 1.2)। एक कंटेनर को काटे गए जीवों से भर दिया जाता है, और फिर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जाता है, जबकि दूसरे प्राप्तकर्ता को दीपक के प्रत्यक्ष प्रकाश के संपर्क में लाया जाता है। इन स्थितियों में, बिना अंडे बस जाते हैं, जबकि जीवित नौपली आसन्न कंटेनर से टकराने वाले प्रकाश से आकर्षित होते हैं, जो पुल कनेक्शन के माध्यम से एक तरफ से दूसरी तरफ प्रवास का पक्ष लेते हैं। 4 घंटे के बाद, लगभग सभी जीवित नौपली प्रकाश के संपर्क में कंटेनर के अंदर होते हैं और परख के निष्पादन के लिए एकत्र किए जाने के लिए तैयार होते हैं। इस स्तर पर, खारे पानी के घोल के कुछ हिस्सों, जिसमें दस से पंद्रह नौपली होते हैं, को हटा दिया जाता है और परीक्षण किए जाने वाले प्रत्येक नमूने के साथ इनक्यूबेट किया जाता है।

इस काम में, यह दिखाया गया है कि विधि कैसे कुशल, आर्थिक और करने में आसान है। हालांकि, इस परख का प्रदर्शन करते समय कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं को स्वीकार किया जाना चाहिए।

परख आमतौर पर नल के पानी के साथ आयोजित की जाती है। भौगोलिक और भौतिक-रासायनिक कारकों के आधार पर, नल का पानी अलग-अलग कठोरता वितरण प्रदर्शित करता है, परख की प्रजनन क्षमता को प्रभावित करता है और विशेष रूप से, अंडे सेने के चरण को प्रभावित करता है। इसी कारण से, समुद्री जल का उपयोग परीक्षण की प्रजनन क्षमता को प्रभावित कर सकता है। अलग-अलग नमक सांद्रता, संदूषकों, माइक्रोप्लास्टिक्स और अन्य कणिकाओं की उपस्थिति ऑपरेटर को आगे के चरणों से गुजरने के लिए मजबूर करेगी, जैसे कि फिल्ट्रेशन और अन्य प्रकार के शुद्धिकरण, जो प्रयोग को अधिक जटिल और संभालने में कम आसान बना देगा। सभी पर विचार किया गया, इष्टतम परिस्थितियों को नल के पानी की विशेषताओं और उपलब्धता के आधार पर तय किया जाना चाहिए, विशेष रूप से कृत्रिम नमक की मात्रा के सावधानीपूर्वक विनियमन द्वारा, जो एक उपयुक्त वातावरण बनाता है और नौपली के लिए पोषण के रूप में भी कार्य करता है।

तापमान में व्यापक भिन्नता के परिणामस्वरूप हैच दर कम हो सकती है। नतीजतन, जीवित आर्टेमिया के निम्न स्तर देखे जा सकते हैं, जो उच्च संख्या में बिना अंडे के साथ मिश्रित होते हैं। स्पष्ट रूप से, ऐसी स्थितियां विश्वसनीय परख के विकास के लिए उपयुक्त नहीं हैं, इसलिए कमरे के नियंत्रित जलवायुकरण या उपयुक्त ऊर्ध्वाधर इनक्यूबेटरों के उपयोग पर विचार किया जाना चाहिए।

हैचिंग पोत के भीतर समाधान के जोरदार वातन की आवश्यकता होती है। निरंतर बुदबुदाहट की उपस्थिति अंडे के बीच संपर्क का पक्ष लेती है और हैचिंग प्रक्रिया को तेज करती है।

कटाई के दौरान अनहैच अंडे और नौपली दोनों को इकट्ठा करना परख की विश्वसनीयता को दृढ़ता से प्रभावित कर सकता है। यह नमूनों के साथ इनक्यूबेशन के दौरान हैचिंग की संभावना के कारण है। इस मामले में, सभी नौपली को एक ही समय के लिए उजागर नहीं किया जाएगा, जिसके परिणामस्वरूप गलत मृत्यु दर होगी। चूंकि अंडे और नौपली कुशलता से अलग होने के लिए बहुत छोटे होते हैं, इसलिए हैचिंग उपकरण में इनक्यूबेशन गुना अधिक या हाथ से बने माइग्रेशन उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता होती है।

प्रत्येक कुएं में इनक्यूबेशन चरण के लिए 10-15 नौपली होनी चाहिए, जिसे दूरबीन माइक्रोस्कोप (12x आवर्धन) के उपयोग से सावधानीपूर्वक गिना जाना चाहिए। एक ही कुएं में बहुत सारे नौपली की उपस्थिति ओवरलैपिंग के कारण अंतिम गिनती को मुश्किल या गलत बना सकती है। दूसरी ओर, झींगा की छोटी मात्रा बिना किसी सांख्यिकीय महत्व के परिणाम देगी।

जैसा कि स्पष्ट है, इस विधि की अधिकांश समस्याएं हैचिंग और विकास चरणों से संबंधित हैं, जहां विश्वसनीयता के मुद्दों से बचने के लिए अधिक ध्यान देने की आवश्यकता है। फिर भी, विधि संशोधनों को सहन कर सकती है, खासकर ऊपर वर्णित सबसे महत्वपूर्ण बिंदुओं के संबंध में। बेशक, जब इन मापदंडों में से एक को बदल दिया जाता है, तो मूल विधि को अनुकूलित करने के लिए कई प्रयास करना आवश्यक हो सकता है। उदाहरण के लिए, तापमान बदलने से परख के समग्र समय को नियंत्रित करने में मदद मिल सकती है: तापमान को 28-29 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाने से हैच दर भी बढ़ेगी और पूरी प्रक्रिया में तेजी आएगी।

सलीना बायोसेसे की कुछ सीमाएं परीक्षण स्थितियों और समय के लिए नमूनों की स्थिरता से भी संबंधित हैं। परख केवल उन नमूनों का उपयोग करके की जा सकती है जो कमरे के तापमान पर स्थिर हैं और दृश्य प्रकाश के तहत हैं। इसके अलावा, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि पूरी प्रक्रिया कम से कम 4 दिनों तक चलती है, और यदि हैच दर कम है, तो परख को हैचिंग चरण के लिए एक अतिरिक्त दिन की आवश्यकता हो सकती है।

कुल मिलाकर, इस अध्ययन में, हम ए सलीना विधि के माध्यम से सामान्य विषाक्तता मूल्यांकन के आवेदन के दो उदाहरणों पर प्रकाश डालते हैं। परीक्षण किए गए सभी नमूनों के लिए सामान्य विषाक्तता स्थापित की गई है। प्लेक्ट्रेंथस पौधों और यौगिक 5 के अर्क ने कोई सामान्य विषाक्तता प्रदर्शित नहीं की, जबकि यौगिक 1-4 नमकीन झींगा पर मामूली या यहां तक कि अत्यधिक विषाक्त साबित हुए। विशेष रूप से, आर्टेमिया पर यौगिक 1 और 2 के नकारात्मक प्रभाव को पहले सितारेक और माटियास द्वारा क्रमशः एमटीटी और एसआरबी / एमटीटी परखद्वारा प्रदर्शित किया गया था। इसी समय, बेंज़ोयलेटेड एनालॉग, यौगिक 3 और 4, अपने पूर्ववर्ती 1 और 2 की तुलना में उच्च विषाक्तता मूल्य दिखाते हैं, इस बात पर प्रकाश डालते हुए कि एस्टर फंक्शनलाइजेशन की साइटोटॉक्सिसिटी के मामले में एक महत्वपूर्ण भूमिका हो सकती है, जैसा कि गार्सिया एट अल.33 द्वारा मानव एनएससीएलसी एमडीआर कैंसर सेल लाइन में यौगिक 4 के लिए पुष्टि की गई है। हालांकि, यह पुष्टि करने के लिए अन्य परखों की आवश्यकता है कि कैंसर चिकित्सा में इस तरह की साइटोटोक्सिक गतिविधि का शोषण किया जा सकता है। दूसरी ओर, व्युत्पन्न 5, सभी परख अर्क के साथ, कोई विषाक्तता नहीं दिखाई दी और श्रृंखला के सबसे आशाजनक शुद्ध यौगिक के रूप में दिखाई देता है। हालांकि, त्वचीय अनुप्रयोग के लिए संभावित जैविक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।

यहां हमने दिखाया कि स्क्रीनिंग टूल के रूप में आर्टेमिया सलीना-आधारित विधि का उपयोग अन्य ज्ञात पद्धतियों की तुलना में समय और धन बचाने की अनुमति कैसे दे सकता है। यह प्रारंभिक विषाक्तता संदर्भों में शोषण करने के लिए एक कुशल और लाभप्रद तरीके का प्रतिनिधित्व करता है। इसका उपयोग विभिन्न और जटिल नमूनों, सिंथेटिक और अर्ध-सिंथेटिक दवाओं की उपस्थिति में किया जा सकता है, साथ ही प्राकृतिक उत्पाद अर्क और नमूनों के जैव-निर्देशित विभाजन के लिए भी किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक ों ने वित्तीय या अन्यथा हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

प्रोफेसर एमिलकर रॉबर्टो की याद में।

इस काम को फंडाको पैरा ए सिएनसिया ई ए टेक्नोलोगिया (एफसीटी, पुर्तगाल) द्वारा परियोजनाओं यूआईडीबी /04567/2020 और यूआईपीपी / 04567/2020 के तहत सीबीआईओएस और पीएचडी अनुदान एसएफआरएच / बीडी / 137671 / 2018 (वेरा इस्का) के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Thermo Fisher Scientific, Denmark 174899 Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish
Aluminium foil Albal - Can be purchased in supermarket
Artemio Set JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany 61066000 Can be purchased in pet shops
Binocular microscope Ceti, Belgium  1700.0000 Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz
Bottles - - 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm
Brine shrimp cysts JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany 3090700 Can be purchased in pet shops
Brine shrimp salt JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany 3090600 Can be purchased in pet shops
Dimethyl sulfoxide (DMSO) VWR chemicals CAS: 67-68-5  99% purity
Discartable tips Diamond F171500 Volume range: 100 - 1000 µL
Eppendorf microtubes BRAND 7,80,546 Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY
Erlenmeyer flask VWR chemicals 4,47,109 volume: 100 mL
Glass beaker Normax 3.2111654N Volume: 1000 mL
Gloves Guantes Luna GLSP3 -
GraphPad Prism GraphPad Software, San Diego, CA, USA - GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software
Home-made A. salina Grower  -  - Home made: two plastic bottles connected by a hose
Hot glue Parkside PHP500E3 230 V, 50 Hz, 25 W
Incubator Heidolph Instruments, Denmark   - One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006
Light Roblan SKYC3008FE14 LED light bulb
Micropipettes VWR chemicals 613-5265 Volume range: 100 - 1000 µL
Potassium dichromate (K2Cr2O7) VWR chemicals CAS: 7778-50-9  99% purity
Pump ProAir a50 JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany  - Included in the Artemio Set+1 kit
Rubber tube - - 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter
Stirring rod VWR chemicals 441-0147 Equation 1 6 mm, 250 mm
Termometer VWR chemicals 620-0821 0 - 100 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
  2. Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
  3. Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
  4. Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
  5. Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
  6. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  7. Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
  8. Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
  9. Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
  10. Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
  11. Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
  12. Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
  13. Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
  14. Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
  15. Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
  16. Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
  17. Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
  18. Svensson, B. -M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
  19. Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
  20. Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
  21. Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
  22. Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
  23. Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
  24. Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
  25. Fischer, I., Milton, C., Wallace, H. Toxicity testing is evolving. Toxicology Research. 9 (2), 67-80 (2020).
  26. de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
  27. Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
  28. Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
  29. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  30. Cunliffe, V. T. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
  31. Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
  32. Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
  33. Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).

Tags

रसायन विज्ञान अंक 188
<em>आर्टेमिया सैलिना</em> एल का उपयोग करके घातक बायोसेसे।
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santos Filipe, M., Isca, V. M. S.,… More

Santos Filipe, M., Isca, V. M. S., Ntungwe N., E., Princiotto, S., Díaz-Lanza, A. M., Rijo, P. Lethality Bioassay Using Artemia salina L.. J. Vis. Exp. (188), e64472, doi:10.3791/64472 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter