Summary
这项工作旨在评估和审查 卤虫 盐碱致死性生物测定程序，也称为盐水虾致死性测定。这种简单而廉价的方法提供了有关样品（即天然产物）的一般毒性（被视为初步毒性评估）的信息。
Abstract
天然产物自古以来就被用来生产药物。如今，有很多化疗药物从天然来源获得并用于治疗多种疾病。不幸的是，这些化合物中的大多数通常表现出全身毒性和不良反应。为了更好地评估所选潜在生物活性样品的耐受性，盐水虾（盐卤菌）通常用作致死率研究的模型。 A. salina 测试基于所研究的生物活性化合物在其幼虫阶段（无节幼体）杀死微甲壳类动物的能力。该方法是细胞毒性研究以及合成、半合成和天然产物的一般毒性筛选的便捷起点。与通常用于上述目的的许多其他测定（体外 细胞或酵母菌株，斑马鱼，啮齿动物）相比，它可以被认为是一种简单，快速和低成本的测定;此外，即使没有任何特定培训，也可以轻松执行。总体而言， A. salina 测定是所选化合物的初步毒性评估和天然产物提取物的生物引导分馏的有用工具。
Introduction
多年来，来自植物、动物或微生物的天然产物因其生物和药理活性的多样性而成为开发新的生物活性分子的一个日益受到关注的领域1。然而，相关的副作用、耐药性或药物的特异性不足，特别是当用作抗癌药物时，是可能导致治疗无效的主要因素1，2。
在过去的几十年里，已经发现了几种植物来源的细胞毒性药物，其中一些被用作抗癌剂1，2，3。在这种情况下，紫杉醇被报道为最著名和最活跃的天然来源化疗药物之一3，4。目前，据估计，市场上超过35%的药物来源于天然产物或受天然产物启发5。这些化合物的潜在高毒性在所有研究阶段都需要考虑，因为不同类型的污染物甚至植物本身的代谢成分都会引起毒性作用。因此，应在初步阶段进行药理学和毒理学概况，以评估新的潜在植物疗法的生物活性和安全性。为了评估新的生物活性样品的毒性，无脊椎动物可以被认为是研究的最佳模型。他们要求最低的伦理要求，并允许初步的体外测定，以优先考虑最有前途的产品进行下一轮脊椎动物1，6测试。
盐水虾俗称盐水虾，是一种小型嗜盐无脊椎动物，属于卤虫属（蒿科，蒿目，甲壳亚门;图1）。在海洋和水生盐碱生态系统中，盐水虾起着重要的营养作用，因为它们以微藻为食，是用于喂养鱼类的浮游动物的组成部分。此外，它们的幼虫（称为无节幼体）在初步研究期间广泛用于评估一般毒性1，3，7。
卤虫 属广泛用于致死性研究，也是毒性评估的方便起点，通过根据实验室中生长的无节幼体的能力跟踪潜在生物活性化合物的毒性1，8。出于这个原因， 盐碱A. salina 的使用在一般毒性研究中获得了吸引力，因为与动物模型9上的其他测试相比，它是一种非常有效且易于使用的方法。
由于其解剖结构简单，体积小，生命周期短，可以在一次实验中研究大量的无脊椎动物。因此，它们将遗传适应性和低成本兼容性与大规模筛查相结合1。在这种情况下，在一般毒性测定中使用盐水虾显示出几个优点，例如快速生长（从孵化到第一次结果需要28-72小时），成本效益和商业鸡蛋的长保质期，可以全年使用3，10。另一方面，由于无脊椎动物具有原始的器官系统并且缺乏适应性免疫系统，因此它们并不代表人类细胞的完美和可靠的模型1。
但是，它为所选样品的一般毒性提供了初步评估方法。由于它被广泛用作致死性测定，它可以提供有关潜在抗癌剂毒性作用的临时指示。它还经常用于获得有关具有任何其他生物活性的化合物的一般毒性的反馈，为此必须显示 卤虫 虾中可能的最低死亡率。
在我们小组正在进行的一项研究中，来自 Plectranthus 物种的不同提取物显示出抗氧化和抗菌活性（未发表的结果）。同时，通过纯化提取物获得分离的化合物，然后进行化学修饰。然后对提取物、纯化合物和半合成衍生物进行一般毒性测试。在这种情况下，本工作旨在概述 使用卤虫 致死性生物测定法来评估来自 Plectranthus11属不同植物的生物活性提取物和分离化合物的一般毒性和潜在细胞毒性活性。
图1：显微镜下的 盐卤虫 。 在显微镜下看到的新孵化的 盐碱青节 幼体（放大倍数12倍）。 请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
1. 设备准备
- 获取市售孵化设备。选择合适的位置来设置孵化设备（图2A）。将漏斗形容器放在黑色支架（包含在套件中）中，然后将漏斗向合适的方向转动以查看水平标记和水龙头。
- 要制作手工迁移设备，请切开两个 0.5 L（直径 5.8 厘米）塑料瓶的顶部，以获得 12 厘米的最终高度。在每个瓶子底部距离底部 7 厘米处的一侧创建一个直径为 1.5 厘米的孔，并在两个开口之间插入一根 13 厘米的橡胶管（外径 1.3 厘米，内径 0.9 厘米）。用热胶密封开口（图2B），晾干15分钟;将瓶子放在平坦的表面上并装满水以验证没有泄漏。
2.人工盐溶液的制备
- 在玻璃烧杯中，制备浓度为35g / L的人造盐溶液（盐水虾盐）。为此，请按照制造商的说明将 28 克盐添加到 800mL 自来水中。用搅拌棒混合，直到所有盐完全溶解。
注意：根据可用容器的大小调整制备的盐溶液的体积。
3. 样品制备
- 通过溶解适量的提取物（Plectranthus 提取物，Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus;Pc-P. cylindraceus ; 和 Pe- P. ecklonii）或化合物 1-5（从 Plectranthus 属获得的两种天然化合物 [1 和 2] 和三种半合成衍生物 [3， 4， 5]; 图3）在二甲基亚砜（DMSO）12中，以获得10 mg/mL的终浓度（如果样品是水溶性的，则无需使用DMSO）。
- 使用步骤 2.1 中制备的 990 μL 人工盐水溶液在新微量离心管中稀释 10 μL 每个样品（以及用于阴性对照的 DMSO），以获得 0.1 mg/mL 的终浓度。
- 在通风橱下，在锥形瓶中，在蒸馏水中制备浓度为1mg / mL13，14，15的重铬酸钾（K 2 Cr 2O7）溶液。
4. 盐水虾致死性生物测定
注意：该测定是从几位作者的作品中发展而来的，修改了1，16，17，18，19。
- 用步骤2.1中制备的培养基填充孵化容器，直至达到水平标记（500 mL）（图2C）。
- 将一勺（约0.75克）盐水虾囊肿放入盐溶液中，然后关闭容器。将一盏灯（台灯，40 W，230 V，50 Hz，LED灯泡为8 W，4，000 K，830 lm）直接指向设备（图2A）并将其打开。
- 将空气供应系统（3 W 输出，50 Hz，230 V）连接到放置在设备顶部的连接器上，然后打开泵。
- 将室温保持在25±3°C。 盐水虾囊肿在人工盐溶液中孵化，在剧烈曝气，连续照明和稳定温度下，24小时至48小时。
注意：或者，可以使用立式培养箱。 - 一旦卵孵化，关闭气泵并等待无节幼体（向漏斗底部移动）与空蛋盒（漂浮在顶部）分离。
- 为了将未孵化的卵与活的无节幼体分离，打开底部的出口水龙头，将漏斗的内容物排放到手工迁移设备容器的一个容器中（如步骤1.2中所述）。确保含有无节幼体和残留未孵化卵的溶液低于管的水平。在第二个容器中，在管高度上方加入步骤2.1中的残余盐溶液。
- 用铝箔覆盖容器中的无节幼体和残留的未孵化卵。将灯放在第二个容器上，只放盐溶液。盐水虾会被光线吸引并从一个容器迁移到另一个容器（收获容器），导致卵（缓慢沉淀到底部）和活 卤虫之间的有效分离。
- 然后，将设备置于步骤4.4中使用的相同条件下的培养箱中4小时（图2E）。从收获容器中收集 900 μL 含有 10 至 15 个无节幼体的盐水溶液。将带有无节幼体的盐水溶液置于24孔板的每个孔中（图2F）;所有样品一式四份进行测试。
- 将阴性对照（DMSO）、阳性对照（K 2 Cr2O7，重铬酸钾）、人造盐溶液和每个样品各加入100μL到各自的孔中（图2F）13，14。
注意：每个孔中的样品浓度为0.01mg / mL。盐溶液中阳性对照的最终浓度为0.1mg/mL，以确保井中的所有无节幼体都暴露于重铬酸钾的毒性作用并死亡。人造盐溶液将充当空白。 - 将板在25±3°C下在照明下孵育24小时（图2G）。24小时后，在双目显微镜（12x）20（图2H）下记录每个孔中死亡幼虫（非移动无节幼体5秒）的数量。或者，使用手持镜头。
- 加入100μL重铬酸钾溶液，诱导剩余活幼虫死亡，等待6小时。在显微镜下计算每个孔中的死亡幼虫总数。根据以下公式确定死亡率。
- 一式三份进行所有测定。计算标准差（SD），并将结果表示为三个独立实验的平均值，每个实验都有内部一式四份（n = 12），±SD。正如Meyer等人所提到的，将LC50<1，000 μg/mL的粗提取物和纯化合物视为有毒;另外，考虑到盐水虾的死亡率与测试样品的浓度成正比21。
图2：卤虫盐碱致死性生物测定法。 （A） 用于孵化盐水虾囊肿的市售设备;（二）手工制作的迁移设备;（三）装满盐水溶液的孵化容器;（D） 收集未孵化的卵和无节幼体;（五）迁移步骤中培养箱中的手工设备。远离灯的容器应用铝箔覆盖;但是，为了更好地查看此处的设置安装，它被删除了;（F） 在进行测定之前在孔中收获卤虫。化合物应如图所示放置：-指阴性对照（DMSO），+至阳性对照（K 2 Cr2O7），盐至人工盐溶液，1至3至样品进行测试（在这种情况下化合物1-3）;（G） 孵育含有卤虫的24孔板和选定的样品;（H）双目显微镜下的卤血计数。请点击此处查看此图的大图。
图3：所选化合物的结构。 化合物1-2的结构，从 Plectranthus 物种中提取，和化合物3-5，通过半合成获得。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
我们小组最近研究的一些天然产物的一般毒性是通过盐水虾致死性生物测定法进行评估的。四种提取物（Pa- P.Pb- P. barbatus;Pc- P. cylindraceus;和Pe- P. ecklonii）来自Plectranthus属，以其抗氧化活性（未发表的结果）而闻名，进行了测试。此外，从Plectranthus属获得的两种天然化合物（1和2）和三种半合成衍生物（3，4，5;图3），在另一部作品3中描述的所有内容也进行了调查。本文报道了它们在潜在细胞毒性活性方面的初步评估。
所有测试的提取物都显示出非常令人鼓舞的结果，死亡率非常低，与空白（盐溶液）和阴性对照（DMSO; 图4）。相反，在纯化合物1-5中，只有衍生物5显示出低死亡率（浓度为100ppm时为2.30%），没有一般毒性（图5）。
图4：盐碱卤虫提取物的致死率。 盐苜蓿暴露于四种甲醇提取物24小时后的死亡率（%），为0.1mg / mL（Pa-P. ambigerus;Pb- P. barbatus;Pc- P. cylindraceus;佩-P.埃克洛尼）。使用该测定法，所有提取物在一般毒性方面都是可接受的。盐对应于盐溶液（空白）;K2 Cr2O7作为阳性对照，DMSO作为阴性对照。结果表示为三个独立实验的平均值，每个实验都有内部四份（n = 12）±SD。 通过方差分析在组内进行比较，使用单因素方差分析与邓内特的后检验。使用商业统计分析软件评估对照组和实验组之间的显着差异。概率水平 p < 0.01 被认为表示统计显著性。请点击此处查看此图的大图。
图5：化合物对盐碱卤虫的致死率。 盐碱曲霉暴露于0.1mg / mL的五种纯化合物24小时后的死亡率（1和2是天然产物，3-5是由1和2制备的衍生物）。很明显，只有5个显示使用该测定的毒性非常有限。盐对应于盐溶液（空白）;K2 Cr2O7作为阳性对照，DMSO作为阴性对照。结果表示为三个独立实验的平均值，每个实验都有内部四份（n = 12）±SD。 通过方差分析在组内进行比较，使用单因素方差分析与邓内特的后检验。使用商业统计分析软件评估对照组和实验组之间的显着差异。概率水平 p < 0.01 被认为表示统计显著性。请点击此处查看此图的大图。
天然产物1和2表现出中等致死率（100 ppm时分别为36.68%和30.95%），而分别从1和2获得的半合成衍生物3和4比原始支架毒性更大（100 ppm时分别为64.02%和36.64%; 图5）。
总体数据表明，所有测试的提取物，以其抗氧化活性而闻名，没有一般毒性，可以被认为是对选定的细胞系进行进一步 体外 活性和毒性研究的候选者。如果在皮肤模型中也证明没有毒性，则可以进行用于皮肤应用的新型生物活性产品的开发。另一方面，在化合物1-4中观察到的毒性作用可能使它们适合作为抗癌剂进行额外评估。
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Discussion
在过去的几年中，科学界对毒性筛查的替代模型的关注有所增加21。除了盐藻致死性生物测定外，通常还执行其他方法来评估样品耐受性，包括脊椎动物生物测定（例如啮齿动物），无脊椎动物（例如斑马鱼），使用酵母菌株或细胞的体外方法以及计算机方法22，23，24，25.考虑到花费的金钱和时间、结果的重现性以及要分析的样品类型，所有这些方法都有明显的优缺点。例如，计算机方法代表了一种标准化的低成本方法，需要最少的设备。尽管如此，当此类研究集中在单个靶点上时，获得的结果质量很差，这使得这种替代方案超出了初步筛选的范围，正如我们在本研究中介绍的那样25，26。在微生物方面，酿酒酵母被认为是评估有毒化合物最广泛使用的模型之一23。事实上，体外酵母的使用通常快速且易于进行;然而，它可能很昂贵，因为它需要特定的化学产品和设备，并且对最小剂量的细胞毒性化合物的敏感性低27。在另一种方法中，可以以快速，简单和廉价的方式使用人类细胞。即便如此，这些也不能代表整个有机体;因此，不同细胞类型之间的相互作用和生理条件下发生的系统扰动没有被适当考虑在内25，26。另一方面，体内测定具有考虑整个生物体的巨大优势，但动物模型（如啮齿动物）需要更多的时间来执行测定，更昂贵并且意味着复杂的伦理考虑25。相反，使用水生生物进行毒性筛查的体内测定通常被广泛接受，考虑到海洋无脊椎动物的使用经历较少的伦理问题，并且该方法易于执行，快速且便宜21，24。在这种情况下，使用斑马鱼研究一般毒性通常是该领域的首选。事实上，与其他动物试验相比，它可以被认为是一种低成本的选择，因为斑马鱼发育迅速，并在受精后 72 小时至 13 天左右达到早期幼虫阶段21，28。然而，斑马鱼的维护需要训练有素的操作人员和特定条件，例如带有循环系统的鱼缸，能够对系统水进行充气和过滤，以保持整体质量;此外，由于斑马鱼可以跳跃，因此需要几个盖子和排水盖，以及特定的照明条件（14 小时光照，10 小时黑暗），并且需要每天检查 pH 值，其中包括29，30。总之，这些考虑因素使斑马鱼模型比这里报告的卤虫模型更耗时和昂贵，因为这些微甲壳类动物更容易处理，并且可以使用实验室方法在大量种群中养殖。这使得盐苜蓿无疑是最常用的筛选工具之一，主要用于测试不同样品的一般毒性，如药物和药用植物提取物1。
在该协议中，已饲养，收集并与合适的样品一起孵育24 小时，以 估计每个样品诱导的无节幼体死亡率。第一步，在市售的漏斗形繁殖容器中进行卵孵化，其中引入剧烈冒泡（图2A）。这种强制曝气是必要的，因为它允许盐水虾孵化尽可能成功。孵化发生在25±3°C下约24小时，而在较低温度下可能需要长达48小时。一旦卵孵化，泵被关闭，让空蛋箱漂浮在顶部，而无节幼体和未孵化的蛋则通过打开底部的漏斗水龙头轻松收集。在我们的实验中，从未实现完整的鸡蛋孵化，因此在收集的溶液中存在无节幼体和未成熟的鸡蛋。因此，为了有效地分离两种形式的 卤虫，准备了用于卤水虾迁移的手工设备（步骤1.2）。一个容器装满收获的生物，然后用铝箔覆盖，而另一个容器则暴露在灯的直射光下。在这些条件下，未孵化的卵倾向于安定下来，而活着的无节幼体被照射到相邻容器的光线所吸引，有利于通过桥梁连接从一侧迁移到另一侧。4小时后，几乎所有活无节幼体都在暴露在光线下的容器内，并准备收集以进行测定。在此阶段，除去含有十至十五个无节幼体的部分盐水溶液，并与每个待测样品一起孵育。
在这项工作中，已经展示了该方法如何高效，经济且易于执行。但是，在进行该测定时应确认一些关键点。
该测定通常用自来水进行。根据地理和物理化学因素，自来水表现出不同的硬度分布，影响测定的可重复性，特别是鸡蛋孵化步骤。出于同样的原因，海水的使用可能会影响测试的可重复性。不同的盐浓度，污染物，微塑料和其他微粒的存在将迫使操作员进行进一步的步骤，例如过滤和其他类型的纯化，这将使实验更加复杂且不易处理。综上所述，最佳条件应根据自来水的特性和可用性来解决，特别是通过仔细调节人工盐的添加量，以创造一个合适的环境，并作为无节幼体的营养。
温度变化很大会导致孵化率降低。因此，可以观察到低水平的 活卤虫 ，与大量未孵化的卵混合在一起。显然，这样的条件不适合开发可靠的测定，因此应考虑房间的受控气候或使用适当的垂直培养箱。
需要在孵化容器内对溶液进行剧烈曝气。连续冒泡的存在有利于种蛋之间的接触并加速孵化过程。
在收获过程中收集未孵化的卵和无节幼体会强烈影响测定的可靠性。这是由于在与样品一起孵育期间可能会孵化。在这种情况下，并非所有的无节幼体都会暴露相同的时间，从而导致错误的死亡率。由于种蛋和无节幼体太小而无法有效分离，因此需要在孵化设备中使用更长的孵化时间或使用手工迁移设备。
每个孔应包含10-15个用于孵育步骤的无节幼体，通过使用双目显微镜（12倍放大倍率）仔细计数。同一口井中存在过多的无节幼体会使最终计数变得困难，甚至错误，因为重叠。另一方面，少量的虾会导致没有统计意义的结果。
很明显，这种方法的大多数问题都与孵化和生长阶段有关，需要更加注意以避免可靠性问题。即便如此，该方法也可以容忍修改，特别是相对于上述最关键点。当然，当这些参数之一发生变化时，可能需要进行多次尝试来优化原始方法。例如，改变温度可以帮助控制测定的总时间：将温度提高到28-29°C也会提高孵化率并加快整个过程。
盐藻A. bio测定的一些局限性也与样品对测试条件和时间的稳定性有关。该测定只能使用在室温和可见光下稳定的样品进行。此外，必须考虑到整个过程至少持续 4 天，如果孵化率低，则测定可能需要额外的一天来进行孵化步骤。
总体而言，在本研究中，我们重点介绍了通过 盐碱曲霉 方法应用一般毒性评估的两个示例。所有测试样品的一般毒性均已确定。来自 紫薇 属植物和化合物5的提取物没有显示出一般毒性，而化合物1-4被证明对盐水虾有中度甚至高度毒性。特别是，化合物1和2对 卤血 的负面影响先前分别由Sitarek和Matias通过MTT和SRB / MTT测定证明31，32。同时，苯甲酰化类似物化合物3和4显示出比其前体1和2更高的毒性值，突出表明酯功能化可能在细胞毒性方面发挥重要作用，正如Garcia等人33在人NSCLC MDR癌细胞系中的化合物4所证实的那样。然而，需要其他测定来确认这种细胞毒性活性可以在癌症治疗中被利用。另一方面，衍生物5与所有测定的提取物一起没有毒性，似乎是该系列中最有希望的纯化合物。然而，需要进一步的研究来评估皮肤应用的潜在生物活性。
在这里，我们展示了与其他已知方法相比，使用 基于卤虫盐的方法作为筛选工具如何节省时间和金钱。它代表了一种在初步毒性环境中被利用的有效和有利的方法。它可用于存在不同和复杂的样品、合成和半合成药物，以及天然产物提取物和样品的生物引导分馏。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突，无论是财务冲突还是其他利益冲突。
Acknowledgments
为了纪念阿米尔卡·罗伯托教授。
这项工作得到了科学和技术基金会（葡萄牙FCT）在UIDB/04567/2020和UIDP/04567/2020项目下的财政支持，该项目归功于CBIOS和博士资助SFRH/BD/137671/2018（Vera Isca）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H.
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
