Summary
Ce travail vise à évaluer et à examiner la procédure d’essai biologique de létalité d’Artemia salina , également identifiée comme test de létalité des artémias. Cette méthode simple et peu coûteuse donne des informations sur la toxicité générale (considérée comme une évaluation préliminaire de la toxicité) des échantillons, à savoir les produits naturels.
Abstract
Les produits naturels sont utilisés depuis l’Antiquité pour produire des médicaments. De nos jours, il existe de nombreux médicaments chimiothérapeutiques obtenus à partir de sources naturelles et utilisés contre une pléthore de maladies. Malheureusement, la plupart de ces composés présentent souvent une toxicité systémique et des effets indésirables. Afin de mieux évaluer la tolérabilité de certains échantillons potentiellement bioactifs, la crevette salée (Artemia salina) est généralement utilisée comme modèle dans les études de létalité. Le test A. salina est basé sur la capacité des composés bioactifs étudiés à tuer les microcrustacés au stade larvaire (nauplii). Cette méthode représente un point de départ pratique pour les études de cytotoxicité, ainsi que pour le dépistage général de la toxicité des produits synthétiques, semi-synthétiques et naturels. Il peut être considéré comme un test simple, rapide et peu coûteux, comparé à de nombreux autres tests (cellules in vitro ou souches de levure, poisson zèbre, rongeurs) généralement adapté aux fins susmentionnées; De plus, il peut être facilement effectué même sans aucune formation spécifique. Dans l’ensemble, le dosage d’A. salina représente un outil utile pour l’évaluation préliminaire de la toxicité de composés sélectionnés et le fractionnement bioguidé d’extraits de produits naturels.
Introduction
Les produits naturels issus de plantes, d’animaux ou de micro-organismes ont été un domaine d’intérêt croissant au fil des ans dans le développement de nouvelles molécules bioactives en raison de leur gamme variée d’activités biologiques et pharmacologiques1. Cependant, les effets secondaires associés, la résistance aux médicaments ou la spécificité insuffisante des agents, en particulier lorsqu’ils sont utilisés comme médicaments anticancéreux, représentent les principaux facteurs pouvant conduire à un traitement inefficace 1,2.
Au cours des dernières décennies, plusieurs agents cytotoxiques d’origine végétale ont été découverts, certains d’entre eux utilisés comme agents anticancéreux 1,2,3. Dans ce contexte, le paclitaxel est considéré comme l’un des médicaments chimiothérapeutiques d’origine naturelle les plus connus et les plus actifs 3,4. Actuellement, on estime que plus de 35% de tous les médicaments sur le marché sont dérivés ou inspirés de produits naturels5. La toxicité potentiellement élevée de ces composés doit être prise en compte pendant toutes les phases de l’étude, car différents types de contaminants ou même des composants métaboliques de la plante elle-même peuvent avoir des effets toxiques. Pour cette raison, des profils pharmacologiques et toxicologiques devraient être établis au cours de la phase préliminaire, afin d’évaluer l’activité biologique et la sécurité de nouveaux traitements potentiels à base de plantes. Pour évaluer la toxicité de nouveaux échantillons bioactifs, les animaux invertébrés peuvent être considérés comme les meilleurs modèles à étudier. Ils exigent des exigences éthiques minimales et permettent des essais in vitro préliminaires, afin de prioriser les produits les plus prometteurs pour la prochaine série d’essais chez les vertébrés 1,6.
Communément appelée artémia, A. salina est un petit invertébré halophile appartenant au genre Artemia (famille Artemiidae, ordre Anostraca, sous-embranchement Crustacea; Graphique 1). Dans les écosystèmes salins marins et aquatiques, les artémias jouent un rôle nutritionnel important car elles se nourrissent de microalgues et sont des constituants du zooplancton utilisé pour nourrir les poissons. De plus, leurs larves (connues sous le nom de nauplii) sont largement utilisées dans l’évaluation de la toxicité générale lors des études préliminaires 1,3,7.
Les espèces du genre Artemia sont largement utilisées dans les études de létalité et constituent également un point de départ pratique pour les évaluations de toxicité, en suivant la toxicité de composés potentiellement bioactifs en fonction de leur capacité à tuer les nauplii cultivés en laboratoire 1,8. Pour cette raison, l’utilisation d’A. salina a gagné en attrait dans les études de toxicité générale, car il s’agit d’une méthode très efficace et facile à utiliser, par rapport à d’autres tests sur des modèles animaux9.
En raison de leur anatomie simple, de leur petite taille et de leur cycle de vie court, un grand nombre d’invertébrés peuvent être étudiés en une seule expérience. En tant que tels, ils combinent l’agrément génétique et la compatibilité à faible coût avec des criblages à grande échelle1. Dans ce contexte, l’utilisation de l’artémia dans un essai de toxicité générale présente plusieurs avantages, tels qu’une croissance rapide (28-72 h sont nécessaires de l’éclosion aux premiers résultats), la rentabilité et la longue durée de conservation des œufs commerciaux, qui peuvent être utilisés toute l’année 3,10. D’autre part, puisque les invertébrés ont un système organique primitif et n’ont pas de système immunitaire adaptatif, ils ne représentent pas un modèle parfait et fiable pour les cellules humaines1.
Cependant, il fournit une méthode d’évaluation préliminaire de la toxicité générale des échantillons sélectionnés. Comme il est largement utilisé comme test de létalité, il peut fournir des indications provisoires sur les effets toxiques des agents anticancéreux potentiels. Il est également souvent utilisé pour obtenir des retours sur la toxicité générale des composés dotés de toute autre activité biologique pour laquelle il est essentiel de montrer le taux de mortalité le plus bas possible parmi les crevettes Artemia .
Dans une étude en cours de notre groupe, différents extraits d’espèces de Plectranthus ont montré des activités antioxydantes et antimicrobiennes (résultats non publiés). En parallèle, des composés isolés ont été obtenus par purification des extraits et ont ensuite été modifiés chimiquement. Les extraits, les composés purs et les dérivés semi-synthétiques ont ensuite été testés en termes de toxicité générale. Dans ce contexte, le présent travail vise à donner un aperçu de l’utilisation du bioessai de létalité Artemia pour l’évaluation de la toxicité générale et de l’activité cytotoxique potentielle d’extraits bioactifs et de composés isolés de différentes plantes du genre Plectranthus11.
Figure 1 : Artemia salina au microscope. Nauplies nouvellement éclos d’A. salina vus au microscope (grossissement 12x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Protocol
1. Préparation de l’équipement
- Acquérir du matériel d’éclosion disponible dans le commerce. Choisissez un endroit approprié pour installer l’équipement d’éclosion (figure 2A). Placez le récipient en forme d’entonnoir dans le support noir (inclus dans l’ensemble) et tournez l’entonnoir dans une direction appropriée pour voir la marque de niveau et le robinet.
- Pour fabriquer de l’équipement de migration fait à la main, coupez le dessus de deux bouteilles en plastique de 0,5 L (5,8 cm de diamètre) pour obtenir une hauteur finale de 12 cm. Créez un trou de 1,5 cm de diamètre d’un côté à 7 cm du fond de chaque bouteille et insérez un tube en caoutchouc de 13 cm (1,3 cm de diamètre extérieur et 0,9 cm de diamètre intérieur) entre les deux ouvertures. Sceller les ouvertures avec de la colle chaude (figure 2B) et laisser sécher pendant 15 min; Placez les bouteilles sur une surface plane et remplissez-les d’eau pour vérifier qu’il n’y a pas de fuite.
2. Préparation de la solution saline artificielle
- Dans un bécher en verre, préparer une solution saline artificielle (sel d’artémie) à une concentration de 35 g/L. Pour ce faire, ajoutez 28 g de sel à 800 ml d’eau du robinet, selon les instructions du fabricant. Mélangez-le avec une tige d’agitation jusqu’à ce que tout le sel soit complètement dissous.
NOTE: Ajuster le volume de la solution saline préparée en fonction de la taille des récipients disponibles.
3. Préparation des échantillons
- Préparer tous les échantillons dans un tube à microcentrifugation en dissolvant une quantité appropriée d’extraits (extraits de Plectranthus , Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus ; et Pe- P. ecklonii) ou composés 1-5 (deux composés naturels [1 et 2] obtenus à partir de Plectranthus spp. et trois dérivés semi-synthétiques [3, 4, 5]; Graphique 3) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)12, de manière à obtenir une concentration finale de 10 mg/mL (si l’échantillon est soluble dans l’eau, l’utilisation de DMSO n’est pas nécessaire).
- Diluer 10 μL de chaque échantillon (et du DMSO pour le témoin négatif) dans un nouveau tube microcentrifugé en utilisant 990 μL de solution saline artificielle préparée à l’étape 2.1, pour obtenir une concentration finale de 0,1 mg/mL.
- Sous une hotte, dans un erlenmeyer, préparer une solution de dichromate de potassium (K2Cr2O7) dans de l’eau distillée à une concentration de 1 mg/mL13,14,15.
4. Essai biologique sur la létalité des artémias
NOTE: Ce test est développé à partir des travaux de plusieurs auteurs avec les modifications 1,16,17,18,19.
- Remplir le récipient à couver avec le milieu préparé à l’étape 2.1 jusqu’au repère de niveau (500 mL) (figure 2C).
- Placez une cuillère (environ 0,75 g) de kystes d’artémia dans la solution saline, puis fermez le récipient. Placez une lampe (lampe de table, 40 W, 230 V, 50 Hz, avec une ampoule LED de 8 W, 4 000 K, 830 lm) pointant directement vers l’équipement (figure 2A) et allumez-la.
- Fixez le système du fournisseur d’air (sortie 3 W, 50 Hz, 230 V) au connecteur placé sur le dessus de l’équipement et mettez la pompe sous tension.
- Maintenez la température ambiante à 25 ± 3 °C. Les kystes de l’artémia éclosent dans la solution saline artificielle, sous une aération vigoureuse, un éclairage continu et une température stable, après 24 h à 48 h.
REMARQUE: Alternativement, un incubateur vertical peut être utilisé. - Une fois que les œufs ont éclos, éteignez la pompe à air et attendez que les nauplii (se déplaçant vers le bas de l’entonnoir) soient séparés des boîtes d’œufs vides (flottant en haut).
- Afin de séparer les œufs non éclos des nauplii vivants, ouvrir le robinet de sortie au fond et vider le contenu de l’entonnoir dans l’un des conteneurs du conteneur d’équipement de migration fait à la main (décrit à l’étape 1.2). S’assurer que la solution contenant les nauplii et les œufs non éclos résiduels se trouve sous le niveau du tube. Dans le deuxième récipient, ajouter la solution saline résiduelle de l’étape 2.1 au-dessus de la hauteur du tube.
- Couvrir le récipient avec les nauplii et les œufs non éclos résiduels à l’aide de papier d’aluminium. Placez la lampe sur le deuxième récipient avec seulement la solution saline. Les artémias seront attirées par la lumière et migreront d’un conteneur à l’autre (conteneur de récolte), conduisant à une séparation efficace entre les œufs (lentement sédimentés vers le fond) et l’Artemia vivant.
- Ensuite, placez l’équipement dans l’incubateur dans les mêmes conditions que celles utilisées à l’étape 4.4 pendant 4 h (Figure 2E). Dans le récipient de récolte, prélever 900 μL de solution saline contenant 10 à 15 nauplii. Placer la solution saline avec les nauplii dans chaque puits d’une plaque de 24 puits (figure 2F); Tous les échantillons sont testés en quadruplicates.
- Ajouter 100 μL chacun du témoin négatif (DMSO), du témoin positif (K 2Cr 2O7, dichromate de potassium), de la solution saline artificielle et de chacun des échantillons au puits respectif (figure 2F)13,14.
REMARQUE : Les échantillons dans chaque puits seront à une concentration de 0,01 mg/mL. La concentration finale du témoin positif dans la solution saline sera de 0,1 mg/mL, pour s’assurer que tous les nauplii dans le puits sont exposés à l’effet toxique du dichromate de potassium et meurent. La solution saline artificielle agira comme un blanc. - Incuber la plaque à 25 ± 3 °C sous éclairage pendant 24 h (figure 2G). Après 24 h, enregistrer le nombre de larves mortes (nauplii non mobiles pendant 5 s) dans chaque puits au microscope binoculaire (12x)20 (figure 2H). Vous pouvez également utiliser une lentille à main.
- Ajouter 100 μL de solution de dichromate de potassium, pour induire la mort des larves vivantes restantes, et attendre 6 h. Comptez le nombre total de larves mortes dans chaque puits au microscope. Déterminez le taux de mortalité selon l’équation suivante.
- Effectuez tous les essais en trois exemplaires. Calculez les écarts-types (ET) et exprimez les résultats comme la moyenne de trois expériences indépendantes, chacune avec des quadruplés internes (n = 12) ± écart-type. Comme l’ont mentionné Meyer et coll., considérer les extraits bruts et les composés purs ayant une CLde 50< 1 000 μg/mL comme toxiques; En outre, tenez compte du fait que le taux de mortalité des artémias est proportionnel à la concentration des échantillons testés21.
Figure 2 : Méthode d’essai biologique de létalité d’Artemia salina. A) Matériel disponible dans le commerce utilisé pour l’éclosion des kystes de l’artémia ; B) Matériel de migration fabriqué à la main; C) Récipient à couver rempli de solution saline; D) Collecte d’œufs et de nauplius non éclos; (E) Matériel fabriqué à la main dans l’incubateur pendant l’étape de migration. Le récipient éloigné de la lampe doit être recouvert de papier d’aluminium; Cependant, pour une meilleure vue de l’installation de l’ensemble ici, il a été supprimé; (F) Récolte d’Artemia dans des puits avant la réalisation de l’essai. Les composés doivent être placés comme indiqué : - se réfère au témoin négatif (DMSO), + au témoin positif (K2Cr2O7), le sel à la solution saline artificielle, et 1 à 3 aux échantillons à tester (dans ce cas les composés 1-3) ; G) Incubation de la plaque de 24 puits contenant Artemia et des échantillons sélectionnés; (H) Dénombrement des artémies au microscope binoculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Structures de composés sélectionnés. Structure des composés 1-2, extraits des espèces de Plectranthus, et des composés 3-5, obtenus par semi-synthèse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
La toxicité générale de certains produits naturels récemment étudiés par notre groupe a été évaluée par le biais du bioessai de létalité des artémias. Quatre extraits (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc-P. cylindraceus; et Pe- P. ecklonii) du genre Plectranthus , connus pour leur activité antioxydante (résultats non publiés), ont été testés. De plus, deux composés naturels (1 et 2) obtenus à partir de Plectranthus spp., et trois dérivés semi-synthétiques (3, 4, 5; La figure 3), toutes décrites dans un autre ouvrage3, ont également été étudiées. Ici, leur évaluation préliminaire en termes d’activité cytotoxique potentielle est rapportée.
Tous les extraits testés ont montré des résultats très encourageants, avec des taux de mortalité très faibles, comparables à ceux enregistrés pour le blanc (solution saline) et le témoin négatif (DMSO; Graphique 4). A l’inverse, parmi les composés purs 1-5, seul le dérivé 5 présentait un faible taux de mortalité (2,30% à une concentration de 100 ppm) sans toxicité générale (Figure 5).
Figure 4 : Létalité des extraits sur Artemia salina. Taux de mortalité d’A. salina (%) après 24 heures d’exposition à quatre extraits méthanoliques de Plectranthus spp., à 0,1 mg/mL (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc-P. cylindraceus; Pe- P. ecklonii). Tous les extraits étaient acceptables en termes de toxicité générale à l’aide de cet essai. Le sel correspond à la solution saline (blanc); K2 Cr2O7 a été utilisé comme témoin positif et le DMSO comme témoin négatif. Les résultats ont été exprimés comme la moyenne de trois expériences indépendantes, chacune avec des quadruples internes (n = 12) ± écart-type. Les comparaisons ont été effectuées au sein des groupes par l’analyse de la variance, en utilisant l’ANOVA unidirectionnelle avec le post-test de Dunnett. Les différences significatives entre le groupe témoin et le groupe expérimental ont été évaluées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique commercial. Un niveau de probabilité p < 0,01 a été considéré comme indiquant une signification statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Létalité des composés sur Artemia salina. Taux de mortalité d’A. salina (%) après 24 heures d’exposition à cinq composés purs à 0,1 mg/mL (1 et 2 sont des produits naturels et 3-5 sont des dérivés préparés à partir de 1 et 2). Il est évident que seulement 5 montrent une toxicité très limitée en utilisant ce test. Le sel correspond à la solution saline (blanc); K2 Cr2O7 a été utilisé comme témoin positif et le DMSO comme témoin négatif. Les résultats ont été exprimés comme la moyenne de trois expériences indépendantes, chacune avec des quadruples internes (n = 12) ± écart-type. Les comparaisons ont été effectuées au sein des groupes par l’analyse de la variance, en utilisant l’ANOVA unidirectionnelle avec le post-test de Dunnett. Les différences significatives entre le groupe témoin et le groupe expérimental ont été évaluées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique commercial. Un niveau de probabilité p < 0,01 a été considéré comme indiquant une signification statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les produits naturels 1 et 2 présentaient une létalité modérée (36,68 % et 30,95 % à 100 ppm, respectivement), tandis que les dérivés semi-synthétiques 3 et 4, obtenus à partir de 1 et 2, respectivement, étaient plus toxiques que l’échafaudage original (64,02 % et 36,64 % à 100 ppm, respectivement; Graphique 5).
Dans l’ensemble, les données suggèrent que tous les extraits testés, connus pour leur activité antioxydante et ne présentant aucune toxicité générale, peuvent être considérés comme candidats pour d’autres études d’activité in vitro et de toxicité sur des lignées cellulaires sélectionnées. Si l’absence de toxicité est également démontrée dans des modèles cutanés, le développement de nouveaux produits bioactifs pour application cutanée peut être réalisé. D’autre part, les effets toxiques observés pour les composés 1 à 4 pourraient en faire des candidats appropriés pour des évaluations supplémentaires en tant qu’agents anticancéreux.
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Discussion
Au cours des dernières années, la communauté scientifique a porté une attention accrue aux modèles alternatifs pour les examens de toxicité21. Outre le bioessai de létalité d’A. salina, d’autres méthodologies sont généralement utilisées pour évaluer la tolérabilité des échantillons et comprennent des essais biologiques sur les vertébrés (tels que les rongeurs), les invertébrés (tels que le poisson zèbre), les méthodes in vitro utilisant des souches ou des cellules de levure et les méthodes in silico 22,23,24,25 . Toutes ces méthodes présentent des avantages et des inconvénients évidents, compte tenu de l’argent et du temps dépensés, de la reproductibilité des résultats et du type d’échantillon à analyser. Par exemple, les approches in silico représentent une méthodologie normalisée à faible coût, nécessitant un équipement minimal. Néanmoins, lorsque de telles études se concentrent sur une seule cible, des résultats de mauvaise qualité sont obtenus, ce qui rend cette alternative hors du champ des examens préliminaires, comme nous le présentons dans cette étude25,26. En ce qui concerne les micro-organismes, Saccharomyces cerevisiae est considéré comme l’un des modèles les plus utilisés pour l’évaluation des composés toxiques23. En fait, l’utilisation de levures in vitro est généralement rapide et facile à réaliser; Cependant, il peut être coûteux, car il nécessite des produits chimiques et des équipements spécifiques, et montre une faible sensibilité à des doses minimales de composés cytotoxiques27. Dans une approche alternative, les cellules humaines peuvent être utilisées, de manière rapide, simple et peu coûteuse. Même ainsi, ceux-ci ne peuvent pas représenter un organisme entier; Ainsi, les interactions entre différents types cellulaires et les perturbations systémiques qui se produisent dans des conditions physiologiques ne sont pas correctement prises en compte25,26. D’autre part, les essais in vivo ont le grand avantage de prendre en considération l’organisme entier, mais les modèles animaux (tels que les rongeurs) nécessitent plus de temps pour l’exécution des essais, sont plus coûteux et impliquent des considérations éthiques complexes25. Inversement, les essais in vivo utilisant des organismes aquatiques pour le dépistage de la toxicité sont généralement bien acceptés, compte tenu également du fait que l’utilisation d’invertébrés marins subit moins de préoccupations éthiques et que la méthodologie est facile à réaliser, rapide et peu coûteuse21,24. Dans ce contexte, l’utilisation du poisson zèbre pour l’étude de la toxicité générale représente souvent le premier choix dans le domaine. En fait, comparé à d’autres tests sur les animaux, il peut être considéré comme une option peu coûteuse, car le poisson zèbre se développe rapidement et atteint le stade larvaire précoce environ 72 h à 13 jours après la fécondation21,28. Néanmoins, l’entretien d’un poisson zèbre nécessite des opérateurs bien formés et des conditions spécifiques, telles qu’un aquarium avec un système de circulation, capable d’aérer et de filtrer l’eau du système, pour maintenir la qualité globale; en outre, plusieurs couvercles et couvercles de drain sont nécessaires, car le poisson zèbre peut sauter, ainsi que des conditions d’éclairage spécifiques (14 h de lumière, 10 h d’obscurité), et les niveaux de pH doivent être vérifiés quotidiennement, entre autres29,30. Dans l’ensemble, ces considérations rendent les modèles de poisson-zèbre plus longs et plus coûteux que le modèle Artemia rapporté ici, car ces microcrustacés sont plus faciles à manipuler et viables pour la culture dans de grandes populations en utilisant des méthodes de laboratoire. Cela fait d’A. salina sans aucun doute l’un des outils de dépistage les plus utilisés, principalement utilisé pour tester la toxicité générale de différents échantillons, tels que les médicaments et les extraits de plantes médicinales1.
Dans le protocole, les nauplii d’A. salina ont été élevés, collectés et incubés avec des échantillons appropriés pendant 24 h, afin d’estimer le taux de mortalité des nauplii induit par chaque échantillon. Dans un premier temps, l’éclosion des œufs est effectuée dans un récipient de reproduction en forme d’entonnoir disponible dans le commerce, dans lequel un bulle vigoureux a été introduit (figure 2A). Cette aération forcée est nécessaire car elle permet à l’éclosion des artémias de se produire le plus efficacement possible. L’éclosion a lieu vers 24 h à 25 ± 3 °C, alors que jusqu’à 48 h pourrait être nécessaire à des températures plus basses. Une fois les œufs éclos, la pompe est éteinte pour permettre aux caisses d’œufs vides de flotter sur le dessus, tandis que les nauplii et les œufs non éclos sont facilement collectés en ouvrant le robinet de l’entonnoir en bas. Au cours de nos expériences, l’éclosion complète des œufs n’a jamais été réalisée, avec la présence conséquente de nauplii et d’œufs non matures dans la solution collectée. Pour cette raison, afin de séparer efficacement les deux formes d’Artemia, un équipement artisanal pour la migration des artémias est préparé (étape 1.2). Un récipient est rempli des organismes récoltés, puis recouvert de papier d’aluminium, tandis que l’autre récipient est exposé à la lumière directe d’une lampe. Dans ces conditions, les œufs non éclos ont tendance à s’installer, tandis que les nauplii vivants sont attirés par la lumière frappant le conteneur adjacent, favorisant la migration d’un côté à l’autre par la connexion du pont. Après 4 h, presque tous les nauplii vivants sont à l’intérieur du récipient exposés à la lumière et prêts à être collectés pour l’exécution du test. À ce stade, des portions de la solution d’eau salée, contenant dix à quinze nauplii, sont retirées et incubées avec chacun des échantillons à tester.
Dans ce travail, il a été démontré comment la méthode est efficace, économique et facile à réaliser. Cependant, certains points critiques doivent être reconnus lors de la réalisation de ce test.
Le test est généralement effectué avec de l’eau du robinet. En fonction de facteurs géographiques et physico-chimiques, l’eau du robinet présente une distribution de dureté différente, influençant la reproductibilité du test et, en particulier, l’étape d’éclosion des œufs. Pour la même raison, l’utilisation d’eau de mer pourrait influencer la reproductibilité de l’essai. La concentration variable de sel, la présence de contaminants, de microplastiques et d’autres corpuscules obligeraient l’opérateur à subir d’autres étapes, telles que des filtrations et d’autres types de purification, qui rendraient l’expérience plus complexe et moins facile à manipuler. Tout bien considéré, les conditions optimales doivent être établies en fonction des caractéristiques et de la disponibilité de l’eau du robinet, en particulier par une réglementation minutieuse de la quantité de sel artificiel ajoutée, qui crée un environnement approprié et sert également de nourriture aux nauplii.
De grandes variations de température peuvent entraîner une baisse des taux d’éclosion. En conséquence, de faibles niveaux d’Artemia vivant ont pu être observés, mélangés à un nombre élevé d’œufs non éclos. De toute évidence, de telles conditions ne conviennent pas au développement de tests fiables, de sorte qu’une climatisation contrôlée de la pièce ou l’utilisation d’incubateurs verticaux appropriés devraient être envisagées.
Une aération vigoureuse de la solution à l’intérieur du récipient à couver est nécessaire. La présence de bulles continues favorise le contact entre les œufs et accélère le processus d’éclosion.
La collecte d’œufs non éclos et de nauplii pendant la récolte peut fortement influencer la fiabilité du test. Cela est dû à la possibilité d’éclosion pendant l’incubation avec les échantillons. Dans ce cas, tous les nauplii n’auront pas été exposés pendant la même durée, avec des taux de mortalité erronés conséquents. Comme les œufs et les nauplii sont trop petits pour être séparés efficacement, des temps d’incubation plus longs dans le matériel d’éclosion ou l’utilisation de l’équipement de migration fait à la main sont nécessaires.
Chaque puits doit contenir 10 à 15 nauplii pour l’étape d’incubation, soigneusement comptés à l’aide d’un microscope binoculaire (grossissement 12x). La présence d’un trop grand nombre de nauplii dans le même puits peut rendre le comptage final difficile, voire erroné, en raison du chevauchement. D’autre part, de petites quantités de crevettes conduiraient à des résultats sans signification statistique.
Comme il est évident, la plupart des problèmes de cette méthode sont liés aux stades d’éclosion et de croissance, où une plus grande attention est requise pour éviter les problèmes de fiabilité. Même ainsi, la méthode peut tolérer des modifications, en particulier en ce qui concerne les points les plus critiques décrits ci-dessus. Bien entendu, lorsque l’un de ces paramètres est modifié, il peut être nécessaire de mener plusieurs tentatives pour optimiser la méthode d’origine. Par exemple, la modification de la température peut aider à contrôler la durée totale du test : augmenter la température jusqu’à 28-29 °C augmentera également le taux d’éclosion et accélérera l’ensemble du processus.
Certaines limites de l’essai biologique d’A. salina sont également liées à la stabilité des échantillons aux conditions et au temps d’essai. Le test ne peut être effectué qu’à l’aide d’échantillons stables à température ambiante et sous lumière visible. De plus, il faut tenir compte du fait que l’ensemble de la procédure dure au moins 4 jours et que si le taux d’éclosion est faible, le test pourrait nécessiter un jour supplémentaire pour l’étape d’éclosion.
Dans l’ensemble, dans cette étude, nous mettons en évidence deux exemples de l’application de l’évaluation générale de la toxicité par la méthode A. salina. La toxicité générale a été établie pour tous les échantillons testés. Les extraits de plantes de Plectranthus et du composé 5 n’ont montré aucune toxicité générale, tandis que les composés 1 à 4 se sont révélés modérément ou même très toxiques pour les artémias. En particulier, l’effet négatif des composés 1 et 2 sur Artemia a déjà été démontré par Sitarek et Matias par les essais MTT et SRB/MTT, respectivement31,32. Dans le même temps, les analogues benzoylés, les composés 3 et 4, présentent des valeurs de toxicité plus élevées que leurs précurseurs 1 et 2, soulignant que la fonctionnalisation de l’ester pourrait jouer un rôle important en termes de cytotoxicité, comme l’ont confirmé Garcia et al.33 pour le composé 4 dans la lignée cellulaire de cancer MDR du CPNPC humain. Cependant, d’autres tests sont nécessaires pour confirmer qu’une telle activité cytotoxique pourrait être exploitée dans le traitement du cancer. D’autre part, le dérivé 5, avec tous les extraits dosés, n’a montré aucune toxicité et apparaît comme le composé pur le plus prometteur de la série. Cependant, d’autres études pour évaluer l’activité biologique potentielle pour l’application cutanée sont nécessaires.
Ici, nous avons démontré comment l’utilisation de la méthode à base d’Artemia salina comme outil de dépistage pouvait permettre d’économiser du temps et de l’argent, par rapport à d’autres méthodologies connues. Il représente un moyen efficace et avantageux d’être exploité dans des contextes de toxicité préliminaire. Il peut être utilisé en présence d’échantillons différents et complexes, de drogues synthétiques et semi-synthétiques, ainsi que pour le fractionnement bioguidé d’extraits et d’échantillons de produits naturels.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts, financier ou autre.
Acknowledgments
En mémoire du professeur Amilcar Roberto.
Ce travail a été soutenu financièrement par la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) dans le cadre des projets UIDB/04567/2020 et UIDP/04567/2020 attribués au CBIOS et à la bourse de doctorat SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
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