Summary
Detta arbete syftar till att utvärdera och granska Artemia salina lethality bioassay procedure, även identifierad som saltlake räkor lethality assay. Denna enkla och billiga metod ger information om den allmänna toxiciteten (betraktas som en preliminär toxicitetsutvärdering) av prover, nämligen naturliga produkter.
Abstract
Naturprodukter har använts sedan antiken för att producera läkemedel. Numera finns det gott om kemoterapeutiska läkemedel som erhållits från naturliga källor och används mot en uppsjö av sjukdomar. Tyvärr, de flesta av dessa föreningar visar ofta systemisk toxicitet och negativa effekter. För att bättre kunna utvärdera toleransen hos utvalda potentiellt bioaktiva prover används vanligtvis saltlakeräkor (Artemia salina) som modell i dödlighetsstudier. A. salina-testet är baserat på förmågan hos de studerade bioaktiva föreningarna att döda mikrokräftdjuren i deras larvstadium (nauplii). Denna metod utgör en lämplig utgångspunkt för cytotoxicitetsstudier, liksom för allmän toxicitetsscreening av syntetiska, semisyntetiska och naturliga produkter. Det kan betraktas som en enkel, snabb och billig analys jämfört med många andra analyser (in vitro-celler eller jäststammar, zebrafisk, gnagare) som i allmänhet är lämpliga för ovannämnda ändamål; Dessutom kan det enkelt utföras även utan någon specifik träning. Sammantaget representerar A. salina-analys ett användbart verktyg för den preliminära toxicitetsutvärderingen av utvalda föreningar och den biostyrda fraktioneringen av naturliga produktextrakt.
Introduction
Naturliga produkter från växter, djur eller mikroorganismer har varit ett växande intresseområde genom åren för utvecklingen av nya bioaktiva molekyler på grund av deras varierande utbud av biologiska och farmakologiska aktiviteter1. De associerade biverkningarna, läkemedelsresistensen eller otillräcklig specificitet hos medlen, särskilt när de används som läkemedel mot cancer, representerar dock de viktigaste faktorerna som kan leda till ineffektiv behandling 1,2.
Under de senaste decennierna har flera vegetabiliska cytotoxiska medel upptäckts, några av dem används som cancerläkemedel 1,2,3. I detta sammanhang rapporteras paklitaxel som ett av de mest kända och mest aktiva kemoterapeutiska läkemedlen av naturligt ursprung 3,4. För närvarande uppskattas det att mer än 35% av alla läkemedel på marknaden härrör från eller är inspirerade av naturprodukter5. Den potentiella höga toxiciteten hos dessa föreningar kräver övervägande under alla studiefaser, eftersom olika typer av föroreningar eller till och med metaboliska komponenter i själva växten kan orsaka toxiska effekter. Av denna anledning bör farmakologiska och toxikologiska profiler göras i den preliminära fasen för att bedöma den biologiska aktiviteten och säkerheten hos nya potentiella växtbaserade behandlingar. För att utvärdera toxiciteten hos nya bioaktiva prover kan ryggradslösa djur betraktas som de bästa modellerna att studera. De kräver minimala etiska krav och tillåter preliminära in vitro-analyser för att prioritera de mest lovande produkterna för nästa testomgång på ryggradsdjur 1,6.
Vanligtvis känd som saltlake räkor, A. salina är ett litet halofilt ryggradslöst djur som tillhör släktet Artemia (familj Artemiidae, ordning Anostraca, subfylum Crustacea; Figur 1). I marina och akvatiska saltlösningsekosystem spelar saltlake räkor en viktig näringsmässig roll eftersom de livnär sig på mikroalger och är beståndsdelar i djurplankton som används för att mata fisk. Dessutom används deras larver (så kallade nauplii) i stor utsträckning vid bedömningen av allmän toxicitet under preliminära studier 1,3,7.
används ofta i dödlighetsstudier och är också en lämplig utgångspunkt för toxicitetsbedömningar genom att spåra toxiciteten hos potentiellt bioaktiva föreningar baserat på deras förmåga att döda nauplii som odlas i laboratoriet 1,8. Av denna anledning fick användningen av A. salina attraktion i allmänna toxicitetsstudier, eftersom det är en mycket effektiv och lättanvänd metod jämfört med andra tester på djurmodeller9.
På grund av deras enkla anatomi, lilla storlek och korta livscykel kan ett stort antal ryggradslösa djur studeras i ett enda experiment. Som sådan kombinerar de genetisk mottaglighet och lågkostnadskompatibilitet med storskaliga screeningar1. I detta sammanhang visar användningen av saltlake räkor i en allmän toxicitetsanalys flera fördelar, såsom snabb tillväxt (28-72 h behövs från kläckning till de första resultaten), kostnadseffektivitet och lång hållbarhet för kommersiella ägg, som kan användas året runt 3,10. Å andra sidan, eftersom ryggradslösa djur har ett primitivt organsystem och saknar ett adaptivt immunsystem, representerar de inte en perfekt och pålitlig modell för mänskliga celler1.
Det ger dock en preliminär utvärderingsmetod för den allmänna toxiciteten hos utvalda prover. Eftersom det används i stor utsträckning som en dödlighetsanalys kan det ge provisoriska indikationer om de toxiska effekterna av potentiella cancermedel. Det används ofta också för att få feedback om den allmänna toxiciteten hos föreningar som är utrustade med andra biologiska aktiviteter för vilka det är viktigt att visa lägsta möjliga dödlighet bland Artemia-räkorna .
I en pågående studie från vår grupp visade olika extrakt från Plectranthus-arter antioxidant och antimikrobiella aktiviteter (opublicerade resultat). Parallellt erhölls isolerade föreningar genom rening av extrakten och modifierades sedan kemiskt. Extrakten, rena föreningar och semisyntetiska derivat testades sedan med avseende på allmän toxicitet. I detta sammanhang syftar detta arbete till att ge en översikt över användningen av Artemia dödlighetsbioassay för utvärdering av allmän toxicitet och potentiell cytotoxisk aktivitet hos bioaktiva extrakt och isolerade föreningar från olika växter av släktet Plectranthus11.
Figur 1: Artemia salina under mikroskopet. Nykläckt nauplii av A. salina sett under mikroskopet (förstoring 12x). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av utrustning
- Skaffa kommersiellt tillgänglig kläckningsutrustning. Välj en lämplig plats för att ställa in kläckningsutrustningen (figur 2A). Placera den trattformade behållaren i det svarta stödet (ingår i uppsättningen) och vrid tratten i lämplig riktning för att se nivåmärket och kranen.
- För att göra handgjord migrationsutrustning, skär toppen av två 0,5 L (5,8 cm diameter) plastflaskor för att få en slutlig höjd på 12 cm. Skapa ett hål med en diameter på 1,5 cm på ena sidan på 7 cm från botten i varje flaska och sätt in ett 13 cm gummirör (1,3 cm yttre och 0,9 cm innerdiameter) mellan de två öppningarna. Försegla öppningarna med varmt lim (figur 2B) och låt torka i 15 minuter. Lägg flaskorna på en plan yta och fyll dem med vatten för att verifiera att det inte finns något läckage.
2. Beredning av konstgjord saltlösning
- Bered i en glasbägare en konstgjord saltlösning (saltlösningsräksalt) i en koncentration av 35 g / L. För att göra detta, tillsätt 28 g salt till 800 ml kranvatten enligt tillverkarens instruktioner. Blanda den med en omrörningsstav tills allt salt är ordentligt upplöst.
OBS: Justera volymen på den beredda saltlösningen efter storleken på de tillgängliga behållarna.
3. Beredning av prover
- Bered alla prover i ett mikrocentrifugrör genom att lösa upp en lämplig mängd extrakt (Plectranthus-extrakt , Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus ; och Pe- P. ecklonii) eller föreningarna 1-5 (två naturliga föreningar [1 och 2] erhållna från Plectranthus spp. och tre halvsyntetiska derivat [3, 4, 5]; Figur 3) i dimetylsulfoxid (DMSO)12, för att erhålla en slutlig koncentration på 10 mg/ml (om provet är vattenlösligt är det inte nödvändigt att använda DMSO).
- Späd 10 μl av varje prov (och DMSO för den negativa kontrollen) i ett nytt mikrocentrifugrör med 990 μl konstgjord saltlösning framställd i steg 2.1 för att erhålla en slutlig koncentration på 0,1 mg/ml.
- Bered en lösning av kaliumdikromat (K2Cr2O7) i destillerat vatten i en Erlenmeyerkolv i endragskåp, i en Erlenmeyerkolv, i destillerat vatten i en koncentration av 1 mg/ml13,14,15.
4. Saltlake räkor dödlighet bioassay
OBS: Denna analys är utvecklad från verk av flera författare med modifieringar 1,16,17,18,19.
- Fyll kläckkärlet med mediet berett i steg 2.1 upp till nivåmärket (500 ml) (figur 2C).
- Placera en sked (ca 0,75 g) saltlake räkor cyster i saltlösningen och stäng sedan behållaren. Placera en lampa (bordslampa, 40 W, 230 V, 50 Hz, med en LED-lampa på 8 W, 4 000 K, 830 lm) som pekar direkt mot utrustningen (figur 2A) och slå på den.
- Anslut luftleverantörssystemet (3 W-utgång, 50 Hz, 230 V) till kontakten placerad på toppen av utrustningen och slå på pumpen.
- Håll rumstemperaturen vid 25 ± 3 °C. Saltlake räkor cystor kläcker i den konstgjorda saltlösningen, under kraftig luftning, kontinuerlig belysning och stabil temperatur, efter 24 h till 48 h.
OBS: Alternativt kan en vertikal inkubator användas. - När äggen har kläckts, stäng av luftpumpen och vänta tills nauplii (som rör sig mot botten av tratten) är separerade från de tomma äggfodralen (flytande på toppen).
- För att separera de oskadade äggen från levande nauplii, öppna utloppskranen längst ner och töm innehållet i tratten i en av behållarna i behållaren för handgjord migrationsutrustning (beskrivs i steg 1.2). Se till att lösningen som innehåller nauplii och de återstående oskadade äggen ligger under rörets nivå. Tillsätt den återstående saltlösningen från steg 2.1 ovanför rörets höjd i den andra behållaren.
- Täck behållaren med nauplii och de återstående oskadade äggen med aluminiumfolie. Placera lampan på den andra behållaren med bara saltlösningen. Saltlakeräkan kommer att lockas av ljuset och migrera från en behållare till en annan (skördbehållare), vilket leder till effektiv separation mellan ägg (långsamt sedimenterade till botten) och levande Artemia.
- Placera sedan utrustningen i inkubatorn under samma förhållanden som används i steg 4.4 i 4 timmar (figur 2E). Samla 900 μl saltlösning innehållande 10 till 15 nauplii från skördebehållaren. Placera saltlösningen med nauplii i varje brunn på en 24-brunnsplatta (figur 2F); Alla prover testas i fyrdubbla prover.
- Tillsätt 100 μl var och en av de negativa kontrollerna (DMSO), den positiva kontrollen (K2Cr2O7, kaliumdikromat), den konstgjorda saltlösningen och vart och ett av proverna till respektive brunn (figur 2F)13,14.
OBS: Proverna i varje brunn kommer att ha en koncentration på 0,01 mg/ml. Den slutliga koncentrationen av den positiva kontrollen i saltlösning kommer att vara 0,1 mg / ml, för att vara säker på att alla nauplii i brunnen utsätts för den toxiska effekten av kaliumdikromat och dör. Den konstgjorda saltlösningen kommer att fungera som tom. - Inkubera plattan vid 25 ± 3 °C under belysning i 24 timmar (figur 2G). Efter 24 timmar registrerar du antalet döda larver (icke-rörliga nauplii i 5 s) i varje brunn under ett kikarmikroskop (12x)20 (figur 2H). Alternativt kan du använda en handlins.
- Tillsätt 100 μl kaliumdikromatlösning för att inducera de återstående levande larvernas död och vänta i 6 timmar. Räkna de totala döda larverna i varje brunn under ett mikroskop. Bestäm dödligheten enligt följande ekvation.
- Utför all analys i tre exemplar. Beräkna standardavvikelser (SD) och uttrycka resultaten som medelvärdet av tre oberoende experiment, var och en med interna kvadrater (n = 12), ± SD. Som nämnts av Meyer et al., betrakta råa extrakt och rena föreningar med LC50< 1,000 μg / ml som giftiga; Ta också hänsyn till att dödligheten för saltlake räkor är proportionell mot koncentrationen av de testade proverna21.
Figur 2: Artemia salina lethality bioassay method. A) Kommersiellt tillgänglig utrustning som används för kläckning av saltlakeräkcystor. B) Handgjord migrationsutrustning. C) Kläckkärl fyllt med saltlösning. D) Insamling av oskadade ägg och nauplii. E) Handgjord utrustning i kuvösen under migreringssteget. Behållaren långt från lampan ska täckas med aluminiumfolie; Men för en bättre bild av den inställda installationen här togs den bort; F) Skörd av Artemia i brunnar innan testet utförs. Föreningarna bör placeras enligt följande: - avser den negativa kontrollen (DMSO), + den positiva kontrollen (K2Cr2O7), salt till denkonstgjorda saltlösningen och 1 till 3 till proverna som ska testas (i detta fall föreningarna 1-3); G) Inkubation av 24-brunnsplattan som innehåller Artemia och de utvalda proverna. (H) Artemia räknas under kikarmikroskopet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Strukturer av utvalda föreningar. Struktur av föreningar 1-2, extraherade från Plectranthus-arter , och föreningar 3-5, erhållna genom halvsyntes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den allmänna toxiciteten hos vissa naturliga produkter som nyligen studerats av vår grupp utvärderades genom bioassay av saltlake räkor. Fyra extrakt (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; och Pe- P. ecklonii) från Plectranthus släkte, kända för sin antioxidantaktivitet (opublicerade resultat), testades. Dessutom två naturliga föreningar (1 och 2) erhållna från Plectranthus spp., och tre halvsyntetiska derivat (3, 4, 5; Figur 3), som alla beskrivs i ett annat arbete3, undersöktes också. Häri redovisas deras preliminära utvärdering med avseende på potentiell cytotoxisk aktivitet.
Alla testade extrakt visade mycket uppmuntrande resultat, med mycket låg dödlighet, jämförbar med dem som registrerats för blindprovet (saltlösningen) och den negativa kontrollen (DMSO; Figur 4). Omvänt, bland de rena föreningarna 1-5, visade endast derivat 5 en låg dödlighet (2,30% vid en koncentration av 100 ppm) utan allmän toxicitet (Figur 5).
Figur 4: Dödlighet av extrakt på Artemia salina. Dödlighet av A. salina (%) efter 24 timmars exponering för fyra metanolextrakt av Plectranthus spp., vid 0,1 mg/ml (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; Pe- P. ecklonii). Alla extrakt var acceptabla när det gäller allmän toxicitet med hjälp av denna analys. Salt motsvarar saltlösningen (blank); K2Cr2O7 användes som positiv kontroll och DMSO som negativ kontroll. Resultaten uttrycktes som medelvärdet av tre oberoende experiment, var och en med interna kvadrater (n = 12) ± SD. Jämförelser utfördes inom grupper genom variansanalys, med hjälp av envägs ANOVA med Dunnetts eftertest. Signifikanta skillnader mellan kontroll- och experimentgrupper bedömdes med hjälp av en kommersiell statistisk analysprogramvara. En sannolikhetsnivå p < 0,01 ansågs indikera statistisk signifikans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Dödlighet av föreningar på Artemia salina. Dödlighet av A. salina (%) efter 24 timmars exponering för fem rena föreningar vid 0,1 mg / ml (1 och 2 är naturliga produkter och 3-5 är derivat framställda från 1 och 2). Det är uppenbart att endast 5 visar mycket begränsad toxicitet med hjälp av denna analys. Salt motsvarar saltlösningen (blank); K2Cr2O7 användes som positiv kontroll och DMSO som negativ kontroll. Resultaten uttrycktes som medelvärdet av tre oberoende experiment, var och en med interna kvadrater (n = 12) ± SD. Jämförelser utfördes inom grupper genom variansanalys, med hjälp av envägs ANOVA med Dunnetts eftertest. Signifikanta skillnader mellan kontroll- och experimentgrupper bedömdes med hjälp av en kommersiell statistisk analysprogramvara. En sannolikhetsnivå p < 0,01 ansågs indikera statistisk signifikans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Naturprodukterna 1 och 2 visade måttlig dödlighet (36,68% respektive 30,95% vid 100 ppm), medan semisyntetiska derivat 3 och 4, erhållna från 1 respektive 2, var giftigare än den ursprungliga ställningen (64,02% respektive 36,64% vid 100 ppm; Figur 5).
Övergripande data tyder på att alla testade extrakt, kända för sin antioxidantaktivitet och inte visar någon allmän toxicitet, kan betraktas som kandidater för ytterligare in vitro-aktivitets - och toxicitetsstudier på utvalda cellinjer. Om frånvaron av toxicitet också demonstreras i kutana modeller kan utvecklingen av nya bioaktiva produkter för kutan applicering utföras. Å andra sidan kan de toxiska effekterna som observerats för föreningar 1-4 göra dem till lämpliga kandidater för ytterligare utvärderingar som cancerläkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under de senaste åren har forskarsamhället ökat sin uppmärksamhet mot alternativa modeller för toxicitetsundersökningar21. Förutom A. salina lethality bioassay utförs vanligtvis andra metoder för utvärdering av provtolerans och inkluderar ryggradsdjurs bioassays (såsom gnagare), ryggradslösa djur (såsom zebrafisk), in vitro-metoder med jäststammar eller celler och in silico-metoder 22,23,24,25 . Alla dessa metoder har tydliga fördelar och nackdelar, med hänsyn till spenderade pengar och tid, reproducerbarhet av resultaten och vilken typ av prov som ska analyseras. Till exempel representerar in silico-metoderna en standardiserad lågkostnadsmetod som kräver minimal utrustning. Icke desto mindre, när sådana studier är inriktade på ett enda mål, erhålls resultat av dålig kvalitet, vilket gör detta alternativ utanför ramen för preliminära screeningar, som vi presenterar i denna studie25,26. När det gäller mikroorganismer anses Saccharomyces cerevisiae vara en av de mest använda modellerna för utvärdering av giftiga föreningar23. Faktum är att användningen av in vitro-jäst i allmänhet är snabb och enkel att utföra; Det kan dock vara dyrt, eftersom det kräver specifika kemiska produkter och utrustning, och visar låg känslighet för minimala doser av cytotoxiska föreningar27. I ett alternativt tillvägagångssätt kan mänskliga celler användas på ett snabbt, enkelt och billigt sätt. Ändå kan dessa inte representera en hel organism; Således beaktas inte interaktioner mellan olika celltyper och systemiska störningar som äger rum under fysiologiska förhållanden på lämpligt sätt25,26. Å andra sidan har in vivo-analyser den stora fördelen att ta hänsyn till hela organismen, men djurmodeller (som gnagare) kräver mer tid för analysutförandet, är dyrare och innebär komplexa etiska överväganden25. Omvänt är in vivo-analyser som använder vattenlevande organismer för toxicitetsscreening i allmänhet väl accepterade, även med tanke på att användningen av marina ryggradslösa djur genomgår mindre etiska problem, och metoden är lätt att utföra, snabb och billig21,24. I detta sammanhang representerar användningen av zebrafisk för studier av allmän toxicitet ofta det första valet inom området. I själva verket, jämfört med andra djurförsök, kan det betraktas som ett billigt alternativ, eftersom zebrafisk utvecklas snabbt och når det tidiga larvstadiet runt 72 h till 13 dagar efter befruktning21,28. Icke desto mindre kräver underhåll av en zebrafisk välutbildade operatörer och specifika förhållanden, såsom en akvarium med ett cirkulationssystem, som kan lufta och filtrera systemets vatten, för att upprätthålla den övergripande kvaliteten; Dessutom är flera lock och avloppslock nödvändiga, eftersom zebrafisk kan hoppa, liksom specifika ljusförhållanden (14 h ljus, 10 h mörk) och pH-nivåer måste kontrolleras dagligen, bland annat29,30. Sammantaget gör dessa överväganden zebrafiskmodeller mer tidskrävande och dyrare än Artemia-modellen som rapporteras här, eftersom dessa mikrokräftdjur är lättare att hantera och livskraftiga för odling i stora populationer med laboratoriemetoder. Detta gör A. salina utan tvekan till ett av de mest använda screeningverktygen, som huvudsakligen används för att testa den allmänna toxiciteten hos olika prover, såsom läkemedel och medicinska växtextrakt1.
I protokollet har A. salina nauplii fötts upp, samlats in och inkuberats med lämpliga prover i 24 timmar för att uppskatta naupliidödligheten som induceras av varje prov. I det första steget utförs äggkläckningen i ett kommersiellt tillgängligt trattformat avelsfartyg, där kraftig bubbling infördes (figur 2A). Denna tvingade luftning är nödvändig eftersom den gör att saltlakeräkkläckningen kan ske så framgångsrikt som möjligt. Kläckningen sker vid cirka 24 timmar vid 25 ± 3 °C, medan upp till 48 timmar kan vara nödvändig vid lägre temperaturer. När äggen kläcks stängs pumpen av så att de tomma äggfodralen kan flyta på toppen, medan nauplii och oskadade ägg lätt samlas upp genom att öppna trattkranen längst ner. Under våra experiment uppnåddes aldrig fullständig äggkläckning, med därav följande närvaro av nauplii och icke-mogna ägg i den uppsamlade lösningen. För att effektivt separera de två formerna av Artemia förbereds därför en handgjord utrustning för migration av saltlake räkor (steg 1.2). En behållare fylls med de skördade organismerna och täcks sedan med aluminiumfolie, medan den andra mottagaren utsätts för ett lampas direkta ljus. Under dessa förhållanden tenderar de oskadade äggen att slå sig ner, medan de levande nauplii lockas av ljuset som träffar den intilliggande behållaren, vilket gynnar migrationen från ena sidan till den andra genom broanslutningen. Efter 4 h är nästan alla levande nauplii inuti behållaren utsatt för ljuset och redo att samlas in för utförandet av analysen. I detta skede avlägsnas delar av saltvattenlösningen, innehållande tio till femton nauplii, och inkuberas med vart och ett av de prover som skall testas.
I detta arbete har det visat sig hur metoden är effektiv, ekonomisk och enkel att genomföra. Vissa kritiska punkter bör dock erkännas när du utför denna analys.
Analysen utförs vanligtvis med kranvatten. Beroende på geografiska och fysikalisk-kemiska faktorer uppvisar kranvatten olika hårdhetsfördelning, vilket påverkar analysens reproducerbarhet och i synnerhet äggkläckningssteget. Av samma anledning kan användningen av havsvatten påverka testets reproducerbarhet. Den varierande saltkoncentrationen, närvaron av föroreningar, mikroplaster och andra kroppar skulle tvinga operatören att genomgå ytterligare steg, såsom filtreringar och andra typer av rening, som skulle göra experimentet mer komplext och mindre lätt att hantera. Sammantaget bör optimala förhållanden lösas baserat på kranvattnets egenskaper och tillgänglighet, särskilt genom en noggrann reglering av mängden tillsatt artificiellt salt, vilket skapar en lämplig miljö och fungerar som näring för nauplii också.
Stora temperaturvariationer kan resultera i lägre luckhastigheter. Som en konsekvens kunde låga nivåer av levande Artemia observeras, blandat med ett stort antal oskadade ägg. Det är uppenbart att sådana förhållanden inte är lämpliga för utveckling av tillförlitliga analyser, så en kontrollerad klimatisering av rummet eller användningen av lämpliga vertikala inkubatorer bör övervägas.
Kraftig luftning av lösningen i kläckningskärlet krävs. Närvaron av kontinuerlig bubbling gynnar kontakten mellan ägg och påskyndar kläckningsprocessen.
Att samla både oskadade ägg och nauplii under skörden kan starkt påverka analysens tillförlitlighet. Detta beror på möjligheten att kläcka under inkubationen med proverna. I det här fallet kommer inte alla nauplii att ha exponerats under samma tid, med därmed felaktiga dödlighetstal. Eftersom ägg och nauplii är för små för att kunna separeras effektivt behövs högre inkubationstider i kläckningsutrustningen eller användningen av den handgjorda migrationsutrustningen.
Varje brunn ska innehålla 10-15 nauplii för inkubationssteget, noggrant räknat med användning av ett binokulärt mikroskop (12x förstoring). Närvaron av för många nauplii i samma brunn kan göra den slutliga räkningen svår, eller till och med felaktig, på grund av överlappning. Å andra sidan skulle små mängder räkor leda till resultat utan statistisk signifikans.
Som det är uppenbart är de flesta problemen med denna metod relaterade till kläcknings- och tillväxtstadierna, där mer uppmärksamhet krävs för att undvika tillförlitlighetsproblem. Ändå kan metoden tolerera modifieringar, särskilt i förhållande till de mest kritiska punkterna som beskrivs ovan. Naturligtvis, när en av dessa parametrar ändras, kan det vara nödvändigt att genomföra flera försök att optimera den ursprungliga metoden. Till exempel kan ändring av temperaturen hjälpa till att kontrollera den totala tiden för analysen: att öka temperaturen upp till 28-29 ° C kommer också att öka luckhastigheten och påskynda hela processen.
Vissa begränsningar av A. salina bioassay är också relaterade till provernas stabilitet till testförhållandena och tiden. Analysen kan endast utföras med hjälp av prover som är stabila vid rumstemperatur och under synligt ljus. Dessutom måste man ta hänsyn till att hela proceduren varar minst 4 dagar, och om luckhastigheten är låg kan analysen behöva en extra dag för kläckningssteget.
Sammantaget lyfter vi i denna studie fram två exempel på tillämpningen av den allmänna toxicitetsutvärderingen genom A. salina-metoden. Allmän toxicitet har fastställts för alla testade prover. Extrakt från Plectranthus växter och förening 5 visade ingen allmän toxicitet, medan föreningar 1-4 visade sig vara måttligt eller till och med mycket giftiga på saltlake räkor. I synnerhet har den negativa effekten av föreningarna 1 och 2 på Artemia tidigare påvisats av Sitarek och Matias genom MTT- respektive SRB/MTT-analyser31,32. Samtidigt visar de bensoylerade analogerna, föreningarna 3 och 4, högre toxicitetsvärden än deras prekursorer 1 och 2, vilket belyser att esterfunktionaliseringen kan ha en viktig roll när det gäller cytotoxicitet, vilket bekräftats för förening 4 i human NSCLC MDR-cancercellinje av Garcia et al.33. Andra analyser behövs dock för att bekräfta att en sådan cytotoxisk aktivitet kan utnyttjas vid cancerbehandling. Å andra sidan visade derivat 5, tillsammans med alla analyserade extrakt, ingen toxicitet och framstår som den mest lovande rena föreningen i serien. Ytterligare studier för att utvärdera den potentiella biologiska aktiviteten för kutan applicering behövs dock.
Här visade vi hur användningen av Artemia salina-baserade metod som screeningverktyg kan göra det möjligt att spara tid och pengar, jämfört med andra kända metoder. Det representerar ett effektivt och fördelaktigt sätt att utnyttjas i preliminära toxicitetssammanhang. Det kan användas i närvaro av olika och komplexa prover, syntetiska och halvsyntetiska läkemedel, liksom för biostyrd fraktionering av naturliga produktextrakt och prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter, ekonomiska eller på annat sätt.
Acknowledgments
Till minne av professor Amilcar Roberto.
Detta arbete fick ekonomiskt stöd av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) inom ramen för projekten UIDB/04567/2020 och UIDP/04567/2020 som tillskrivs CBIOS och doktorandbidrag SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H.
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
