Summary
Dit werk is gericht op het evalueren en herzien van de Artemia salina letaliteit bioassay procedure, ook geïdentificeerd als pekel garnalen letaliteit ashality assay. Deze eenvoudige en goedkope methode geeft informatie over de algemene toxiciteit (beschouwd als een voorlopige toxiciteitsevaluatie) van monsters, namelijk natuurlijke producten.
Abstract
Natuurlijke producten worden al sinds de oudheid gebruikt om medicijnen te produceren. Tegenwoordig zijn er tal van chemotherapeutische geneesmiddelen verkregen uit natuurlijke bronnen en gebruikt tegen een overvloed aan ziekten. Helaas vertonen de meeste van deze verbindingen vaak systemische toxiciteit en bijwerkingen. Om de verdraagbaarheid van geselecteerde potentieel bioactieve monsters beter te evalueren, worden pekelgarnalen (Artemia salina) over het algemeen gebruikt als model in letaliteitsstudies. De A. salina-test is gebaseerd op het vermogen van de bestudeerde bioactieve stoffen om de microschaaldieren in hun larvale stadium (nauplii) te doden. Deze methode vormt een handig startpunt voor cytotoxiciteitsstudies, evenals voor de algemene toxiciteitsscreening van synthetische, semisynthetische en natuurlijke producten. Het kan worden beschouwd als een eenvoudige, snelle en goedkope test, vergeleken met veel andere assays (in vitro cellen of giststammen, zebravissen, knaagdieren) die over het algemeen geschikt zijn voor de bovengenoemde doeleinden; bovendien kan het gemakkelijk worden uitgevoerd, zelfs zonder specifieke training. Over het algemeen is de A. salina-test een nuttig hulpmiddel voor de voorlopige toxiciteitsevaluatie van geselecteerde verbindingen en de biogeleide fractionering van extracten van natuurlijke producten.
Introduction
Natuurlijke producten van planten, dieren of micro-organismen zijn in de loop der jaren een groeiend interessegebied geweest in de ontwikkeling van nieuwe bioactieve moleculen vanwege hun gevarieerde scala aan biologische en farmacologische activiteiten1. De bijbehorende bijwerkingen, medicijnresistentie of onvoldoende specificiteit van de middelen, vooral wanneer ze worden gebruikt als geneesmiddelen tegen kanker, vertegenwoordigen echter de belangrijkste factoren die kunnen leiden tot een ineffectieve behandeling 1,2.
In de afgelopen decennia zijn verschillende van planten afgeleide cytotoxische middelen ontdekt, waarvan sommige worden gebruikt als middelen tegen kanker 1,2,3. In deze context wordt paclitaxel gerapporteerd als een van de bekendste en meest actieve chemotherapeutische geneesmiddelen van natuurlijke oorsprong 3,4. Momenteel wordt geschat dat meer dan 35% van alle geneesmiddelen op de markt afkomstig is van of geïnspireerd is op natuurlijke producten5. De potentiële hoge toxiciteit van deze verbindingen vereist aandacht tijdens alle onderzoeksfasen, omdat verschillende soorten verontreinigingen of zelfs metabole componenten van de plant zelf toxische effecten kunnen veroorzaken. Daarom moeten in de voorbereidende fase farmacologische en toxicologische profielen worden uitgevoerd om de biologische activiteit en veiligheid van nieuwe potentiële plantaardige behandelingen te beoordelen. Om de toxiciteit van nieuwe bioactieve monsters te evalueren, kunnen ongewervelde dieren worden beschouwd als de beste modellen om te bestuderen. Ze eisen minimale ethische vereisten en staan voorlopige in vitro assays toe, om prioriteit te geven aan de meest veelbelovende producten voor de volgende testronde bij gewervelde dieren 1,6.
A. salina, algemeen bekend als pekelgarnalen, is een klein halofiel ongewervelde die behoort tot het geslacht Artemia (familie Artemiidae, orde Anostraca, subphylum Crustacea; Figuur 1). In mariene en aquatische zoute ecosystemen spelen pekelgarnalen een belangrijke voedingsrol omdat ze zich voeden met microalgen en bestanddelen zijn van het zoöplankton dat wordt gebruikt om vissen te voeden. Bovendien worden hun larven (bekend als nauplii) veel gebruikt bij de beoordeling van algemene toxiciteit tijdens voorbereidende studies 1,3,7.
Artemia spp. worden veel gebruikt in letaliteitsstudies en zijn ook een handig startpunt voor toxiciteitsbeoordelingen, door de toxiciteit van potentieel bioactieve stoffen te volgen op basis van hun vermogen om nauplii te doden die in het laboratorium zijn gekweekt 1,8. Om deze reden heeft het gebruik van A. salina aantrekkingskracht gewonnen in algemene toxiciteitsstudies, omdat het een zeer efficiënte en gebruiksvriendelijke methode is, in vergelijking met andere tests op diermodellen9.
Vanwege hun eenvoudige anatomie, kleine omvang en korte levenscyclus kan een groot aantal ongewervelde dieren in één experiment worden bestudeerd. Als zodanig combineren ze genetische aansprakelijkheid en goedkope compatibiliteit met grootschalige screenings1. In deze context toont het gebruik van pekelgarnalen in een algemene toxiciteitstest verschillende voordelen, zoals snelle groei (28-72 uur is nodig vanaf het uitkomen tot de eerste resultaten), kosteneffectiviteit en lange houdbaarheid van commerciële eieren, die het hele jaar door kunnen worden gebruikt 3,10. Aan de andere kant, omdat ongewervelde dieren een primitief orgaansysteem hebben en geen adaptief immuunsysteem hebben, vertegenwoordigen ze geen perfect en betrouwbaar model voor menselijke cellen1.
Het biedt echter een voorlopige evaluatiemethode voor de algemene toxiciteit van geselecteerde monsters. Omdat het veel wordt gebruikt als een letaliteitstest, kan het voorlopige aanwijzingen geven over de toxische effecten van potentiële middelen tegen kanker. Het wordt vaak ook gebruikt om feedback te krijgen over de algemene toxiciteit van verbindingen die zijn begiftigd met andere biologische activiteiten waarvoor het essentieel is om het laagst mogelijke sterftecijfer onder de Artemia-garnalen aan te tonen.
In een lopende studie van onze groep vertoonden verschillende extracten van Plectranthus-soorten antioxiderende en antimicrobiële activiteiten (ongepubliceerde resultaten). Tegelijkertijd werden geïsoleerde verbindingen verkregen door zuivering van de extracten en vervolgens chemisch gemodificeerd. De extracten, zuivere verbindingen en semisynthetische derivaten werden vervolgens getest in termen van algemene toxiciteit. In deze context beoogt dit werk een overzicht te geven van het gebruik van de Artemia letaliteitsbioassay voor de evaluatie van algemene toxiciteit en potentiële cytotoxische activiteit van bioactieve extracten en geïsoleerde verbindingen van verschillende planten van het geslacht Plectranthus11.
Figuur 1: Artemia salina onder de microscoop. Nieuw uitgekomen nauplii van A. salina zoals gezien onder de microscoop (vergroting 12x). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de apparatuur
- Koop in de handel verkrijgbare broedapparatuur. Selecteer een geschikte plaats om de broedapparatuur in te stellen (figuur 2A). Plaats de trechtervormige container in de zwarte steun (inbegrepen in de set) en draai de trechter in een geschikte richting om de niveaumarkering en de tik te zien.
- Om handgemaakte migratieapparatuur te maken, snijdt u de bovenkant van twee plastic flessen met een diameter van 0,5 l (5,8 cm) om een uiteindelijke hoogte van 12 cm te verkrijgen. Maak een gat van 1,5 cm diameter aan één kant op 7 cm van de bodem in elke fles en steek een rubberen buis van 13 cm (1,3 cm buitendiameter en 0,9 cm binnendiameter) tussen de twee openingen. Sluit de openingen af met hete lijm (figuur 2B) en laat 15 minuten drogen; zet de flessen op een vlakke ondergrond en vul ze met water om te controleren of er geen lekkage is.
2. Bereiding van een kunstmatige zoutoplossing
- Bereid in een glazen bekerglas een kunstmatige zoutoplossing (pekelgarnalenzout) in een concentratie van 35 g/L. Voeg hiervoor 28 g van het zout toe aan 800 ml kraanwater, volgens de instructies van de fabrikant. Meng het met een roerstaaf tot al het zout goed is opgelost.
OPMERKING: Pas het volume van de bereide zoutoplossing aan op basis van de grootte van de beschikbare containers.
3. Monstervoorbereiding
- Bereid alle monsters in een microcentrifugebuis door een geschikte hoeveelheid extracten op te lossen (Plectranthus-extracten , Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; en Pe- P. ecklonii) of verbindingen 1-5 (twee natuurlijke verbindingen [1 en 2] verkregen uit Plectranthus spp. en drie semi-synthetische derivaten [3, 4, 5]; Figuur 3) in dimethylsulfoxide (DMSO)12, om een eindconcentratie van 10 mg/ml te verkrijgen (als het monster in water oplosbaar is, is het gebruik van DMSO niet nodig).
- Verdun 10 μL van elk monster (en DMSO voor de negatieve controle) in een nieuwe microcentrifugebuis met behulp van 990 μL kunstmatige zoutoplossing bereid in stap 2.1, om een eindconcentratie van 0,1 mg/ml te verkrijgen.
- Bereid onder een zuurkast in een erlenmeyer een oplossing van kaliumdichromaat (K 2Cr2O7) in gedestilleerd water in een concentratie van 1 mg/ml 13,14,15.
4. Pekelgarnalen letaliteit bioassay
OPMERKING: Deze test is ontwikkeld op basis van het werk van verschillende auteurs met wijzigingen 1,16,17,18,19.
- Vul het broedvat met het medium dat in stap 2.1 is voorbereid tot het niveaumerk (500 ml) (figuur 2C).
- Plaats een lepel (ongeveer 0,75 g) pekelgarnalencysten in de zoutoplossing en sluit vervolgens de container. Plaats een lamp (tafellamp, 40 W, 230 V, 50 Hz, met een LED-lamp van 8 W, 4.000 K, 830 lm) die rechtstreeks naar de apparatuur wijst (figuur 2A) en schakel deze in.
- Bevestig het luchttoevoersysteem (3 W uitgang, 50 Hz, 230 V) aan de connector die aan de bovenkant van de apparatuur is geplaatst en schakel de pomp in.
- Houd de kamertemperatuur op 25 ± 3 °C. Pekelgarnalencysten komen uit in de kunstmatige zoutoplossing, onder krachtige beluchting, continue verlichting en stabiele temperatuur, na 24 uur tot 48 uur.
OPMERKING: Als alternatief kan een verticale incubator worden gebruikt. - Zodra de eieren zijn uitgekomen, zet u de luchtpomp uit en wacht u tot de nauplii (die naar de onderkant van de trechter beweegt) is gescheiden van de lege eierdozen (drijvend aan de bovenkant).
- Om de niet-gehate eieren van levende nauplii te scheiden, opent u de uitlaatkraan aan de onderkant en ontlaadt u de inhoud van de trechter in een van de containers van de handgemaakte container voor migratieapparatuur (beschreven in stap 1.2). Zorg ervoor dat de oplossing die de nauplii en de resterende niet-gehate eieren bevat, zich onder het niveau van de buis bevindt. Voeg in de tweede container de resterende zoutoplossing uit stap 2.1 boven de hoogte van de buis toe.
- Bedek de container met de nauplii en de resterende niet-gehate eieren met aluminiumfolie. Plaats de lamp op de tweede container met alleen de zoutoplossing. De pekelgarnalen worden aangetrokken door het licht en migreren van de ene container naar de andere (oogstcontainer), wat leidt tot een efficiënte scheiding tussen eieren (langzaam bezinkt naar de bodem) en levende Artemia.
- Plaats de apparatuur vervolgens in de incubator onder dezelfde omstandigheden als in stap 4.4 gedurende 4 uur (figuur 2E). Verzamel uit de oogstcontainer 900 μL zoutoplossing met 10 tot 15 nauplii. Plaats de zoutoplossing met nauplii in elk putje van een 24-wellsplaat (figuur 2F); alle monsters worden getest in quadruplicaten.
- Voeg 100 μL elk van de negatieve controle (DMSO), de positieve controle (K2Cr2O7, kaliumdichromaat), de kunstmatige zoutoplossing en elk van de monsters toe aan de respectieve put (figuur 2F)13,14.
OPMERKING: De monsters in elke put zullen in een concentratie van 0,01 mg / ml zijn. De uiteindelijke concentratie van de positieve controle in zoutoplossing zal 0,1 mg / ml zijn, om er zeker van te zijn dat alle nauplii in de put worden blootgesteld aan het toxische effect van kaliumdichromaat en sterven. De kunstmatige zoutoplossing zal als blanco werken. - Incubeer de plaat bij 25 ± 3 °C onder verlichting gedurende 24 uur (figuur 2G). Registreer na 24 uur het aantal dode larven (niet-mobiele nauplii gedurende 5 s) in elke put onder een binoculaire microscoop (12x)20 (figuur 2H). U kunt ook een handlens gebruiken.
- Voeg 100 μL kaliumdichromaatoplossing toe om de dood van de resterende levende larven te induceren en wacht tot 6 uur. Tel de totale dode larven in elke put onder een microscoop. Bepaal het sterftecijfer volgens de volgende vergelijking.
- Voer alle testen in drievoud uit. Bereken standaarddeviaties (SD) en druk de resultaten uit als het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten, elk met interne quadruplicaten (n = 12), ± SD. Zoals vermeld door Meyer et al., beschouw ruwe extracten en zuivere verbindingen met LC50< 1.000 μg / ml als giftig; houd er ook rekening mee dat het sterftecijfer van pekelgarnalen evenredig is met de concentratie van de geteste monsters21.
Figuur 2: Artemia salina lethality bioassay methode. (A) In de handel verkrijgbare apparatuur voor het uitkomen van pekelgarnalencysten; B) handgemaakte migratieapparatuur; c) broedvat gevuld met zoutoplossing; D) verzameling van niet-gehate eieren en nauplii; (E) Handgemaakte apparatuur in de incubator tijdens de migratiestap. De container ver van de lamp moet worden bedekt met aluminiumfolie; voor een beter zicht op de ingestelde installatie hier werd deze echter verwijderd; (F) Het oogsten van Artemia in putten voorafgaand aan het uitvoeren van de test. De verbindingen moeten worden geplaatst zoals aangegeven: - verwijst naar de negatieve controle (DMSO), + naar de positieve controle (K2Cr2O7), zout naar de kunstmatige zoutoplossing en 1 tot 3 naar de te testen monsters (in dit geval verbindingen 1-3); G) Incubatie van de 24-wellsplaat met Artemia en de geselecteerde monsters; (H) Artemia telling onder de binoculaire microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Structuren van geselecteerde verbindingen. Structuur van verbindingen 1-2, geëxtraheerd uit Plectranthus-soorten , en verbindingen 3-5, verkregen door semi-synthese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De algemene toxiciteit van sommige natuurlijke producten die onlangs door onze groep zijn bestudeerd, werd geëvalueerd door middel van de pekelgarnalen letaliteitsbioassay. Vier extracten (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; PC- P. cylindraceus; en Pe-P. ecklonii) uit het geslacht Plectranthus , bekend om hun antioxiderende activiteit (ongepubliceerde resultaten), werden getest. Daarnaast twee natuurlijke verbindingen (1 en 2) verkregen uit Plectranthus spp., en drie semi-synthetische derivaten (3, 4, 5; Figuur 3), allemaal beschreven in een ander werk3, werden ook onderzocht. Hierin wordt hun voorlopige evaluatie in termen van potentiële cytotoxische activiteit gerapporteerd.
Alle geteste extracten lieten zeer bemoedigende resultaten zien, met zeer lage sterftecijfers, vergelijkbaar met die geregistreerd voor de blanco (zoutoplossing) en de negatieve controle (DMSO; Figuur 4). Omgekeerd vertoonde van de zuivere verbindingen 1-5 alleen derivaat 5 een laag sterftecijfer (2,30% bij een concentratie van 100 ppm) zonder algemene toxiciteit (figuur 5).
Figuur 4: Letaliteit van extracten op Artemia salina. Sterftecijfer van A. salina (%) na blootstelling van 24 uur aan vier methanolische extracten van Plectranthus spp., bij 0,1 mg/ml ( Pa-P. ambigerus; Pb- P. barbatus; PC- P. cylindraceus; Pe- P. ecklonii). Alle extracten waren aanvaardbaar in termen van algemene toxiciteit met behulp van deze test. Zout komt overeen met de zoutoplossing (blanco); K2Cr2O7 werd gebruikt als de positieve controle en DMSO als de negatieve controle. De resultaten werden uitgedrukt als het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten, elk met interne quadruplicaten (n = 12) ± SD. Vergelijkingen werden uitgevoerd binnen groepen door de variantieanalyse, met behulp van de eenrichtings-ANOVA met dunnett's post-test. Significante verschillen tussen controle- en experimentele groepen werden beoordeeld met behulp van een commerciële statistische analysesoftware. Een waarschijnlijkheidsniveau p < 0,01 werd beschouwd als een indicatie van statistische significantie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Letaliteit van verbindingen op Artemia salina. Sterftecijfer van A. salina (%) na 24 uur blootstelling aan vijf zuivere verbindingen bij 0,1 mg / ml (1 en 2 zijn natuurlijke producten en 3-5 zijn derivaten bereid uit 1 en 2). Het is duidelijk dat slechts 5 zeer beperkte toxiciteit vertoont met behulp van deze test. Zout komt overeen met de zoutoplossing (blanco); K2Cr2O7 werd gebruikt als de positieve controle en DMSO als de negatieve controle. De resultaten werden uitgedrukt als het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten, elk met interne quadruplicaten (n = 12) ± SD. Vergelijkingen werden uitgevoerd binnen groepen door de variantieanalyse, met behulp van de eenrichtings-ANOVA met dunnett's post-test. Significante verschillen tussen controle- en experimentele groepen werden beoordeeld met behulp van een commerciële statistische analysesoftware. Een waarschijnlijkheidsniveau p < 0,01 werd beschouwd als een indicatie van statistische significantie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Natuurlijke producten 1 en 2 vertoonden matige letaliteit (respectievelijk 36,68% en 30,95% bij 100 ppm), terwijl semisynthetische derivaten 3 en 4, verkregen uit respectievelijk 1 en 2, giftiger waren dan de oorspronkelijke steiger (respectievelijk 64,02% en 36,64% bij 100 ppm; Figuur 5).
Algemene gegevens suggereerden dat alle geteste extracten, bekend om hun antioxiderende activiteit en die geen algemene toxiciteit vertonen, kunnen worden beschouwd als kandidaten voor verdere in vitro activiteits- en toxiciteitsstudies op geselecteerde cellijnen. Als de afwezigheid van toxiciteit ook wordt aangetoond in cutane modellen, kan de ontwikkeling van nieuwe bioactieve producten voor cutane toepassing worden uitgevoerd. Aan de andere kant kunnen de toxische effecten die worden waargenomen voor verbindingen 1-4 hen geschikte kandidaten maken voor aanvullende evaluaties als middelen tegen kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de afgelopen jaren heeft de wetenschappelijke gemeenschap haar aandacht voor alternatieve modellen voor toxiciteitsscreenings vergroot21. Naast A. salina letaliteit bioassay, worden andere methoden meestal uitgevoerd voor de evaluatie van de verdraagbaarheid van monsters en omvatten gewervelde bioassays (zoals knaagdieren), ongewervelde dieren (zoals zebravissen), in vitro methoden met behulp van giststammen of cellen, en in silico-methoden 22,23,24,25 . Al deze methoden hebben duidelijke voor- en nadelen, rekening houdend met besteed geld en tijd, reproduceerbaarheid van de resultaten en het type monster dat moet worden geanalyseerd. De in silico-benaderingen vertegenwoordigen bijvoorbeeld een gestandaardiseerde goedkope methodologie, waarvoor minimale apparatuur nodig is. Niettemin, wanneer dergelijke studies gericht zijn op een enkel doel, worden resultaten van slechte kwaliteit verkregen, waardoor dit alternatief buiten de ruimte valt voor voorlopige screenings, zoals we in deze studie presenteren25,26. Als het gaat om micro-organismen, wordt Saccharomyces cerevisiae beschouwd als een van de meest gebruikte modellen voor de evaluatie van toxische verbindingen23. In feite is het gebruik van in vitro gist over het algemeen snel en gemakkelijk uit te voeren; het kan echter duur zijn, omdat het specifieke chemische producten en apparatuur vereist en een lage gevoeligheid vertoont voor minimale doses cytotoxische verbindingen27. In een alternatieve benadering kunnen menselijke cellen worden gebruikt, op een snelle, eenvoudige en goedkope manier. Toch kunnen deze niet een heel organisme vertegenwoordigen; interacties tussen verschillende celtypen en systemische verstoringen die plaatsvinden in fysiologische omstandigheden worden dus niet op passende wijze in aanmerking genomen25,26. Aan de andere kant hebben in vivo assays het grote voordeel om rekening te houden met het hele organisme, maar diermodellen (zoals knaagdieren) hebben meer tijd nodig voor de uitvoering van de test, zijn duurder en impliceren complexe ethische overwegingen25. Omgekeerd zijn in vivo testen waarbij aquatische organismen worden gebruikt voor toxiciteitsscreening over het algemeen goed geaccepteerd, ook gezien het feit dat het gebruik van ongewervelde mariene dieren minder ethische bezwaren ondergaat en de methodologie gemakkelijk uit te voeren, snel en goedkoop is21,24. In deze context is het gebruik van zebravissen voor de studie van algemene toxiciteit vaak de eerste keuze in het veld. In vergelijking met andere dierproeven kan het zelfs als een goedkope optie worden beschouwd, omdat zebravissen zich snel ontwikkelen en het vroege larvale stadium bereiken rond 72 uur tot 13 dagen na de bevruchting21,28. Niettemin vereist het onderhoud van een zebravis goed opgeleide operators en specifieke omstandigheden, zoals een aquarium met een circulerend systeem, dat in staat is om het systeemwater te beluchten en te filteren, om de algehele kwaliteit te behouden; bovendien zijn verschillende deksels en afvoerdeksels nodig, omdat zebravissen kunnen springen, evenals specifieke lichtomstandigheden (14 uur licht, 10 uur donker) en de pH-waarden moeten dagelijks worden gecontroleerd, waaronder29,30. Al met al maken deze overwegingen zebravismodellen tijdrovender en duurder dan het Artemia-model dat hier wordt gerapporteerd, omdat deze microschaaldieren gemakkelijker te hanteren en levensvatbaar zijn voor teelt in grote populaties met behulp van laboratoriummethoden. Dit maakt A. salina ongetwijfeld een van de meest gebruikte screeningsinstrumenten, voornamelijk gebruikt om de algemene toxiciteit van verschillende monsters, zoals geneesmiddelen en medicinale plantenextracten, te testen1.
In het protocol zijn A. salina nauplii gedurende 24 uur gekweekt, verzameld en geïncubeerd met geschikte monsters om het nauplii-sterftecijfer te schatten dat door elk monster wordt geïnduceerd. In de eerste stap wordt het uitkomen van eieren uitgevoerd in een in de handel verkrijgbaar trechtervormig kweekvat, waarin krachtig borrelen werd geïntroduceerd (figuur 2A). Deze geforceerde beluchting is noodzakelijk omdat hierdoor de pekelkreeftjes zo succesvol mogelijk kunnen uitkomen. Het uitkomen vindt plaats rond 24 uur bij 25 ± 3 °C, terwijl tot 48 uur nodig kan zijn bij lagere temperaturen. Zodra de eieren uitkomen, wordt de pomp uitgeschakeld om de lege eierdozen aan de bovenkant te laten drijven, terwijl nauplii en niet-gehate eieren gemakkelijk kunnen worden verzameld door de trechterkraan aan de onderkant te openen. Tijdens onze experimenten werd nooit volledig uitkomen van eieren bereikt, met de daaruit voortvloeiende aanwezigheid van nauplii en niet-rijpe eieren in de verzamelde oplossing. Om deze reden, om de twee vormen van Artemia efficiënt te scheiden, wordt een handgemaakte apparatuur voor de migratie van pekelgarnalen voorbereid (stap 1.2). Eén container wordt gevuld met de geoogste organismen en vervolgens bedekt met aluminiumfolie, terwijl de andere ontvanger wordt blootgesteld aan het directe licht van een lamp. In deze omstandigheden hebben de niet-gehate eieren de neiging om zich te vestigen, terwijl de levende nauplii worden aangetrokken door het licht dat de aangrenzende container raakt, waardoor de migratie van de ene naar de andere kant via de brugverbinding wordt bevorderd. Na 4 uur bevinden bijna alle levende nauplii zich in de container blootgesteld aan het licht en klaar om te worden verzameld voor de uitvoering van de test. In dit stadium worden delen van de zoutwateroplossing, die tien tot vijftien nauplii bevatten, verwijderd en geïncubeerd met elk van de te testen monsters.
In dit werk is aangetoond hoe de methode efficiënt, economisch en gemakkelijk uit te voeren is. Er moeten echter enkele kritieke punten worden erkend bij het uitvoeren van deze test.
De test wordt meestal uitgevoerd met kraanwater. Afhankelijk van geografische en fysisch-chemische factoren vertoont leidingwater een verschillende hardheidsverdeling, die de reproduceerbaarheid van de test en in het bijzonder de broedstap van het ei beïnvloedt. Om dezelfde reden kan het gebruik van zeewater de reproduceerbaarheid van de test beïnvloeden. De variërende zoutconcentratie, de aanwezigheid van verontreinigingen, microplastics en andere bloedlichaampjes zouden de operator dwingen om verdere stappen te ondergaan, zoals filtraties en andere soorten zuivering, die het experiment complexer en minder gemakkelijk te hanteren zouden maken. Alles bij elkaar genomen, moeten optimale omstandigheden worden geregeld op basis van de kenmerken en beschikbaarheid van kraanwater, vooral door een zorgvuldige regulering van de hoeveelheid toegevoegd kunstzout, die een geschikte omgeving creëert en ook als voeding voor de nauplii fungeert.
Grote temperatuurschommelingen kunnen leiden tot lagere broedsnelheden. Als gevolg hiervan konden lage niveaus van levende Artemia worden waargenomen, gemengd met een hoog aantal niet-gehate eieren. Het is duidelijk dat dergelijke omstandigheden niet geschikt zijn voor de ontwikkeling van betrouwbare testen, dus een gecontroleerde klimatisatie van de ruimte of het gebruik van geschikte verticale incubators moet worden overwogen.
Krachtige beluchting van de oplossing in het broedvat is vereist. De aanwezigheid van continu borrelen bevordert het contact tussen eieren en versnelt het broedproces.
Het verzamelen van zowel niet-gehate eieren als nauplii tijdens het oogsten kan de betrouwbaarheid van de test sterk beïnvloeden. Dit komt door de mogelijkheid om uit te komen tijdens de incubatie met de monsters. In dit geval zullen niet alle nauplii gedurende dezelfde tijd zijn blootgesteld, met als gevolg onjuiste sterftecijfers. Omdat eieren en nauplii te klein zijn om efficiënt te worden gescheiden, zijn hogere incubatietijden in de broedapparatuur of het gebruik van de handgemaakte migratieapparatuur nodig.
Elke put moet 10-15 nauplii bevatten voor de incubatiestap, zorgvuldig geteld met behulp van een binoculaire microscoop (12x vergroting). De aanwezigheid van te veel nauplii in dezelfde put kan de uiteindelijke telling moeilijk of zelfs onjuist maken vanwege overlapping. Aan de andere kant zouden kleine hoeveelheden garnalen leiden tot resultaten zonder statistische significantie.
Zoals duidelijk is, zijn de meeste problemen van deze methode gerelateerd aan de broed- en groeistadia, waar meer aandacht nodig is om betrouwbaarheidsproblemen te voorkomen. Toch kan de methode wijzigingen verdragen, vooral met betrekking tot de meest kritieke punten die hierboven zijn beschreven. Natuurlijk, wanneer een van deze parameters wordt gewijzigd, kan het nodig zijn om verschillende pogingen uit te voeren om de oorspronkelijke methode te optimaliseren. Het veranderen van de temperatuur kan bijvoorbeeld helpen de totale tijd van de test te beheersen: het verhogen van de temperatuur tot 28-29 ° C zal ook de hatchsnelheid verhogen en het hele proces versnellen.
Sommige beperkingen van de bioassay van A. salina houden ook verband met de stabiliteit van de monsters ten opzichte van de testomstandigheden en -tijd. De test kan alleen worden uitgevoerd met monsters die stabiel zijn bij kamertemperatuur en onder zichtbaar licht. Bovendien moet er rekening mee worden gehouden dat de hele procedure minstens 4 dagen duurt en als de broedsnelheid laag is, kan de test een extra dag nodig hebben voor de broedstap.
Over het algemeen belichten we in deze studie twee voorbeelden van de toepassing van de algemene toxiciteitsevaluatie via de A. salina-methode. Voor alle geteste monsters is algemene toxiciteit vastgesteld. Extracten van Plectranthus-planten en verbinding 5 vertoonden geen algemene toxiciteit, terwijl verbindingen 1-4 matig of zelfs zeer giftig bleken te zijn voor pekelgarnalen. In het bijzonder werd het negatieve effect van verbindingen 1 en 2 op Artemia eerder aangetoond door Sitarek en Matias door MTT- en SRB/MTT-assays, respectievelijk31,32. Tegelijkertijd vertonen de benzoylated analogen, verbindingen 3 en 4, hogere toxiciteitswaarden dan hun voorlopers 1 en 2, wat benadrukt dat de esterfunctionalisatie een belangrijke rol zou kunnen spelen in termen van cytotoxiciteit, zoals bevestigd voor verbinding 4 in menselijke NSCLC MDR-kankercellijn door Garcia et al.33. Er zijn echter andere testen nodig om te bevestigen dat een dergelijke cytotoxische activiteit kan worden benut bij kankertherapie. Aan de andere kant vertoonde derivaat 5, samen met alle geteste extracten, geen toxiciteit en verschijnt het als de meest veelbelovende pure verbinding van de serie. Verdere studies om de potentiële biologische activiteit voor cutane toepassing te evalueren zijn echter nodig.
Hier hebben we gedemonstreerd hoe het gebruik van de op Artemia salina gebaseerde methode als screeningsinstrument tijd en geld kan besparen, in vergelijking met andere bekende methodologieën. Het is een efficiënte en voordelige manier om te worden geëxploiteerd in voorlopige toxiciteitscontexten. Het kan worden gebruikt in de aanwezigheid van verschillende en complexe monsters, synthetische en semi-synthetische drugs, evenals voor de biogeleide fractionering van extracten en monsters van natuurlijke producten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten, financieel of anderszins.
Acknowledgments
Ter nagedachtenis aan professor Amilcar Roberto.
Dit werk werd financieel ondersteund door Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) in het kader van de projecten UIDB/04567/2020 en UIDP/04567/2020 toegeschreven aan CBIOS en PhD-subsidie SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H.
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
