Summary
この作業は、評価とレビューを目的としています アルテミアサリナ 致死性バイオアッセイ手順、ブラインシュリンプ致死性アッセイとしても識別されます。このシンプルで安価な方法は、サンプル、すなわち天然物の一般的な毒性(予備毒性評価と見なされる)に関する情報を提供します。
Abstract
天然物は古くから医薬品の製造に使用されてきました。今日では、天然資源から入手し、多くの病気に対して使用される化学療法薬がたくさんあります。残念ながら、これらの化合物のほとんどは、全身毒性と副作用を示すことがよくあります。選択された潜在的に生理活性サンプルの忍容性をよりよく評価するために、ブラインシュリンプ(Artemia salina)は一般的に致死性研究のモデルとして使用されます。 A.サリナ テストは、研究された生理活性化合物が幼虫期(ノープリウス)で微小甲殻類を殺す能力に基づいています。この方法は、細胞毒性試験、ならびに合成、半合成、および天然物の一般的な毒性スクリーニングのための便利な出発点となります。これは、前述の目的に一般的に適した他の多くのアッセイ(in vitro 細胞または酵母株、ゼブラフィッシュ、げっ歯類)と比較して、単純、迅速、および低コストのアッセイと見なすことができます。さらに、特別なトレーニングがなくても簡単に実行できます。全体として、 A.サリナ アッセイは、選択された化合物の予備毒性評価および天然物抽出物のバイオガイド分画のための有用なツールである。
Introduction
植物、動物、または微生物からの天然物は、その多様な生物学的および薬理学的活性のために、新しい生理活性分子の開発において長年にわたって関心が高まっている分野です1。しかし、関連する副作用、薬剤耐性、または薬剤の不十分な特異性は、特に抗癌剤として使用される場合、無効な治療につながる可能性のある主要な要因を表しています1,2。
過去数十年にわたって、いくつかの植物由来の細胞傷害剤が発見されており、そのうちのいくつかは抗癌剤として使用されている1,2,3。これに関連して、パクリタキセルは、天然起源の最も有名で最も活性な化学療法薬の1つとして報告されています3,4。現在、市場に出回っているすべての医薬品の35%以上が天然物に由来するか、天然物に触発されていると推定されています5。これらの化合物の潜在的な高い毒性は、植物自体のさまざまな種類の汚染物質または代謝成分でさえ毒性作用を引き起こす可能性があるため、すべての研究段階で考慮する必要があります。このため、薬理学的および毒物学的プロファイルは、新しい潜在的な植物ベースの治療の生物学的活性と安全性を評価するために、予備段階で実施する必要があります。新しい生理活性サンプルの毒性を評価するために、無脊椎動物を研究するのに最適なモデルと見なすことができます。彼らは最小限の倫理的要件を要求し、脊椎動物1,6での次のテストラウンドで最も有望な製品を優先するために、予備的なin vitroアッセイを可能にします。
一般にブラインシュリンプとして知られているA.サリナは、アルテミア属に属する小さな好塩性無脊椎動物です(アルテミダエ科、アノストラカ目、甲殻類亜門;図1)。海洋および水生塩水の生態系では、ブラインシュリンプは微細藻類を食べ、魚の餌に使用される動物プランクトンの成分であるため、重要な栄養的役割を果たします。さらに、それらの幼虫(ノープリウスとして知られている)は、予備研究中の一般的な毒性の評価に広く使用されています1,3,7。
アルテミア属は致死性試験で広く使用されており、実験室で増殖したノープリウスを殺す能力に基づいて潜在的に生理活性化合物の毒性を追跡することにより、毒性評価の便利な出発点でもあります1,8。このため、A. salinaの使用は、動物モデル9の他の試験と比較して、非常に効率的で使いやすい方法であるため、一般的な毒性試験で注目を集めました。
解剖学的構造が単純で、サイズが小さく、ライフサイクルが短いため、1回の実験で膨大な数の無脊椎動物を研究することができます。そのため、遺伝的快適性と低コストの適合性を大規模スクリーニングと組み合わせています1。これに関連して、一般的な毒性アッセイにおけるブラインシュリンプの使用は、急速な成長(孵化から最初の結果まで28〜72時間が必要)、費用対効果、および一年中使用できる市販の卵の長い貯蔵寿命などのいくつかの利点を示しています3,10。一方、無脊椎動物は原始的な器官系を持ち、適応免疫系を持たないため、ヒト細胞の完全で信頼できるモデルではありません1。
ただし、選択したサンプルの一般的な毒性の予備評価方法を提供します。致死性アッセイとして広く使用されているため、潜在的な抗がん剤の毒性作用に関する暫定的な適応症を提供できます。また、 アルテミア エビの中で可能な限り低い死亡率を示すことが不可欠である他の生物学的活性に恵まれた化合物の一般的な毒性についてのフィードバックを得るためにもよく使用されます。
私たちのグループからの進行中の研究では、プレクトランサス種からのさまざまな抽出物が抗酸化作用と抗菌作用を示しました(未発表の結果)。並行して、単離された化合物を抽出物の精製によって得、次いで化学修飾した。次に、抽出物、純粋な化合物、および半合成誘導体を一般的な毒性の観点からテストしました。これに関連して、本研究は、生理活性抽出物およびPlectranthus属の異なる植物からの単離された化合物の一般的な毒性および潜在的な細胞毒性活性の評価のためのアルテミア致死性バイオアッセイの使用の概要を示すことを目的としています11。
図1:顕微鏡下の アルテミアサリナ 。 顕微鏡で見た A.サリナ の新しく孵化したノープリウス(倍率12倍)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1.機器の準備
- 市販の孵化装置を入手してください。孵化装置を設置するのに適した場所を選択してください(図2A)。漏斗状の容器を黒いサポート(セットに含まれています)に入れ、漏斗を適切な方向に回してレベルマークとタップを確認します。
- 手作りの移行装置を作るには、0.5 L(直径5.8 cm)のペットボトル2本の上部をカットして、最終的な高さ12 cmにします。各ボトルの底から7cmの片側に直径1.5cmの穴を開け、2つの開口部の間に13cmのゴムチューブ(外側1.3cm、内径0.9cm)を挿入します。ホットグルーで開口部を密閉し(図2B)、15分間乾燥させます。ボトルを平らな面に置き、水で満たして、漏れがないことを確認します。
2.人工塩溶液の調製
- ガラスビーカーに、35g/Lの濃度の人工塩溶液(かん水エビ塩)を調製する。これを行うには、製造元の指示に従って、28 gの塩を800mLの水道水に加えます。すべての塩が完全に溶解するまで攪拌棒で混ぜます。
注意: 利用可能な容器のサイズに応じて、準備した生理食塩水の量を調整します。
3. サンプル調製
- 適量の抽出物(プレクトランサス 抽出物、Pa- P. ambigerus; Pb-P.バルバトゥス;Pc−P. シリンドラセウス ;およびPe− P.エクロニイ)または化合物1〜5( プレクトランサス 属から得られる2つの天然化合物[1および2]および3つの半合成誘導体[3、4、5]; 図3)ジメチルスルホキシド(DMSO)12で、最終濃度10 mg/mLになるようにします(サンプルが水溶性の場合、DMSOを使用する必要はありません)。
- ステップ2.1で調製した990 μLの人工生理食塩水を使用して、各サンプル(およびネガティブコントロールの場合はDMSO)を新しい微量遠心チューブで10 μL希釈し、最終濃度0.1 mg / mLを得ました。
- ヒュームフードの下で、三角フラスコで、1 mg / mLの濃度の蒸留水中の重クロム酸カリウム(K 2Cr2O7)の溶液を調製します13,14,15。
4.ブラインシュリンプ致死性バイオアッセイ
注:このアッセイは、修正1,16,17,18,19を有する数人の著者の研究から開発されている。
- ステップ2.1で調製した培地をレベルマーク(500 mL)まで孵化容器に充填します(図2C)。
- スプーン1杯(約0.75 g)の塩水エビ嚢胞を塩溶液に入れ、容器を閉じます。ランプ(テーブルランプ、40 W、230 V、50 Hz、8 W、4,000 K、830 lmのLED電球付き)を機器に直接向けて(図2A)オンにします。
- エアサプライヤーシステム(3 W出力、50 Hz、230 V)を機器の上部に配置されたコネクタに接続し、ポンプをオンにします。
- 室温を25±3°Cに保ちます。 ブラインシュリンプシストは、24時間から48時間後に、激しい曝気、連続照明、および安定した温度の下で、人工塩溶液中で孵化する。
注:あるいは、垂直インキュベーターを使用することもできます。 - 卵が孵化したら、エアポンプをオフにし、ノープリウス(漏斗の下部に向かって移動)が空の卵ケース(上部に浮かぶ)から分離されるまで待ちます。
- 孵化していない卵を生きているノープリウスから分離するには、底部の出口タップを開き、手作りの移動装置コンテナのコンテナの1つに漏斗の内容物を排出します(ステップ1.2で説明)。ノープリウスと残りの孵化していない卵を含む溶液がチューブのレベルより下にあることを確認してください。2番目の容器に、ステップ2.1の残留塩溶液をチューブの高さより上に追加します。
- アルミホイルを使用して、ノープリウスと残りの孵化していない卵で容器を覆います。塩溶液だけで2番目の容器にランプを置きます。ブラインシュリンプは光に引き付けられ、一方の容器からもう一方の容器(収穫容器)に移動し、卵(ゆっくりと底に沈降する)と生きている アルテミアを効率的に分離します。
- 次に、ステップ4.4で使用したのと同じ条件下で機器をインキュベーターに4時間配置します(図2E)。収穫容器から、10〜15個のノープリウスを含む生理食塩水900μLを収集します。ノープリウスを含む生理食塩水を24ウェルプレートの各ウェルに入れます(図2F)。すべてのサンプルは4倍でテストされます。
- 陰性対照(DMSO)、陽性対照(K2Cr2O7、重クロム酸カリウム)、人工塩溶液、および各サンプルをそれぞれウェルにそれぞれ100μL加える(図2F)13、14。
注:各ウェルのサンプルは0.01 mg / mLの濃度になります。塩溶液中のポジティブコントロールの最終濃度は0.1 mg / mLになり、ウェル内のすべてのノープリウスが重クロム酸カリウムの毒性作用にさらされて死ぬことを確認します。人工塩溶液はブランクとして機能します。 - プレートを25±3°Cの照明下で24時間インキュベートします(図2G)。24時間後、双眼顕微鏡(12x)20の下で各ウェルの死んだ幼虫(5秒間の非可動性ノープリウス)の数を登録します(図2H)。または、ハンドレンズを使用してください。
- 100μLの重クロム酸カリウム溶液を加え、残りの生きている幼虫の死を誘発し、6時間待つ。顕微鏡下で各ウェル内の死んだ幼虫の総数を数えます。次式に従って死亡率を求める。
- すべてのアッセイを3回で実行します。標準偏差(SD)を計算し、結果を3つの独立した実験の平均として表し、それぞれに内部四重(n = 12)±SDがあります。Meyerらが述べたように、LC50< 1,000 μg / mLの粗抽出物および純粋な化合物を毒性と見なします。また、ブラインシュリンプの死亡率は試験試料21の濃度に比例することを考慮に入れる。
図2:アルテミアサリナ致死バイオアッセイ法。 (A)ブラインシュリンプシストの孵化に使用される市販の機器。(B)手作りの移行装置。(c)生理食塩水で満たされた孵化容器;(D)孵化していない卵とノープリウスの収集。(E)移行ステップ中のインキュベーター内の手作りの機器。ランプから離れた容器はアルミホイルで覆う必要があります。ただし、ここでのセットインストールをよりよく見るために、セットは削除されました。(f)アッセイを実施する前のウェルでのアルテミアの採取。化合物は次のように配置する必要があります:-ネガティブコントロール(DMSO)、+はポジティブコントロール(K 2 Cr2O7)、塩は人工塩溶液、およびテストするサンプル(この場合は化合物1〜3)を指します。(g)アルテミアおよび選択されたサンプルを含む24ウェルプレートのインキュベーション;(H)双眼顕微鏡下でのアルテミアカウント。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:選択した化合物の構造。 化合物1〜2の構造は、 プレクトランサス 種から抽出され、化合物3〜5と、半合成により得られる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
私たちのグループが最近研究したいくつかの天然物の一般的な毒性は、ブラインシュリンプ致死性バイオアッセイを通じて評価されました。4つの抽出物(Pa- P. ambigerus; Pb-P.バルバトゥス;Pc- P.シリンドラセウス;およびPe- P. ecklonii)は、それらの抗酸化活性(未発表の結果)で知られている プレクトランサス 属から、試験された。さらに、 プレクトランサス 属から得られた2つの天然化合物(1および2)、および3つの半合成誘導体(3、4、5; 図3)は、他の著作物3に記載した全て、調査も行った。本明細書では、潜在的な細胞傷害活性の観点からのそれらの予備評価が報告されている。
テストされたすべての抽出物は非常に有望な結果を示し、死亡率は非常に低く、ブランク(塩溶液)および陰性対照(DMSO; 図4)。逆に、純粋な化合物1〜5のうち、誘導体5のみが一般的な毒性がなく、低い死亡率(100ppmの濃度で2.30%)を示しました(図5)。
図4:アルテミアサリナの抽出物の致死性。 プレクトランサス属の4つのメタノール抽出物に24時間曝露した後のA.サリナの死亡率(%)、0.1 mg / mL(Pa- P.Pb-P.バルバトゥス;Pc- P.シリンドラセウス;Pe- P. ecklonii)。全ての抽出物は、このアッセイを用いた一般的な毒性の点で許容できた。塩は塩溶液(ブランク)に対応します。K2Cr2O7をポジティブコントロールとして、DMSOをネガティブコントロールとして用いた。結果は、それぞれが内部四重(n = 12)±SDを持つ3つの独立した実験の平均として表されました。 比較は、ダネットの事後検定で一元配置分散分析を使用して、分散分析によってグループ内で実行されました。対照群と実験群との間の有意差は、市販の統計解析ソフトウェアを用いて評価した。確率水準p<0.01は統計的有意性を示すと考えられた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:アルテミアサリナの化合物の致死率。 0.1 mg / mLの5つの純粋な化合物に24時間曝露した後のA.サリナの死亡率(%)(1と2は天然物であり、3-5は1と2から調製された誘導体です)。このアッセイを使用して非常に限られた毒性を示すのは5つだけであることは明らかです。塩は塩溶液(ブランク)に対応します。K2Cr2O7をポジティブコントロールとして、DMSOをネガティブコントロールとして用いた。結果は、それぞれが内部四重(n = 12)±SDを持つ3つの独立した実験の平均として表されました。 比較は、ダネットの事後検定で一元配置分散分析を使用して、分散分析によってグループ内で実行されました。対照群と実験群との間の有意差は、市販の統計解析ソフトウェアを用いて評価した。確率水準p<0.01は統計的有意性を示すと考えられた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
天然物1および2は中程度の致死性(100ppmでそれぞれ36.68%および30.95%)を示したが、1および2から得られた半合成誘導体3および4は、元の足場よりも毒性が高かった(それぞれ100ppmで64.02%および36.64%)。 図5)。
全体的なデータは、抗酸化活性で知られ、一般的な毒性を示さないすべての試験抽出物が、選択された細胞株に対するさらなる in vitro 活性および毒性研究の候補と見なすことができることを示唆しました。毒性がないことが皮膚モデルでも実証されている場合、皮膚適用のための新しい生理活性製品の開発を行うことができます。一方、化合物1〜4について観察された毒性作用は、それらを抗癌剤としての追加評価のための適切な候補にする可能性がある。
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Discussion
過去数年間、科学界は毒性スクリーニングの代替モデルへの関心を高めてきました21。A. salina致死バイオアッセイの他に、他の方法論が通常、サンプル忍容性の評価のために行われ、脊椎動物バイオアッセイ(げっ歯類など)、無脊椎動物(ゼブラフィッシュなど)、酵母株または細胞を使用するin vitro法、およびインシリコ法が含まれます22,23,24,25.これらの方法はすべて、費やされたお金と時間、結果の再現性、および分析するサンプルの種類を考慮して、明確な長所と短所があります。たとえば、インシリコアプローチは、標準化された低コストの方法論を表しており、最小限の機器しか必要としません。それにもかかわらず、そのような研究が単一のターゲットに焦点を合わせている場合、質の悪い結果が得られ、この研究で提示されているように、この代替案は予備スクリーニングの範囲外になります25,26。微生物に関しては、サッカロミセス・セレビシエは毒性化合物の評価に最も広く使用されているモデルの1つと考えられています23。実際、in vitro酵母の使用は一般的に迅速かつ簡単に実行できます。しかしながら、それは特定の化学製品および装置を必要とし、そして細胞傷害性化合物の最小用量に対して低い感受性を示すので、高価であり得る27。別のアプローチでは、ヒト細胞を高速、簡単、かつ安価な方法で使用することができる。それでも、これらは生物全体を表すことはできません。したがって、異なる細胞型と生理学的条件下で起こる全身摂動との間の相互作用は、適切に考慮されていない25,26。一方、インビボアッセイは、生物全体を考慮に入れるという大きな利点を有するが、動物モデル(げっ歯類など)は、アッセイの実行により多くの時間を必要とし、より高価であり、複雑な倫理的考慮事項を意味する25。逆に、毒性スクリーニングに水生生物を用いたin vivoアッセイは、海洋無脊椎動物の使用が倫理的懸念が少なく、方法論が実行しやすく、高速で安価であることも考慮して、一般的に広く受け入れられています21,24。これに関連して、一般的な毒性の研究のためのゼブラフィッシュの使用は、しばしばこの分野での最初の選択肢を表しています。実際、他の動物実験と比較して、ゼブラフィッシュは急速に成長し、受精後72時間から13日頃に幼虫期に達するため、低コストの選択肢と見なすことができます21,28。それにもかかわらず、ゼブラフィッシュのメンテナンスには、全体的な品質を維持するために、システムの水を曝気してろ過できる循環システムを備えた水槽など、よく訓練されたオペレーターと特定の条件が必要です。さらに、ゼブラフィッシュがジャンプする可能性があるため、いくつかの蓋と排水カバーが必要であり、特定の照明条件(14時間の光、10時間の暗)、およびpHレベルを毎日チェックする必要があります29,30。全体として、これらの考慮事項により、ゼブラフィッシュモデルは、実験室の方法を使用して大規模な集団での培養に扱いやすく、実行可能であるため、ここで報告されたアルテミアモデルよりも時間と費用がかかります。これにより、A. salinaは間違いなく最も採用されているスクリーニングツールの1つになり、主に薬物や薬用植物抽出物などのさまざまなサンプルの一般的な毒性をテストするために使用されます1。
プロトコールでは、 A. salina naupliiを飼育し、収集し、適切なサンプルと共に24時間インキュベートし、各サンプルによって誘導されるノープリウス死亡率を推定した。第1工程では、市販の漏斗状の飼育容器内で卵の孵化を行い、そこに激しいバブリングを導入した(図2A)。この強制曝気は、ブラインシュリンプの孵化を可能な限りうまく行うことを可能にするので必要です。孵化は25 ± 3°Cで約24時間で起こりますが、低温では最大48時間が必要になる可能性があります。卵が孵化したら、ポンプをオフにして空の卵ケースを上に浮かせ、ノープリウスと孵化していない卵は下部の漏斗タップを開くことで簡単に収集できます。私たちの実験中、完全な卵の孵化は決して達成されず、その結果、収集された溶液中にノープリウスと非成熟卵が存在しました。このため、 アルテミアの2つの形態を効率的に分離するために、ブラインシュラインエビの移動のための手作りの装置が用意されています(ステップ1.2)。一方の容器は収穫された生物で満たされ、次にアルミホイルで覆われ、もう一方の受取人はランプの直射日光にさらされます。これらの条件では、孵化していない卵は落ち着く傾向がありますが、生きているノープリウスは隣接するコンテナに当たる光に引き付けられ、橋の接続を介して一方の側からもう一方の側に移動することを促進します。4時間後、ほとんどすべての生きたノープリウスは光にさらされた容器の中にあり、アッセイの実行のために収集する準備ができています。この段階で、10〜15個のノープリウスを含む塩水溶液の一部を取り除き、試験する各サンプルとインキュベートします。
この研究では、この方法がいかに効率的で経済的で、実行が容易であるかが示されています。ただし、このアッセイを実行する際には、いくつかの重要な点を認識する必要があります。
アッセイは通常、水道水で行われます。地理的および物理化学的要因に応じて、水道水は異なる硬度分布を示し、アッセイの再現性、特に卵の孵化ステップに影響を与えます。同じ理由で、海水の使用は試験の再現性に影響を与える可能性があります。塩濃度の変化、汚染物質、マイクロプラスチック、その他の小体の存在により、オペレーターはろ過やその他の種類の精製などのさらなるステップを踏む必要があり、実験がより複雑になり、取り扱いが容易になります。考慮されたすべての最適な条件は、水道水の特性と利用可能性に基づいて、特に適切な環境を作り出し、ノープリウスの栄養としても機能する人工塩の添加量を慎重に調整することによって決定する必要があります。
温度の変動が大きいと、ハッチング率が低くなる可能性があります。結果として、低レベルの生きている アルテミア が観察され、多数の孵化していない卵と混合された。明らかに、そのような条件は信頼性の高いアッセイの開発には適していないので、部屋の制御された気候化または適切な垂直インキュベーターの使用を考慮する必要があります。
孵化容器内の溶液の激しい曝気が必要です。連続的な泡立ちの存在は卵間の接触を促進し、孵化プロセスを加速します。
収穫中に孵化していない卵とノープリウスの両方を収集すると、アッセイの信頼性に強く影響する可能性があります。これは、サンプルとのインキュベーション中に孵化する可能性があるためです。この場合、すべてのノープリウスが同じ時間曝露されたわけではなく、その結果、誤った死亡率が発生します。卵とノープリウスは小さすぎて効率的に分離できないため、孵化装置での培養時間を長くするか、手作りの移動装置を使用する必要があります。
各ウェルには、双眼顕微鏡(倍率12倍)を使用して慎重に数えた、インキュベーションステップ用の10〜15個のノープリウスが含まれている必要があります。同じ井戸にノープリウスが多すぎると、重複して最終的なカウントが困難になったり、誤っていたりする可能性があります。一方、少量のエビは統計的有意性のない結果につながります。
明らかなように、この方法の問題のほとんどは、信頼性の問題を回避するためにより多くの注意が必要な孵化および成長段階に関連しています。それでも、この方法は、特に上記の最も重要な点に関連して、変更を許容することができる。もちろん、これらのパラメータの1つが変更された場合、元の方法を最適化するためにいくつかの試みを行う必要があるかもしれません。例えば、温度を変えることはアッセイの全体的な時間を制御するのを助けることができます:温度を28-29°Cまで上げることはまたハッチ率を高めそして全体のプロセスをスピードアップする。
A.サリナバイオアッセイのいくつかの制限は、試験条件および時間に対するサンプルの安定性にも関連している。アッセイは、室温および可視光下で安定なサンプルを使用してのみ実行できます。さらに、手順全体が少なくとも4日間続くことを考慮に入れる必要があり、孵化率が低い場合、アッセイは孵化ステップに余分な日を必要とする可能性があります。
全体として、この研究では、A.サリナ法による一般的な毒性評価の適用の2つの例を強調します。テストされたすべてのサンプルについて一般的な毒性が確立されています。プレクトランサス植物および化合物5からの抽出物は一般的な毒性を示さなかったが、化合物1〜4は塩水エビに対して中程度または非常に毒性があることが証明された。特に、アルテミアに対する化合物1および2の悪影響は、MTTおよびSRB / MTTアッセイによってシタレクおよびマティアスによって以前に実証された31,32。同時に、ベンゾイル化類似体である化合物3および4は、それらの前駆体1および2よりも高い毒性値を示し、GalciaらによってヒトNSCLC MDR癌細胞株における化合物4について確認されたように、エステル官能基化が細胞毒性の観点から重要な役割を果たす可能性があることを強調している33。しかしながら、そのような細胞傷害活性が癌治療において利用され得ることを確認するために他のアッセイが必要である。一方、誘導体5は、アッセイされたすべての抽出物とともに、毒性を示さず、シリーズの中で最も有望な純粋な化合物として現れます。ただし、皮膚適用のための潜在的な生物学的活性を評価するためのさらなる研究が必要です。
ここでは、スクリーニングツールとして アルテミアサリナベースの方法を使用することで、他の既知の方法論と比較して、時間とお金を節約できることを示しました。これは、予備的な毒性の状況で利用するための効率的かつ有利な方法を表しています。異なる複雑なサンプル、合成薬、半合成薬の存在下で、また天然物抽出物やサンプルのバイオガイド分画に使用できます。
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Disclosures
著者は、金銭的またはその他の利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
アミルカル・ロベルト教授を偲んで。
この作業は、プロジェクトUIDB/04567/2020およびUIDP/04567/2020の下で、CFIOSおよび博士号助成金SFRH/BD/137671/2018(Vera Isca)に起因するFundaçãopara a Ciência e a Tecnologia(FCT、ポルトガル)によって財政的に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
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