Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Биоанализ летальности с использованием Artemia salina L.

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64472
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2, 1, 2, 1,3
1CBIOS - Lusófona University's Center for Research in Biosciences & Health Technologies, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias, 2Facultad de Farmacia, Departamento de Ciencias Biomédicas (Área de Farmacologia; Nuevos agentes antitumorales, Acción tóxica sobre células leucémicas), Universidad de Alcalá de Henares, 3Instituto de Investigação do Medicamento (iMed.ULisboa), Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa
* These authors contributed equally

Summary

Эта работа направлена на оценку и обзор процедуры биоанализа летальности Artemia salina , также идентифицированной как анализ летальности креветок в рассоле. Этот простой и дешевый метод дает информацию об общей токсичности (рассматриваемой как предварительная оценка токсичности) образцов, а именно натуральных продуктов.

Abstract

Натуральные продукты использовались с древних времен для производства лекарств. В настоящее время существует множество химиотерапевтических препаратов, полученных из природных источников и используемых против множества заболеваний. К сожалению, большинство из этих соединений часто проявляют системную токсичность и побочные эффекты. Чтобы лучше оценить переносимость отобранных потенциально биологически активных образцов, рассольная креветка (Artemia salina) обычно используется в качестве модели в исследованиях летальности. Тест A. salina основан на способности исследуемых биологически активных соединений убивать микрокрустацев в их личиночной стадии (nauplii). Этот метод представляет собой удобную отправную точку для исследований цитотоксичности, а также для скрининга общей токсичности синтетических, полусинтетических и натуральных продуктов. Его можно считать простым, быстрым и недорогим анализом по сравнению со многими другими анализами (клетки in vitro или штаммы дрожжей, рыбки данио, грызуны), обычно подходящие для вышеупомянутых целей; более того, его можно легко выполнить даже без какой-либо специальной подготовки. В целом, анализ A. salina представляет собой полезный инструмент для предварительной оценки токсичности выбранных соединений и био-управляемого фракционирования экстрактов натуральных продуктов.

Introduction

Натуральные продукты из растений, животных или микроорганизмов на протяжении многих лет были растущей областью интереса в разработке новых биологически активных молекул из-за их разнообразного диапазона биологической и фармакологической активности1. Однако связанные с этим побочные эффекты, лекарственная устойчивость или недостаточная специфичность агентов, особенно при использовании в качестве противоопухолевых препаратов, представляют собой основные факторы, которые могут привести к неэффективномулечению 1,2.

За последние несколько десятилетий было обнаружено несколько цитотоксических агентов растительного происхождения, некоторые из которых используются в качестве противоопухолевых средств 1,2,3. В этом контексте паклитаксел сообщается как один из самых известных и наиболее активных химиотерапевтических препаратов природного происхождения 3,4. В настоящее время, по оценкам, более 35% всех лекарственных средств на рынке получены из натуральных продуктов5 или вдохновлены ими. Потенциальная высокая токсичность этих соединений требует рассмотрения на всех этапах исследования, поскольку различные типы загрязняющих веществ или даже метаболических компонентов самого растения могут вызывать токсические эффекты. По этой причине фармакологические и токсикологические профили должны проводиться на предварительном этапе для оценки биологической активности и безопасности новых потенциальных методов лечения на растительной основе. Чтобы оценить токсичность новых биологически активных образцов, беспозвоночные животные могут рассматриваться как лучшие модели для изучения. Они требуют минимальных этических требований и позволяют проводить предварительные анализы in vitro, чтобы определить приоритетность наиболее перспективных продуктов для следующего раунда тестирования на позвоночных 1,6.

A. salina, широко известная как рассольная креветка, является небольшим галофильным беспозвоночным, принадлежащим к роду Artemia (семейство Artemiidae, отряд Anostraca, подтип ракообразных; Рисунок 1). В морских и водных соленых экосистемах соленые креветки играют важную питательную роль, поскольку они питаются микроводорослями и являются компонентами зоопланктона, используемого для кормления рыб. Более того, их личинки (известные как науплии) широко используются в оценке общей токсичности при предварительных исследованиях 1,3,7.

Artemia spp. широко используются в исследованиях летальности, а также являются удобной отправной точкой для оценки токсичности, отслеживая токсичность потенциально биологически активных соединений на основе их способности убивать науплии, выращенные в лаборатории 1,8. По этой причине применение A. salina приобрело привлекательность в общих исследованиях токсичности, поскольку это очень эффективный и простой в использовании метод, по сравнению с другими испытаниями на животных моделях9.

Благодаря их простой анатомии, крошечным размерам и короткому жизненному циклу, огромное количество беспозвоночных может быть изучено в одном эксперименте. Таким образом, они сочетают генетическую податливость и недорогую совместимость с крупномасштабными скринингами1. В этом контексте использование рассола креветок в общем анализе токсичности показывает несколько преимуществ, таких как быстрый рост (от вылупления до первых результатов требуется 28-72 ч), экономическая эффективность и длительный срок хранения коммерческих яиц, которые можно использовать круглый год 3,10. С другой стороны, поскольку беспозвоночные имеют примитивную систему органов и не имеют адаптивной иммунной системы, они не представляют собой идеальную и надежную модель для клеток человека1.

Однако он обеспечивает предварительный метод оценки общей токсичности отобранных образцов. Поскольку он широко используется в качестве анализа летальности, он может предоставить предварительные показания о токсических эффектах потенциальных противоопухолевых агентов. Он также часто используется для получения обратной связи об общей токсичности соединений, наделенных любой другой биологической активностью, для которой важно показать самый низкий уровень смертности среди креветок артемии .

В продолжающемся исследовании нашей группы различные экстракты из видов Plectranthus показали антиоксидантную и антимикробную активность (неопубликованные результаты). Параллельно выделенные соединения получали путем очистки экстрактов и затем химически модифицировали. Затем экстракты, чистые соединения и полусинтетические производные были протестированы с точки зрения общей токсичности. В этом контексте настоящая работа направлена на то, чтобы дать обзор использования биоанализа на летальность артемии для оценки общей токсичности и потенциальной цитотоксической активности биоактивных экстрактов и изолированных соединений из различных растений рода Plectranthus11.

Figure 1
Рисунок 1: Артемия салина под микроскопом. Недавно вылупившиеся науплии A. salina , как видно под микроскопом (увеличение 12x). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка оборудования

  1. Приобретение коммерчески доступного хэтчингового оборудования. Выберите подходящее место для установки штриховочного оборудования (рисунок 2А). Поместите воронкообразный контейнер в черную опору (входит в комплект) и поверните воронку в подходящем направлении, чтобы увидеть отметку уровня и кран.
  2. Чтобы изготовить миграционное оборудование ручной работы, вырежьте верхнюю часть двух пластиковых бутылок диаметром 0,5 л (5,8 см), чтобы получить окончательную высоту 12 см. Создайте отверстие диаметром 1,5 см с одной стороны при 7 см от дна в каждой бутылке и вставьте резиновую трубку 13 см (1,3 см снаружи и 0,9 см внутренний диаметр) между двумя отверстиями. Заклейте отверстия горячим клеем (рисунок 2B) и оставьте сохнуть на 15 мин; положите бутылки на ровную поверхность и наполните их водой, чтобы убедиться, что нет утечки.

2. Приготовление раствора искусственной соли

  1. В стеклянном стакане приготовьте искусственный солевой раствор (соль креветок) в концентрации 35 г/л. Для этого добавьте 28 г соли в 800 мл водопроводной воды, согласно инструкции производителя. Смешайте его с помешивающим стержнем до тех пор, пока вся соль не растворится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте объем приготовленного солевого раствора в соответствии с размером имеющихся контейнеров.

3. Пробоподготовка

  1. Подготовьте все образцы в микроцентрифужной трубке, растворив подходящее количество экстрактов (экстракты Plectranthus , Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; и Pe- P. ecklonii) или соединения 1-5 (два природных соединения [1 и 2], полученные из Plectranthus spp. и три полусинтетических производных [3, 4, 5]; Рисунок 3) в диметилсульфоксиде (ДМСО)12, с тем чтобы получить конечную концентрацию 10 мг/мл (если проба водорастворима, использование ДМСО не требуется).
  2. Разбавляют 10 мкл каждого образца (и ДМСО для отрицательного контроля) в новой микроцентрифужной трубке, используя 990 мкл искусственного физиологического раствора, приготовленного на стадии 2.1, для получения конечной концентрации 0,1 мг/мл.
  3. Под вытяжной вытяжкой, в колбе Эрленмейера, готовят раствор дихромата калия (K2Cr2O7) в дистиллированной воде в концентрации 1 мг/мл 13,14,15.

4. Биоанализ летальности креветок рассола

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный анализ разработан из работ нескольких авторов с модификациями 1,16,17,18,19.

  1. Наполните инкубационный сосуд средой, подготовленной на этапе 2.1, до отметки уровня (500 мл) (рис. 2С).
  2. Поместите одну ложку (примерно 0,75 г) рассола креветочных цист в солевой раствор, а затем закройте емкость. Поместите лампу (настольную лампу, 40 Вт, 230 В, 50 Гц, со светодиодной лампочкой 8 Вт, 4000 К, 830 лм), направленную непосредственно на оборудование (рисунок 2А), и включите его.
  3. Подключите систему подачи воздуха (выход 3 Вт, 50 Гц, 230 В) к разъему, расположенному в верхней части оборудования, и включите насос.
  4. Держите комнатную температуру на уровне 25 ± 3 °C. Цисты креветок вылупляются в искусственном солевом растворе, при энергичной аэрации, непрерывном освещении и стабильной температуре, через 24 ч до 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать вертикальный инкубатор.
  5. Как только яйца вылупятся, выключите воздушный насос и подождите, пока науплии (движущиеся к нижней части воронки) не отделятся от пустых ящиков для яиц (плавающих наверху).
  6. Для того чтобы отделить невылупившиеся яйца от живых науплии, откройте выходной кран на дне и выгрузите содержимое воронки в один из контейнеров контейнера для миграционного оборудования ручной работы (описано на этапе 1.2). Убедитесь, что раствор, содержащий науплии и остаточные невылупившиеся яйца, находится ниже уровня трубки. Во второй контейнер добавляют остаточный раствор соли со стадии 2.1 над высотой трубки.
  7. Накройте контейнер науплиями и остаточными невылупленными яйцами с использованием алюминиевой фольги. Поместите лампу на вторую емкость только с солевым раствором. Рассольные креветки будут притягиваться светом и мигрировать из одного контейнера в другой (контейнер для сбора урожая), что приведет к эффективному разделению между яйцами (медленно осажденными на дно) и живой артемией.
  8. Затем поместите оборудование в инкубатор в тех же условиях, которые использовались на этапе 4.4 в течение 4 ч (рисунок 2E). Из контейнера для сбора урожая собирают 900 мкл солевого раствора, содержащего от 10 до 15 науплий. Поместите солевой раствор с науплиями в каждую лунку 24-луночной пластины (рисунок 2F); все образцы тестируются в четырех экземплярах.
  9. Добавьте по 100 мкл к отрицательному контрольному (DMSO), положительному контролю (K2Cr2O7, дихромат калия), искусственному раствору соли и каждому из образцов к соответствующей скважине (рисунок 2F)13,14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пробы в каждой скважине будут находиться в концентрации 0,01 мг/мл. Конечная концентрация положительного контроля в солевом растворе составит 0,1 мг/мл, чтобы быть уверенным, что все науплии в лунке подвергаются токсическому действию дихромата калия и погибают. Раствор искусственной соли будет действовать как пустой.
  10. Инкубируют пластину при 25 ± 3 °C при освещении в течение 24 ч (рисунок 2G). Через 24 ч регистрируют количество погибших личинок (неподвижных науплии за 5 с) в каждой лунке под бинокулярным микроскопом (12х)20 (рисунок 2Н). В качестве альтернативы используйте ручной объектив.
  11. Добавьте 100 мкл раствора дихромата калия, чтобы вызвать гибель оставшихся живых личинок, и подождите 6 ч. Подсчитайте общее количество мертвых личинок в каждой лунке под микроскопом. Определите коэффициент смертности по следующему уравнению.
    Equation 1
  12. Выполните все анализы в трех экземплярах. Рассчитайте стандартные отклонения (SD) и выразите результаты как среднее значение трех независимых экспериментов, каждый с внутренними квадрупликатами (n = 12), ± SD. Как упоминалось Мейером и др., считать токсичными сырые экстракты и чистые соединения с ЛК50< 1000 мкг/мл; также учтите, что смертность соленых креветок пропорциональна концентрации испытуемых образцов21.

Figure 2
Рисунок 2: Метод биоанализа летальности Artemia salina. (A) Коммерчески доступное оборудование, используемое для вылупления цист рассола креветок; B) миграционное оборудование ручной работы; с) инкубационный сосуд, заполненный солевым раствором; D) сбор невылупившихся яиц и науплий; E) оборудование ручной работы в инкубаторе на этапе миграции. Контейнер, удаленный от лампы, должен быть покрыт алюминиевой фольгой; однако для лучшего представления о наборе установки здесь он был удален; (F) Сбор артемии в скважинах до проведения анализа. Соединения следует размещать так, как показано: - относится к отрицательному контролю (ДМСО), + к положительному контролю (K2Cr2O7), соль - к искусственному раствору соли и от 1 до 3 к образцам для тестирования (в данном случае соединения 1-3); G) инкубация 24-луночной плиты, содержащей артемию, и отобранных образцов; (H) Количество артемии под бинокулярным микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Структуры выбранных соединений. Структура соединений 1-2, экстрагированных из видов Plectranthus , и соединений 3-5, полученных полусинтезом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Общая токсичность некоторых натуральных продуктов, недавно изученных нашей группой, была оценена с помощью биоанализа летальности креветок в рассоле. Четыре экстракта (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; и Pe- P. ecklonii) из рода Plectranthus, известные своей антиоксидантной активностью (неопубликованные результаты), были протестированы. Дополнительно два природных соединения (1 и 2), полученные из Plectranthus spp., и три полусинтетических производных (3, 4, 5; Рисунок 3), все описанные в другой работе3, также были исследованы. При этом сообщается об их предварительной оценке с точки зрения потенциальной цитотоксической активности.

Все протестированные экстракты показали очень обнадеживающие результаты, с очень низкими показателями смертности, сопоставимыми с показателями, зарегистрированными для заготовки (солевой раствор) и отрицательного контроля (ДМСО; Рисунок 4). И наоборот, среди чистых соединений 1-5 только производное 5 демонстрировало низкую смертность (2,30% при концентрации 100 ppm) без общей токсичности (рисунок 5).

Figure 4
Рисунок 4: Летальность экстрактов на Artemia salina. Смертность A. salina (%) после 24 ч воздействия четырех метанольных экстрактов Plectranthus spp., при 0,1 мг/мл (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; Pe- P. ecklonii). Все экстракты были приемлемы с точки зрения общей токсичности с использованием этого анализа. Соль соответствует соляному раствору (заготовка); K2Cr2O7 использовался в качестве положительного контроля, а DMSO в качестве отрицательного контроля. Результаты были выражены как среднее значение трех независимых экспериментов, каждый с внутренними квадрупликатами (n = 12) ± SD. Сравнения проводились внутри групп путем дисперсионного анализа с использованием односторонней ANOVA с пост-тестом Даннетта. Значительные различия между контрольной и экспериментальной группами оценивались с использованием коммерческого программного обеспечения для статистического анализа. Уровень вероятности p < 0,01 был признан указывающим на статистическую значимость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Летальность соединений на Artemia salina. Смертность A. salina (%) после 24 ч воздействия пяти чистых соединений по 0,1 мг/мл (1 и 2 являются натуральными продуктами и 3-5 - производными, полученными из 1 и 2). Очевидно, что только 5 показывают очень ограниченную токсичность при использовании этого анализа. Соль соответствует соляному раствору (заготовка); K2Cr2O7 использовался в качестве положительного контроля, а DMSO в качестве отрицательного контроля. Результаты были выражены как среднее значение трех независимых экспериментов, каждый с внутренними квадрупликатами (n = 12) ± SD. Сравнения проводились внутри групп путем дисперсионного анализа с использованием односторонней ANOVA с пост-тестом Даннетта. Значительные различия между контрольной и экспериментальной группами оценивались с использованием коммерческого программного обеспечения для статистического анализа. Уровень вероятности p < 0,01 был признан указывающим на статистическую значимость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Натуральные продукты 1 и 2 показали умеренную летальность (36,68% и 30,95% при 100 ppm соответственно), тогда как полусинтетические производные 3 и 4, полученные из 1 и 2, соответственно, были более токсичными, чем исходный каркас (64,02% и 36,64% при 100 ppm соответственно; Рисунок 5).

Общие данные свидетельствуют о том, что все протестированные экстракты, известные своей антиоксидантной активностью и не показывающие общей токсичности, могут рассматриваться в качестве кандидатов на дальнейшие исследования активности in vitro и токсичности на отдельных клеточных линиях. Если отсутствие токсичности также продемонстрировано в кожных моделях, может быть проведена разработка новых биологически активных продуктов для кожного применения. С другой стороны, токсические эффекты, наблюдаемые для соединений 1-4, могут сделать их подходящими кандидатами для дополнительных оценок в качестве противоопухолевых агентов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В последние годы научное сообщество усилило свое внимание к альтернативным моделям скрининга токсичности21. Помимо биоанализа на летальность A. salina, другие методологии обычно выполняются для оценки переносимости образцов и включают биоанализы позвоночных (таких как грызуны), беспозвоночных (таких как рыбки данио), методы in vitro с использованием штаммов дрожжей или клеток и методы in silico 22,23,24,25 . Все эти методы имеют явные преимущества и недостатки, учитывая потраченные деньги и время, воспроизводимость результатов и тип анализируемой выборки. Например, подходы in silico представляют собой стандартизированную недорогую методологию, требующую минимального оборудования. Тем не менее, когда такие исследования сосредоточены на одной цели, получаются результаты низкого качества, что делает эту альтернативу вне рамок предварительных скринингов, как мы представляем в этом исследовании25,26. Когда дело доходит до микроорганизмов, Saccharomyces cerevisiae считается одной из наиболее широко используемых моделей для оценки токсичных соединений23. На самом деле, использование дрожжей in vitro, как правило, быстро и легко осуществимо; однако он может быть дорогостоящим, поскольку требует специфических химических продуктов и оборудования и показывает низкую чувствительность к минимальным дозам цитотоксических соединений27. В альтернативном подходе человеческие клетки могут быть использованы быстрым, простым и недорогим способом. Тем не менее, они не могут представлять весь организм; таким образом, взаимодействия между различными типами клеток и системные возмущения, происходящие в физиологических условиях, должным образом не учитываются25,26. С другой стороны, анализы in vivo имеют большое преимущество в том, чтобы учитывать весь организм, но животные модели (такие как грызуны) требуют больше времени для выполнения анализа, являются более дорогими и подразумевают сложные этические соображения25. И наоборот, анализы in vivo с использованием водных организмов для скрининга токсичности, как правило, хорошо приняты, учитывая также, что использование морских беспозвоночных подвергается менее этическим проблемам, а методология проста в выполнении, быстра и дешева21,24. В этом контексте использование рыбок данио для изучения общей токсичности часто представляет собой первый выбор в этой области. Фактически, по сравнению с другими испытаниями на животных, это можно считать недорогим вариантом, так как рыбки данио быстро развиваются и достигают ранней личиночной стадии примерно через 72 ч до 13 дней после оплодотворения21,28. Тем не менее, содержание рыбок данио требует хорошо подготовленных операторов и конкретных условий, таких как аквариум с циркулирующей системой, способной аэрировать и фильтровать воду системы, для поддержания общего качества; кроме того, необходимо несколько крышек и дренажных крышек, так как рыбки данио могут прыгать, а также определенные условия освещения (14 ч света, 10 ч темноты), и уровни pH необходимо проверять ежедневно, среди прочего29,30. Все вместе эти соображения делают модели рыбок данио более трудоемкими и дорогими, чем модель артемии, о которой сообщается здесь, поскольку эти микрокрустацеаны легче обрабатывать и жизнеспособны для выращивания в больших популяциях с использованием лабораторных методов. Это делает A. salina, несомненно, одним из наиболее часто используемых инструментов скрининга, в основном используемых для проверки общей токсичности различных образцов, таких как лекарства и экстракты лекарственных растений1.

В протоколе A. salina nauplii были выращены, собраны и инкубированы с подходящими образцами в течение 24 ч, чтобы оценить уровень смертности nauplii, индуцированный каждым образцом. На первом этапе вылупление яиц проводят в коммерчески доступном воронкообразном племенном сосуде, в который вводится энергичное бурление (рисунок 2А). Эта принудительная аэрация необходима, так как она позволяет вылуплению креветок в рассоле происходить максимально успешно. Вылупление происходит примерно через 24 ч при 25 ± 3 °C, тогда как при более низких температурах может потребоваться до 48 ч. Как только яйца вылупляются, насос выключается, чтобы пустые ящики для яиц плавали сверху, в то время как науплии и невылупившиеся яйца легко собираются, открыв воронку внизу. Во время наших экспериментов полное вылупление яиц так и не было достигнуто, с последующим присутствием науплий и незрелых яиц в собранном растворе. По этой причине, чтобы эффективно разделить две формы артемии, подготовлено оборудование ручной работы для миграции соленых креветок (этап 1.2). Один контейнер заполняется собранными организмами, а затем покрывается алюминиевой фольгой, в то время как другой получатель подвергается воздействию прямого света лампы. В этих условиях невылупившиеся яйца, как правило, оседают, тогда как живые науплии притягиваются светом, попадающим на соседний контейнер, способствуя миграции из одной стороны в другую через мостовое соединение. Через 4 ч почти все живые науплии оказываются внутри контейнера, подвергшегося воздействию света и готовые к сбору для выполнения анализа. На этом этапе части раствора соленой воды, содержащие от десяти до пятнадцати науплий, удаляют и инкубируют с каждым из образцов, подлежащих испытанию.

В этой работе было показано, насколько метод эффективен, экономичен и прост в выполнении. Тем не менее, некоторые критические моменты должны быть признаны при выполнении этого анализа.

Анализ обычно проводится с водопроводной водой. В зависимости от географических и физико-химических факторов водопроводная вода проявляет различное распределение жесткости, влияя на воспроизводимость анализа и, в частности, на стадию вылупления яиц. По той же причине использование морской воды может повлиять на воспроизводимость испытания. Изменяющаяся концентрация соли, наличие загрязняющих веществ, микропластика и других тельца заставили бы оператора пройти дальнейшие этапы, такие как фильтрация и другие виды очистки, что сделало бы эксперимент более сложным и менее простым в обращении. Учитывая все соображения, оптимальные условия должны быть установлены на основе характеристик и наличия водопроводной воды, особенно путем тщательного регулирования количества добавляемой искусственной соли, которая создает подходящую среду и действует как питание для науплий.

Большие колебания температуры могут привести к снижению скорости вылупления. Как следствие, можно наблюдать низкий уровень живой артемии , смешанной с большим количеством невылупившихся яиц. Очевидно, что такие условия не подходят для разработки надежных анализов, поэтому следует рассмотреть вопрос о контролируемой климатизации помещения или использовании соответствующих вертикальных инкубаторов.

Требуется энергичная аэрация раствора внутри инкубационного сосуда. Наличие непрерывного пузырька способствует контакту между яйцами и ускоряет процесс вылупления.

Сбор как невылупившихся яиц, так и науплий во время сбора урожая может сильно повлиять на надежность анализа. Это связано с возможностью вылупления во время инкубации с образцами. В этом случае не все науплии будут подвергаться воздействию в течение одинакового периода времени с последующими ошибочными показателями смертности. Поскольку яйца и науплии слишком малы, чтобы их можно было эффективно разделить, требуется более длительное время инкубации в инкубационном оборудовании или использование ручного миграционного оборудования.

Каждая лунка должна содержать 10-15 науплий для стадии инкубации, тщательно подсчитываемой с помощью бинокулярного микроскопа (12-кратное увеличение). Наличие слишком большого количества науплий в одном колодце может затруднить окончательный подсчет или даже ошибиться из-за перекрытия. С другой стороны, небольшое количество креветок приведет к результатам, не имеющим статистической значимости.

Как видно, большинство проблем этого метода связаны со стадиями вылупления и роста, где требуется больше внимания, чтобы избежать проблем с надежностью. Тем не менее, метод может допускать модификации, особенно в отношении наиболее критических точек, описанных выше. Конечно, при изменении одного из этих параметров может потребоваться провести несколько попыток оптимизации исходного метода. Например, изменение температуры может помочь контролировать общее время анализа: повышение температуры до 28-29 °C также увеличит скорость вывода и ускорит весь процесс.

Некоторые ограничения биоанализа A. salina также связаны со стабильностью образцов к условиям и времени испытаний. Анализ может быть проведен только с использованием образцов, которые стабильны при комнатной температуре и при видимом свете. Более того, необходимо учитывать, что вся процедура длится не менее 4 дней, и если скорость вылупления низкая, для анализа может потребоваться дополнительный день для этапа вылупления.

В целом, в этом исследовании мы выделяем два примера применения общей оценки токсичности с помощью метода A. salina. Общая токсичность была установлена для всех испытанных образцов. Экстракты из растений Plectranthus и соединение 5 не проявляли общей токсичности, в то время как соединения 1-4 оказались умеренно или даже высокотоксичными на солевых креветках. В частности, негативное влияние соединений 1 и 2 на артемию ранее было продемонстрировано Ситареком и Матиасом анализами MTT и SRB/MTT соответственно31,32. В то же время бензоилированные аналоги, соединения 3 и 4, показывают более высокие значения токсичности, чем их предшественники 1 и 2, подчеркивая, что функционализация эфира может играть важную роль с точки зрения цитотоксичности, что подтверждено для соединения 4 в клеточной линии рака НМРЛ человека Garcia et al.33. Тем не менее, необходимы другие анализы, чтобы подтвердить, что такая цитотоксическая активность может быть использована в терапии рака. С другой стороны, производное 5 вместе со всеми анализируемыми экстрактами не показало токсичности и является наиболее перспективным чистым соединением серии. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования для оценки потенциальной биологической активности для кожного применения.

Здесь мы продемонстрировали, как использование метода на основе artemia salina в качестве инструмента скрининга может позволить сэкономить время и деньги по сравнению с другими известными методологиями. Он представляет собой эффективный и выгодный способ использования в условиях предварительной токсичности. Его можно использовать в присутствии различных и сложных образцов, синтетических и полусинтетических препаратов, а также для биоуправляемого фракционирования экстрактов и образцов натуральных продуктов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, финансовых или иных.

Acknowledgments

Памяти профессора Амилькара Роберто.

Эта работа была финансово поддержана Фондом социальной и технологической науки (FCT, Португалия) в рамках проектов UIDB/04567/2020 и UIDP/04567/2020, приписываемых CBIOS и гранту PhD SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Thermo Fisher Scientific, Denmark 174899 Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish
Aluminium foil Albal - Can be purchased in supermarket
Artemio Set JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany 61066000 Can be purchased in pet shops
Binocular microscope Ceti, Belgium  1700.0000 Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz
Bottles - - 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm
Brine shrimp cysts JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany 3090700 Can be purchased in pet shops
Brine shrimp salt JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany 3090600 Can be purchased in pet shops
Dimethyl sulfoxide (DMSO) VWR chemicals CAS: 67-68-5  99% purity
Discartable tips Diamond F171500 Volume range: 100 - 1000 µL
Eppendorf microtubes BRAND 7,80,546 Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY
Erlenmeyer flask VWR chemicals 4,47,109 volume: 100 mL
Glass beaker Normax 3.2111654N Volume: 1000 mL
Gloves Guantes Luna GLSP3 -
GraphPad Prism GraphPad Software, San Diego, CA, USA - GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software
Home-made A. salina Grower  -  - Home made: two plastic bottles connected by a hose
Hot glue Parkside PHP500E3 230 V, 50 Hz, 25 W
Incubator Heidolph Instruments, Denmark   - One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006
Light Roblan SKYC3008FE14 LED light bulb
Micropipettes VWR chemicals 613-5265 Volume range: 100 - 1000 µL
Potassium dichromate (K2Cr2O7) VWR chemicals CAS: 7778-50-9  99% purity
Pump ProAir a50 JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany  - Included in the Artemio Set+1 kit
Rubber tube - - 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter
Stirring rod VWR chemicals 441-0147 Equation 1 6 mm, 250 mm
Termometer VWR chemicals 620-0821 0 - 100 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
  2. Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
  3. Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
  4. Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
  5. Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
  6. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  7. Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
  8. Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
  9. Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
  10. Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
  11. Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
  12. Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
  13. Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
  14. Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
  15. Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
  16. Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
  17. Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
  18. Svensson, B. -M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
  19. Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
  20. Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
  21. Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
  22. Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
  23. Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
  24. Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
  25. Fischer, I., Milton, C., Wallace, H. Toxicity testing is evolving. Toxicology Research. 9 (2), 67-80 (2020).
  26. de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
  27. Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
  28. Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
  29. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  30. Cunliffe, V. T. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
  31. Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
  32. Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
  33. Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).

Tags

Химия выпуск 188
Биоанализ летальности с использованием <em>Artemia salina</em> L.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santos Filipe, M., Isca, V. M. S.,… More

Santos Filipe, M., Isca, V. M. S., Ntungwe N., E., Princiotto, S., Díaz-Lanza, A. M., Rijo, P. Lethality Bioassay Using Artemia salina L.. J. Vis. Exp. (188), e64472, doi:10.3791/64472 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter