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Medicine

पूर्ण मोटाई उपास्थि दोषों के एक चूहे मॉडल का विकास और मूल्यांकन

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64475
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 1, 5, 1, 3, 1, 1
1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2Fuyang Orthopaedics and Traumatology Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 3College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, 4Affiliated Zhejiang Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Xianju County Hospital of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल चूहों के ऊरु ट्रोक्लेयर नाली में छेद ड्रिलिंग करके और बाद के दर्द व्यवहार और हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों को मापकर एक पूर्ण मोटाई उपास्थि दोष (एफटीसीडी) मॉडल स्थापित करता है।

Abstract

आघात के कारण घुटने के जोड़ के उपास्थि दोष क्लिनिक में एक आम खेल संयुक्त चोट है, और इन दोषों के परिणामस्वरूप जोड़ों में दर्द, बिगड़ा हुआ आंदोलन और अंततः, घुटने के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (केओए) होते हैं। हालांकि, उपास्थि दोष या यहां तक कि केओए के लिए बहुत कम प्रभावी उपचार है। चिकित्सीय दवाओं को विकसित करने के लिए पशु मॉडल महत्वपूर्ण हैं, लेकिन उपास्थि दोषों के लिए मौजूदा मॉडल असंतोषजनक हैं। इस काम ने चूहों के ऊरु ट्रोक्लेयर नाली में छेद करके एक पूर्ण मोटाई उपास्थि दोष (एफटीसीडी) मॉडल स्थापित किया, और बाद के दर्द व्यवहार और हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों को रीडआउट प्रयोगों के रूप में इस्तेमाल किया गया। सर्जरी के बाद, यांत्रिक वापसी सीमा कम हो गई थी, घायल स्थल पर चोंड्रोसाइट्स खो गए थे, मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेस एमएमपी 13 अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई थी, और टाइप II कोलेजन अभिव्यक्ति में कमी आई थी, जो मानव उपास्थि दोषों में देखे गए रोग संबंधी परिवर्तनों के अनुरूप थी। यह पद्धति प्रदर्शन करने में आसान और सरल है और चोट के तुरंत बाद सकल अवलोकन को सक्षम बनाती है। इसके अलावा, यह मॉडल नैदानिक उपास्थि दोषों की सफलतापूर्वक नकल कर सकता है, इस प्रकार उपास्थि दोषों की रोग प्रक्रिया का अध्ययन करने और संबंधित चिकित्सीय दवाओं को विकसित करने के लिए एक मंच प्रदान करता है।

Introduction

आर्टिकुलर कार्टिलेज एक अत्यधिक विभेदित और घना ऊतक है जिसमें चोंड्रोसाइट्स और बाह्य मैट्रिक्स1 शामिल हैं। आर्टिकुलर कार्टिलेज की सतह परत हाइलिन कार्टिलेज का एक रूप है, जिसमें एक चिकनी सतह, कम घर्षण, अच्छी ताकत और लोच और उत्कृष्ट यांत्रिक तनाव सहिष्णुता2 है। बाह्य मैट्रिक्स में कोलेजन प्रोटिओग्लाइकन और पानी शामिल हैं, और टाइप II कोलेजन कोलेजन का मुख्य संरचनात्मक घटक है, क्योंकि यह कुल कोलेजन3 का लगभग 90% है। चूंकि उपास्थि ऊतक में कोई रक्त वाहिका एं या तंत्रिकाएं मौजूद नहीं हैं,इसलिए चोट के बाद आत्म-मरम्मत करने की क्षमता का अभाव है। इसलिए, आघात के कारण उपास्थि दोष हमेशा क्लीनिकों में एक असाध्य संयुक्त रोग रहा है; इसके अतिरिक्त, यह संयुक्त रोग युवा लोगों पर हमला करता है, और वैश्विक घटना 5,6 बढ़ रही है। घुटने का जोड़ उपास्थि दोषों का सबसे आम स्थल है, और यहां दोष जोड़ों के दर्द, जोड़ों की शिथिलता और आर्टिकुलर कार्टिलेज अपघटन के साथ होते हैं, जो अंततः घुटने के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (केओए) 7 का कारण बनते हैं। घुटने के जोड़ के उपास्थि दोष रोगियों के लिए आर्थिक और शारीरिक बोझ लाते हैं और रोगियोंके जीवन की गुणवत्ता को गंभीर रूप से प्रभावित करते हैं। यह बीमारी एक बड़ी और तत्काल नैदानिक चुनौती है जिसका कोई आसन्न समाधान नहीं है। वर्तमान में, कार्टिलेज दोषों के लिए सर्जरी उपचार का मुख्य आधार है, लेकिन इसका दीर्घकालिक परिणाम असंतोषजनक रहताहै।

नैदानिक उपास्थि दोष अंततः केओए का कारण बनते हैं, और, इस प्रकार, केओए पशु मॉडल आमतौर पर उपास्थि दोषों और दवा के विकास के पैथोलॉजिकल अध्ययन के लिए उपयोग किए जाते हैं। उपास्थि दोष की मरम्मत की पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रिया को समझने के लिए पशु मॉडल की स्थापना महत्वपूर्ण है, जिसका उपयोग उपास्थि पुनर्जनन और फाइब्रोकार्टिलेज और हाइलिन कार्टिलेज10 के बीच परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले केओए पशु मॉडल, जैसे कि एंटीरियर क्रूसिएट लिगामेंट ट्रांससेक्शन (एसीएलटी) के सर्जिकल मॉडल, मेडियल मेनिस्कस (डीएमएम), ओवरीक्टॉमी (ओवीएक्स), और हल्थ की अस्थिरता, को आमतौर पर दीर्घकालिक मॉडलिंग की आवश्यकता होती है और केवल पैथोलॉजिकल और दर्द मूल्यांकन की अनुमति होती है, जोदवा विकास की दक्षता के लिए सीमाएं पैदा करता है। सर्जिकल मॉडल के अलावा, रासायनिक मॉडल, जैसे कि मोनोआयोडोसेटेट (एमआईए) और पपैन इंजेक्शन भी उपास्थि दोष का परिणाम है, लेकिन दोष की डिग्री को अच्छी तरह से प्रबंधित नहीं किया जा सकता है, और स्थितियां नैदानिक वास्तविकतासे बहुत दूर हैं। टकराव बड़े जानवरों में उपास्थि दोषों को मॉडल करने के लिए एक और दृष्टिकोण है, लेकिन यह विधि विशिष्ट उपकरणों के उपयोग पर निर्भर करती है और शायद ही कभीलागू होती है।

सारांश में, मौजूदा केओए मॉडल उपास्थि दोषों के रोगजनन का अध्ययन करने या नई दवाओं को विकसित करने के लिए आदर्श नहीं हैं, और उपास्थि दोषों के लिए एक विशिष्ट और मानकीकृत मॉडल की आवश्यकता है। इस अध्ययन ने चूहों में ऊरु ट्रोक्लेयर नाली में छेद करके एक पूर्ण मोटाई उपास्थि दोष (एफटीसीडी) मॉडल स्थापित किया। मॉडल मूल्यांकन के लिए सकल अवलोकन, दर्द व्यवहार परीक्षण और हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण आयोजित किए गए थे। केओए के अन्य पशु मॉडल के विपरीत, इस मॉडल का चूहों की सामान्य स्थिति पर बहुत कम प्रभाव पड़ता है। यह मॉडलिंग दृष्टिकोण सुलभ है, अच्छी तरह से प्रबंधित किया जा सकता है, और उपास्थि दोषों से केओए तक प्रगति की समझ और प्रभावी चिकित्सीय के विकास का समर्थन करता है। इस मॉडल का उपयोग उन उपचारों के परीक्षण के लिए भी किया जा सकता है जो पूर्व-ऑस्टियोआर्थ्रिटिक जोड़ों में दोषों को ठीक करके केओए को रोकते हैं।

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Protocol

पशु प्रयोगों को पारंपरिक चीनी चिकित्सा के झेजियांग विश्वविद्यालय के चिकित्सा मानकों और नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, जो प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग और देखभाल पर चीन कानून के अनुरूप है। वर्तमान अध्ययन में, 150-180 ग्राम वजन वाले 6 सप्ताह के नर स्प्राग-डॉवले (एसडी) चूहों का उपयोग किया गया था। जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. चूहों में एक पूर्ण मोटाई उपास्थि दोष मॉडल की स्थापना

  1. नए वातावरण के अनुकूलन के 1 सप्ताह के बाद, यादृच्छिक रूप से और समान रूप से चूहों को दो समूहों (एन = 8 चूहों / समूह) में विभाजित करें। शाम समूह के चूहों की शाम सर्जरी होगी, जबकि मॉडल समूह के चूहों में प्रयोगात्मक सर्जरी होगी जिसमें ऊरु ट्रोक्लियर नाली में ड्रिलिंग छेद शामिल होंगे।
    नोट: चूहों के पैर की उंगलियों की रक्षा के लिए प्रत्येक पिंजरे को बाँझ कॉर्नकोब पैडिंग ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ कवर किया जाना चाहिए।
  2. पेंटोबार्बिटल सोडियम (40 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन (आई.पी.) द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें। फिर, पर्याप्त संज्ञाहरण की पुष्टि करने के लिए चूहों के पैर की उंगलियों को धीरे से दबाएं। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए चूहों की आंखों पर एक पशु चिकित्सक मरहम का उपयोग करें।
    नोट: पशु सर्जरी को आटोक्लेव सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करके एक समर्पित ऑपरेटिंग रूम में किया जाना चाहिए। ऑपरेटरों को सर्जरी के दौरान साफ प्रयोगशाला कोट, फेसमास्क, हेड कवर और बाँझ दस्ताने पहनने चाहिए। सर्जिकल क्षेत्र पर बाँझ पैड रखें और उपयोग करने से पहले सभी उपकरणों को निष्फल करें। पूरी प्रक्रिया के दौरान थर्मल समर्थन प्रदान करें।
  3. चूहे को लापरवाह स्थिति में ऑपरेटिंग टेबल पर रखें, बाएं और दाएं पिछले अंगों को शेव करें, और सर्जिकल साबुन के साथ घुटने के जोड़ क्षेत्र को साफ करें, इसके बाद बाँझ परिस्थितियों में तीन बार एंटीसेप्टिक पोविडोन-आयोडीन घोल और अल्कोहल को बदलें। चूहे के ऊपर एक बाँझ ड्रेप रखें, और केवल कीटाणुरहित घुटने के जोड़ को उजागर करें।
  4. चूहे के घुटने के जोड़ के बीच में ऊपर से नीचे तक स्केलपेल ब्लेड (संख्या 11) के साथ 1 सेमी चीरा लगाएं, और सतही विच्छेदन के बाद पेटेला के मध्यवर्ती किनारे के साथ संयुक्त कैप्सूल और क्वाड्रिसेप्स फेमोरिस टेंडन को काट लें।
    नोट: क्वाड्रिसेप्स फेमोरिस टेंडन घुटने के जोड़13 के फ्लेक्सन के दौरान पेटेला और फेमोरल कोंडिल से जुड़ा होता है। संयुक्त कैप्सूल में देखा जाने वाला नाली ऊरु ट्रोक्लेयर नाली है, और डिस्टल फेमोरल कोंडिल औसत दर्जे का और पार्श्व कोंडिल बनाता है।
  5. पेटेला को बाहर की ओर घुमाएं, और टिबिया और फाइबुला को 90 डिग्री कोण पर फ्लेक्स करें ताकि फेमोरल कोंडिल के ट्रोक्लेया को पूरी तरह से उजागर किया जा सके। 0.1 मिमी की गहराई के साथ ऊरु ट्रोक्लेयर नाली में एक पूर्ण मोटाई उपास्थि दोष बनाने के लिए 10 सेकंड के लिए 4,000 आरपीएम पर उपास्थि की सतह पर 1.6 मिमी व्यास के गोलाकार ड्रिल बिट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
    नोट: ड्रिलिंग प्रक्रिया के दौरान आसपास की हड्डी के ऊतकों को थर्मल आघात को कम करने के लिए रुक-रुक कर नमकीन का उपयोग करें।
  6. शल्य चिकित्सा स्थल को 0.9% खारे घोल में भिगोई गई कपास की गेंदों से पोंछें, पेटेला को बदलें, घुटने को एक विस्तार स्थिति में रखें, और चीरे को परत दर परत 4-0 सीवन के साथ झुकाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. जानवरों को उरोस्थि के साथ हीटिंग पैड पर रखें, जब तक वे जाग न जाएं, तब तक उनकी निगरानी करें, और फिर उन्हें अपने पिंजरों में वापस कर दें। दर्द से राहत के लिए ऑपरेशन के बाद हर 8 घंटे में तीन बार बुप्रेनोर्फिन (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
  7. सर्जरी के 3 दिन, 10 दिन और 17 दिन बाद सभी चूहों के दर्द से संबंधित व्यवहार का परीक्षण करें, जैसा कि खंड 2 में वर्णित है।

2. मैकेनिकल निकासी सीमा (एमडब्ल्यूटी)

नोट: चूहों के द्विपक्षीय पश्चवर्ती प्लांटर के एमडब्ल्यूटी को शास्त्रीय वॉन फ्रे फिलामेंट दर्द माप विधि14 द्वारा मापा गया था।

  1. चूहे को एक एकल प्लास्टिक कक्ष (17 सेमी x 11 सेमी x 13 सेमी) में एक तार जाल मंच पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें), और तार जाल आधार को एक मेज से 50 सेमी ऊपर रखें। अनुकूलन के 30 मिनट के बाद एमडब्ल्यूटी को मापें।
  2. वॉन फ्रे फिलामेंट ( सामग्री की तालिका देखें) को प्रत्येक चूहे के पिछले पंजे की प्लांटर सतह पर लंबवत दबाएं, और ब्रश को लगभग 2 सेकंड तक झुकाएं, पिछले पंजे के केंद्र के सबसे मोटे हिस्से से बचें।
  3. धीरे-धीरे उत्तेजना वजन को सबसे कम 4 ग्राम से बढ़ाएं जब तक कि सकारात्मक प्रतिक्रिया (पंजा वापसी या पंजा चाटना) न हो।
    नोट: प्रत्येक उत्तेजना के बीच का अंतराल 1 मिनट से अधिक होना चाहिए। एमडब्ल्यूटी को पांच उत्तेजनाओं में तीन सकारात्मक प्रतिक्रियाओं के रूप में परिभाषित किया गया है; ग्राम में उत्तेजना वजन रिकॉर्ड करें।
  4. ग्राम में दर्ज न्यूनतम उत्तेजना वजन के अनुसार शाम और मॉडल समूहों के लिए औसत मूल्यों की गणना करें।

3. हिस्टोपैथोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण

  1. सर्जरी के 17 और 56 दिनों के बाद, चूहों को 40 मिलीग्राम / किग्रा पेंटोबार्बिटल सोडियम (आई.पी.) के साथ एनेस्थेटाइज करें, और दिल से रक्त निकालकर सभी चूहों की बलि दें। मध्य-फीमर और मध्य-टिबिया पर हड्डी को काटकर घुटनों को अलग करें, और आसपास की मांसपेशियों के ऊतकों को विच्छेदित करें। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए घुटने के जोड़ों को हटा दें।
  2. कमरे के तापमान पर 48 घंटे के लिए 10% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान के 20 एमएल में घुटने के जोड़ों को ठीक करें, और फिर उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 सप्ताह के लिए ऑर्बिटल शेकर में 10% ईडीटीए समाधान के 20 एमएल के साथ डिकैल्सीफाई करें। हर दिन EDTA समाधान बदलें।
  3. एम्बेडिंग बॉक्स के आकार को फिट करने के लिए घुटने के जोड़ को ट्रिम करें। निर्जलित घुटने के जोड़ों को 100% पैराफिन15 में एम्बेड करें।
  4. पैराफिन-एम्बेडेड घुटने के जोड़ों को एक माइक्रोटोम के धारक पर रखें, कोण को समायोजित करें, और पैराफिन नमूने को ब्लेड से ट्रिम करें जब तक कि सतह सपाट न हो।
  5. पैराफिन स्लाइस की मोटाई 3 μm पर सेट करें, और 40 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में स्लाइस को समतल करें।
  6. स्लाइस को ग्लास स्लाइड पर चिपकाएं, उन्हें 45 डिग्री सेल्सियस बेकिंग मशीन ( सामग्री की तालिका देखें) में रखें जब तक कि वे सूख न जाएं, और उन्हें कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  7. डीवैक्सिंग और पुनर्जलीकरण: 4 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में स्लाइस को डीवैक्स करें, और फिर स्लाइस को 100% जाइलीन (तीन बार), 100% इथेनॉल (दो बार), 95% इथेनॉल, 80% इथेनॉल और 75% इथेनॉल में हर बार 5 मिनट के लिए क्रमिक रूप से रखें।
  8. हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला होना।
    1. डीवैक्स, रीहाइड्रेट करें, और 2 मिनट के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी के साथ स्लाइस धो लें।
    2. स्लाइस को 3 मिनट के लिए 0.5% हेमटोक्सीलिन ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ दाग दें, और स्लाइस को डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें जब तक कि स्लाइस सतहों पर कोई हेमटोक्सीलिन अवशेष न हो।
    3. स्लाइस को 3 सेकंड के लिए 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड अल्कोहल में डुबोएं, और स्लाइस को 2 मिनट के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें।
    4. स्लाइस को 1% अमोनिया पानी में 10 सेकंड के लिए भिगोदें, और स्लाइस को डबल-डिस्टिल्ड पानी से 2 मिनट के लिए धो लें।
    5. 1 मिनट के लिए इओसिन ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ स्लाइस को दाग दें, और स्लाइस को डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें जब तक कि स्लाइस सतहों पर कोई ईओसिन अवशेष न हो।
    6. स्लाइस को 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल, और 100% जाइलीन (तीन बार) में हर बार 1 मिनट के लिए क्रमिक रूप से डुबोएं।
    7. प्रत्येक स्लाइस में तटस्थ राल की एक बूंद ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, और इसे कवरस्लिप के साथ सील करें।
  9. फास्ट फ्रीन (एसओ) धुंधला होना।
    1. डीवैक्स, रीहाइड्रेट करें, और 2 मिनट के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी के साथ स्लाइस धो लें।
    2. स्लाइस को 3 मिनट के लिए 0.05% फास्ट ग्रीन ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ दाग दें, और स्लाइस को डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें जब तक कि स्लाइस की सतह पर कोई फास्ट ग्रीन अवशेष न हो।
    3. स्लाइस को 1% एसिटिक एसिड घोल में 10 सेकंड के लिए डुबोएं, और स्लाइस को डबल-डिस्टिल्ड पानी से 2 मिनट के लिए धो लें।
    4. 2 मिनट के लिए 2.5% एसओ ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ स्लाइस को दाग दें, और फिर स्लाइस को डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें जब तक कि स्लाइस सतहों पर कोई एसओ अवशेष न हो।
    5. स्लाइस को 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल, और 100% जाइलीन (तीन बार) में हर बार 1 मिनट के लिए क्रमिक रूप से डुबोएं।
    6. प्रत्येक स्लाइस में तटस्थ राल की एक बूंद जोड़ें, और इसे कवरस्लिप के साथ सील करें।
  10. टोलुइडाइन ब्लू (टीबी) धुंधला हो जाना
    1. डीवैक्स, रीहाइड्रेट करें, और 2 मिनट के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी के साथ स्लाइस धो लें।
    2. स्लाइस को 2 मिनट के लिए 1% टीबी समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) में डुबोएं, और स्लाइस को डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें जब तक कि स्लाइस की सतह पर कोई टोलुडीन नीला अवशेष न हो।
    3. स्लाइस को 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल, और 100% जाइलीन (तीन बार) में हर बार 1 मिनट के लिए क्रमिक रूप से डुबोएं।
    4. प्रत्येक स्लाइस में तटस्थ राल की एक बूंद जोड़ें, और इसे कवरस्लिप के साथ सील करें।
  11. मैसन धुंधला हो गया
    1. डीवैक्स, रीहाइड्रेट करें, और 2 मिनट के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी के साथ स्लाइस धो लें।
    2. स्लाइस में बूइन घोल ( सामग्री की तालिका देखें) डालें, उन्हें 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर दाग दें, और उन्हें डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें जब तक कि स्लाइस की सतह पर पीला रंग गायब न हो जाए।
    3. स्लाइस को 3 मिनट के लिए सेलेटाइट ब्लू ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ दाग दें, और स्लाइस को डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें जब तक कि स्लाइस सतहों पर कोई सेलेटाइट नीला अवशेष न हो।
    4. स्लाइस को 3 मिनट के लिए हेमटोक्सीलिन के साथ दाग दें, और स्लाइस को डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें जब तक कि स्लाइस सतहों पर कोई हेमटोक्सीलिन अवशेष न हो।
    5. स्लाइस को 5 सेकंड के लिए अम्लीय इथेनॉल में डुबोएं, और स्लाइस को 2 मिनट के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें।
    6. स्लाइस को 10 मिनट के लिए पोन्सेउ फुचिन ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ दाग दें, और स्लाइस को डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें जब तक कि स्लाइस सतहों पर कोई पोन्सेउ फ्यूचिन अवशेष न हो।
    7. स्लाइस को 10 मिनट के लिए फॉस्फोमोलिब्डिक एसिड (सामग्री की तालिका देखें) में डुबोएं, फिर उन्हें 5 मिनट के लिए टीबी के घोल में डुबोएं, और स्लाइस को डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें जब तक कि स्लाइस की सतह पर कोई टीबी अवशेष न हो।
    8. स्लाइस को 2 मिनट के लिए एक कमजोर एसिड घोल में डुबोएं, और स्लाइस को 2 मिनट के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें।
    9. स्लाइस को 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल, और 100% जाइलीन (तीन बार) में हर बार 1 मिनट के लिए क्रमिक रूप से डुबोएं।
    10. प्रत्येक स्लाइस में तटस्थ राल की एक बूंद जोड़ें, और इसे कवरस्लिप के साथ सील करें।
  12. मैनकिन के स्कोरिंग सिस्टम16 के अनुसार आर्टिकुलर कार्टिलेज अपघटन की डिग्री निर्धारित करने के लिए डबल-ब्लाइंड सेटिंग में माइक्रोस्कोप के तहत सभी स्लाइस का निरीक्षण करें।
  13. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री।
    1. स्लाइस को नियमित रूप से डीवैक्स और रीहाइड्रेट करें, और 2 मिनट के लिए पीबीएस के साथ स्लाइस धो लें।
    2. स्लाइस को सोडियम साइट्रेट घोल में डुबोएं, और एंटीजन की मरम्मत के लिए 4 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में स्लाइस रखें। पीबीएस के साथ स्लाइस को 3 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
    3. स्लाइस को 10 मिनट के लिए 0.3% ट्राइटन एक्स -100 समाधान में डुबोएं, और हर बार 3 मिनट के लिए पीबीएस के साथ स्लाइस को दो बार धोएं।
    4. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मेथनॉल में 3% एच 2 ओ2समाधान जोड़कर अंतर्जात पेरोक्सीडेज गतिविधि को अवरुद्ध करें। हर बार 3 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार स्लाइस धोएं।
    5. किसी भी गैर-विशिष्ट बंधन को अवरुद्ध करने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 5% बकरी सीरम के साथ अनुभागों को इनक्यूबेट करें। हर बार 3 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार स्लाइस धोएं।
    6. प्रत्येक स्लाइस में पीबीएस-पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-कोल 1, 1: 50; एंटी-कोल 3, 1: 50; एंटी-कोल 2, 1: 100; और एंटी-एमएमपी 13, 1: 100; सामग्री की तालिका देखें) के 100 μL जोड़ें, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। हर बार 3 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार स्लाइस धोएं।
    7. प्रत्येक स्लाइस को 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस-पतला (1:100) द्वितीयक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी खरगोश या बकरी विरोधी माउस, सामग्री की तालिका देखें) के 100 μL के साथ इनक्यूबेट करें। हर बार 3 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार स्लाइस धोएं।
    8. प्रत्येक स्लाइस में 3, 3 '-डायमिनोबेंज़िडीन (डीएबी, सामग्री की तालिका देखें) कार्य समाधान के 100 μL जोड़ें।
    9. माइक्रोस्कोप के तहत भूरे रंग के उपस्थिति समय का निरीक्षण और रिकॉर्ड करें; क्रोमोजेनिक प्रतिक्रिया एपिटोप साइटों को भूरे रंग में बदल देतीहै। शेष नमूनों को उसी रिकॉर्ड किए गए प्रतिक्रिया समय के साथ इलाज करें।
    10. स्लाइस ब्राउन होने के बाद, स्लाइस को हर बार 3 मिनट के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी से दो बार धो लें।
    11. 1 मिनट के लिए हेमटोक्सीलिन के साथ स्लाइस को फिर से दाग दें, और स्लाइस को 2 मिनट के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें।
    12. स्लाइस को हाइड्रोक्लोरिक एसिड में 3 सेकंड के लिए डुबोएं, और स्लाइस को 2 मिनट के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी से धो लें।
    13. स्लाइस को 1% अमोनिया पानी में 10 सेकंड के लिए भिगोदें, और स्लाइस को डबल-डिस्टिल्ड पानी से 2 मिनट के लिए धो लें।
    14. स्लाइस को 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल, और 100% जाइलीन (तीन बार) में हर बार 1 मिनट के लिए क्रमिक रूप से डुबोएं।
    15. प्रत्येक स्लाइस में तटस्थ राल की एक बूंद जोड़ें, और इसे कवरस्लिप के साथ सील करें।

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Representative Results

इस काम में, फेमोरल ट्रोक्लेयर ग्रूव में छेद करके और बाद के दर्द व्यवहार और हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों का पता लगाकर एफटीसीडी का एक चूहा मॉडल स्थापित किया गया था। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, मॉडलिंग के 3 दिन बाद, शाम समूह की तुलना में, मॉडल समूह में चूहों का एमडब्ल्यूटी काफी कम हो गया था, जो एफटीसीडी के कारण हाइपरलेजेसिया का सुझाव देता है। मॉडलिंग के 17 दिनों के बाद, मॉडल समूह में चूहों की यांत्रिक वापसी सीमा निम्न स्तर पर बनी रही, यह दर्शाता है कि दर्द संवेदीकरण कम से कम 17 दिनों तक रह सकता है। हिस्टोपैथोलॉजिकल धुंधला परिणामों से पता चला कि, शाम समूह में, आर्टिकुलर कार्टिलेज की संरचना स्पष्ट थी, उपास्थि की सतह बरकरार थी, चोंड्रोसाइट्स समान रूप से वितरित किए गए थे, और टाइप II कोलेजन अत्यधिक व्यक्त किया गया था। इसके विपरीत, मॉडल समूह में, उपास्थि की सतह ने एक अवसाद का गठन किया, चोंड्रोसाइट्स खो गए, मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेस एमएमपी 13 की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई, और टाइप II कोलेजन की अभिव्यक्ति में कमी आई (चित्रा 2 और चित्रा 3)।

Figure 1
चित्र 1: उपास्थि दोषों के बाद एमडब्ल्यूटी का विकास। उपास्थि दोषों को प्रेरित करने के बाद पिछले पंजे की यांत्रिक वापसी सीमा का आकलन किया गया था। n = 8 चूहे/समूह। मानों को SEM ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। **P < 0.01 बनाम शाम समूह, ***P < 0.001 बनाम शाम समूह. एक छात्र का टी-टेस्ट किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: हिस्टोपैथोलॉजिकल अवलोकन (एचई, एसओ, टीबी, और मैसन स्टेनिंग) और कार्टिलेज दोष उपचार के बाद 17 वें दिन चूहे के घुटने के जोड़ों का मैनकिन स्कोरिंग। (ए) एफटीसीडी चूहे के प्रतिनिधि हिस्टोलॉजिकल चित्र। काले तीर उपास्थि दोषों का संकेत देते हैं। स्केल बार = 200 μm. (B) शाम और मॉडल समूहों में पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस स्कोरिंग का सांख्यिकीय विश्लेषण। n = 6 चूहे/समूह। मानों को SEM. ***P < 0.001 बनाम शाम समूह के ±माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है. एक छात्र का टी-टेस्ट किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: 17 वें दिन कोल 1, कोल 3, कोल 2, और एमएमपी 13 की अभिव्यक्ति और चूहे के उपास्थि में नकारात्मक धुंधलापन का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अवलोकन। एफटीसीडी चूहे के प्रतिनिधि हिस्टोलॉजिकल चित्र। काले तीर उपास्थि दोषों का संकेत देते हैं। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: चूहे के ऊरु ट्रोक्लेयर नाली में ड्रिलिंग द्वारा पूर्ण मोटाई उपास्थि दोषों को प्रेरित करने के प्रतिनिधि चित्र। (ए) शाम चूहा। (बी) मॉडल चूहा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन चूहों में पूर्ण मोटाई उपास्थि दोषों को पूरी तरह से भरने को दर्शाता है। (ए) 17 वें दिन एक प्रतिनिधि छवि। (बी) 56 वें दिन एक प्रतिनिधि छवि। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह अध्ययन चूहों के ऊरु ट्रोक्लेयर नाली में छेद करके नैदानिक उपास्थि दोषों की नकल करने के लिए एक पशु मॉडल का वर्णन करता है (पूरक चित्र 1)। उपास्थि की चोट के बाद, परिधीय नोसिसेप्टर्स की उत्तेजना या जवाबदेही बढ़ जाती है, जिसके परिणामस्वरूप दर्द की सीमा में कमी हो सकती है और उत्तेजना के प्रति प्रतिक्रिया में वृद्धि हो सकतीहै। प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में, जानवरों की विभिन्न प्रजातियों में उपास्थि दोषों के मॉडलिंग नेहमेशा दर्द का कारण बना है। नैदानिक अनुसंधान से यह भी पता चला है कि उपास्थि की चोटों वाले रोगियों के दर्द दृश्य एनालॉग स्केल (वीएएस) स्कोर स्वस्थ व्यक्तियों की तुलना मेंकाफी कम हैं। हमने एफटीसीडी उपचार के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एफटीसीडी मॉडल का उपयोग किया, और परिणामों से पता चला कि एमडब्ल्यूटी में कमी क्षणिक नहीं थी, और एमडब्ल्यूटी थोड़े समय के भीतर जल्दी से ठीक नहीं हुआ। उपचार की अवधि के बाद, मॉडल समूह में एमडब्ल्यूटी अभी भी महत्वपूर्ण था, जबकि उपचार समूह को राहत मिली (डेटा नहीं दिखाया गया)। नैदानिक प्रभावकारिता का मूल्यांकन आमतौर पर उपचार के 1 महीने के पाठ्यक्रम के आधार पर किया जाता है, इसलिए भले ही वसूली कुछ महीनों के बाद होती है, यह इस मॉडल के प्रयोगात्मक अनुप्रयोग को प्रभावित नहीं करता है। इसके अलावा, उपास्थि सतह दोषों का निरीक्षण करने और एफटीसीडी की स्थापना का प्रदर्शन करने के लिए पैथोलॉजिकल स्टेनिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री लागू किया गया था।

एफटीसीडी मॉडल करने के लिए इस विधि के निम्नलिखित फायदे हैं: (1) आसान और सरल ऑपरेशन; (2) कम मॉडलिंग समय; (3) उच्च सफलता अनुपात; और (4) सकल अवलोकन के माध्यम से दृश्य प्रगति की उपस्थिति। अन्य पशु मॉडल के विपरीत, इस मॉडल को मानकीकृत किया जा सकता है। एफटीसीडी मॉडल की ड्रिलिंग गहराई और व्यास को नियंत्रित करना आसान है, जो एफटीसीडी मॉडल को मानकीकृत करने के लिए फायदेमंद है और इसकी पुनरावृत्ति को बढ़ाता है। दूसरे, ड्रिलिंग छेद का व्यास एक महत्वपूर्ण कारक है जो मरम्मत दक्षता निर्धारित करता है। 1.4 मिमी के व्यास के साथ ओस्टियोकॉन्ड्रल दोष सहज रूप से ठीक हो सकते हैं, जिससे चिकित्सीय उपचारके उचित मूल्यांकन में विफलता हो सकती है। इन कमियों को दूर करने और मानकीकरण प्राप्त करने के लिए, प्रारंभिक प्रयोग किए गए थे, और यह निर्धारित किया गया था कि उपास्थि दोष सर्जरी के 17 दिनों बाद तक अनायास मरम्मत नहीं करेंगे यदि एफटीसीडी सर्जरी 1.6 मिमी व्यास के ड्रिल छेद के साथ आर्टिकुलर कार्टिलेज सतह पर की गई थी। समय के साथ, ड्रिलिंग के कारण होने वाली एफटीसीडी उपास्थि की मरम्मत दिखाती है, और दोषपूर्ण उपास्थि को सर्जरी के 8 सप्ताह बाद काफी हद तक मरम्मत की जाती है (पूरक चित्र 2)। अनुप्रयोगों के संदर्भ में, इस मॉडल का उपयोग न केवल केओए के कारण उपास्थि दोषों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि दर्दनाक उपास्थि दोषों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, अर्थात् पोस्ट-ट्रॉमेटिक ऑस्टियोआर्थराइटिस22। स्व-मरम्मत वाली उपास्थि हमेशा घायल स्थल पर हाइलिन उपास्थि के बजाय फाइब्रोकार्टिलेज बनाती है, और यह मॉडल उपास्थि फाइब्रोसिस23 के रोगजनन और उपचार का अध्ययन करने के लिए भी उपयुक्त हो सकता है।

इस मॉडल की सीमाओं के संदर्भ में, अपरिपक्व चूहों को चुना गया था, क्योंकि नैदानिक अभ्यास में आघात के कारण उपास्थि दोष युवा लोगों में होते हैं। हालांकि, कंकाल के विकास के चरण में अपरिपक्व चूहों में, उपास्थि परिपक्व चूहों की तुलना में पतली होती है, जो प्रयोग24 के परिणामों को प्रभावित कर सकती है। पिछले शोध से पता चला है कि किशोर चूहों की तुलना मेंवयस्क चूहों में उपास्थि क्षति के बाद स्टेम कोशिकाओं की पुन: उत्पन्न करने की क्षमता कम हो जाती है। हमने प्रयोग के लिए 6 सप्ताह पुराने चूहों का चयन किया, और इन चूहों का उपयोग स्टेम सेल की मरम्मत के तंत्र का निरीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है; इसके अतिरिक्त, 6 सप्ताह के चूहों में चिकित्सीय प्रभाव वयस्क चूहों की तुलना में अधिक स्पष्ट हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है)। हमें पुराने चूहों में एफटीसीडी मॉडल करने की भी आवश्यकता है, और यह अनुमान लगाया जा सकता है कि स्टेम सेल पुनर्योजी क्षमता में कमी के कारण वृद्ध चूहों में मरम्मत धीमी हो सकती है। अनुसंधान से पता चला है कि ओस्टियोकॉन्ड्रल दोषों के आसपास के आर्टिकुलर कार्टिलेज में अपचय गतिविधि होती है, और आईएल -1 और एफजीएफ 2 की अभिव्यक्ति और एफजीएफआर 1 / एफजीएफआर 3 संतुलन में गड़बड़ी प्रारंभिक ऑस्टियोआर्थ्रिटिक रोग21 की प्रक्रिया शुरू करने में महत्वपूर्ण है। हालांकि, एफटीसीडी मॉडल में अभी भी पूर्व-ऑस्टियोआर्थ्रिटिक दोष की मरम्मत का मूल्यांकन करने में सीमाएं हैं। इस अध्ययन की एक और सीमा मॉडलिंग के 17 दिनों के बाद एमडब्ल्यूटी के माप की कमी थी।

निष्कर्ष में, यह मॉडल चूहों के ऊरु ट्रोक्लेयर नाली में छेद करके उपास्थि दोषों की नकल करने के लिए एक आदर्श और मानकीकृत पशु मॉडल होगा। यह मॉडल न केवल नैदानिक एफटीसीडी की घटना और विकास की नकल करता है, बल्कि एफटीसीडी के खिलाफ चिकित्सीय उपचार के मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय पशु मॉडल भी प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को झेजियांग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या LQ20H270009), चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 82074464 और 82104890), झेजियांग पारंपरिक चीनी चिकित्सा विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2020जेडए039, 2020जेडए096, और 2022जेडबी 137) और झेजियांग प्रांतीय स्वास्थ्य आयोग की चिकित्सा स्वास्थ्य विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना (अनुदान संख्या 2016केवाईए196) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3, 3 '-diaminobenzidine   Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9019 The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody Novus NB600-594 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody Abcam (UK) 34712 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody Novus NB600-408 Primary antibody for IHC
Bouin solution Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Celestite blue Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Corncob paddings   Xiaohe Technology Co., Ltd  Bedding for animal 
Eosin Sigma-Aldrich 861006 The dye for HE staining
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9002 Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9001 Secondary antibody for IHC
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3163 The dye for HE staining
Masson Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Microdrill Rwd Life Science Co., Ltd 78001 Equipment for surgery
MMP13 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) 69926 Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center Thermo Fisher Scientific (USA) EC 350 Produce paraffin blocks
Neutral resin Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9555 Seal for IHC
Nonabsorbable suture Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. 4-0 Equipment for surgery
Pentobarbital sodium  Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. WBBTN5G Anesthetized animal
phosphomolybdic acid  Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes Thermo Fisher Scientific (USA) HM325 Precise paraffin sections
Safranin-O Sigma-Aldrich S2255 The dye for SO staining
Scalpel blade Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. 11 Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x) Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. HK1222 Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats  Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. SD Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr Sakura (Japan) Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue Sigma-Aldrich 89640 The dye for TB staining
Von Frey filament UGO Basile (Italy)  37450-275 Equipment for MWT assay
Wire mesh platform  Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. Equipment for MWT assay

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References

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