Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Utvikling og evaluering av en rottemodell av bruskdefekter i full tykkelse

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64475
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 1, 5, 1, 3, 1, 1
1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2Fuyang Orthopaedics and Traumatology Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 3College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, 4Affiliated Zhejiang Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Xianju County Hospital of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen etablerer en bruskdefektmodell med full tykkelse (FTCD) ved å bore hull i lårtrochleasporet hos rotter og måle påfølgende smerteatferd og histopatologiske endringer.

Abstract

Bruskdefekter i kneleddet forårsaket av traumer er en vanlig sportsleddskade i klinikken, og disse feilene resulterer i leddsmerter, nedsatt bevegelse og til slutt kneartrose (kOA). Imidlertid er det lite effektiv behandling for bruskdefekter eller til og med kOA. Dyremodeller er viktige for å utvikle terapeutiske legemidler, men de eksisterende modellene for bruskdefekter er utilfredsstillende. Dette arbeidet etablerte en bruskdefektmodell (FTCD) med full tykkelse ved å bore hull i lårtrochleasporet hos rotter, og den påfølgende smerteoppførselen og histopatologiske endringene ble brukt som avlesningseksperimenter. Etter operasjonen ble den mekaniske tilbaketrekningsterskelen redusert, kondrocytter på det skadede stedet gikk tapt, matriks metalloproteinase MMP13-ekspresjon ble økt, og type II kollagenuttrykk redusert, i samsvar med de patologiske endringene observert i humane bruskdefekter. Denne metodikken er enkel og enkel å utføre og muliggjør grov observasjon umiddelbart etter skaden. Videre kan denne modellen med hell etterligne kliniske bruskdefekter, og dermed gi en plattform for å studere den patologiske prosessen med bruskdefekter og utvikle tilsvarende terapeutiske legemidler.

Introduction

Leddbrusk er et svært differensiert og tett vev bestående av kondrocytter og ekstracellulær matrise1. Overflatelaget av leddbrusk er en form for hyalinbrusk, som har en jevn overflate, lav friksjon, god styrke og elastisitet, og utmerket mekanisk stresstoleranse2. Den ekstracellulære matrisen består av kollagenproteoglykan og vann, og type II kollagen er den viktigste strukturelle komponenten i kollagenet, da det står for ca. 90% av det totale kollagenet3. Siden det ikke finnes blodårer eller nerver i bruskvev, mangler det evnen til selvreparasjon etter skade4. Derfor har bruskdefekter forårsaket av traumer alltid vært en ugjennomtrengelig leddsykdom i klinikker; I tillegg har denne felles sykdommen en tendens til å ramme unge mennesker, og den globale forekomsten øker 5,6. Kneleddet er det vanligste stedet for bruskdefekter, og defekter her ledsages av leddsmerter, ledddysfunksjon og leddbruskdegenerasjon, som til slutt fører til kneartrose (kOA)7. Bruskdefekter i kneleddet medfører økonomiske og fysiologiske belastninger for pasientene og påvirker pasientens livskvalitetalvorlig 8. Denne sykdommen utgjør en stor og akutt klinisk utfordring uten forestående løsninger. For tiden er kirurgi bærebjelken i behandlingen for bruskdefekter, men det langsiktige resultatet er fortsatt utilfredsstillende9.

Kliniske bruskdefekter fører til slutt til kOA, og derfor brukes kOA dyremodeller ofte til patologisk studie av bruskdefekter og medikamentutvikling. Etablering av dyremodeller er viktig for å forstå den patofysiologiske prosessen med reparasjon av bruskdefekter, som kan brukes til å observere bruskregenerering og endringen mellom fibrobrusk og hyalinbrusk10. Imidlertid trenger ofte brukte kOA-dyremodeller, som kirurgiske modeller av fremre korsbåndtranseksjon (ACLT), destabilisering av mediale menisker (DMM), ovariektomi (OVX) og Hulth, vanligvis langsiktig modellering og tillater bare patologiske og smerteevalueringer, noe som gir begrensninger for effektiviteten av legemiddelutvikling11. Foruten de kirurgiske modellene resulterer også kjemiske modeller, som monoiodoacetat (MIA) og papaininjeksjon, i bruskdefekter, men graden av defekten kan ikke håndteres godt, og forholdene er langt fra den kliniske virkeligheten11. Kollisjon er en annen tilnærming til å modellere bruskdefekter hos større dyr, men denne metoden avhenger av bruk av spesifikke instrumenter og brukes sjelden12.

Oppsummert er de eksisterende kOA-modellene ikke ideelle for å studere patogenesen til bruskdefekter eller utvikle nye legemidler, og det er behov for en spesifikk og standardisert modell for bruskdefekter. Denne studien etablerte en bruskdefektmodell med full tykkelse (FTCD) ved å bore hull i lårtrochleasporet hos rotter. Grov observasjon, smerteatferdstester og histopatologisk analyse ble utført for modellevaluering. I motsetning til andre dyremodeller av kOA, har denne modellen liten effekt på rottenes allmenntilstand. Denne modelleringstilnærmingen er tilgjengelig, kan håndteres godt og støtter forståelsen av progresjon fra bruskdefekter til kOA og utvikling av effektive terapier. Denne modellen kan også brukes til å teste behandlinger som forhindrer kOA ved å helbrede defekter i pre-osteoartrittiske ledd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøkene ble godkjent av Medical Standards and Ethics Committee ved Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, som er i samsvar med Kinas lovgivning om bruk og pleie av forsøksdyr. I denne studien ble 6 uker gamle mannlige Sprague-Dawley (SD) rotter som veier 150-180 g brukt. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialfortegnelsen).

1. Etablering av en bruskdefektmodell i full tykkelse hos rotter

  1. Etter 1 uke med akklimatisering til det nye miljøet, deler rottene tilfeldig og likt inn i to grupper (n = 8 rotter/gruppe). Rottene i narregruppen vil ha narreoperasjonen, mens rottene i modellgruppen vil ha eksperimentell kirurgi med boring av hull i lårtrochleasporet.
    MERK: Hvert bur må være dekket med sterile maiskolbepolstringer (se materialfortegnelsen) for å beskytte rottenes tær.
  2. Bedøve rottene ved en intraperitoneal injeksjon (i.p.) av pentobarbitalnatrium (40 mg/kg). Trykk deretter forsiktig på tærne til rottene for å bekrefte tilstrekkelig anestesi. Bruk en veterinærsalve på rotternes øyne for å forhindre tørrhet under anestesi.
    MERK: Dyrekirurgien må utføres i en dedikert operasjonssal ved hjelp av autoklaverte kirurgiske instrumenter. Operatørene må bruke rene laboratoriefrakker, ansiktsmasker, hodedeksler og sterile hansker under operasjonen. Plasser sterile pads over operasjonsområdet og steriliser alt utstyr før bruk. Gi termisk støtte gjennom hele prosedyren.
  3. Plasser rotta på operasjonsbordet i en liggende stilling, barber venstre og høyre bakre lemmer, og rengjør kneleddområdet med kirurgisk såpe, etterfulgt av vekslende antiseptisk povidon-jodoppløsning og alkohol tre ganger under sterile forhold. Legg en steril drapering over rotta, og utsett bare det desinfiserte kneleddet.
  4. Lag et 1 cm snitt med et skalpellblad (nummer 11) midt i rottekneleddet fra topp til bunn, og skjær leddkapselen og quadriceps femoris senen langs medialkanten av patella etter overfladisk disseksjon.
    MERK: Quadriceps femoris senen er festet til patella og til lårkondylen under fleksjonen av kneleddet13. Sporet som ses i leddkapselen er lårtrochlearsporet, og det distale femoralkondylet danner mediale og laterale kondyler.
  5. Vri patella til utsiden, og bøy tibia og fibula i en 90 ° vinkel for å fullstendig eksponere trochlea av femoralkondylen. Bruk et sirkulært borøre med en diameter på 1,6 mm (se materialfortegnelsen) vertikalt til bruskoverflaten ved 4000 o/min i 10 s for å lage en bruskdefekt i full tykkelse i lårbenssporet med en dybde på 0,1 mm.
    MERK: Bruk saltvann periodisk for å minimere termisk traumer til det omkringliggende beinvevet under boreprosedyren.
  6. Tørk operasjonsstedet med bomullsdotter dynket i en 0,9% saltoppløsning, bytt patella, hold kneet i forlengelsesstilling og sutur snittet lag for lag med ikke-absorberbare 4-0 suturer (se materialtabellen).
    1. Plasser dyrene på varmeputer med sternal recumbency, overvåke dem til de våkner, og deretter returnere dem til burene sine. Injiser buprenorfin (0,05 mg/kg) subkutant hver 8. time tre ganger etter operasjonen for smertelindring.
  7. Test den smerterelaterte atferden til alle rottene 3 dager, 10 dager og 17 dager etter operasjonen, som beskrevet i avsnitt 2.

2. Mekanisk uttaksterskel (MWT)

MERK: MWT av den bilaterale bakre plantaren av rotter ble målt ved den klassiske von Frey filament smertemålingsmetoden14.

  1. Plasser rotta i et enkelt plastkammer (17 cm x 11 cm x 13 cm) på en nettingplattform (se materialfortegnelsen), og plasser nettingbasen 50 cm over et bord. Mål MWT etter 30 min tilpasning.
  2. Trykk von Frey-filamentet (se materialfortegnelsen) vinkelrett på plantaroverflaten på hver rottes bakpote, og bøy børsten i ca 2 s, unngå den tykkeste delen av midten av bakpoten.
  3. Øk gradvis stimulusvekten fra laveste 4 g til en positiv respons (poteuttak eller poteslikking) oppstår.
    MERK: Intervallet mellom hver stimulering bør være mer enn 1 min. MWT er definert som tre positive responser i fem stimuleringer; Registrer stimulusvekten i gram.
  4. Beregn gjennomsnittsverdiene for humbug- og modellgruppene i henhold til den registrerte minimale stimulusvekten i gram.

3. Histopatologisk og immunhistokjemisk analyse

  1. Ved 17 og 56 dager etter operasjonen, bedøve rotter med en 40 mg / kg pentobarbital natrium (i.p.), og ofre alle rotter ved å trekke blod fra hjertet. Isoler knærne ved å kutte beinet i midten av lårbenet og midten av tibia, og dissekere det omkringliggende muskelvevet. Fjern kneleddene for histologisk analyse.
  2. Fest kneleddene i 20 ml 10% paraformaldehydoppløsning i 48 timer ved romtemperatur, og avkalk dem deretter med 20 ml 10% EDTA-oppløsning i en orbital shaker i 8 uker ved 4 °C. Endre EDTA-løsningen hver dag.
  3. Trim kneleddet slik at det passer til størrelsen på innebyggingsboksen. Legg de dehydrerte kneleddene i 100% parafin15.
  4. Plasser de parafininnebygde kneleddene på holderen til en mikrotom, juster vinkelen og trim parafinprøven med et blad til overflaten er flat.
  5. Sett tykkelsen på parafinskivene til 3 μm, og flat ut skivene i et vannbad ved 40 °C.
  6. Fest skivene på glasslysbilder, legg dem i en 45 °C bakemaskin (se materialfortegnelsen) til de er tørre, og oppbevar dem i romtemperatur.
  7. Avvoksing og rehydrering: Smør skivene i en ovn ved 60 °C i 4 timer, og legg deretter skivene suksessivt i 100 % xylen (tre ganger), 100 % etanol (to ganger), 95 % etanol, 80 % etanol og 75 % etanol i 5 minutter hver gang.
  8. Farging av hematoksylin og eosin (H&E)
    1. Voks, rehydrer og vask skivene med dobbeltdestillert vann i 2 minutter.
    2. Beis skivene med 0,5% hematoksylin (se materialfortegnelse) i 3 min, og vask skivene med dobbeltdestillert vann til det ikke er hematoksylinrester på skiveoverflatene.
    3. Fordyp skivene i 1% saltsyrealkohol i 3 s, og vask skivene med dobbeltdestillert vann i 2 minutter.
    4. Bløtlegg skivene i 1% ammoniakkvann i 10 s, og vask skivene med dobbeltdestillert vann i 2 minutter.
    5. Beis skivene med eosin (se materialfortegnelse) i 1 min, og vask skivene med dobbeltdestillert vann til det ikke er eosinrester på skiveflatene.
    6. Dypp skivene i 95% etanol, 100% etanol og 100% xylen (tre ganger) suksessivt i 1 min hver gang.
    7. Tilsett en dråpe nøytral harpiks (se Materialfortegnelse) i hver skive, og forsegl den med et deksel.
  9. Safranin O/Fast Freen (SO) farging
    1. Voks, rehydrer og vask skivene med dobbeltdestillert vann i 2 minutter.
    2. Beis skivene med 0,05% Fast Green (se materialfortegnelsen) i 3 min, og vask skivene med dobbeltdestillert vann til det ikke er noen Fast Green-rester på overflaten av skivene.
    3. Dyp skivene i 1% eddiksyreoppløsning i 10 s, og vask skivene med dobbeltdestillert vann i 2 minutter.
    4. Beis skivene med 2,5% SO (se materialfortegnelse) i 2 min, og vask deretter skivene med dobbeltdestillert vann til det ikke er SO-rester på skiveoverflatene.
    5. Dypp skivene i 95% etanol, 100% etanol og 100% xylen (tre ganger) suksessivt i 1 min hver gang.
    6. Tilsett en dråpe nøytral harpiks i hver skive, og forsegl den med et deksel.
  10. Toluidinblå (TB) farging
    1. Voks, rehydrer og vask skivene med dobbeltdestillert vann i 2 minutter.
    2. Dypp skivene i 1% TB-løsning (se materialfortegnelsen) i 2 minutter, og vask skivene med dobbeltdestillert vann til det ikke er toluidinblå rester på overflaten av skivene.
    3. Dypp skivene i 95% etanol, 100% etanol og 100% xylen (tre ganger) suksessivt i 1 min hver gang.
    4. Tilsett en dråpe nøytral harpiks i hver skive, og forsegl den med et deksel.
  11. Masson farging
    1. Voks, rehydrer og vask skivene med dobbeltdestillert vann i 2 minutter.
    2. Tilsett Bouin løsning (se materialfortegnelsen) dråpevis til skivene, flekk dem ved 37 ° C i 2 timer, og vask dem med dobbeltdestillert vann til den gule fargen på overflaten av skivene forsvinner.
    3. Beis skivene med celestite blå (se materialtabellen) i 3 min, og vask skivene med dobbeltdestillert vann til det ikke er celestite blå rester på skiveoverflatene.
    4. Flekk skivene med hematoksylin i 3 min, og vask skivene med dobbeltdestillert vann til det ikke er hematoksylinder på skiveoverflatene.
    5. Dypp skivene i sur etanol i 5 s, og vask skivene med dobbeltdestillert vann i 2 minutter.
    6. Beis skivene med Ponceau fuchsin (se materialtabellen) i 10 min, og vask skivene med dobbeltdestillert vann til det ikke er Ponceau fuchsin-rester på skiveoverflatene.
    7. Dyp skivene i fosfolybdisk syre (se materialtabellen) i 10 minutter, senk dem deretter i TB-løsning i 5 minutter, og vask skivene med dobbeltdestillert vann til det ikke er TB-rester på overflaten av skivene.
    8. Dyp skivene i en svak syreoppløsning i 2 minutter, og vask skivene med dobbeltdestillert vann i 2 minutter.
    9. Dypp skivene i 95% etanol, 100% etanol og 100% xylen (tre ganger) suksessivt i 1 min hver gang.
    10. Tilsett en dråpe nøytral harpiks i hver skive, og forsegl den med et deksel.
  12. Observer alle skivene under et mikroskop i en dobbeltblind innstilling for å bestemme graden av leddbruskdegenerasjon i henhold til Mankins scoring system16.
  13. Immunhistokjemi
    1. Smør og rehydrer skivene rutinemessig, og vask skivene med PBS i 2 min.
    2. Dypp skivene i natriumsitratoppløsning, og sett skivene i en ovn ved 60 °C i 4 timer for å reparere antigenet. Vask skivene med PBS tre ganger i 3 min hver.
    3. Fordyp skivene i en 0,3% Triton X-100 løsning i 10 min, og vask skivene to ganger med PBS i 3 min hver gang.
    4. Blokker den endogene peroksidaseaktiviteten ved å tilsette en 3%H2O2-løsningi metanol ved romtemperatur i 30 minutter. Vask skivene to ganger med PBS i 3 min hver gang.
    5. Inkuber seksjonene med 5% geitserum i PBS i 30 minutter ved romtemperatur for å blokkere eventuell uspesifikk binding. Vask skivene to ganger med PBS i 3 min hver gang.
    6. Tilsett 100 μL PBS-fortynnede primære antistoffer (anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; og anti-MMP13, 1:100; se materialfortegnelsen) til hver skive, og inkuber dem over natten ved 4 °C. Vask skivene to ganger med PBS i 3 min hver gang.
    7. Inkuber hver skive med 100 μL PBS-fortynnet (1:100) sekundært antistoff (geit-antikanin eller geit-anti-mus, se materialtabellen) ved romtemperatur i 20 minutter. Vask skivene to ganger med PBS i 3 min hver gang.
    8. Tilsett 100 μL 3, 3'-diaminobenzidin (DAB, se materialfortegnelsen) arbeidsløsning til hver skive.
    9. Vær oppmerksom på og registrer utseendet til en brun farge under et mikroskop; Den kromogene reaksjonen gjør epitopstedene brune17. Behandle resten av prøvene med samme registrerte reaksjonstid.
    10. Etter at skivene blir brune, vask skivene to ganger med dobbeltdestillert vann i 3 min hver gang.
    11. Flekk skivene med hematoksylin i 1 min, og vask skivene med dobbeltdestillert vann i 2 minutter.
    12. Dypp skivene i saltsyre i 3 s, og vask skivene med dobbeltdestillert vann i 2 minutter.
    13. Bløtlegg skivene i 1% ammoniakkvann i 10 s, og vask skivene med dobbeltdestillert vann i 2 minutter.
    14. Dypp skivene i 95% etanol, 100% etanol og 100% xylen (tre ganger) suksessivt i 1 min hver gang.
    15. Tilsett en dråpe nøytral harpiks i hver skive, og forsegl den med et deksel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette arbeidet ble en rottemodell av FTCD etablert ved å bore hull i lårtrochleasporet og oppdage påfølgende smerteatferd og histopatologiske forandringer. Som vist i figur 1, 3 dager etter modellering, sammenlignet med simuleringsgruppen, ble MWT av rotter i modellgruppen signifikant redusert, noe som tyder på hyperalgesi forårsaket av FTCD. Ved 17 dager etter modellering forblir den mekaniske tilbaketrekningsterskelen for rotter i modellgruppen på et lavt nivå, noe som indikerer at smertesensibiliseringen kunne vare minst 17 dager. De histopatologiske fargeresultatene viste at i narregruppen var strukturen i leddbrusken tydelig, bruskoverflaten var intakt, kondrocyttene var jevnt fordelt og type II kollagen ble sterkt uttrykt. Tvert imot, i modellgruppen dannet bruskoverflaten en depresjon, kondrocytene gikk tapt, ekspresjonen av matriksmetalloproteinase MMP13 økte, og uttrykket av type II kollagen redusert (figur 2 og figur 3).

Figure 1
Figur 1: Utvikling av MWT etter bruskdefekter. Mekaniske uttaksterskler i bakpotene ble vurdert etter at bruskdefekter var indusert. n = 8 rotter/gruppe. Verdiene presenteres som gjennomsnitt ± SEM. **P < 0,01 versus humbuggruppe, ***P < 0,001 versus humbuggruppe. En Student t-test ble utført. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Histopatologisk observasjon (HE, SO, TB og Masson-farging) og Mankins skåring av kneleddene hos rotter dag 17 etter bruskdefektbehandlingen. (A) Representative histologiske bilder av en FTCD-rotte. De svarte pilene indikerer bruskdefektene. Skala bar = 200 μm. (B) Statistisk analyse av slitasjegikt scorings i humbug og modell grupper. n = 6 rotter/gruppe. Verdiene presenteres som gjennomsnitt ± SEM. ***P < 0,001 versus humbuggruppe. En Student t-test ble utført. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Immunhistokjemisk observasjon av ekspresjon av Col1, Col3, Col2 og MMP13 og negativ farging i rottebrusk dag 17. Representative histologiske bilder av en FTCD-rotte. De svarte pilene indikerer bruskdefektene. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Representative bilder av indusering av bruskdefekter i full tykkelse ved boring i lårbenssporet hos rotter. (A) Humbug rotte. (B) Modell rotte. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Histologisk evaluering som viser fullstendig fylling av bruskdefektene i full tykkelse hos rotter. (A) Et representativt bilde på dag 17. (B) Et representativt bilde på dag 56. Skala bar = 200 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne studien beskriver en dyremodell for etterligning av kliniske bruskdefekter ved å bore hull i lårbenets trochleaspor hos rotter (tilleggsfigur 1). Etter bruskskade forbedres eksitabiliteten eller responsen til perifere nociceptorer, noe som kan resultere i en reduksjon i smerteterskelen og forbedring av respons på stimulering18. I prekliniske studier har modellering av bruskdefekter i forskjellige dyrearter alltid forårsaket smerte19. Klinisk forskning har også vist at smerten visuell analog skala (VAS) score av pasienter med bruskskader er betydelig lavere enn hos friske individer20. Vi brukte FTCD-modellen for å teste effekten av FTCD-behandlingen, og resultatene viste at reduksjonen i MWT ikke var forbigående, og MWT kom seg ikke raskt i løpet av kort tid. Etter en tids behandling var MWT i modellgruppen fortsatt signifikant, mens behandlingsgruppen var lettet (data ikke vist). Klinisk effekt vurderes generelt basert på et 1 måneders behandlingsforløp, så selv om utvinning skjer etter noen måneder, påvirker det ikke den eksperimentelle anvendelsen av denne modellen. Videre ble patologisk farging og immunhistokjemi anvendt for å observere bruskoverflatedefekter og demonstrere etablering av FTCD.

Denne metoden for å modellere FTCD har følgende fordeler: (1) den enkle og enkle betjeningen; (2) den korte modelleringstiden; (3) det høye suksessforholdet; og (4) tilstedeværelsen av synlig progresjon via grov observasjon. I motsetning til andre dyremodeller kan denne modellen standardiseres. Boredybden og diameteren til FTCD-modellen er enkel å kontrollere, noe som er gunstig for standardisering av FTCD-modellen og øker repeterbarheten. For det andre er diameteren på borehullet en nøkkelfaktor som bestemmer reparasjonseffektiviteten. Osteokondrale defekter med en diameter på 1,4 mm kan gjenopprette seg selv, noe som fører til svikt i riktig evaluering av terapeutiske behandlinger21. For å overvinne disse manglene og oppnå standardisering ble det utført foreløpige eksperimenter, og det ble bestemt at bruskdefektene ikke spontant ville reparere opptil 17 dager etter operasjonen dersom FTCD-operasjonen ble utført på leddbruskoverflaten med borehull på 1,6 mm i diameter. Over tid viser FTCD forårsaket av boring bruskreparasjon, og den defekte brusken er i stor grad reparert 8 uker etter operasjonen (tilleggsfigur 2). Når det gjelder anvendelser, kan denne modellen ikke bare brukes til å studere bruskdefekter forårsaket av kOA, men også for å studere traumatiske bruskdefekter, nemlig posttraumatisk slitasjegikt22. Selvreparert brusk danner alltid fibrobrusk i stedet for hyalinbrusk på det skadde stedet, og denne modellen kan også være egnet til å studere patogenesen og behandling av bruskfibrose23.

Når det gjelder begrensningene i denne modellen, ble umodne rotter valgt, da bruskdefekter forårsaket av traumer i klinisk praksis har en tendens til å forekomme hos unge mennesker. Hos umodne rotter på skjelettutviklingsstadiet er brusken imidlertid tynnere enn hos modne rotter, noe som kan påvirke resultatene av forsøket24. Tidligere forskning har vist at stamcellers evne til å regenerere etter bruskskade er redusert hos voksne mus sammenlignet med unge mus25. Vi valgte 6 uker gamle rotter for forsøket, og disse rottene kunne også brukes til å observere mekanismene for stamcellereparasjon; I tillegg er de terapeutiske effektene hos 6 uker gamle rotter mer uttalt enn hos voksne rotter (data ikke vist). Vi må også modellere FTCD hos eldre rotter, og det kan spekuleres i at reparasjon kan være langsommere hos eldre rotter på grunn av redusert stamcelleregenerativ kapasitet. Forskning har vist at leddbrusken rundt osteokondrale defekter har katabolsk aktivitet, og uttrykket av IL-1β og FGF2 og en forstyrrelse i FGFr1/FGFr3-balansen er viktig for å starte prosessen med tidlig osteoartrittisk sykdom21. Imidlertid har FTCD-modellen fortsatt begrensninger i evaluering av reparasjon av pre-osteoartrittisk defekt. En annen begrensning ved denne studien var mangelen på måling av MWT etter 17 dager med modellering.

Avslutningsvis vil denne modellen være en ideell og standardisert dyremodell for å etterligne bruskdefekter ved å bore hull i lårtrochleasporet hos rotter. Denne modellen etterligner ikke bare forekomsten og utviklingen av klinisk FTCD, men gir også en pålitelig dyremodell for evaluering av terapeutiske behandlinger mot FTCD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av Zhejiang Natural Science Foundation (tilskuddsnummer LQ20H270009), Natural Science Foundation of China (tilskuddsnummer 82074464 og 82104890), Zhejiang Traditional Chinese Medical Science Foundation (tilskuddsnummer 2020ZA039, 2020ZA096 og 2022ZB137) og Medical Health Science and Technology Project of Zhejiang Provincial Health Commission (tilskuddsnummer 2016KYA196).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3, 3 '-diaminobenzidine   Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9019 The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody Novus NB600-594 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody Abcam (UK) 34712 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody Novus NB600-408 Primary antibody for IHC
Bouin solution Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Celestite blue Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Corncob paddings   Xiaohe Technology Co., Ltd  Bedding for animal 
Eosin Sigma-Aldrich 861006 The dye for HE staining
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9002 Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9001 Secondary antibody for IHC
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3163 The dye for HE staining
Masson Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Microdrill Rwd Life Science Co., Ltd 78001 Equipment for surgery
MMP13 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) 69926 Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center Thermo Fisher Scientific (USA) EC 350 Produce paraffin blocks
Neutral resin Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9555 Seal for IHC
Nonabsorbable suture Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. 4-0 Equipment for surgery
Pentobarbital sodium  Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. WBBTN5G Anesthetized animal
phosphomolybdic acid  Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes Thermo Fisher Scientific (USA) HM325 Precise paraffin sections
Safranin-O Sigma-Aldrich S2255 The dye for SO staining
Scalpel blade Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. 11 Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x) Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. HK1222 Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats  Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. SD Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr Sakura (Japan) Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue Sigma-Aldrich 89640 The dye for TB staining
Von Frey filament UGO Basile (Italy)  37450-275 Equipment for MWT assay
Wire mesh platform  Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. Equipment for MWT assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
  2. Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
  3. Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
  4. Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
  5. Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065 (2022).
  6. Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
  7. Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
  8. Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245 (2022).
  9. Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
  10. Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
  11. Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288 (2018).
  12. Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
  13. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
  14. Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
  15. Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639 (2020).
  16. Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
  17. Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
  18. Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
  19. Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37 (2021).
  20. Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
  21. Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
  22. Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422 (2020).
  23. Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
  24. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  25. Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).

Tags

Medisin utgave 195 Bruskdefekter i full tykkelse slitasjegikt dyremodell slitasjegikt smerte rotter
Utvikling og evaluering av en rottemodell av bruskdefekter i full tykkelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, H., Bao, R., Xu, J., Ge, Y.,… More

Zhang, H., Bao, R., Xu, J., Ge, Y., Chen, Z., Fan, M., Yu, G., Zhou, L., Guo, L., Shan, L., Bao, H. Development and Evaluation of a Rat Model of Full-Thickness Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (195), e64475, doi:10.3791/64475 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter