Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Разработка и оценка крысиной модели полноразмерных дефектов хряща

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64475
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 1, 5, 1, 3, 1, 1
1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2Fuyang Orthopaedics and Traumatology Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 3College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, 4Affiliated Zhejiang Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Xianju County Hospital of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол устанавливает модель полноразмерных дефектов хряща (FTCD) путем сверления отверстий в бедренной трохлеарной борозде крыс и измерения последующего болевого поведения и гистопатологических изменений.

Abstract

Дефекты хряща коленного сустава, вызванные травмой, являются распространенными спортивными повреждениями суставов в клинике, и эти дефекты приводят к боли в суставах, нарушению движений и, в конечном итоге, остеоартриту коленного сустава (кОА). Тем не менее, существует мало эффективного лечения дефектов хряща или даже кОА. Животные модели важны для разработки терапевтических препаратов, но существующие модели дефектов хряща неудовлетворительны. В этой работе была создана модель полноразмерных дефектов хряща (FTCD) путем сверления отверстий в бедренной трохлеарной борозде крыс, а последующее болевое поведение и гистопатологические изменения были использованы в качестве считывающих экспериментов. После операции был снижен механический порог абстиненции, утрачены хондроциты в поврежденном месте, повышена экспрессия матриксной металлопротеиназы MMP13 и снижена экспрессия коллагена II типа, что соответствует патологическим изменениям, наблюдаемым при дефектах хряща человека. Эта методика проста и легка в применении и позволяет проводить грубое наблюдение сразу после травмы. Кроме того, эта модель может успешно имитировать клинические дефекты хряща, обеспечивая тем самым платформу для изучения патологического процесса дефектов хряща и разработки соответствующих терапевтических препаратов.

Introduction

Суставной хрящ представляет собой высокодифференцированную и плотную ткань, состоящую из хондроцитов и внеклеточного матрикса1. Поверхностный слой суставного хряща представляет собой форму гиалинового хряща, который имеет гладкую поверхность, низкое трение, хорошую прочность и эластичность, а также отличную устойчивость к механическим нагрузкам2. Внеклеточный матрикс состоит из коллагена, протеогликана и воды, а коллаген II типа является основным структурным компонентом коллагена, так как на его долю приходится около 90% от общего количества коллагена3. Поскольку в хрящевой ткани отсутствуют кровеносные сосуды или нервы, она не обладает способностью к самовосстановлению после травмы4. Поэтому дефекты хряща, вызванные травмой, всегда были трудноизлечимым заболеванием суставов в клиниках; Кроме того, это заболевание суставов, как правило, поражает молодых людей, и глобальная заболеваемость растет 5,6. Коленный сустав является наиболее распространенным местом дефектов хряща, и дефекты здесь сопровождаются болью в суставах, дисфункцией суставов и дегенерацией суставного хряща, что в конечном итоге приводит к остеоартрозу коленного сустава (кОА)7. Дефекты хряща коленного сустава создают экономическое и физиологическое бремя для пациентов и серьезно влияют на качество жизни пациентов8. Это заболевание представляет собой серьезную и неотложную клиническую проблему, решение которой не может быть найдено в ближайшее время. В настоящее время хирургическое вмешательство является основой лечения дефектов хряща, но его отдаленный исход остается неудовлетворительным9.

Клинические дефекты хряща в конечном итоге приводят к кОА, и, таким образом, животные модели кОА обычно используются для патологического изучения дефектов хряща и разработки лекарств. Создание животных моделей важно для понимания патофизиологического процесса восстановления дефектов хряща, которые могут быть использованы для наблюдения за регенерацией хряща и изменением между фиброзно-хрящевым и гиалиновым хрящами10. Тем не менее, широко используемые модели кОА на животных, такие как хирургические модели рассечения передней крестообразной связки (ACLT), дестабилизации медиального мениска (DMM), овариоэктомии (OVX) и Hulth, обычно нуждаются в долгосрочном моделировании и позволяют проводить только патологоанатомическую и болевую оценку, что накладывает ограничения на эффективность разработки лекарств11. Помимо хирургических моделей, химические модели, такие как монойодоацетат (МИА) и инъекция папаина, также приводят к дефектам хряща, но степень дефекта не поддается адекватному контролю, а условия далеки от клинической реальности11. Коллизия является еще одним подходом к моделированию дефектов хряща у более крупных животных, но этот метод зависит от использования конкретных инструментов и применяется редко12.

Подводя итог, можно сказать, что существующие модели кОА не являются идеальными для изучения патогенеза дефектов хряща или разработки новых лекарственных препаратов, и необходима специфическая и стандартизированная модель дефектов хряща. В этом исследовании была создана модель полноразмерных дефектов хряща (FTCD) путем сверления отверстий в вертельчатой бороздке бедренной кости у крыс. Для оценки модели были проведены грубое наблюдение, тесты болевого поведения и гистопатологический анализ. В отличие от других животных моделей кОА, эта модель мало влияет на общее состояние крыс. Такой подход к моделированию является доступным, хорошо управляемым и способствует пониманию прогрессирования от дефектов хряща к кОА и разработке эффективных терапевтических средств. Эта модель также может быть использована для тестирования методов лечения, которые предотвращают кОА путем заживления дефектов в суставах, предостеартритных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по медицинским стандартам и этике Чжэцзянского университета традиционной китайской медицины, который соответствует законодательству Китая об использовании и уходе за лабораторными животными. В настоящем исследовании использовали 6-недельных самцов крыс Sprague-Dawley (SD) массой 150-180 г. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Создание полноразмерной модели дефектов хряща у крыс

  1. Через 1 неделю акклиматизации к новой среде случайным образом и поровну разделите крыс на две группы (n = 8 крыс/группа). Крысы в фиктивной группе будут подвергнуты фиктивной операции, в то время как крысы в модельной группе будут подвергнуты экспериментальной операции, включающей сверление отверстий в бедренной трохлеарной бороздке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая клетка должна быть покрыта стерильными набивками из кукурузных початков (см. Таблицу материалов) для защиты пальцев ног крыс.
  2. Обезболивайте крыс внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (40 мг/кг). Затем осторожно надавите на пальцы ног крыс, чтобы убедиться в адекватной анестезии. Наносите ветеринарную мазь на глаза крыс, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Операция на животных должна проводиться в специальной операционной с использованием автоклавных хирургических инструментов. Во время операции операторы должны носить чистые лабораторные халаты, маски для лица, головные уборы и стерильные перчатки. Положите стерильные прокладки на операционную область и простерилизуйте все оборудование перед использованием. Обеспечьте тепловую поддержку на протяжении всей процедуры.
  3. Поместить крысу на операционный стол в положение лежа на спине, побрить левую и правую задние конечности, а область коленного сустава очистить хирургическим мылом с последующим чередованием антисептического раствора повидон-йода и спирта трижды в стерильных условиях. Накройте крысу стерильной простыней и обнажите только продезинфицированный коленный сустав.
  4. Сделать надрез лезвием скальпеля (No 11) в середине коленного сустава крысы сверху вниз, а после поверхностного рассечения разрезать суставную капсулу и сухожилие четырехглавой мышцы бедра по медиальному краю надколенника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сухожилие четырехглавой мышцы бедра прикрепляется к надколеннику и мыщелку бедренной кости во время сгибания коленного сустава13. Бороздка, видимая в капсуле сустава, является вертельной бороздой бедренной кости, а дистальный мыщелок бедренной кости образует медиальный и латеральный мыщелки.
  5. Поверните коленную чашечку наружу и согните большеберцовую и малоберцовую кости под углом 90°, чтобы полностью обнажить улитку мыщелка бедренной кости. Используйте циркулярное сверло диаметром 1,6 мм (см. таблицу материалов) вертикально к поверхности хряща при 4 000 об/мин в течение 10 с, чтобы сделать один дефект хряща на всю толщину в вертельной бороздке бедренной кости глубиной 0,1 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте физиологический раствор с перерывами, чтобы свести к минимуму термическую травму окружающих костных тканей во время процедуры сверления.
  6. Протирают место операции ватными шариками, смоченными в 0,9% физиологическом растворе, заменяют коленную чашечку, удерживают колено в разгибающем положении и послойно зашивают разрез нерассасывающимися нитями 4-0 (см. Таблицу материалов).
    1. Положите животных на грелки с лежачей грудиной, наблюдайте за ними до тех пор, пока они не проснутся, а затем верните их в клетки. Вводите бупренорфин (0,05 мг/кг) подкожно каждые 8 ч три раза после операции для облегчения боли.
  7. Протестируйте поведение, связанное с болью, у всех крыс через 3, 10 и 17 дней после операции, как описано в разделе 2.

2. Механический порог изъятия (MWT)

ПРИМЕЧАНИЕ: MWT двустороннего заднего подошвенного отдела крыс измеряли классическим методом измерения боли в нитях по Фрею14.

  1. Поместите крысу в одну пластиковую камеру (17 см x 11 см x 13 см) на платформу из проволочной сетки (см. Таблицу материалов), а основание из проволочной сетки разместите на высоте 50 см над столом. Измерьте MWT через 30 минут адаптации.
  2. Надавите на нить фон Фрея (см. Таблицу материалов) перпендикулярно подошвенной поверхности задней лапы каждой крысы и согните щетку примерно на 2 с, избегая самой толстой части центра задней лапы.
  3. Постепенно увеличивайте вес стимула с самых низких 4 г до тех пор, пока не наступит положительный ответ (отдергивание лапы или облизывание лапы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал между каждой стимуляцией должен быть более 1 мин. MWT определяется как три положительных реакции в пяти стимуляциях; Запишите вес стимула в граммах.
  4. Вычислите средние значения для фиктивной и модельной групп в соответствии с записанным минимальным весом стимула в граммах.

3. Гистопатологический и иммуногистохимический анализ

  1. Через 17 и 56 дней после операции обезболивайте крыс пентобарбиталом натрия (в/в) в дозе 40 мг/кг и приносите в жертву всех крыс, забирая кровь из сердца. Изолируйте колени, разрезав кость в середине бедренной и средней большеберцовой костей, и рассеките окружающую мышечную ткань. Удалить коленные суставы для проведения гистологического анализа.
  2. Зафиксируйте коленные суставы в 20 мл 10% раствора параформальдегида в течение 48 ч при комнатной температуре, а затем декальцинируйте их 20 мл 10% раствора ЭДТА в орбитальном шейкере в течение 8 недель при 4 °C. Меняйте раствор ЭДТА каждый день.
  3. Обрежьте коленный сустав в соответствии с размером коробки для встраивания. Заделайте обезвоженные коленные суставы в 100% парафин15.
  4. Поместите залитые парафином коленные суставы на держатель микротома, отрегулируйте угол и обрежьте образец парафина лезвием до тех пор, пока поверхность не станет ровной.
  5. Установите толщину ломтиков парафина на 3 мкм и расплющите ломтики на водяной бане при температуре 40 °C.
  6. Наклейте ломтики на предметные стекла, поместите их в машину для выпечки при температуре 45 °C (см. Таблицу материалов), пока они не высохнут, и храните при комнатной температуре.
  7. Депарафинизация и регидратация: Депарафинизация ломтиков в духовке при температуре 60 °C в течение 4 часов, а затем последовательно помещайте ломтики в 100% ксилол (три раза), 100% этанол (два раза), 95% этанол, 80% этанол и 75% этанол на 5 минут каждый раз.
  8. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)
    1. Удалите парафин, регидратируйте и промойте ломтики двойной дистиллированной водой в течение 2 минут.
    2. Окрасьте ломтики 0,5% гематоксилином (см. Таблицу материалов) в течение 3 мин и промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхностях ломтиков не останется остатков гематоксилина.
    3. Погрузите ломтики в 1%-ный солянокислый спирт на 3 с, а ломтики промойте дважды дистиллированной водой на 2 мин.
    4. Замочите ломтики в 1%-ной нашатырной воде на 10 с и промойте ломтики дважды дистиллированной водой в течение 2 минут.
    5. Окрасьте ломтики эозином (см. Таблицу материалов) в течение 1 мин и промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхности ломтиков не останется следов эозина.
    6. Погрузите ломтики в 95% этанол, 100% этанол и 100% ксилол (три раза) последовательно на 1 минуту каждый раз.
    7. Добавьте каплю нейтральной смолы (см. Таблицу материалов) к каждому ломтику и запечатайте его покровным стеклом.
  9. Окрашивание Safranin O/Fast Freen (SO)
    1. Удалите парафин, регидратируйте и промойте ломтики двойной дистиллированной водой в течение 2 минут.
    2. Окрасьте ломтики 0,05% Fast Green (см. Таблицу материалов) в течение 3 минут и промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхности ломтиков не останется остатков Fast Green.
    3. Срезы погрузить в 1% раствор уксусной кислоты на 10 с, а срезы промыть дважды дистиллированной водой на 2 мин.
    4. Окрасьте ломтики 2,5% SO (см. Таблицу материалов) в течение 2 мин, а затем промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхности ломтиков не останется остатков SO.
    5. Погрузите ломтики в 95% этанол, 100% этанол и 100% ксилол (три раза) последовательно на 1 минуту каждый раз.
    6. Добавьте каплю нейтральной смолы в каждый ломтик и запечатайте его покровным стеклом.
  10. Окрашивание толуидиновым синим (TB)
    1. Удалите парафин, регидратируйте и промойте ломтики двойной дистиллированной водой в течение 2 минут.
    2. Погрузите ломтики в 1% раствор ТБ (см. таблицу материалов) на 2 мин и промойте ломтики дважды дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхности ломтиков не останется остатка толуидинового синего.
    3. Погрузите ломтики в 95% этанол, 100% этанол и 100% ксилол (три раза) последовательно на 1 минуту каждый раз.
    4. Добавьте каплю нейтральной смолы в каждый ломтик и запечатайте его покровным стеклом.
  11. Окрашивание по Массону
    1. Удалите парафин, регидратируйте и промойте ломтики двойной дистиллированной водой в течение 2 минут.
    2. Добавьте раствор Буэна (см. Таблицу материалов) по каплям к ломтикам, окрасьте их при 37 °C в течение 2 ч и промойте двойной дистиллированной водой до исчезновения желтого цвета на поверхности ломтиков.
    3. Окрасьте ломтики целеститовым синим (см. Таблицу материалов) в течение 3 минут и промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхности ломтиков не останется следов целеститового синего цвета.
    4. Окрасьте ломтики гематоксилином в течение 3 минут и промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхностях ломтиков не останется следов гематоксилина.
    5. Погрузите ломтики в кислый этанол на 5 секунд и промойте ломтики дважды дистиллированной водой на 2 минуты.
    6. Окрасьте ломтики фуксином Понсо (см. Таблицу материалов) в течение 10 минут и промойте ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхностях ломтиков не останется остатков фуксина Понсо.
    7. Срезы погрузить в фосфомолибдиновую кислоту (см. таблицу материалов) на 10 мин, затем погрузить их в раствор туберкулеза на 5 мин и промыть ломтики двойной дистиллированной водой до тех пор, пока на поверхности ломтиков не останется остатков туберкулеза.
    8. Погрузите ломтики в слабый раствор кислоты на 2 мин, а ломтики промойте дважды дистиллированной водой на 2 мин.
    9. Погрузите ломтики в 95% этанол, 100% этанол и 100% ксилол (три раза) последовательно на 1 минуту каждый раз.
    10. Добавьте каплю нейтральной смолы в каждый ломтик и запечатайте его покровным стеклом.
  12. Наблюдают все срезы под микроскопом в двойных слепых условиях, чтобы определить степень дегенерации суставного хряща в соответствии с системой оценкиМанкина 16.
  13. Иммуногистохимия
    1. Регулярно депарафинизируйте и увлажняйте ломтики и мойте ломтики PBS в течение 2 минут.
    2. Погрузите ломтики в раствор цитрата натрия и поместите ломтики в духовку при температуре 60 °C на 4 часа для восстановления антигена. Промойте ломтики PBS три раза по 3 минуты каждый.
    3. Погрузите ломтики в 0,3% раствор Triton X-100 на 10 минут и промойте ломтики дважды PBS по 3 минуты каждый раз.
    4. Блокируют активность эндогенной пероксидазы, добавляя 3%-ныйраствор Н2О2 в метанол при комнатной температуре в течение 30 мин. Промойте ломтики дважды PBS в течение 3 минут каждый раз.
    5. Инкубируйте срезы с 5% козьей сывороткой в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы заблокировать любое неспецифическое связывание. Промойте ломтики дважды PBS в течение 3 минут каждый раз.
    6. Добавьте 100 мкл первичных антител, разбавленных PBS (анти-кол1, 1:50; анти-кол3, 1:50; анти-кол2, 1:100; и анти-MMP13, 1:100; см. таблицу материалов) к каждому ломтику и инкубируйте их в течение ночи при 4 °C. Промойте ломтики дважды PBS в течение 3 минут каждый раз.
    7. Инкубируют каждый срез со 100 мкл вторичных антител, разбавленных PBS (1:100) (козьи антикролики или козьи мыши, см. таблицу материалов) при комнатной температуре в течение 20 минут. Промойте ломтики дважды PBS в течение 3 минут каждый раз.
    8. К каждому срезу добавляют 100 мкл 3,3'-диаминобензидина (DAB, см. таблицу материалов).
    9. Наблюдайте и записывайте время появления коричневого цвета под микроскопом; Хромогенная реакция окрашивает участки эпитопов в коричневыйцвет 17. Обработайте остальные образцы с тем же зарегистрированным временем реакции.
    10. После того, как ломтики станут коричневыми, промойте ломтики дважды двойной дистиллированной водой в течение 3 минут каждый раз.
    11. Повторно окрасьте ломтики гематоксилином в течение 1 минуты и промойте ломтики дважды дистиллированной водой в течение 2 минут.
    12. Погрузите ломтики в соляную кислоту на 3 с, а ломтики промойте дважды дистиллированной водой на 2 мин.
    13. Замочите ломтики в 1%-ной нашатырной воде на 10 с и промойте ломтики дважды дистиллированной водой в течение 2 минут.
    14. Погрузите ломтики в 95% этанол, 100% этанол и 100% ксилол (три раза) последовательно на 1 минуту каждый раз.
    15. Добавьте каплю нейтральной смолы в каждый ломтик и запечатайте его покровным стеклом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В данной работе была создана модель FTCD на крысах путем сверления отверстий в трохлеарной борозде бедренной кости и выявления последующего болевого поведения и гистопатологических изменений. Как показано на рисунке 1, через 3 дня после моделирования, по сравнению с фиктивной группой, MWT крыс в модельной группе была значительно снижена, что указывает на гипералгезию, вызванную FTCD. Через 17 дней после моделирования механический порог отмены у крыс в модельной группе оставался на низком уровне, что указывает на то, что болевая сенсибилизация могла длиться не менее 17 дней. Результаты гистопатологического окрашивания показали, что в фиктивной группе структура суставного хряща была четкой, поверхность хряща была неповрежденной, хондроциты были распределены равномерно, а коллаген II типа был высоко экспрессирован. Напротив, в модельной группе на поверхности хряща образовалась депрессия, хондроциты были утрачены, экспрессия матриксной металлопротеиназы MMP13 увеличилась, а экспрессия коллагена II типа снизилась (рис. 2 и рис. 3).

Figure 1
Рисунок 1: Развитие MWT после дефектов хряща. Механические пороги отведения задних лап оценивали после индуцирования дефектов хряща. n = 8 крыс на группу. Значения представлены как среднее значение ± SEM. **P < 0,01 против фиктивной группы, ***P < 0,001 против фиктивной группы. Был проведен t-критерий Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Гистопатологическое наблюдение (окрашивание HE, SO, TB и Masson) и оценка по шкале Манкина коленных суставов крыс на 17-й день после лечения дефектов хряща. (А) Репрезентативные гистологические картины крысы с ФТКД. Черные стрелки указывают на дефекты хряща. Масштабная линейка = 200 мкм. (B) Статистический анализ оценок остеоартрита в симуляционной и модельной группах. n = 6 крыс на группу. Значения представлены в виде среднего ± SEM. ***P < 0,001 по сравнению с фиктивной группой. Был проведен t-критерий Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Иммуногистохимическое наблюдение за экспрессией Col1, Col3, Col2 и MMP13 и отрицательным окрашиванием хряща крысы на 17-е сутки. Репрезентативная гистологическая картина крысы с ФТКД. Черные стрелки указывают на дефекты хряща. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Репрезентативные изображения индуцирования полноразмерных дефектов хряща путем сверления в трохлеарной бороздке бедренной кости крысы. (А) Бутафорская крыса. (Б) Модельная крыса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Гистологическая оценка, показывающая полное заполнение дефектов хряща по всей толщине у крыс. (А) Репрезентативное изображение на 17-й день. (Б) Репрезентативное изображение на 56-й день. Масштабная линейка = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом исследовании описывается животная модель для имитации клинических дефектов хряща путем сверления отверстий в бедренной трохлеарной борозде крыс (дополнительный рисунок 1). После повреждения хряща повышается возбудимость или отзывчивость периферических ноцицепторов, что может привести к снижению болевого порога и усилению реакции на стимуляцию18. В доклинических исследованиях моделирование дефектов хряща у разных видов животных всегда вызывало боль19. Клинические исследования также показали, что показатели боли по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) у пациентов с повреждениями хряща значительно ниже, чем у здоровых людей20. Мы использовали модель FTCD для проверки эффекта лечения FTCD, и результаты показали, что снижение MWT не было преходящим, и MWT не восстанавливалась быстро в течение короткого периода времени. После некоторого периода лечения МВТ в модельной группе все еще была значимой, в то время как в группе лечения наблюдалось облегчение (данные не показаны). Клиническая эффективность, как правило, оценивается на основании 1-месячного курса лечения, поэтому даже если выздоровление наступает через несколько месяцев, это не влияет на экспериментальное применение данной модели. Кроме того, патологическое окрашивание и иммуногистохимия были применены для наблюдения дефектов поверхности хряща и демонстрации установления ФТХД.

Этот метод моделирования FTCD имеет следующие преимущества: (1) легкость и простота эксплуатации; (2) короткое время моделирования; (3) высокий коэффициент успешности; и (4) наличие видимого прогресса при грубом наблюдении. В отличие от других моделей животных, эта модель может быть стандартизирована. Глубину сверления и диаметр модели FTCD легко контролировать, что полезно для стандартизации модели FTCD и повышает ее повторяемость. Во-вторых, диаметр отверстия является ключевым фактором, определяющим эффективность ремонта. Остеохондральные дефекты диаметром 1,4 мм могут самовосстанавливаться самопроизвольно, что приводит к неудаче в надлежащей оценке терапевтического лечения21. Для преодоления этих недостатков и достижения стандартизации были проведены предварительные эксперименты, в ходе которых было определено, что дефекты хряща не будут самопроизвольно восстанавливаться в течение 17 дней после операции, если операция FTCD была выполнена на поверхности суставного хряща с просверленными отверстиями диаметром 1,6 мм. Со временем FTCD, вызванный сверлением, показывает восстановление хряща, и дефектный хрящ в значительной степени восстанавливается через 8 недель после операции (дополнительный рисунок 2). С точки зрения приложений, эта модель может быть использована не только для изучения дефектов хряща, вызванных кОА, но и для изучения травматических дефектов хряща, а именно посттравматического остеоартрита22. Самовосстанавливающийся хрящ всегда образует фиброзно-хрящированный, а не гиалиновый хрящ в поврежденном месте, и эта модель также может быть пригодна для изучения патогенеза и лечения фиброза хряща23.

С точки зрения ограничений этой модели были выбраны неполовозрелые крысы, так как дефекты хряща, вызванные травмой, в клинической практике, как правило, встречаются у молодых людей. Однако у неполовозрелых крыс на стадии развития скелета хрящ тоньше, чем у половозрелых крыс, что может повлиять на результаты эксперимента24. Предыдущие исследования показали, что способность стволовых клеток к регенерации после повреждения хряща снижается у взрослых мышей по сравнению с молодымимышами. Для эксперимента были отобраны 6-недельные крысы, которых также можно было использовать для наблюдения за механизмами репарации стволовых клеток; Кроме того, терапевтические эффекты у 6-недельных крыс более выражены, чем у взрослых крыс (данные не показаны). Нам также необходимо смоделировать FTCD у пожилых крыс, и можно предположить, что восстановление может происходить медленнее у пожилых крыс из-за снижения регенеративной способности стволовых клеток. Исследования показали, что суставной хрящ, окружающий остеохондральные дефекты, обладает катаболической активностью, а экспрессия IL-1β и FGF2 и нарушение баланса FGFr1/FGFr3 играют важную роль в инициировании процесса раннего остеоартрита21. Тем не менее, модель FTCD по-прежнему имеет ограничения в оценке восстановления предостеоартритного дефекта. Еще одним ограничением этого исследования было отсутствие измерения MWT после 17 дней моделирования.

В заключение, эта модель была бы идеальной и стандартизированной животной моделью для имитации дефектов хряща путем сверления отверстий в бедренной трохлеарной бороздке крыс. Эта модель не только имитирует возникновение и развитие клинического ФКХД, но и обеспечивает надежную модель на животных для оценки терапевтических методов лечения ФТКД.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Чжэцзянским фондом естественных наук (грант No LQ20H270009), Фондом естественных наук Китая (гранты No 82074464 и 82104890), Чжэцзянским фондом традиционной китайской медицины (номера грантов 2020ZA039, 2020ZA096 и 2022ZB137) и Проектом медицинской науки и технологий здравоохранения Комиссии по здравоохранению провинции Чжэцзян (грант No 2016KYA196).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3, 3 '-diaminobenzidine   Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9019 The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody Novus NB600-594 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody Abcam (UK) 34712 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody Novus NB600-408 Primary antibody for IHC
Bouin solution Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Celestite blue Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Corncob paddings   Xiaohe Technology Co., Ltd  Bedding for animal 
Eosin Sigma-Aldrich 861006 The dye for HE staining
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9002 Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9001 Secondary antibody for IHC
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3163 The dye for HE staining
Masson Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Microdrill Rwd Life Science Co., Ltd 78001 Equipment for surgery
MMP13 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) 69926 Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center Thermo Fisher Scientific (USA) EC 350 Produce paraffin blocks
Neutral resin Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9555 Seal for IHC
Nonabsorbable suture Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. 4-0 Equipment for surgery
Pentobarbital sodium  Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. WBBTN5G Anesthetized animal
phosphomolybdic acid  Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes Thermo Fisher Scientific (USA) HM325 Precise paraffin sections
Safranin-O Sigma-Aldrich S2255 The dye for SO staining
Scalpel blade Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. 11 Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x) Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. HK1222 Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats  Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. SD Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr Sakura (Japan) Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue Sigma-Aldrich 89640 The dye for TB staining
Von Frey filament UGO Basile (Italy)  37450-275 Equipment for MWT assay
Wire mesh platform  Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. Equipment for MWT assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
  2. Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
  3. Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
  4. Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
  5. Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065 (2022).
  6. Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
  7. Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
  8. Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245 (2022).
  9. Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
  10. Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
  11. Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288 (2018).
  12. Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
  13. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
  14. Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
  15. Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639 (2020).
  16. Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
  17. Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
  18. Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
  19. Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37 (2021).
  20. Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
  21. Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
  22. Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422 (2020).
  23. Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
  24. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  25. Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).

Tags

Медицина Выпуск 195 Дефекты хряща полной толщины остеоартрит животная модель боль при остеоартрите крысы
Разработка и оценка крысиной модели полноразмерных дефектов хряща
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, H., Bao, R., Xu, J., Ge, Y.,… More

Zhang, H., Bao, R., Xu, J., Ge, Y., Chen, Z., Fan, M., Yu, G., Zhou, L., Guo, L., Shan, L., Bao, H. Development and Evaluation of a Rat Model of Full-Thickness Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (195), e64475, doi:10.3791/64475 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter