Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tam Kat Kıkırdak Defektlerinin Sıçan Modelinin Geliştirilmesi ve Değerlendirilmesi

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64475
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 1, 5, 1, 3, 1, 1
1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2Fuyang Orthopaedics and Traumatology Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 3College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, 4Affiliated Zhejiang Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Xianju County Hospital of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, sıçanların femoral troklear oluğunda delikler açarak ve sonraki ağrı davranışını ve histopatolojik değişiklikleri ölçerek tam kat kıkırdak defektleri (FTCD) modeli oluşturur.

Abstract

Travma sonucu diz ekleminin kıkırdak defektleri klinikte sık görülen bir spor eklemi yaralanmasıdır ve bu defektler eklem ağrısı, hareket bozukluğu ve sonunda diz osteoartriti (kOA) ile sonuçlanır. Bununla birlikte, kıkırdak kusurları ve hatta kOA için çok az etkili tedavi vardır. Terapötik ilaçlar geliştirmek için hayvan modelleri önemlidir, ancak kıkırdak kusurları için mevcut modeller tatmin edici değildir. Bu çalışma, sıçanların femoral troklear oluğunda delikler açarak tam kalınlıkta bir kıkırdak defekti (FTCD) modeli oluşturdu ve sonraki ağrı davranışı ve histopatolojik değişiklikler okuma deneyleri olarak kullanıldı. Ameliyattan sonra, insan kıkırdak defektlerinde gözlenen patolojik değişikliklerle tutarlı olarak mekanik geri çekilme eşiği azaldı, yaralı bölgedeki kondrositler kayboldu, matriks metalloproteinaz MMP13 ekspresyonu arttı ve tip II kollajen ekspresyonu azaldı. Bu metodolojinin uygulanması kolay ve basittir ve yaralanmadan hemen sonra büyük gözlem sağlar. Ayrıca, bu model klinik kıkırdak kusurlarını başarılı bir şekilde taklit edebilir, böylece kıkırdak defektlerinin patolojik sürecini incelemek ve karşılık gelen terapötik ilaçları geliştirmek için bir platform sağlar.

Introduction

Eklem kıkırdağı, kondrositler ve hücre dışı matriks1'den oluşan oldukça farklılaşmış ve yoğun bir dokudur. Eklem kıkırdağının yüzey tabakası, pürüzsüz bir yüzeye, düşük sürtünmeye, iyi mukavemete ve elastikiyete ve mükemmel mekanik stres toleransına sahip bir hiyalin kıkırdak şeklidir2. Hücre dışı matris, kollajen proteoglikan ve sudan oluşur ve tip II kollajen, toplam kollajenin yaklaşık %90'ını oluşturduğu için kollajenin ana yapısal bileşenidir3. Kıkırdak dokusunda kan damarı veya sinir bulunmadığından, yaralanmadan sonra kendi kendini onarma yeteneğinden yoksundur4. Bu nedenle travma sonucu oluşan kıkırdak defektleri kliniklerde her zaman inatçı bir eklem hastalığı olmuştur; Ek olarak, bu eklem hastalığı gençleri vurma eğilimindedir ve küresel insidans artmaktadır 5,6. Diz eklemi, kıkırdak defektlerinin en yaygın bölgesidir ve buradaki kusurlara eklem ağrısı, eklem disfonksiyonu ve eklem kıkırdak dejenerasyonu eşlik eder ve sonunda diz osteoartritine (kOA) yol açar7. Diz ekleminin kıkırdak defektleri hastalara ekonomik ve fizyolojik yükler getirmekte ve hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde etkilemektedir8. Bu hastalık, yakın bir çözümü olmayan büyük ve acil bir klinik sorun teşkil etmektedir. Şu anda, cerrahi kıkırdak defektleri için tedavinin temel dayanağıdır, ancak uzun vadeli sonuçları tatmin edici değildir9.

Klinik kıkırdak defektleri sonunda kOA'ya yol açar ve bu nedenle kOA hayvan modelleri, kıkırdak defektlerinin patolojik incelemesi ve ilaç geliştirme için yaygın olarak kullanılır. Hayvan modellerinin oluşturulması, kıkırdak rejenerasyonunu ve fibrokartilaj ile hiyalin kıkırdak arasındaki değişimi gözlemlemek için kullanılabilecek kıkırdak defekti onarımının patofizyolojik sürecini anlamak için önemlidir10. Bununla birlikte, ön çapraz bağ transeksiyonu (ACLT), medial menisküsün destabilizasyonu (DMM), ovariektomi (OVX) ve Hulth'un cerrahi modelleri gibi yaygın olarak kullanılan kOA hayvan modelleri genellikle uzun vadeli modellemeye ihtiyaç duyar ve yalnızca patolojik ve ağrı değerlendirmelerine izin verir, bu da ilaç geliştirmenin etkinliğine sınırlamalar getirir11. Cerrahi modellerin yanı sıra monoiyodoasetat (MIA) ve papain enjeksiyonu gibi kimyasal modeller de kıkırdak defektlerine neden olur, ancak defektin derecesi iyi yönetilemez ve koşullar klinik gerçeklikten uzaktır11. Çarpışma, daha büyük hayvanlarda kıkırdak defektlerini modellemek için başka bir yaklaşımdır, ancak bu yöntem belirli aletlerin kullanımına bağlıdır ve nadiren uygulanır12.

Özetle, mevcut kOA modelleri kıkırdak defektlerinin patogenezini araştırmak veya yeni ilaçlar geliştirmek için ideal değildir ve kıkırdak defektleri için spesifik ve standardize bir modele ihtiyaç vardır. Bu çalışma, sıçanlarda femoral troklear olukta delikler açarak tam kat kıkırdak defektleri (FTCD) modeli oluşturmuştur. Model değerlendirmesi için kaba gözlem, ağrı davranış testleri ve histopatolojik analiz yapıldı. Diğer hayvan kOA modellerinden farklı olarak, bu modelin sıçanların genel durumu üzerinde çok az etkisi vardır. Bu modelleme yaklaşımı erişilebilirdir, iyi yönetilebilir ve kıkırdak defektlerinden kOA'ya ilerlemenin anlaşılmasını ve etkili terapötiklerin geliştirilmesini destekler. Bu model aynı zamanda osteoartritik eklemlerdeki kusurları iyileştirerek kOA'yı önleyen tedavileri test etmek için de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan deneyleri, laboratuvar hayvanlarının kullanımı ve bakımı ile ilgili Çin mevzuatına uygun olan Zhejiang Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Tıbbi Standartlar ve Etik Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmada 150-180 g ağırlığında 6 haftalık erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanlar kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Sıçanlarda tam kalınlıkta kıkırdak defektleri modelinin oluşturulması

  1. Yeni ortama alıştıktan 1 hafta sonra, sıçanları rastgele ve eşit olarak iki gruba ayırın (n = 8 sıçan / grup). Sahte gruptaki sıçanlar sahte cerrahiye sahip olurken, model grubundaki sıçanlar femoral troklear oluğunda delikler açmayı içeren deneysel cerrahiye sahip olacaklar.
    NOT: Sıçanların ayak parmaklarını korumak için her kafes steril mısır koçanı dolguları ile kaplanmalıdır ( Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Sıçanları intraperitoneal enjeksiyon (i.p.) pentobarbital sodyum (40 mg / kg) ile uyuşturun. Ardından, yeterli anesteziyi doğrulamak için sıçanların ayak parmaklarına hafifçe bastırın. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için farelerin gözlerine veteriner merhemi kullanın.
    NOT: Hayvan cerrahisinin, otoklavlanmış cerrahi aletler kullanılarak özel bir ameliyathanede yapılması gerekir. Operatörler ameliyat sırasında temiz laboratuvar önlükleri, yüz maskeleri, baş maskeleri ve steril eldivenler giymelidir. Steril pedleri cerrahi alanın üzerine yerleştirin ve kullanmadan önce tüm ekipmanı sterilize edin. Prosedür boyunca termal destek sağlayın.
  3. Fareyi ameliyat masasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin, sol ve sağ arka bacakları tıraş edin ve diz eklemi bölgesini cerrahi sabunla temizleyin, ardından steril koşullar altında üç kez alternatif antiseptik povidon-iyot çözeltisi ve alkol uygulayın. Sıçanın üzerine steril bir örtü yerleştirin ve sadece dezenfekte edilmiş diz eklemini ortaya çıkarın.
  4. Sıçan diz ekleminin ortasında bir neşter bıçağı (11 numara) ile yukarıdan aşağıya doğru 1 cm'lik bir kesi yapın ve yüzeysel diseksiyondan sonra eklem kapsülünü ve kuadriseps femoris tendonunu patellanın medial kenarı boyunca kesin.
    NOT: Kuadriseps femoris tendonu, diz ekleminin fleksiyonu sırasında patellaya ve femoral kondilebağlanır 13. Eklem kapsülünde görülen oluk femoral troklear oluktur ve distal femoral kondil medial ve lateral kondilleri oluşturur.
  5. Patellayı dışa çevirin ve femoral kondilin trokleasını tamamen ortaya çıkarmak için tibia ve fibulayı 90° açıyla esnetin. Femoral troklear oluğunda 0,1 mm derinliğe sahip bir tam kalınlıkta kıkırdak defekti yapmak için 10 saniye boyunca 4.000 rpm'de kıkırdak yüzeyine dikey olan 1,6 mm çapında dairesel bir matkap ucu ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın.
    NOT: Delme prosedürü sırasında çevredeki kemik dokusuna termal travmayı en aza indirmek için aralıklı olarak salin kullanın.
  6. Ameliyat bölgesini %0.9 tuzlu su çözeltisine batırılmış pamuk topları ile silin, patellayı değiştirin, dizini uzatma pozisyonunda tutun ve emilmeyen 4-0 dikişlerle kesiyi katman katman dikin (bkz.
    1. Hayvanları sternal yaslanmış ısıtma yastıklarına yerleştirin, uyanana kadar izleyin ve ardından kafeslerine geri koyun. Ağrıyı hafifletmek için ameliyattan sonra her 8 saatte bir üç kez deri altına buprenorfin (0.05 mg/kg) enjekte edin.
  7. Bölüm 2'de açıklandığı gibi, ameliyattan 3 gün, 10 gün ve 17 gün sonra tüm sıçanların ağrı ile ilgili davranışlarını test edin.

2. Mekanik geri çekilme eşiği (MWT)

NOT: Sıçanların bilateral posterior plantarının DYT'si klasik von Frey filament ağrı ölçüm yöntemi14 ile ölçüldü.

  1. Fareyi tek bir plastik hazneye (17 cm x 11 cm x 13 cm) bir tel örgü platform üzerine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve tel örgü tabanını bir masanın 50 cm yukarısına yerleştirin. 30 dakikalık adaptasyondan sonra MWT'yi ölçün.
  2. Von Frey filamentini ( Malzeme Tablosuna bakın) her bir sıçanın arka pençesinin plantar yüzeyine dik olarak bastırın ve arka pençenin merkezinin en kalın kısmından kaçınarak fırçayı yaklaşık 2 saniye bükün.
  3. Olumlu bir yanıt (pençe çekilmesi veya pençe yalama) oluşana kadar uyaran ağırlığını en düşük 4 g'dan kademeli olarak artırın.
    NOT: Her stimülasyon arasındaki aralık 1 dakikadan fazla olmalıdır. MWT, beş stimülasyonda üç pozitif yanıt olarak tanımlanır; Uyaran ağırlığını gram cinsinden kaydedin.
  4. Sham ve model grupları için ortalama değerleri, gram cinsinden kaydedilen minimum uyaran ağırlığına göre hesaplayın.

3. Histopatolojik ve immünohistokimyasal analiz

  1. Ameliyattan 17 ve 56. günlerde, sıçanları 40 mg / kg pentobarbital sodyum (ip) ile uyuşturun ve kalpten kan çekerek tüm sıçanları kurban edin. Orta femur ve orta tibiadaki kemiği keserek dizleri izole edin ve çevredeki kas dokusunu inceleyin. Histolojik analiz için diz eklemlerini çıkarın.
  2. Diz eklemlerini oda sıcaklığında 48 saat boyunca 20 mL %10 paraformaldehit çözeltisine sabitleyin ve ardından 4 ° C'de 8 hafta boyunca bir orbital çalkalayıcıda 20 mL %10 EDTA çözeltisi ile kireçten arındırın. EDTA çözeltisini her gün değiştirin.
  3. Diz eklemini gömme kutusunun boyutuna uyacak şekilde kesin. Susuz kalmış diz eklemlerini %100 parafin15 içine gömün.
  4. Parafine gömülü diz eklemlerini bir mikrotomun tutucusuna yerleştirin, açıyı ayarlayın ve parafin örneğini yüzey düz olana kadar bir bıçakla kesin.
  5. Parafin dilimlerinin kalınlığını 3 μm'ye ayarlayın ve dilimleri 40 °C'de bir su banyosunda düzleştirin.
  6. Dilimleri cam slaytlara yapıştırın, kuruyana kadar 45 °C'lik bir fırın makinesine ( Malzeme Tablosuna bakın) koyun ve oda sıcaklığında saklayın.
  7. Mum alma ve rehidrasyon: Dilimleri 60 °C'de 4 saat fırında mumdan arındırın ve ardından dilimleri art arda %100 ksilen, %100 etanol (iki kez), %95 etanol, %80 etanol ve %75 etanol içine her seferinde 5 dakika yerleştirin.
  8. Hematoksilen ve eozin (H&E) boyama
    1. Mumdan arındırın, yeniden sulandırın ve dilimleri 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
    2. Dilimleri 3 dakika boyunca% 0.5 hematoksilen ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve dilim yüzeylerinde hematoksilen kalıntısı kalmayana kadar dilimleri çift damıtılmış suyla yıkayın.
    3. Dilimleri 3 saniye boyunca% 1 hidroklorik asit alkole batırın ve dilimleri 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
    4. Dilimleri %1 amonyaklı suda 10 saniye bekletin ve dilimleri çift damıtılmış suyla 2 dakika yıkayın.
    5. Dilimleri 1 dakika boyunca eozin ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve dilim yüzeylerinde eozin kalıntısı kalmayana kadar dilimleri çift damıtılmış suyla yıkayın.
    6. Dilimleri her seferinde 1 dakika boyunca art arda %95 etanol, %100 etanol ve %100 ksilene (üç kez) daldırın.
    7. Her dilime bir damla nötr reçine ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve bir lamel ile kapatın.
  9. Safranin O / Fast Freen (SO) boyama
    1. Mumdan arındırın, yeniden sulandırın ve dilimleri 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
    2. Dilimleri 3 dakika boyunca %0,05 Hızlı Yeşil ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve dilimlerin yüzeyinde Hızlı Yeşil kalıntısı kalmayana kadar dilimleri çift damıtılmış suyla yıkayın.
    3. Dilimleri 10 saniye boyunca% 1 asetik asit çözeltisine batırın ve dilimleri 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
    4. Dilimleri 2 dakika boyunca %2,5 SO ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ardından dilim yüzeylerinde SO kalıntısı kalmayana kadar dilimleri çift damıtılmış suyla yıkayın.
    5. Dilimleri her seferinde 1 dakika boyunca art arda %95 etanol, %100 etanol ve %100 ksilene (üç kez) daldırın.
    6. Her dilime bir damla nötr reçine ekleyin ve bir lamel ile kapatın.
  10. Toluidin mavisi (TB) boyama
    1. Mumdan arındırın, yeniden sulandırın ve dilimleri 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
    2. Dilimleri 2 dakika boyunca% 1 TB çözeltisine daldırın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve dilimlerin yüzeyinde toluidin mavisi kalıntısı kalmayana kadar dilimleri çift damıtılmış suyla yıkayın.
    3. Dilimleri her seferinde 1 dakika boyunca art arda %95 etanol, %100 etanol ve %100 ksilene (üç kez) daldırın.
    4. Her dilime bir damla nötr reçine ekleyin ve bir lamel ile kapatın.
  11. Masson boyama
    1. Mumdan arındırın, yeniden sulandırın ve dilimleri 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
    2. Dilimlere damla damla Bouin solüsyonu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, 37 °C'de 2 saat boyayın ve dilimlerin yüzeyindeki sarı renk kaybolana kadar çift damıtılmış su ile yıkayın.
    3. Dilimleri 3 dakika boyunca selestit mavisi ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve dilim yüzeylerinde selestit mavisi kalıntısı kalmayana kadar dilimleri çift damıtılmış suyla yıkayın.
    4. Dilimleri hematoksilen ile 3 dakika boyayın ve dilim yüzeylerinde hematoksilen kalıntısı kalmayana kadar dilimleri çift damıtılmış suyla yıkayın.
    5. Dilimleri 5 saniye asidik etanole batırın ve dilimleri 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
    6. Dilimleri 10 dakika boyunca Ponceau fuchsin ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve dilim yüzeylerinde Ponceau fuchsin kalıntısı kalmayana kadar dilimleri çift damıtılmış suyla yıkayın.
    7. Dilimleri 10 dakika boyunca fosfomolibdik aside ( Malzeme Tablosuna bakınız) daldırın, ardından 5 dakika boyunca TB çözeltisine daldırın ve dilimlerin yüzeyinde TB kalıntısı kalmayana kadar dilimleri çift damıtılmış suyla yıkayın.
    8. Dilimleri 2 dakika boyunca zayıf bir asit çözeltisine batırın ve dilimleri 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
    9. Dilimleri her seferinde 1 dakika boyunca art arda %95 etanol, %100 etanol ve %100 ksilene (üç kez) daldırın.
    10. Her dilime bir damla nötr reçine ekleyin ve bir lamel ile kapatın.
  12. Mankin'in puanlama sistemine göre eklem kıkırdağı dejenerasyonunun derecesini belirlemek için tüm dilimleri mikroskop altında çift kör bir ortamda gözlemleyin16.
  13. İmmünohistokimya
    1. Dilimleri rutin olarak mumdan arındırın ve yeniden sulandırın ve dilimleri PBS ile 2 dakika yıkayın.
    2. Dilimleri sodyum sitrat çözeltisine daldırın ve antijeni onarmak için dilimleri 4 saat boyunca 60 ° C'de bir fırına koyun. Dilimleri PBS ile her biri 3 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    3. Dilimleri 10 dakika boyunca %0.3 Triton X-100 solüsyonuna daldırın ve dilimleri her seferinde 3 dakika PBS ile iki kez yıkayın.
    4. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında metanol içinde% 3H2O2çözeltisi ekleyerek endojen peroksidaz aktivitesini bloke edin. Dilimleri her seferinde 3 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.
    5. Spesifik olmayan bağlanmaları engellemek için bölümleri PBS'de %5 keçi serumu ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Dilimleri her seferinde 3 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.
    6. Her dilime 100 μL PBS ile seyreltilmiş primer antikor (anti-kol1, 1:50; anti-kol3, 1:50; anti-kol2, 1:100; ve anti-MMP13, 1:100; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Dilimleri her seferinde 3 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.
    7. Her dilimi 100 μL PBS ile seyreltilmiş (1:100) ikincil antikor (keçi anti-tavşan veya keçi anti-fare, Malzeme Tablosuna bakınız) ile oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Dilimleri her seferinde 3 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.
    8. Her dilime 100 μL 3, 3 '-diaminobenzidin (DAB, Malzeme Tablosuna bakınız) çalışma çözeltisi ekleyin.
    9. Mikroskop altında kahverengi bir rengin ortaya çıkma süresini gözlemleyin ve kaydedin; Kromojenik reaksiyon epitop bölgelerini kahverengiye çevirir17. Numunelerin geri kalanını aynı kaydedilen reaksiyon süresiyle işlemden geçirin.
    10. Dilimler kahverengileştikten sonra, dilimleri her seferinde 3 dakika boyunca iki kez çift damıtılmış suyla yıkayın.
    11. Dilimleri 1 dakika hematoksilen ile tekrar boyayın ve dilimleri 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
    12. Dilimleri 3 saniye hidroklorik aside batırın ve dilimleri 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.
    13. Dilimleri %1 amonyaklı suda 10 saniye bekletin ve dilimleri çift damıtılmış suyla 2 dakika yıkayın.
    14. Dilimleri her seferinde 1 dakika boyunca art arda %95 etanol, %100 etanol ve %100 ksilene (üç kez) daldırın.
    15. Her dilime bir damla nötr reçine ekleyin ve bir lamel ile kapatın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışmada, femoral troklear olukta delikler açılarak ve sonraki ağrı davranışı ve histopatolojik değişiklikler tespit edilerek FTCD'nin bir sıçan modeli oluşturulmuştur. Şekil 1'de gösterildiği gibi, modellemeden 3 gün sonra, sahte grupla karşılaştırıldığında, model grubundaki sıçanların MWT'si önemli ölçüde azaldı ve bu da FTCD'nin neden olduğu hiperaljeziyi düşündürdü. Modellemeden 17 gün sonra, model grubundaki sıçanların mekanik geri çekilme eşiği düşük bir seviyede kaldı, bu da ağrı duyarlılığının en az 17 gün sürebileceğini gösterdi. Histopatolojik boyama sonuçları, sham grubunda eklem kıkırdağının yapısının açık olduğunu, kıkırdak yüzeyinin sağlam olduğunu, kondrositlerin eşit dağıldığını ve tip II kollajenin yüksek oranda eksprese edildiğini gösterdi. Aksine, model grubunda kıkırdak yüzeyi bir çöküntü oluşturdu, kondrositler kayboldu, matriks metalloproteinaz MMP13 ekspresyonu arttı ve tip II kollajen ekspresyonu azaldı (Şekil 2 ve Şekil 3).

Figure 1
Şekil 1: Kıkırdak defektlerinden sonra DYT gelişimi. Arka pençelerin mekanik çekilme eşikleri, kıkırdak defektleri indüklendikten sonra değerlendirildi. n = 8 sıçan/grup. Değerler ortalama ± SEM olarak sunulur. **P < 0.01 sham grubuna karşı, ***P < 0.001 vs sham grubu. Student'ın t-testi uygulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Histopatolojik gözlem (HE, SO, TB ve Masson boyama) ve kıkırdak defektleri tedavisinden sonraki 17. günde sıçan diz eklemlerinin Mankin skorlaması. (A) Bir FTCD sıçanının temsili histolojik resimleri. Siyah oklar kıkırdak kusurlarını gösterir. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B) Sahte ve model gruplarındaki osteoartrit skorlarının istatistiksel analizi. n = 6 sıçan/grup. Değerler ortalama ± SEM olarak sunulur. ***P < 0,001 ve sahte grup. Student'ın t-testi uygulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: 17. günde sıçan kıkırdağında Kol1, Kol3, Kol2 ve MMP13 ekspresyonunun ve negatif boyamanın immünohistokimyasal gözlemi. Bir FTCD sıçanının temsili histolojik resimleri. Siyah oklar kıkırdak kusurlarını gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Sıçan femoral troklear oluğunda delme yoluyla tam kalınlıkta kıkırdak defektlerinin indüklenmesinin temsili resimleri. (A) Sahte sıçan. (B) Model sıçan. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Sıçanlarda tam kat kıkırdak defektlerinin tam olarak doldurulduğunu gösteren histolojik değerlendirme. (A) 17. günde temsili bir görüntü. (B) 56. günde temsili bir görüntü. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışma, sıçanların femoral troklear oluğunda delikler açarak klinik kıkırdak defektlerini taklit etmek için bir hayvan modelini açıklamaktadır (Ek Şekil 1). Kıkırdak yaralanmasından sonra, periferik nosiseptörlerin uyarılabilirliği veya duyarlılığı artar, bu da ağrı eşiğinde bir azalmaya ve stimülasyona yanıtın artmasına neden olabilir18. Klinik öncesi çalışmalarda, farklı hayvan türlerinde kıkırdak defektlerinin modellenmesi her zaman ağrıya neden olmuştur19. Klinik araştırmalar ayrıca kıkırdak yaralanması olan hastaların ağrı görsel analog skala (VAS) puanlarının sağlıklı bireylere göre anlamlı derecede düşük olduğunu göstermiştir20. FTCD tedavisinin etkisini test etmek için FTCD modelini kullandık ve sonuçlar, ÖÇT'deki azalmanın geçici olmadığını ve ÖÇT'nin kısa bir süre içinde hızlı bir şekilde iyileşmediğini gösterdi. Bir süre tedaviden sonra, model grubundaki MWT hala anlamlıydı, tedavi grubu rahatladı (veriler gösterilmedi). Klinik etkinlik genellikle 1 aylık bir tedavi sürecine göre değerlendirilir, bu nedenle iyileşme birkaç ay sonra gerçekleşse bile, bu modelin deneysel uygulamasını etkilemez. Ayrıca kıkırdak yüzey defektlerini gözlemlemek ve FTCD'nin oluşumunu göstermek için patolojik boyama ve immünohistokimya uygulandı.

FTCD'yi modellemek için kullanılan bu yöntem aşağıdaki avantajlara sahiptir: (1) kolay ve basit kullanım; (2) kısa modelleme süresi; (3) yüksek başarı oranı; ve (4) brüt gözlem yoluyla görünür ilerlemenin varlığı. Diğer hayvan modellerinden farklı olarak, bu model standartlaştırılabilir. FTCD modelinin delme derinliği ve çapının kontrolü kolaydır, bu da FTCD modelini standartlaştırmak için faydalıdır ve tekrarlanabilirliğini artırır. İkincisi, delme deliğinin çapı, onarım verimliliğini belirleyen önemli bir faktördür. 1.4 mm çapındaki osteokondral defektler kendiliğinden iyileşebilir ve bu da terapötik tedavilerin uygun şekilde değerlendirilmesinde başarısızlığa yol açabilir21. Bu eksikliklerin giderilmesi ve standardizasyonun sağlanması için ön deneyler yapılmış, FTCD ameliyatı eklem kıkırdağı yüzeyine 1.6 mm çapında deliklerle yapılırsa kıkırdak defektlerinin ameliyattan 17 gün sonrasına kadar kendiliğinden tamir edilmeyeceği tespit edilmiştir. Zamanla, sondajın neden olduğu FTCD kıkırdak onarımını gösterir ve kusurlu kıkırdak ameliyattan 8 hafta sonra büyük ölçüde onarılır (Ek Şekil 2). Uygulamalar açısından, bu model sadece kOA'nın neden olduğu kıkırdak defektlerini incelemek için değil, aynı zamanda travmatik kıkırdak defektlerini, yani travma sonrası osteoartritleri incelemek için dekullanılabilir22. Kendi kendine onarılan kıkırdak, yaralı bölgede hiyalin kıkırdak yerine her zaman fibrokartilaj oluşturur ve bu model aynı zamanda kıkırdak fibrozunun patogenezini ve tedavisini incelemek için de uygun olabilir23.

Bu modelin sınırlılıkları açısından, klinik uygulamada travmanın neden olduğu kıkırdak defektleri gençlerde ortaya çıkma eğiliminde olduğundan, olgunlaşmamış sıçanlar seçilmiştir. Bununla birlikte, iskelet gelişim aşamasındaki olgunlaşmamış sıçanlarda, kıkırdak olgun sıçanlarınkinden daha incedir ve bu da deneyin sonuçlarını etkileyebilir24. Önceki araştırmalar, yetişkin farelerde kıkırdak hasarından sonra kök hücrelerin yenilenme yeteneğinin genç farelere kıyasla azaldığını göstermiştir25. Deney için 6 haftalık sıçanlar seçtik ve bu sıçanlar kök hücre onarım mekanizmalarını gözlemlemek için de kullanılabilir; Ek olarak, 6 haftalık sıçanlarda terapötik etkiler yetişkin sıçanlara göre daha belirgindir (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca FTCD'yi yaşlı sıçanlarda modellememiz gerekiyor ve kök hücre rejeneratif kapasitesinin azalması nedeniyle yaşlı sıçanlarda onarımın daha yavaş olabileceği tahmin edilebilir. Araştırmalar, osteokondral defektleri çevreleyen eklem kıkırdağının katabolik aktiviteye sahip olduğunu ve IL-1β ve FGF2 ekspresyonu ve FGFr1/FGFr3 dengesindeki bir bozukluğun erken osteoartritik hastalık sürecini başlatmada önemli olduğunu göstermiştir21. Bununla birlikte, FTCD modelinin osteoartritik defekt onarımını değerlendirmede hala sınırlamaları vardır. Bu çalışmanın bir diğer sınırlılığı, 17 günlük modellemeden sonra DYT'lerin ölçülmemesiydi.

Sonuç olarak, bu model sıçanların femoral troklear oluğunda delikler açarak kıkırdak defektlerini taklit etmek için ideal ve standardize bir hayvan modeli olacaktır. Bu model sadece klinik FTCD'nin oluşumunu ve gelişimini taklit etmekle kalmaz, aynı zamanda FTCD'ye karşı terapötik tedavileri değerlendirmek için güvenilir bir hayvan modeli sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Zhejiang Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası LQ20H270009), Çin Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numaraları 82074464 ve 82104890), Zhejiang Geleneksel Çin Tıp Bilimleri Vakfı (hibe numaraları 2020ZA039, 2020ZA096 ve 2022ZB137) ve Zhejiang İl Sağlık Komisyonu Tıbbi Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Projesi (hibe numarası 2016KYA196) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3, 3 '-diaminobenzidine   Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9019 The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody Novus NB600-594 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody Abcam (UK) 34712 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody Novus NB600-408 Primary antibody for IHC
Bouin solution Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Celestite blue Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Corncob paddings   Xiaohe Technology Co., Ltd  Bedding for animal 
Eosin Sigma-Aldrich 861006 The dye for HE staining
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9002 Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9001 Secondary antibody for IHC
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3163 The dye for HE staining
Masson Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Microdrill Rwd Life Science Co., Ltd 78001 Equipment for surgery
MMP13 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) 69926 Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center Thermo Fisher Scientific (USA) EC 350 Produce paraffin blocks
Neutral resin Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9555 Seal for IHC
Nonabsorbable suture Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. 4-0 Equipment for surgery
Pentobarbital sodium  Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. WBBTN5G Anesthetized animal
phosphomolybdic acid  Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes Thermo Fisher Scientific (USA) HM325 Precise paraffin sections
Safranin-O Sigma-Aldrich S2255 The dye for SO staining
Scalpel blade Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. 11 Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x) Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. HK1222 Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats  Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. SD Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr Sakura (Japan) Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue Sigma-Aldrich 89640 The dye for TB staining
Von Frey filament UGO Basile (Italy)  37450-275 Equipment for MWT assay
Wire mesh platform  Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. Equipment for MWT assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
  2. Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
  3. Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
  4. Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
  5. Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065 (2022).
  6. Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
  7. Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
  8. Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245 (2022).
  9. Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
  10. Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
  11. Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288 (2018).
  12. Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
  13. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
  14. Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
  15. Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639 (2020).
  16. Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
  17. Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
  18. Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
  19. Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37 (2021).
  20. Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
  21. Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
  22. Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422 (2020).
  23. Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
  24. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  25. Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).

Tags

Tıp Sayı 195 Tam kalınlıkta kıkırdak defektleri osteoartrit hayvan modeli osteoartrit ağrısı sıçanlar
Tam Kat Kıkırdak Defektlerinin Sıçan Modelinin Geliştirilmesi ve Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, H., Bao, R., Xu, J., Ge, Y.,… More

Zhang, H., Bao, R., Xu, J., Ge, Y., Chen, Z., Fan, M., Yu, G., Zhou, L., Guo, L., Shan, L., Bao, H. Development and Evaluation of a Rat Model of Full-Thickness Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (195), e64475, doi:10.3791/64475 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter