Summary
neuroHuMiX er en avanceret gut-on-a-chip-model til at studere interaktionerne mellem bakterielle, epitel- og neuronale celler under proksimale og repræsentative co-kulturbetingelser. Denne model gør det muligt at optrævle de molekylære mekanismer, der ligger til grund for kommunikationen mellem tarmmikrobiomet og nervesystemet.
Abstract
Den menneskelige krop er koloniseret af mindst det samme antal mikrobielle celler, som den består af humane celler, og de fleste af disse mikroorganismer er placeret i tarmen. Selvom samspillet mellem tarmmikrobiomet og værten er blevet grundigt undersøgt, er det stort set ukendt, hvordan tarmmikrobiomet interagerer med det enteriske nervesystem. Til dato findes der ikke en fysiologisk repræsentativ in vitro-model til undersøgelse af tarmmikrobiom-nervesysteminteraktioner.
For at udfylde dette hul videreudviklede vi den human-mikrobielle krydstale (HuMiX) gut-on-chip-model ved at introducere inducerede pluripotente stamcelleafledte enteriske neuroner i enheden. Den resulterende model, 'neuroHuMiX', muliggør samdyrkning af bakterielle, epitel- og neuronale celler på tværs af mikrofluidiske kanaler, adskilt af semipermeable membraner. På trods af adskillelse af de forskellige celletyper kan cellerne kommunikere med hinanden gennem opløselige faktorer, samtidig med at de giver mulighed for at studere hver celletype separat. Denne opsætning giver mulighed for første indsigt i, hvordan tarmmikrobiomet påvirker de enteriske neuronale celler. Dette er et kritisk første skridt i at studere og forstå den menneskelige tarmmikrobiom-nervesystemakse.
Introduction
Det menneskelige tarmmikrobiom spiller en afgørende rolle i menneskers sundhed og sygdom. Det er blevet grundigt undersøgt i løbet af det sidste halvandet årti, og dets potentielle rolle i modulering af sundhed og sygdom er nu etableret1. En forstyrrelse i mikrobiomet, der fører til et ubalanceret mikrobielt samfund (dysbiose), er blevet postuleret at være involveret i patogenesen af mange kroniske lidelser, såsom fedme, inflammatorisk tarmsygdom og kolorektal cancer eller endda neurodegenerative sygdomme såsom Parkinsons sygdom 2,3.
Selvom det menneskelige tarmmikrobiom har været forbundet med neurologiske tilstande, er det stadig uklart, hvordan tarmmikrobiomet kommunikerer med og påvirker det enteriske nervesystem. Da det menneskelige enteriske nervesystem ikke er let tilgængeligt til øjeblikkelig undersøgelse, er dyremodeller hidtil blevet brugt i forsøg4. I betragtning af de tilsyneladende forskelle mellem dyremodeller og mennesker5 er udviklingen af in vitro-modeller, der efterligner den menneskelige tarm, imidlertid af umiddelbar interesse. I denne sammenhæng har det spirende og fremadskridende felt af humant inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) gjort det muligt for os at opnå repræsentative enteriske neuroner (EN'er)6. iPSC-afledte EN'er gør det muligt at undersøge det enteriske nervesystem i in vitro-dyrkningsmodeller, såsom cellekulturindsatser, organoider eller organer-på-en-chip 7,8.
HuMiX-modellen (human-microbial crosstalk) er en gut-on-a-chip-model, der efterligner den menneskelige tarm9. Den oprindelige HuMiX-model (i det følgende benævnt den oprindelige enhed) rummede epitelceller (Caco-2) og bakterieceller10,11. For at studere forbindelsen mellem tarmmikrobiom og nervesystem er iPSC-afledte EN'er6 imidlertid også blevet introduceret i systemet (figur 1). Den proksimale co-kultur af neuronale, epitel- og bakterieceller tillader analyse af de forskellige celletyper individuelt og undersøgelse af interaktionerne mellem de forskellige celletyper i et miljø, der efterligner den menneskelige tarm.
I de senere år er der gjort fremskridt i udviklingen af modeller til at studere organer på mere fysiologisk repræsentative måder ved hjælp af organer-på-en-chip (f.eks. gut-on-a-chip) modeller. Disse modeller er mere repræsentative for det menneskelige tarmmiljø på grund af konstant næringsstofforsyning og fjernelse af affald samt realtidsovervågning af for eksempel iltniveauer eller barriereintegritet 8,12. Disse modeller tillader specifikt undersøgelse af tarmbakteriernes virkninger på værtsceller. For at kunne bruge organer-på-en-chip til at studere sammenhængen mellem tarmmikrobiomet og nervesystemet skal neuronale celler imidlertid integreres i sådanne systemer. Formålet med at videreudvikle HuMiX og etablere neuroHuMiX-systemet (herefter benævnt udstyret) var derfor at udvikle en gut-on-a-chip-model, som inkluderer enteriske neuronale celler i proksimal co-kultur med tarmepitelceller og bakterier.
Protocol
1. Cellekultur og sortering
- Inducerede pluripotente stamcelleafledte enteriske neuroner
BEMÆRK: Kultur iPSC'er 6 uger før starten af et løb. Differentieringsprotokollen for EN'erne er blevet tilpasset fra Fattahi et al.6.- IPSC'erne dyrkes på en matrixgelbelagt 6-brønds plade i 2 ml/hul iPSC-dyrkningsmedium suppleret med 1 % penicillin-streptomycin (P/S).
- Ved 80% -90% sammenløb, passage cellerne, frø i en matrix gel-coated plade ved hjælp af samme medium, inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 og 90% relativ luftfugtighed (RH).
- Til iPSC-afledning, efter to passager efter optøning, ved 80% -90% sammenløb, frø cellerne i en matrix gelbelagt 6-brønds plade med en densitet på 100.000 celler / brønd. Der inkuberes i det ovenfor beskrevne medie + ROCK-hæmmer Y-27632 (1:2.000) i 24 timer ved 37 °C.
- Efter 24 timer erstattes supernatantsubstratet med dag 0-substratet i overensstemmelse med tabel 1. Medtag et kontrolfelt, der skal bruges som negativ kontrol under cellesortering til afledningsprocessen. Hold kontrollen godt i dag 0 mediesammensætning i hele afledningsperioden. Skift mediet hver anden dag fra dag 2 til 10 i henhold til tabel 1.
- På dag 11 sorteres cellerne for CD49d-positive celler, som vil blive brugt i de følgende trin i denne protokol.
- Saml cellerne, der skal sorteres, baseret på CD49d-positive celler samt kontrolbrønden. Centrifuger cellerne i 3 minutter ved 300 × g. Resuspender cellepellet i 2% bovin serumalbumin (BSA) + 1% P/S i 1x fosfatbufret saltvand (PBS).
- Opdel hvert celleparti (poolet og kontroller) i to: plet en fraktion med anti-humant CD49d-antistof og den anden fraktion med et isotypekontrolantistof.
- Gate hovedcellepopulationen og derefter gate enkeltceller, baseret på hvilke cellerne, der præsenterer CD49d på deres overflade, vælges. Saml disse celler til det næste trin i differentieringen.
BEMÆRK: Normalt er 30% -40% af de sorterede celler CD49d-positive.
- Overfør to til fire millioner af de sorterede celler til en 6-brønds plade med en ultralav fastgørelsesplade i N2B27-medier (se tabel 2) + FGF2 + CHIR i 4 dage for at tillade sfærisk dannelse.
- På dag 15 genplades sfæroiderne på en poly L-ornithin/laminin/fibronectin (P/L/F)-belagt 6-brønds plade i 2 ml/brønd N2B27-medier med GDNF og ascorbinsyre (AA). Udskift mediet hver 2-3 dage.
BEMÆRK: Belægningsforhold: poly L-ornithin, 15 μg/ml; laminin, 2 μg/ml; fibronectin, 2 μg/ml i 1x PBS. - Efter 3 uger skal du bruge cellerne til podning i enheden.
- Caco-2
BEMÆRK: Optø Caco-2-celler mindst 1 uge før en kørsel.- Frø en T75-kolbe med 1 × 106 Caco-2-celler i RPMI 1640 glutamintilskud + HEPES + 10% føtalt bovint serum (FBS); inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 og 90 % RH.
BEMÆRK: Til disse eksperimenter skal du ideelt set bruge Caco-2 ved deres første eller anden passage efter optøning.
- Frø en T75-kolbe med 1 × 106 Caco-2-celler i RPMI 1640 glutamintilskud + HEPES + 10% føtalt bovint serum (FBS); inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 og 90 % RH.
2. HuMiX køre forberedelse
- Klargøring og belægning af polycarbonatlåg
- Autoklave et par polycarbonatlåg (PC) (figur 2) sammen med fire skruer ved hjælp af enhedens indledende instrumentcyklus (se tabel 3 for detaljer).
- I et biosikkerhedsskab skal du indsætte fire skruer i hvert hjørne af det nederste pc-låg (se figur 3) og overføre til en steril firkantet petriskål til en totrins belægningsproces.
- Den første dag tilsættes 2 ml 1,5% poly L-ornithin i PBS (1x) til midten af PC-låget. Inkuberes natten over ved 37 °C, 5% CO2 og 90% RH.
- Den næste dag fjernes opløsningen og erstattes med en opløsning indeholdende 0,2% laminin og 0,2% fibronectin i PBS (1x) for at dække overfladen af neuroncellekammeret. Låget inkuberes natten over ved 37 °C, 5 % CO2 og 90 % relativ luftfugtighed.
- Efter inkubation skal du holde belægningsopløsningen på pc-låget og lukke petriskålen med en tætningsfilm. De anbringes ved 4 °C til opbevaring indtil brug.
- Før brug fjernes belægningsopløsningen, og lufttørres i et biosikkerhedsskab i 30 minutter, indtil belægningen er helt tør.
- Pakningsforberedelse og belægning
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver, hvordan man forbereder pakninger ved at klæbe semipermeable membraner til silikonepakninger. Efter et indledende autoklaveringstrin er pakningerne belagt med kollagen eller mucin for at tillade vedhæftning af intestinale epitelceller eller bakterier. Den mucinbelagte membran efterligner slimbarrieren, der er til stede i den menneskelige tarm.- Fastgør en polycarbonatmembran på 1 μm porestørrelse til kollagenpakningen og en polycarbonatmembran på 50 nm porestørrelse mellem de nederste og øverste sandwichpakninger. Pakningerne autoklave med de fastgjorte membraner ved hjælp af den indledende instrumentcyklus (se tabel 3).
- For at belægge membranerne skal du placere hver pakning i en steril firkantet skål.
BEMÆRK: Belægningen udføres under sterile forhold i et biosikkerhedsskab.- Til kollagenpakningen tilsættes 3 ml kollagen (50 μg/ml) til membranen og inkuberes i 3 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: Pas på ikke at røre membranen med pipettespidsen, når du tilsætter kollagen for at undgå at beskadige membranen. - Til mucinbelægningen placeres sandwichpakningen med den øverste pakningsside opad i en petriskål for at belægge oversiden af membranen med 3 ml mucin (0,025 mg / ml). Pakningerne inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Til kollagenpakningen tilsættes 3 ml kollagen (50 μg/ml) til membranen og inkuberes i 3 timer ved 37 °C.
- Efter inkubationstiden aspireres kollagen- og mucinopløsningerne fra deres respektive pakninger og lufttørres membranen i et biosikkerhedsskab i 30 minutter. Luk opvasken, forsegl med laboratorieforseglingsfilm, og opbevar pakningerne ved 4 °C indtil brug.
- Slange samling
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver, hvordan man samler slangen til perfusion af enheden. Før montering skal du autoklave alle stykkerne og / eller købe dem, der er pakket individuelt i en steril emballage. Placer alle komponenterne i et biosikkerhedsskab.- Brug tre rørledninger til hver enhed og til hver rørledning, et stykke pumperørledning, to stykker lange Marprene-slanger (20 cm), to stykker kort Marprene-slange (8 cm), en 40 mm nål til udstrømningsflasken, en 120 mm nål til 250 ml indløbsflasker eller 80 mm nål til mindre indløbsflasker, tre mandlige såvel som syv kvindelige Luer til modhagestik, tre Luer-adaptere og to trevejs stophaneventiler.
- Saml slangelinjer fra venstre mod højre ved hjælp af de autoklaverede og steriliserede komponenter, der er anført ovenfor (figur 4).
BEMÆRK: Spray hver komponent med 70% ethanol mellem hvert forbindelsestrin.
- Forberedelse af medierne
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver, hvordan mediet forberedes til de forskellige celletyper i udstyret, samt hvordan mediet overføres til serumflasker på en steril måde.- Suppler RPMI 1640 med 10% 0,22 μm filtreret, varmeinaktiveret FBS. Suppler N2B27-mediet frisk med GDNF og AA.
- Overfør substratet til serumflasker under sterile forhold. Overfør 200 ml RPMI 1640-medier til 250 ml flasker og 30 ml N2B27-medier til 50 ml flasker.
- Forbered bakteriemedium (RPMI 1640 + 10% FBS + 5% De Man, Rogosa og Shapre kulturmedium [MRS]) på et senere tidspunkt, da dette kun kræves i de sidste 24 timer af eksperimentet.
- Luk flaskerne med en septum, aluminium krymper dem og autoklave.
- For at overføre mediet skal du fjerne aluminiumskrympen ved hjælp af en passende decapper (diameter = 20 mm). Fjern også septumet. Hæld forsigtigt det tilberedte medium i serumflaskerne uden at røre flasken.
- For at sterilisere skal du flamme åbningen af flasken ved hjælp af en bærbar Bunsen-brænder. Forsegl flaskerne ved at sprøjte septum med 70% ethanol, tilsæt det til flasken og luk det med en aluminiumskrympe ved hjælp af en tætningspresser.
- De lukkede flasker anbringes i inkubatoren ved 37 °C, 5 % CO2 i 24 timer for at opvarme mediet til 37 °C samt for at sikre, at der ikke er synlige tegn på kontaminering, før der anvendes medieflasker til enheden.
3. HuMiX start
- NeuroHuMiX-samling
BEMÆRK: Dette afsnit forklarer, hvordan du samler enheden. Kort sagt steriliseres og strammes spændesystemet igen, hvorefter det nederste pc-låg placeres på bunden af klemmen. Derefter stables de belagte pakninger og de øverste pc-låg på hinanden efterfulgt af den øverste del af klemmen. Endelig strammes klemmen for at komprimere pakningerne og gøre systemet lækagefrit og gastæt. Figur 4 viser de forskellige dele, der er nødvendige for samlingen.- Autoklaver klemmerne og de to pc-låg (top og bund) inden montering.
- Stram skruerne, der bruges til at samle klemmens øverste og nederste del (figur 4C, D). Åbn skruerne inden autoklaveringsprocessen, og stram dem igen senere.
- Det overtrukne og tørrede (trin 2.2.3) nederste pc-låg (figur 4 A1) overføres fra det firkantede petrifad til toppen af klemmebunden ved at holde de fire skruer i hjørnerne af pc-låget.
BEMÆRK: Undgå at røre ved pc-låget for at reducere risikoen for kontaminering. - Placer epitelkammerpakningen opad (dvs. med membranen ovenpå) på pc-låget ved hjælp af steril pincet. Brug skruerne til at justere pakningen og pc-låget for at sikre, at indløbs- og udløbsportene i lågets hjørner er justeret med åbningerne i pakningen (figur 3).
- Brug den sterile pincet til at placere sandwichpakningen oven på kollagenpakningen med oversiden opad.
- Placer det øverste pc-låg oven på sandwichpakningen. For at reducere risikoen for kontaminering skal du gøre dette ved kun at berøre lågets kanter (rør ikke ved den øverste eller nederste del af låget). Sørg for, at modhagerne på klemmelåget flugter med indløbs- og udløbsåbningen på membranenheden, og at skruerne fra det nederste pc-låg passer ind i åbningen på det øverste pc-låg.
- For at lukke enheden skal du placere klemmelåget (den øverste del af klemmen) oven på pc-låget. Sørg for, at lågets åbninger falder sammen med indløbs- og udløbsmodhagerne på det øverste pc-låg. Luk låsene. Hold den lukkede anordning (figur 5) under emhætten for at tilslutte den til de grundede slangeledninger (trin 3.2.6).
- Priming af slangelinjer
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver, hvordan man forbinder slangen til ind- og udstrømningsflaskerne samt til pumpen, derefter primer slangen med medium for at fjerne eventuelle resterende produkter, der anvendes under rengøring og sterilisering, og sørg for, at der ikke er bobler i slangen.- Priming af rørledningerne udføres i biosikkerhedsskabet. Indsæt beluftningsnåle med filtre i septum på hver ind- og udstrømningsflaske. Brug en ren, steril pincet til at stikke 120 mm nålene i 250 ml serumflaskerne. Sæt 80 mm nålene i 50 ml serumflaskerne.
- De 40 mm nåle for enden af hver slangeslange sættes i en udstrømmende serumflaske. Pr. enhed er der to udstrømningsflasker til de tre slangelinjer. 40 mm nålene på epitel- og neuronalrørlinjerne er forbundet til den samme udstrømningsflaske til medium kassering. Bakterierørledningen går til den anden udstrømningsflaske.
- Indsæt pumperørledningerne i pumpekassetterne. Sørg for, at rørlinjernes trevejs stophaner alle er åbne.
- Indstil først den peristaltiske pumpe til at lede medier fra indstrømningen til udstrømningsflasken med en hastighed på 5 o / min (se tabel 4).
BEMÆRK: Under grundning af slangeledningen kan hastigheden øges op til 10 o / min for at fremskynde processen. - Start pumpen ved at trykke på startknappen , og sørg for, at pumperetningen er med uret. Når mediet falder ned i udstrømningsflaskerne, skal du sørge for, at der ikke er lækager, og at der ikke er luftbobler tilbage i rørledningerne og forbindelsespunkterne. Fjern eventuelle resterende bobler ved at banke på slangen og stikkene eller ved at øge pumpehastigheden.
- Når alle rørledningerne falder ned i udstrømningsflaskerne, skal du indstille strømningshastigheden til 2 o / min for tilslutning af den oprindelige enhed.
- Priming af enheden
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver, hvordan du primer enheden med cellekulturmedium for at sikre, at alle kamre er fyldt og forbelagt med medium, så der ikke efterlades bobler i systemet, og cellerne let kan klæbe under podningen.- Priming af enheden udføres i biosikkerhedsskabet under sterile forhold. For at forbinde enheden skal du starte med at forbinde neuronlinjen, enhedens nederste kammer.
- For at tilslutte en linje skal du lukke trevejs stophaneventilerne (figur 5C), først starte med udstrømningssiden, hvor den korte slange kobles fra hun-Luer-stikket og tilsluttes udløbsporten fra enheden ved at skubbe slangen over modhagen. For at sikre korrekt tilslutning og reducere risikoen for lækager og/eller kontaminering skal du sørge for, at slangen er i kontakt med låget ved at skubbe den helt ned over stikket. Tilslut tilstrømningsslangen på samme måde. Når en linje er helt forbundet til enheden (ind- og udstrømning), skal du åbne trevejs stophanerne.
- Gentag det foregående trin med epitellinjen og derefter med bakterielinjen. Hold pumpen ved en strømningshastighed på 2 o / min. Forøg pumpehastigheden til 2,5 o / min, men ikke højere, for at undgå lækager på grund af trykopbygning. Lad pumpen prime kamrene i enheden.
- Overvåg altid udstrømningsserumflaskerne. Hvis luftbobler sidder fast i kamrene, ledningerne eller stikket, vil en slangeledning med en luftboble indeni ikke falde længere i udstrømningskammeret. For at slippe af med luftbobler skal du først lade enhederne køre i et par minutter. Hvis dette ikke løser problemet, skal du lukke en af de andre linjer, der falder i kort tid, ved at lukke trevejs stophanen for udstrømningen.
- Når alle kamrene i enheden er fuldt primet - alle kamre er fyldt med cellekulturmedium, og der ikke er bobler tilbage i enheden - reducer pumpehastigheden til 0,5 o / min. Enheden er nu klar til cellepodning.
4. Celleforberedelse og podning
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver, hvordan du forbereder de forskellige celletyper, der er nødvendige for at pode enheden, samt hvordan du poder dem i enheden på en steril måde og uden at indføre luftbobler. Desuden beskriver den, hvordan man udfører medium forfriskning til neuroncellerne, og hvordan man forbereder medium til bakteriekulturen i enheden.
- Epitelceller
- Caco-2-cellerne løsnes fra kolben ved hjælp af trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), resuspenderes i RPMI 1640 + 10% FBS, og tæl i en Neubauer-celletæller ved hjælp af trypanblå udelukkelsesassay. Caco-2-cellesuspensionen centrifugeres (3 min, 300 × g), og supernatanten kasseres for at fjerne den resterende trypsin-EDTA. Caco-2-cellerne resuspenderes i RMPI 1640 + 10% FBS for at opnå en suspension på 350.000 celler/ml. For hver enhed er der brug for et volumen på 1,5 ml.
- Overfør 1,5 ml af Caco-2-cellesuspensionen til en steril 2 ml sprøjte, og fjern eventuel luft eller bobler, der er tilbage i sprøjten.
- Luk trevejs stophaneventilerne i slangen i bakterie- og neuronkamrene. Afbryd slangen i bakterie- og neuronkamrene fra pumpen ved at fjerne kassetterne med den respektive slange fra rotoren.
- Åbn hætten på trevejs stophaneventilen på indstrømningsslangen, der fører til epitelkammeret, og drej trevejs stophaneventilen for at omdirigere mediestrømmen fra enheden til det 'åbne stik' (figur 5C). Lad mediet flyde, indtil der vises en dråbe medium i den åbne ende af trevejs stophaneventilen.
- Indsæt sprøjten med epitelcellerne i det "åbne stik" ved hjælp af drop-drop-forbindelsesmetoden, så sprøjten kan indsættes i konnektoren uden indføring af luftbobler. Drej ventilen på trevejs stophanen for at stoppe mediets strømning fra indstrømningsflasken (via pumpen) og for at tillade flow fra den tilsluttede sprøjte til den oprindelige enhed. Afbryd epitelkanalen fra pumpen.
- Tryk langsomt på sprøjten for at pode epitelkammeret med cellesuspensionen. Sørg for, at ca. en dråbe pr. 3 s falder ned i udstrømningsflasken.
- Tilsæt 1,5 ml af cellesuspensionen, og luk derefter ventilen på udstrømningsstophanen. Afbryd sprøjten, og luk den åbne ende af trevejs stophanen med hætten. Hold kammeret lukket i mindst 2 timer. I mellemtiden inokulere neuronale celler.
- Neuronale celler
- Fjern neuronccellerne fra brønden ved at resuspendere cellerne i medierne fra de respektive brønde ved hjælp af en pipette. Pod hver enhed med fuldt sammenflydende celler fra en brønd (9,6 cm2) af en 6-brønds plade.
- Resuspender cellepelleten i det tilsvarende N2B27 medium volumen (1,5 ml medier pr. Enhed) + 1 μL fibronectin / ml cellesuspension. Overfør 1,5 ml af den resuspenderede cellesuspension til en 2 ml sprøjte, og fjern eventuelle luftbobler, der er tilbage i sprøjten. Anbring den fyldte sprøjte i et sterilt 50 ml konisk rør og overfør det til biosikkerhedsskabet, der indeholder den grundede HuMiX-enhed.
- Følg den samme podningsproces som beskrevet tidligere for epitelkammerinokulationen, bortset fra ændring af rørledning. Her skal du afbryde bakterie- og epitelrørledningerne fra pumpen.
- Efter neuronal celleinokulation skal du lukke alle trevejs stophaner på rørledningerne og afbryde forbindelsen til pumpen. Apparatet anbringes i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2. Hold alle kanaler lukket i 2 timer for at lade cellerne fastgøre.
- Efter 2 timer skal du forbinde bakterie- og epitelkanalerne til pumpen og åbne tilstrømnings- og udstrømningsstophanerne på begge linjer. Hold neuronkammeret lukket i løbet af de kommende 14 dage efter den første enhedskørsel, undtagen under medium skift.
- I løbet af 14 dages løb skal du ændre mediet i neuronkammeret hver 3-4 dage. Til medium opdatering tilberedes 3 ml frisk N2B27-medium pr. enhed og overføres til en steril 20 ml serumflaske. Luk serumflasken med medium ved hjælp af en steril septum og en aluminiumskrympeforsegling.
- Indsæt en beluftning og 80 mm nål i skillevæggen på den nye flaske. Udskift den gamle medieflaske med den nye i inkubatoren ved at afbryde hanflasken Luer fra nålen på den gamle flaske til nålen på den nye flaske.
- Tilslut kassetten med pumpeslangen i neuronkammeret til pumpen, og åbn trevejs stophanerne. Lad mediet strømme ved 0,5 o / min i 2 timer, før du lukker trevejs stophanerne i neuronalslangen og kobler fra pumpen indtil næste medieudveksling.
5. Bakteriekultur og podning
BEMÆRK: I denne undersøgelse, på dag 12, blev en flydende kultur af Limosilactobacillus reuteri stamme F275 genoplivet fra en glycerolbestand. Afhængigt af behov eller undersøgelsesdesign kan andre bakteriearter anvendes.
- Forbered tre rør med 5 ml MRS bouillon-et sterilt kontrolrør og to til L. reuteri podning. Med en podningssløjfe skraber du toppen af glycerolstammen af og overfører den til et rør. Gentag med et andet podningsrør. Reagensglassene inkuberes ved 37 °C, 170 o/min natten over.
BEMÆRK: Lad ikke glycerolstammen tø op. - Forbered frisk medium til de oprindelige enheder ved at blande Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 + 10% FBS med 5% MRS bouillon. Forbered 25 ml pr. enhed og overfør til 100 ml serumflasker under sterile forhold. Luk flaskerne med en steril septum og aluminiumskrympe. Anbring flaskerne i inkubatoren ved 37 °C, 5% CO2 natten over.
- Før flaskerne tilsluttes bakterieslangen, tilsættes en beluftningsnål og en 80 mm nål til hver flaske RPMI 1640/MRS-medie.
- Forbered nye rør, hver med 3 ml RPMI 1640 + 10% FBS + 5% MRS bouillon. Forbered mindst to rør, et kontrolrør og et rør pr. Enhed. 15 μL af L. reuteri overnight culture (optisk densitet [OD] > 2) podes i to af de nyfremstillede rør.
- Reagensglassene inkuberes i 1 time ved 37 °C, 170 omdr./min., hvorefter der opnås en OD på 0,05-0,10, svarende til ~1 × 107 kolonidannende enheder (CFU)/ml. Overfør 1,5 ml til en 2 ml sprøjte (én pr. enhed). Brug resten af bakteriesuspensionen til CFU-plettering og levende/død farvning.
- For bakteriel podning af enheden skal du følge samme procedure som nævnt i trin 4.1, bortset fra at her lukkes neuron- og epitelrørlinjerne.
- Efter podning skal du også lukke bakterierørledningen ved at lukke ventilerne og afbryde pumpen i 30 minutter. Tilslut epitel- og bakterierørlinjerne og åbn igen. Lad enhederne køre i yderligere 24 timer ved 37 °C og 0,5 o / min.
6. HuMiX åbning og prøveudtagning
BEMÆRK: Nedenstående afsnit beskriver prøveudtagningen af forskellige celletyper. For eksempel anvendes neuronale cellepellets til RNA-ekstraktion og efterfølgende kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR), bakteriepellets til DNA-ekstraktion og 16S rRNA-gensekventering og supernatanter til enzymbundne immunosorbentassays (ELISA'er) og andre assays (f.eks. lactassay).
- På dag 14, åbningsdagen, skal du lukke alle trevejs stophaner, frakoble slangerne fra pumpen og tage inkubatorens enhed ud til laboratoriebænken.
BEMÆRK: Når du flytter enheden, skal du sørge for at holde den faktiske enhed vandret. - Fjern slangeledningerne, der er tilsluttet enheden, før du langsomt åbner klemmen, og fjern klemmelåget. Fjern forsigtigt det øverste pc-låg, saml mediet i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og læg det på is.
- Fjern forsigtigt sandwichpakningen, mens du samler mediet fra epitelkammeret; Pas på ikke at røre cellelaget. Sandwichpakningen anbringes i et firkantet petrifad og tilsættes steril 0,9% NaCl-opløsning iH2Otil bakteriekammeret, indtil kammeret er helt dækket (ca. 1 ml).
- Fjern langsomt kollagenpakningen, mens du samler mediet fra neuronkammeret og overfører det til et mikrocentrifugerør. Placer alle medierørene på is. Placer kollagenpakningen i en firkantet skål og tilsæt forsigtigt et par milliliter 1x PBS til Caco-2-laget, indtil cellelaget er helt dækket.
- Placer det nederste pc-låg i en firkantet petriskål og tilsæt forsigtigt ca. 2 ml 1x PBS oven på neuroncellerne, så de ikke tørrer ud under prøveudtagningsprocessen.
- Centrifuger bakteriemedierøret ved 5.000 × g i 5 minutter ved 4 °C. Centrifuger epitel- og neuronmedierørene ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C. Efter centrifugeringen overføres supernatanten fra hvert glas til et nyt mikrocentrifugeglas og anbringes straks på tøris.
- Epitelceller
- Fjern forsigtigt PBS fra pakningen og saml i et 15 ml konisk rør. Tilsæt 2 ml trypsin til cellerne og inkuber pakningen i 5 minutter ved 37 °C, 5% CO2. Tilsæt 2 ml RPMI 1640 til pakningen efter inkubation, resuspender cellerne og saml i et andet 15 ml konisk rør.
- Begge glas centrifugeres i 5 minutter ved 300 × g. Supernatanten kasseres. Resuspender pellet fra PBS-vasken i 300 μL PBS og cellepelleten i 1 ml PBS.
- Overfør 50 μL af hvert rør til et 0,5 ml mikrocentrifugerør til det automatiserede celletæller og trypanblå eksklusionsanalysecelletal. Den resuspenderede cellepille (1 ml) overføres til et 1,5 ml rør og centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter.
- Supernatanten fjernes og cellepellet resuspenderes i 250 μl lysisbuffer + 1% beta-mercaptoethanol, og glasset anbringes på tøris.
- Neuronale celler
- Tag den firkantede petriskål med det nederste, gennemsigtige pc-låg med neuronale celler fra det foregående trin (6.5) til et omvendt fasekontrastmikroskop.
BEMÆRK: Mens du flytter pc-låget med PBS oven på det, skal du være meget blid, da neuronnetværket løsner sig meget let. - Udfør en sidste kvalitetskontrol før podning ved at observere neuroncellernes morfologi og celletæthed ved hjælp af brightfield-mikroskopi. Kontroller, at cellerne er migreret fra sfæroiderne, og at der er dannet et neuronalt netværk. Det neuronale netværk skal være ca. 90% sammenflydende. For flere detaljer, se Fattahi et al.6.
- På bænken resuspenderes cellerne i PBS og samles i et 1,5 ml rør. Centrifuger glasset ved 300 × g i 3 min. Supernatanten kasseres, cellepelletsen resuspenderes i 250 μl lysisbuffer + 1 % beta-mercaptoethanol, og den lægges på tøris.
BEMÆRK: Immunofluorescens (IF) farvning kan udføres på neuroncellerne på pc-låget. Hvis IF-farvning er det foretrukne assay for ikke at ødelægge neuronnetværket, skal cellerne fastgøres på PC-låget med 4% paraformaldehyd (PFA), hvilket forhindrer genbrug af PC-låget i fremtidige eksperimenter.
- Tag den firkantede petriskål med det nederste, gennemsigtige pc-låg med neuronale celler fra det foregående trin (6.5) til et omvendt fasekontrastmikroskop.
- Bakterieceller
- Resuspender bakteriecellerne, der er fastgjort til membranen, i 0,9% NaCl-opløsning. Hvis cellerne er fast fastgjort, skal du forsigtigt bruge en celleskraber til at løsne bakteriecellerne fra membranen.
BEMÆRK: Brug af en skraber kan beskadige cellerne, hvilket øger sandsynligheden for at se flere døde celler. - Opsaml cellesuspensionen i et 15 ml konisk rør. Tilsæt pelleten, der er tilbage fra det tidligere opsamlede medie, til det 15 ml koniske rør. Der centrifugeres ved 5.000 × g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 1 ml 0,9% NaCl-opløsning.
- Opdel dette volumen i tre dele: en til frysning af en bakteriepille til nukleinsyreekstraktion (650 μL), en til CFU-plettering (50 μL) på MRS-plader og en til levende/død farvning (300 μL). Til fremstilling af pellet til nukleinsyreekstraktion overføres cellesuspensionen til et mikrocentrifugeglas, centrifugeres ved 5.000 × g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres. Placer cellepillen på tøris.
- Ved prøveudtagningens afslutning overføres alle reagensglas på tøris til en fryser til -80 °C til opbevaring med henblik på senere efterfølgende analyser.
BEMÆRK: Supernatant kan endvidere anvendes til gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) analyse. Desuden kan den kollagenbelagte membran under åbningen opdeles i forskellige dele til forskellige analyser - en halvdel skal bruges til IF-okklusionfarvning, en anden del til RNA-ekstraktion til yderligere genekspressionsanalyse og en anden del til celletælling.
- Resuspender bakteriecellerne, der er fastgjort til membranen, i 0,9% NaCl-opløsning. Hvis cellerne er fast fastgjort, skal du forsigtigt bruge en celleskraber til at løsne bakteriecellerne fra membranen.
Representative Results
I neuroHuMiX dyrkede vi tre forskellige celletyper sammen - bakterielle, epitel- og neuronale celler (figur 1). For at sikre, at cellerne alle var levedygtige, udførte vi forskellige analyser på de forskellige celletyper. For eksempel udførte vi CFU-tællinger på bakterieceller, celletal og cellelevedygtighedsanalyser på epitelcellerne, mens neuroncellerne blev vurderet via mikroskopiske analyser.
Figur 1: Skematisk repræsentation af neuroHuMiX og dens eksperimentelle opsætning . (A) De tre kamre holdes mellem to pc-låg for at holde dem lukkede. Hvert kammer er fyldt med et specifikt medium til cellerne dyrket indeni. De forskellige kamre adskilles af semipermeable membraner, der tillader cellekommunikation via opløselige faktorer, der passerer membranerne. (B) Repræsentation af neuroHuMiX-opsætningen. Hvert kammer er forbundet til forskellige medieflasker. For bakteriekammeret er kammeret i de første 12,5 dage forbundet til RPMI + 10% FBS, inden det ændres i de sidste 36 timer til RPMI + 10% FBS + 5% MRS. Forkortelser: PC = polycarbonat; P / L / F = poly L-ornithin / laminin / fibronectin; RPMI = Roswell Park Memorial Institute cellekulturmedium; MRS = De Man, Rogosa og Shapre kultur medium. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at afgøre, om cellerne var korrekt fastgjort, vurderede vi dannelsen af et cellelag på den kollagenbelagte membran ved åbning af enhederne (figur 6A). For at sikre, at cellerne i enheden var levedygtige, blev der udført en automatiseret celletællertælling (figur 6B) og en trypanblå eksklusionsanalysecelletælling (figur 6C). Assays blev udført på Caco-2-celler fra tre forskellige HuMiX-opsætninger: (i) Caco-2 i kultur med EN'er, (ii) Caco-2 i kultur med L. reuteri og (iii) enheden, der involverer co-kultur af alle tre celletyper. Statistisk test ved hjælp af en envejs ANOVA gav ingen signifikante forskelle mellem celletyperne, hvilket tyder på, at Caco-2-cellerne forblev levedygtige i alle disse indledende enhedsopsætninger og betingelser, der blev testet i denne undersøgelse. Dette understreger det faktum, at den bakterietæthed, der opnås under co-kulturen af L. reuteri og de to humane celletyper, ikke har cytotoksiske virkninger på de humane celler.
Figur 6: Vurdering af Caco-2-celler på den kollagenbelagte membran. (A) Lag af Caco-2-celler på den kollagenbelagte membran efter åbning. Pilen angiver den kollagenbelagte membran, som er omgivet af en stiplet cirkel. Caco-2-cellerne voksede på spiralformen på membranen. Cellelevedygtighed af Caco-2-celler efter 14 dage i HuMiX. Celletal blev opnået ved anvendelse af (B) den automatiserede celletæller og (C) trypanblå eksklusionscelletal. Caco-2-celletal blev bestemt ud fra forskellige kulturopsætninger i den oprindelige enhed: co-kultur med enteriske neuroner (EN'er) (sort), co-kultur med L. reuteri (orange) og i enheden (EN'er og L. reuteri) (blå). Der blev udført en envejs ANOVA, der viser, at der ikke er nogen signifikant forskel mellem de forskellige kulturopsætninger (envejs ANOVA, p = 0,1234 [ns]; fejlbjælker angiver standardfejl). Klik her for at se en større version af denne figur.
For at kunne dyrke L. reuteri med pattedyrceller optimerede og tilpassede vi først dyrkningsmediet til brug i enheden. Vi fandt, at en 5% blanding af MRS i RPMI 1640 (suppleret med 10% FBS) var optimalt egnet til vækst af L. reuteri , mens den ikke var cytotoksisk for de pattedyrceller, der anvendes i disse assays. Derefter blev der udført en CFU-tælling for at vurdere væksten af L. reuteri , når den dyrkes i enheden i 24 timer. CFU-tallet blev vurderet for to forskellige indledende enhedsopsætninger (figur 7)-L. reuteri dyrket sammen med Caco-2 og L. reuteri i enheden . I begge opsætninger var CFU-tællingerne signifikant forskellige fra HuMiX-inokulumet og de høstede celler (envejs ANOVA, p = 0,0002), hvilket indikerer vækst af bakteriecellerne inde i den oprindelige enhed.
Figur 7: Limosilactobacillus reuteri CFU-tal for podningen (fortyndet 1:100.000) og efter 24 timer i HuMiX. To forskellige opsætninger: Caco-2-celler i co-kultur med L. reuteri og enheden. En envejs ANOVA viser en signifikant forskel (p = 0,0002 [***]) mellem podningen og de høstede celler, hvilket betyder, at bakterierne vokser inde i HuMiX. Fejlbjælker angiver standardfejlen. Forkortelser: CB. HX = Caco-2 bakterier HuMiX; nHX = neuroHuMiX. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at vurdere, om dyrkning af EN'erne i enheden ville ændre cellernes fænotype, blev EN'ernes bruttomorfologi observeret ved hjælp af et omvendt fasekontrastmikroskop. I løbet af dette trin blev både sammenløbet og EN-morfologien vurderet. Etablering af et sammenflydende neuronalt netværk indikerede, at cellerne havde fastgjort godt på den coatede enheds PC-låg. Det er vigtigt, at dette fremhæver forestillingen om, at de voksede i co-kultur med Caco-2 og L. reuteri. Kanten mellem det sammenflydende neuronale netværk og den pakningsafgrænsede spiral var tydeligt tydelig (figur 8).
Figur 8: Enteriske neuroner efter 14 dages kultur i enheden. På venstre side af billedet er neuronerne vokset til et sammenflydende lag på spiralen. Kanten, mellem neuronlaget og rummet uden celler, er kanten af spiralen; forstørret 10x, skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Låg, der bruges i enheden. Billeder viser øverste (venstre) og nederste (højre) pc-låg. Hver side af pc-låget er 6,4 cm. Forkortelse: PC = polycarbonat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Epitelkammerpakning på nederste pc-låg. Set ovenfra af epitelkammerpakningen placeret på det nederste pc-låg (venstre) og set nederst (højre), der viser justeringen af epitelkammerpakningen med indløb og udløb på det nederste pc-låg. Hver side af pakningerne samt pc-låget måler 6,4 cm. Forkortelse: PC = polycarbonat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Montering af enheden. (A) Forskellige dele til samling af HuMiX: (1) nederste pc-låg; (2) pakning med kollagenbelagt mikroporøs membran, som placeres oven på (1); 3) sandwichpakning med en mucinbelagt nanoporøs membran imellem og anbragt oven på (2) (4) øverste pc-låg placeret oven på (3). Hver side af pakningerne og PC-lågene måler 6,4 cm. (B) Alle dele fra (A) placeres sammen. (C,D) Samlet enhedstop (venstre) og side (højre) visning. B placeres i spændesystemet for at lukke systemet. (C) Hver side af topklemmen måler 8 cm. Forkortelse: PC = polycarbonat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Nødvendige dele til rørledning og samlet rørledning til et kammer. (A) Forskellige dele til opbygning af en rørledning: a. pumperørledning; b. trevejs stophane; c. 40 mm nål; d. 80 mm nål; e. 120 mm nål; f. lang slangeline (20 cm); g. kort slangelinje (8 cm); h. mandlige Luer; i. kvindelig Luer; J. Adapter. B) Samlet rørledning til bakterie- eller epitelkammeret. For neuronkammeret skal 120 mm nålen ændres til en 80 mm nål. (C) Trevejs stophaneventil drejet for at omdirigere mediestrømmen fra anordningen til det »åbne stik« og for at lukke kammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Dag | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| Mediekomposition | 100% E6 | 100% E6 | 75% E6 | 50% E6 | 25% E6 | 100% N2 |
| + LDN | + LDN | 25% N2 | 50% N2 | 75% N2 | + LDN | |
| + SB | + SB | + LDN | + LDN | + LDN | + SB | |
| + CHIR | + SB | + SB | + SB | + CHIR | ||
| + CHIR | + CHIR | + CHIR | + RA | |||
| + RA | + RA | |||||
| Molekyle | [koncentration] | |||||
| LDN | 100 nM | |||||
| SB | 10 μM | |||||
| CHIR | 3 μM | |||||
| Retinsyre (RA) | 1 μM |
Tabel 1: Mediernes sammensætning.
| Medie | Komponenter (koncentrationer opført i materialetabellen) | Volumen (ml) |
| N2-medier (50 ml) | DMEM-F12 | 48 |
| N2 Tillæg | 0.5 | |
| L-glutamin | 0.5 | |
| Penicillin/streptomycin | 0.5 | |
| NEAA | 0.5 | |
| N2B27/ENS Medier (50 ml) | Neurobasal | 48 |
| N2 Tillæg | 0.5 | |
| L-glutamin | 0.5 | |
| Penicillin/streptomycin | 0.5 | |
| B27-A | 0.5 |
Tabel 2: Medieopskrifter.
| Steriliseringstemperatur (°C) | 116 |
| Steriliseringstid (min.) | 20 |
| Tørretid (min.) | 10 |
| Pulser | 3 |
| Sluttemperatur (°C) | 99 |
Tabel 3: HuMiX autoklave kørsel.
| Rotationer pr. minut (o / min) | Gennemsnitlig strømningshastighed (μL/min) |
| 0.5 | 13 |
| 2 | 79 |
| 5 | 180 |
Tabel 4: Flowhastigheder for den peristaltiske pumpe.
Discussion
Det er nu fastslået, at det menneskelige tarmmikrobiom påvirker værtens sundhed og sygdom. På trods af den viden, der tyder på vigtigheden af vores mikrobiom, især i neurologiske lidelser som Alzheimers eller Parkinsons sygdom 3,13, forbliver det stort set ukendt, hvordan tarmmikrobiomet interagerer med det enteriske nervesystem og efterfølgende med hjernen.
En repræsentativ model til at studere interaktionerne mellem tarmmikrobiomet og nervesystemet har hidtil ikke været tilgængelig. Undersøgelser vedrørende tarm-hjerneaksen er traditionelt blevet udført ved hjælp af murinmodeller13. Mus og mennesker deler 85% af deres genomsekvenser14, men der er betydelige forskelle at overveje, når man sammenligner mus med mennesker. Med hensyn til tarmen er det vigtigt at bemærke, at mus sammenlignet med mennesker udelukkende er planteædere. Som følge heraf varierer deres mave-tarmkanal i længde og karakteristika, såsom "gastrisk tømning"14. Murinhjerner viser også vigtige forskelle, hvorved den overordnede struktur mellem mus og mennesker er forskellig15. Det er vigtigt, at mennesker har længere cellecyklustider for neurale forfædre15. Derfor er det vigtigt at udvikle repræsentative modeller, der omfatter humanafledte celler, herunder tarm- og neuronceller5. I denne sammenhæng reducerer udviklingen af mere reproducerbar forskning via in vitro-modeller behovet for at anvende dyremodeller og forbedrer reproducerbarheden.
neuroHuMiX er en avanceret version af den tidligere HuMiX model9. HuMiX er en gut-on-a-chip-model, der tillader proksimale og repræsentative co-kulturer af epitel- og bakterieceller. Celle-celle kommunikation er mulig gennem proksimal co-kultur og diffusion af udskillede faktorer og metabolitter via semipermeable membraner. For at udvide nytten af den oprindelige enhed til at studere det menneskelige tarmmiljø kræves imidlertid introduktionen af en yderligere celletype. For at løse dette muliggør neuroHuMiX, udviklet med introduktionen af iPSC-afledte EN'er, en proksimal co-kultur af bakterier, intestinale epitelceller og EN'er. Den resulterende in vitro-model giver os mulighed for at behandle spørgsmål vedrørende det menneskelige tarmmikrobiom i forhold til det menneskelige nervesystem. Samdyrkning af forskellige celletyper, især co-kulturer af pattedyrceller og bakterier, har flere udfordringer, herunder tab af levedygtighed, dårlig vedhæftning og generelt tab i sammenløb16. Her har vi demonstreret, at vi inden for denne enhed er i stand til at co-dyrke tre forskellige celletyper inden for det samme system, samtidig med at cellelevedygtigheden holdes høj.
Et kritisk trin i protokollen er at sikre sammenløbet af neuroncellerne - 80% -90% cellesammenløb og levedygtighed - før podning i enheden. Da det ikke er muligt at vurdere cellevæksten under kørslen, er det yderst vigtigt at sikre, at cellerne flyder sammen og vokser godt, før de introduceres i modellen. Selvom dette kan være en begrænsende faktor, er den samlede levedygtighed og sammenløb, der observeres inden for enheden, generelt høj.
Enheden er forbundet via slangeledninger til en peristaltisk pumpe. Hvert cellekammer har sin specifikke slangelinje. Slangen består af en pumpeslange, der tillader brug af en peristaltisk pumpe til perfusion af medium, samt slanger, der forbinder pumpeslangen til enheden og slangen, der forbinder enheden med udstrømnings- / affaldsflaskerne. Prøveudtagningsporte er inkluderet før og efter anordningen for at muliggøre podning og prøveudtagning af udstrømningsmedium. Hvert kammer kan forbindes til et andet medium, hvilket giver de bedste dyrkningsbetingelser for hver enkelt celletype. Hvert kammer kan åbnes eller lukkes afhængigt af de specifikke behov for medium forsyning. I enheden forbliver neuronkammeret lukket i det meste af eksperimentet, mens bakterie- og epitelkamrene er åbne hele tiden, hvilket betyder, at de får frisk medium gennem hele eksperimentet. For at sikre, at mediet flyder uden afbrydelse, er det afgørende ikke at have luft tilbage i slangerne, stikkene eller i enheden. Derfor er det vigtigt først at lade enhederne køre i et par minutter ved priming-trinnet. Dette løser ofte problemet. Hvis ikke, kan en af de andre linjer, der falder, lukkes i kort tid ved at lukke udstrømningens trevejs stophane. Dette omdirigerer mediet til linjen med luftboblen og løser dermed problemet ved at skubbe boblen udad gennem slangen.
For ethvert cellekultureksperiment er mediet en nøglekomponent, hvor hver celletype har sit respektive medium. I en co-kultur opsætning skal mediet være kompatibelt ikke kun for den celletype, der vokser i det, men også for de andre celletyper inden for co-kulturen. Dette er ikke anderledes for enheden, hvilket udgør en ekstra udfordring, da vi har tre forskellige rum med tre forskellige celletyper indeni - bakterielle, epitel- og neuronale celler. Vi har imidlertid vist, at ved at modificere bakteriemediet - med tilsætning af 5% MRS til RPMI 1640 med 10% FBS - kan alle celletyper, især bakterie- og epitelceller, med succes samdyrkes i systemet. I enheden dyrkes forskellige celletyper imidlertid i nærheden og er derfor ikke i direkte kontakt med hinanden. Selvom dette ikke er fuldt repræsentativt for den direkte kontakt mellem celler i den menneskelige tarm og derfor en begrænsning, er den proksimale og repræsentative samkulturtilstand en styrke for downstream-analyser. Opløselige faktorer udveksles mellem de forskellige kamre og celletyper; Derfor interagerer cellerne stadig med hinanden. Derudover giver det faktum, at celletyperne kan høstes og analyseres separat, os mulighed for at studere effekten af et sundt og/eller sygt mikrobiom på forskellige celletyper (herunder neuronale celler) og derved bestemme/hente celletypespecifikke aflæsninger. En anden begrænsning er, at cellernes morfologi ikke kan følges op under forsøgskørslen, da enheden kun kan åbnes og cellerne kontrolleres ved afslutningen af hvert eksperiment.
Så vidt vi ved, er neuroHuMiX den første gut-on-a-chip-model, herunder EN'er. Dette er et skridt i retning af at belyse kommunikationen mellem tarmmikrobiota og det enteriske nervesystem. Det er en model, der gør det muligt at undersøge samspillet mellem en bakterieart, et epitellag og EN'er. Dens design giver os mulighed for at studere udvekslingen af opløselige faktorer udskilt af de forskellige celletyper og deres virkning på hinanden. Fremadrettet vil det være vigtigt ikke kun at have iPSC-afledte EN'er, men også iPSC-afledte epitelceller inde i enheden for at overføre enheden til en personlig model. Det er vigtigt, at denne personaliserede model kan bruges til at teste præ-, pro- og synbiotika 10,11 og potentielt udvikle personlig screening og terapeutiske tilgange17. Personlig neuroHuMiX kunne i sidste ende kaste lys over det 'mørke stof' i det menneskelige tarmmikrobiom og dets interaktioner med nervesystemet langs tarmmikrobiomet-nervesystemets akse og bane vejen for terapeutisk vurdering og interventioner.
Vi kan konkludere, at det at være i stand til at have en gut-on-a-chip, herunder det enteriske neuronale system, er afgørende for at komme videre i undersøgelsen og forståelsen af interaktioner langs tarmmikrobiomet-nervesystemets akse. NeuroHuMiX giver os mulighed for at studere virkningerne af bakteriearter på værtsceller og giver os et godt grundlag for at forbedre modellen endnu mere på en endnu mere fysiologisk repræsentativ måde.
Disclosures
P.W. erklærer at være opført som opfinder på patenterne PCT/EP2013/056607, PCT/EP2016/062024, PCT/US2017/061602 og PCT/EP2019/081424. P.W., C.S. og L.G. erklærer at være opført som opfindere på patent LU503075.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Jared Sterneckert for at give os cellerne fra K7-linjen. Vi vil også gerne takke de mangeårige samarbejdspartnere Dr. Frederic Zenhausern og Matthew W. Barret fra University of Arizona for deres hjælp med de tekniske aspekter. Vi vil også gerne takke Dr. Valentina Galata for hendes hjælp med at designe den skematiske repræsentation af neuroHuMiX. Dette projekt har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale 863664). Figur 1 blev delvist oprettet med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 10712 | |
| Aeration cannula (length: 1.10 diameter: 30 mm) | VWR (B.Braun) | BRAU4190050 | |
| Agar-agar | Merck Millipore | 1.01614.1000 | |
| Aluminium Crimp | Glasgerätebau Ochs | 102050 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bacterial Cell Membrane, pore size: 1 µm | VWR (Whatman) | 515-2084 | |
| Caco-2 cells | DSMZ | ACC169 | |
| Cell Counter & Analyzer CASY | OMNI Life Sceince | ||
| CHIR | Axon Mechem BV | CT99021 | |
| Collagen I, Rat Tail | Invitrogen | A1048301 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3471 | |
| Difco Lactobacilli MRS Broth | BD Biosciences | 288130 | |
| Discofix 3-way stopcock | B. Braun | BRAU40951111 | |
| DMEM/F12, no glutamine | Thermofisher Scientific | 21331020 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, D-PBS | Sigma Aldrich | 14190-169 | |
| Essential 6 Medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| Essential 8 Medium | Thermofisher Scientific | A1517001 | |
| Female Luer Lock to Barb Connector | Qosina | 11733 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Foetal Bovine Serum, FBS | Thermofisher Scientific | 10500-064 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Human Cell Membrane, pore size: 50 nm | Sigma Aldrich (GE Healthcare) | WHA111703 | |
| HuMiX Gasket Collagen | Auer Precision | 216891-003 | |
| HuMiX Gasket Sandwich Bottom | Auer Precision | 216891-002 | |
| HuMiX Gasket Sandwich Top | Auer Precision | 216891-001 | |
| iPSC | Max Planck Institute for Molecular Biomedicine | K7 line | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Laminin from Engelbreth-Holmswarm | Sigma Aldrich | L2020 | |
| LDN193189 | Sigma Aldrich | SML0559 | |
| Limosilactobacillus reuteri | ATCC | 23272 | |
| Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit | Thermofisher Scientific | L7012 | |
| Male Luer with Spin Lock to Barb | Qosina | 11735 | |
| Marprene tubing (0.8 mm x 1.6 mm) | Watson-Marlow | 902.0008.J16 | |
| Matrigel hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | |
| Mucin, from porcine stomach | Sigma Aldrich | T3924 | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEAA | Thermofisher Scientific | 11140050 | |
| Needle (length: 120 mm; diameter: 0.80 mm) | B.Braun (color code: green) | 466 5643 | |
| Needle (length: 40 mm; diameter: 0.70 mm) | Henke Sass Wolf (color code: black) | 4710007040 | |
| Needle (length: 80 mm; diameter: 0.60 mm) | B.Braun (color code: blue) | 466 5635 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| PE/Cy7 anti-human CD49d antibody | Biolegend | 304314 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Peristaltic pump | Watson-Marlow | 205CA | |
| Poly-L-ornithine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Polycarbonate lids (HuMiX) | University of Arizona | HuMiX 1.0 / 2.0 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | |
| RLT Buffer (RNeasy Minikit) | Qiagen | 74104 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermofisher Scientific | 72400-021 | |
| SB431542, ALK inhibitor | Abcam | ab120163 | |
| Serum bottles | Glasgerätebau Ochs | 102091 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309110 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |
References
- Heintz-Buschart, A., Wilmes, P. Human gut microbiome: function matters. Trends in Microbiology. 26 (7), 563-574 (2018).
- Toor, D., et al. Dysbiosis disrupts gut immune homeostasis and promotes gastric diseases. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2432 (2019).
- Braak, H., de Vos, R. A. I., Bohl, J., Del Tredici, K. Gastric α-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neuroscience Letters. 396 (1), 67-72 (2006).
- Schmit, K. J., et al. Dietary fibre deprivation and bacterial curli exposure shift gut microbiome and exacerbate Parkinson's disease-like pathologies in an alpha-synuclein-overexpressing mouse. bioRxiv. , (2022).
- Fritz, J. V., Desai, M. S., Shah, P., Schneider, J. G., Wilmes, P. From meta-omics to causality: experimental models for human microbiome research. Microbiome. 1 (1), 14 (2013).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Wu, Q., et al. Organ-on-a-chip: Recent breakthroughs and future prospects. BioMedical Engineering Online. 19 (1), 9 (2020).
- May, S., Evans, S., Parry, L. Organoids, organs-on-chips and other systems, and microbiota. Emerging Topics in Life Sciences. 1 (4), 385-400 (2017).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535 (2016).
- Greenhalgh, K., et al. Integrated in vitro and in silico modeling delineates the molecular effects of a synbiotic regimen on colorectal-cancer-derived cells. Cell Reports. 27 (5), 1621-1632 (2019).
- Mao, J. H., et al. Genetic and metabolic links between the murine microbiome and memory. Microbiome. 8 (1), 53 (2020).
- Moysidou, C. M., Owens, R. M. Advances in modelling the human microbiome-gut-brain axis in vitro. Biochemical Society Transactions. 49 (1), 187-201 (2021).
- Kim, S., et al. Transneuronal propagation of pathologic α-synuclein from the gut to the brain models Parkinson's disease. Neuron. 103 (4), 627-641 (2019).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Marshall, J. J., Mason, J. O. Mouse vs man: Organoid models of brain development & disease. Brain Research. 1724, 146427 (2019).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Sedrani, C., Wilmes, P. Toward hypothesis-driven, personalized microbiome screening. Cell Reports Methods. 2 (1), 100139 (2022).
