Summary
neuroHuMiX is een geavanceerd darm-op-een-chip-model om de interacties van bacteriële, epitheel- en neuronale cellen te bestuderen onder proximale en representatieve co-cultuuromstandigheden. Dit model maakt het mogelijk om de moleculaire mechanismen te ontrafelen die ten grondslag liggen aan de communicatie tussen het darmmicrobioom en het zenuwstelsel.
Abstract
Het menselijk lichaam wordt gekoloniseerd door minstens hetzelfde aantal microbiële cellen als het is samengesteld uit menselijke cellen, en de meeste van deze micro-organismen bevinden zich in de darm. Hoewel de wisselwerking tussen het darmmicrobioom en de gastheer uitgebreid is bestudeerd, blijft de interactie tussen het darmmicrobioom en het enterische zenuwstelsel grotendeels onbekend. Tot op heden bestaat er geen fysiologisch representatief in vitro model om de interacties tussen het darmmicrobioom en het zenuwstelsel te bestuderen.
Om deze leemte op te vullen, hebben we het humaan-microbiële overspraak (HuMiX) darm-op-chip-model verder ontwikkeld door geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide enterische neuronen in het apparaat te introduceren. Het resulterende model, 'neuroHuMiX', maakt het mogelijk om bacteriële, epitheel- en neuronale cellen samen te kweken via microfluïdische kanalen, gescheiden door semi-permeabele membranen. Ondanks de scheiding van de verschillende celtypen, kunnen de cellen met elkaar communiceren door middel van oplosbare factoren, waardoor tegelijkertijd de mogelijkheid wordt geboden om elk celtype afzonderlijk te bestuderen. Deze opstelling geeft de eerste inzichten in hoe het darmmicrobioom de enterische neuronale cellen beïnvloedt. Dit is een cruciale eerste stap in het bestuderen en begrijpen van de as van het menselijke darmmicrobioom-zenuwstelsel.
Introduction
Het menselijke darmmicrobioom speelt een cruciale rol in de gezondheid en ziekte van de mens. Het is de afgelopen vijftien jaar uitgebreid bestudeerd en de potentiële rol ervan bij het moduleren van gezondheid en ziekte is nu vastgesteld1. Er is verondersteld dat een verstoring van het microbioom die leidt tot een onevenwichtige microbiële gemeenschap (dysbiose) betrokken is bij de pathogenese van veel chronische aandoeningen, zoals obesitas, inflammatoire darmaandoeningen en colorectale kanker, of zelfs neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson 2,3.
Hoewel het menselijke darmmicrobioom in verband is gebracht met neurologische aandoeningen, is het nog steeds onduidelijk hoe het darmmicrobioom communiceert met en invloed heeft op het enterische zenuwstelsel. Omdat het menselijk enterisch zenuwstelsel niet gemakkelijk toegankelijk is voor onmiddellijke studie, zijn tot nu toe diermodellen gebruikt in experimenten4. Gezien de schijnbare verschillen tussen diermodellen en mensen5, is de ontwikkeling van in vitro modellen die de menselijke darm nabootsen echter van onmiddellijk belang. In deze context heeft het ontluikende en voortschrijdende veld van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) ons in staat gesteld representatieve enterische neuronen (EN's) te verkrijgen6. iPSC-afgeleide EN's maken het mogelijk om het enterische zenuwstelsel te bestuderen in in vitro kweekmodellen, zoals celkweekinserts, organoïden of organen-op-een-chip 7,8.
Het humaan-microbiële overspraakmodel (HuMiX) is een darm-op-een-chip-model dat de menselijke darm nabootst9. Het oorspronkelijke HuMiX-model (hierna het initiële apparaat genoemd) bood plaats aan epitheelcellen (Caco-2) en bacteriële cellen10,11. Om de link tussen het darmmicrobioom en het zenuwstelsel te bestuderen, zijn echter ook van iPSC afgeleide EN's6 in het systeem geïntroduceerd (Figuur 1). De proximale co-cultuur van neuronale, epitheliale en bacteriële cellen maakt het mogelijk om de verschillende celtypen afzonderlijk te analyseren en de interacties tussen de verschillende celtypen te bestuderen in een omgeving die die van de menselijke darm nabootst.
In de afgelopen jaren is er vooruitgang geboekt in de ontwikkeling van modellen om organen op meer fysiologisch representatieve manieren te bestuderen door gebruik te maken van organen-op-een-chip (bijv. darm-op-een-chip) modellen. Deze modellen zijn meer representatief voor het menselijke darmmilieu vanwege de constante toevoer van voedingsstoffen en afvalverwijdering, evenals real-time monitoring van bijvoorbeeld zuurstofniveaus of barrière-integriteit 8,12. Deze modellen maken het specifiek mogelijk om de effecten van darmbacteriën op gastheercellen te bestuderen. Om organen-op-een-chip te kunnen gebruiken om de onderlinge relaties tussen het darmmicrobioom en het zenuwstelsel te bestuderen, moeten neuronale cellen echter in dergelijke systemen worden geïntegreerd. Daarom was het doel van de verdere ontwikkeling van HuMiX en het opzetten van het neuroHuMiX-systeem (hierna het apparaat genoemd) het ontwikkelen van een darm-op-een-chip-model, dat enterische neuronale cellen omvat in proximale co-cultuur met darmepitheelcellen en bacteriën.
Protocol
1. Celkweek en sortering
- Geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide enterische neuronen
LET OP: Kweek iPSC's 6 weken voor aanvang van een run. Het differentiatieprotocol voor de EN's is overgenomen van Fattahi et al.6.- Kweek de iPSC's op een matrix-gel-gecoate plaat met 6 putjes in 2 ml/putje iPSC-kweekmedium aangevuld met 1% penicilline-streptomycine (P/S).
- Bij 80%-90% confluentie passeren de cellen, zaad in een matrixgel-gecoate plaat met hetzelfde medium, incuberen bij 37 °C, 5% CO2 en 90% relatieve vochtigheid (RV).
- Voor iPSC-afleiding zaait u, na twee passages na ontdooiing, bij 80%-90% confluentie, de cellen in een met matrixgel beklede plaat met 6 putjes met een dichtheid van 100.000 cellen/put. Incubeer in de hierboven beschreven media + ROCK-remmer Y-27632 (1:2.000) gedurende 24 uur bij 37 °C.
- Vervang na 24 uur het supernatans medium door dag 0 medium, volgens tabel 1. Voeg één controleputje toe dat kan worden gebruikt als negatieve controle tijdens het sorteren van cellen voor het afleidingsproces. Houd de controle goed in de mediacompositie van dag 0 gedurende de hele afleidingsperiode. Verander het medium om de dag van dag 2 tot 10, volgens tabel 1.
- Sorteer op dag 11 de cellen op CD49d-positieve cellen, die in de volgende stappen van dit protocol zullen worden gebruikt.
- Pool de cellen die moeten worden gesorteerd op basis van CD49d-positieve cellen, evenals de controleput. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 300 × g. Resuspendeer de celpellet in 2% runderserumalbumine (BSA) + 1% P/S in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Verdeel elke celpartij (gepoold en controles) in tweeën: kleur de ene fractie met anti-humaan CD49d-antilichaam en de andere fractie met een isotype-controle-antilichaam.
- Poort de hoofdcelpopulatie en vervolgens enkele cellen, op basis waarvan de cellen die CD49d op hun oppervlak presenteren, worden geselecteerd. Verzamel deze cellen voor de volgende stap van differentiatie.
OPMERKING: Gewoonlijk is 30%-40% van de gesorteerde cellen CD49d-positief.
- Breng twee tot vier miljoen van de gesorteerde cellen over naar één plaat met 6 putjes van een ultralage bevestigingsplaat in N2B27-media (zie tabel 2) + FGF2 + CHIR gedurende 4 dagen om sferoïdevorming mogelijk te maken.
- Op dag 15 worden de sferoïden opnieuw geplateerd op een met poly L-ornithine/laminine/fibronectine (P/L/F) gecoate plaat met 6 putjes in 2 ml/putje N2B27-media met GDNF en ascorbinezuur (AA). Vervang het medium elke 2-3 dagen.
OPMERKING: Coatingverhouding: poly L-ornithine, 15 μg/ml; laminine, 2 μg/ml; fibronectine, 2 μg/ml in 1x PBS. - Gebruik na 3 weken de cellen voor inoculatie in het apparaat.
- Caco-2
OPMERKING: Ontdooi Caco-2-cellen ten minste 1 week voorafgaand aan een run.- Zaai een T75-kolf met 1 × 106 Caco-2-cellen in RPMI 1640 glutaminesupplement + HEPES + 10% foetaal runderserum (FBS); incuberen bij 37 °C, 5% CO2 en 90% RV.
OPMERKING: Gebruik voor deze experimenten idealiter Caco-2 bij de eerste of tweede passage na ontdooiing.
- Zaai een T75-kolf met 1 × 106 Caco-2-cellen in RPMI 1640 glutaminesupplement + HEPES + 10% foetaal runderserum (FBS); incuberen bij 37 °C, 5% CO2 en 90% RV.
2. Voorbereiding HuMiX-run
- Voorbereiding en coating van het deksel van polycarbonaat
- Autoclaaf een paar deksels van polycarbonaat (PC) (Figuur 2) samen met vier schroeven met behulp van de initiële instrumentcyclus van het apparaat (zie tabel 3 voor details).
- Steek in een bioveiligheidskast vier schroeven in elke hoek van het onderste pc-deksel (zie afbeelding 3) en breng ze over naar een steriele vierkante petrischaal voor een coatingproces in twee stappen.
- Voeg de eerste dag 2 ml 1,5% poly-L-ornithine in PBS (1x) toe aan het midden van het pc-deksel. 's Nachts incuberen bij 37 °C, 5% CO2 en 90% RV.
- Verwijder de volgende dag de oplossing en vervang deze door een oplossing met 0,2% laminine en 0,2% fibronectine in PBS (1x) om het oppervlak van de neuronale celkamer te bedekken. Incubeer het deksel een nacht bij 37 °C, 5% CO2 en 90% RV.
- Bewaar na het incuberen de coatingoplossing op het pc-deksel en sluit de petrischaal af met een afdichtingsfolie. Plaats ze op 4 °C om ze tot gebruik te bewaren.
- Verwijder voor gebruik de coatingoplossing en laat deze 30 minuten aan de lucht drogen in een bioveiligheidskast totdat de coating volledig droog is.
- Pakking voorbereiding en coating
NOTITIE: In dit gedeelte wordt beschreven hoe pakkingen kunnen worden voorbereid door semipermeabele membranen op siliconenpakkingen te plakken. Na een eerste autoclaafstap worden de pakkingen gecoat met collageen of mucine om de hechting van darmepitheelcellen of bacteriën mogelijk te maken. Het met mucine beklede membraan bootst de slijmbarrière na die aanwezig is in de menselijke darm.- Bevestig een polycarbonaatmembraan met een poriegrootte van 1 μm aan de collageenpakking en een polycarbonaatmembraan van 50 nm met een poriegrootte tussen de onderste en bovenste sandwichpakkingen. Autoclaaf de pakkingen met de bevestigde membranen met behulp van de initiële instrumentcyclus van het apparaat (zie tabel 3).
- Om de membranen te coaten, plaatst u elke pakking in een steriele vierkante schaal.
OPMERKING: De coating wordt onder steriele omstandigheden aangebracht in een bioveiligheidskast.- Voeg voor de collageenpakking 3 ml collageen (50 μg/ml) toe aan het membraan en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C.
NOTITIE: Zorg ervoor dat u het membraan niet aanraakt met de pipetpunt wanneer u het collageen toevoegt om beschadiging van het membraan te voorkomen. - Plaats voor de mucinecoating de sandwichpakking met de bovenste pakkingzijde naar boven in een petrischaal om de bovenkant van het membraan te bedekken met 3 ml mucine (0.025 mg/ml). Incubeer de pakkingen bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Voeg voor de collageenpakking 3 ml collageen (50 μg/ml) toe aan het membraan en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C.
- Zuig na de incubatietijd de collageen- en mucineoplossingen op uit hun respectievelijke pakkingen en laat het membraan gedurende 30 minuten aan de lucht drogen in een bioveiligheidskast. Sluit de schalen, sluit af met laboratoriumafdichtingsfolie en bewaar de pakkingen bij 4 °C tot gebruik.
- Assemblage van slangen
NOTITIE: In dit gedeelte wordt beschreven hoe u de slang monteert voor de perfusie van het apparaat. Voorafgaand aan de montage autoclaveren alle onderdelen en/of kopen ze afzonderlijk verpakt in een steriele verpakking. Plaats alle componenten in een bioveiligheidskast.- Gebruik drie slangleidingen voor elk apparaat en voor elke slangleiding, één stuk pompslang, twee stukken lange Marprene-slang (20 cm), twee stukken korte Marprene-slang (8 cm), één naald van 40 mm voor de uitstroomfles, één naald van 120 mm voor de instroomflessen van 250 ml of een naald van 80 mm voor kleinere instroomflessen, drie mannelijke en zeven vrouwelijke Luer-naar-weerhaakconnectoren, drie Luer-adapters en twee driewegafsluitkleppen.
- Monteer de slangenleidingen van links naar rechts met behulp van de hierboven genoemde geautoclaveerde en gesteriliseerde componenten (Figuur 4).
NOTITIE: Spuit elk onderdeel tussen elke aansluitstap in met 70% ethanol.
- Voorbereiding van de media
NOTITIE: In dit gedeelte wordt beschreven hoe het medium moet worden voorbereid voor de verschillende celtypen in het apparaat en hoe het medium op een steriele manier naar serumflessen kan worden overgebracht.- Vul RPMI 1640 aan met 10% 0,22 μm gefilterde, door warmte geïnactiveerde FBS. Vul de N2B27-media vers aan met GDNF en AA.
- Breng het medium onder steriele omstandigheden over in serumflessen. Breng 200 ml RPMI 1640-media over in flessen van 250 ml en 30 ml N2B27-media in flessen van 50 ml.
- Bereid in een later stadium bacterieel medium (RPMI 1640 + 10% FBS + 5% De Man, Rogosa en Shapre kweekmedium [MRS]) voor, aangezien dit alleen nodig is tijdens de laatste 24 uur van het experiment.
- Sluit de flessen af met een septum, krimp ze met aluminium en autoclaaf.
- Om de media over te brengen, verwijdert u de aluminium krimp met behulp van een geschikte decapper (diameter = 20 mm). Verwijder ook het septum. Giet het voorbereide medium voorzichtig in de serumflesjes zonder het flesje aan te raken.
- Om te steriliseren, vlamt u de opening van de fles met behulp van een draagbare bunsenbrander. Sluit de flessen af door het septum te besproeien met 70% ethanol, het aan de fles toe te voegen en het af te sluiten met een aluminium krimptang met behulp van een afdichtingskrimptang.
- Plaats de gesloten flessen gedurende 24 uur in de incubator bij 37 °C, 5% CO2 om het medium op te warmen tot 37 °C en om ervoor te zorgen dat er geen zichtbare tekenen van verontreiniging zijn voordat u mediaflessen voor het apparaat gebruikt.
3. HuMiX-start
- NeuroHuMiX-assemblage
NOTITIE: In dit gedeelte wordt uitgelegd hoe u het apparaat monteert. Kortom, het klemsysteem wordt gesteriliseerd en opnieuw vastgedraaid, waarna het onderste pc-deksel op de basis van de klem wordt geplaatst. Vervolgens worden de gecoate pakkingen en de bovenste pc-deksels op elkaar gestapeld, gevolgd door het bovenste deel van de klem. Ten slotte wordt de klem aangedraaid om de pakkingen samen te drukken en het systeem lek- en gasdicht te maken. Figuur 4 toont de verschillende onderdelen die nodig zijn voor de montage.- Autoclaaf de klemmen en de twee pc-deksels (boven en onder) voorafgaand aan de montage.
- Draai de schroeven vast die zijn gebruikt om de boven- en onderkant van de clamp (Figuur 4C,D). Open de schroeven voorafgaand aan het autoclaverproces en draai ze later weer vast.
- Breng het gecoate en gedroogde (stap 2.2.3) onderste PC-deksel (Figuur 4 A1) over van de vierkante petrischaal naar de bovenkant van de klembasis door de vier schroeven in de hoeken van het PC-deksel vast te houden.
NOTITIE: Raak het pc-deksel niet aan om het risico op besmetting te verminderen. - Plaats de pakking van de epitheelkamer met het gezicht naar boven gericht (d.w.z. met het membraan erop) op het pc-deksel met behulp van een steriel pincet. Gebruik de schroeven om de pakking en het pc-deksel uit te lijnen om ervoor te zorgen dat de inlaat- en uitlaatpoorten in de hoeken van het deksel zijn uitgelijnd met de openingen in de pakking (Figuur 3).
- Plaats met behulp van het steriele pincet de sandwichpakking bovenop de collageenpakking, met de bovenkant naar boven gericht.
- Plaats het bovenste pc-deksel op de sandwichpakking. Om het risico op besmetting te verminderen, doet u dit door alleen de randen van het deksel aan te raken (raak het bovenste of onderste deel van het deksel niet aan). Zorg ervoor dat de weerhaken op het klemdeksel zijn uitgelijnd met de inlaat- en uitlaatopening op de membraanconstructie en dat de schroeven van het onderste pc-deksel in de opening van het bovenste pc-deksel passen.
- Om het apparaat te sluiten, plaatst u het clampdeksel (het bovenste deel van de clamp) bovenop het pc-deksel. Zorg ervoor dat de openingen van het deksel samenvallen met de inlaat- en uitlaatweerhaken van het bovenste pc-deksel. Sluit de vergrendelingen. Houd het gesloten apparaat (Figuur 5) onder de motorkap om aan te sluiten op de geprimed slangleidingen (stap 3.2.6).
- Primeren van slangleidingen
NOTITIE: In dit gedeelte wordt beschreven hoe u de slang aansluit op de in- en uitstroomflessen en op de pomp, vervolgens de slang vult met medium om eventuele restproducten te verwijderen die tijdens het reinigen en steriliseren zijn gebruikt, en ervoor zorgt dat er geen luchtbellen in de slang aanwezig zijn.- Het aanzuigen van de slangenleidingen wordt uitgevoerd in de bioveiligheidskast. Steek beluchtingsnaalden met filters in het septum van elke instroom- en uitstroomfles. Steek met een schoon, steriel pincet de naalden van 120 mm in de serumflesjes van 250 ml. Steek de naalden van 80 mm in de serumflesjes van 50 ml.
- Steek de naalden van 40 mm, aan het einde van elke slanglijn, in een uitstroomserumfles. Per apparaat zijn er twee uitstroomflessen voor de drie slanglijnen. De naalden van 40 mm van de epitheel- en neuronale slanglijnen zijn verbonden met dezelfde uitstroomfles voor het weggooien van medium. De bacteriële buisleiding gaat naar de tweede uitstroomfles.
- Steek de leidingen van de pompslang in de pompcassettes. Zorg ervoor dat de driewegafsluitkranen van de slangleidingen allemaal open zijn.
- Stel in het begin de peristaltische pomp in om media van de instroom naar de uitstroomfles te leiden met een snelheid van 5 tpm (zie tabel 4).
NOTITIE: Tijdens het aanzuigen van de slanglijn kan de snelheid worden verhoogd tot 10 tpm om het proces te versnellen. - Start de pomp door op de startknop te drukken en zorg ervoor dat de richting van de pompactie met de klok mee is. Zodra het medium in de uitstroomflessen valt, moet u ervoor zorgen dat er geen lekken zijn en dat er geen luchtbellen achterblijven in de slangleidingen en aansluitpunten. Verwijder eventuele resterende luchtbellen door op de slang en connectoren te tikken of door de pompsnelheid te verhogen.
- Wanneer alle slangleidingen in de uitstroomflessen vallen, stelt u het debiet in op 2 tpm voor het aansluiten van het eerste apparaat.
- Priming van het apparaat
NOTITIE: In dit gedeelte wordt beschreven hoe het apparaat moet worden geprimed met celkweekmedium om ervoor te zorgen dat alle kamers zijn gevuld en voorgecoat met medium, zodat er geen luchtbellen in het systeem achterblijven en de cellen zich gemakkelijk kunnen hechten tijdens de inoculatie.- Het primen van het apparaat wordt uitgevoerd in de bioveiligheidskast onder steriele omstandigheden. Om het apparaat aan te sluiten, begint u met het aansluiten van de neuronale lijn, de onderste kamer van het apparaat.
- Om een leiding aan te sluiten, sluit u de driewegafsluiters (Figuur 5C), te beginnen met de uitstroomzijde, waar de korte slang wordt losgekoppeld van de vrouwelijke Luer-connector en wordt aangesloten op de uitlaatpoort van het apparaat, door de slang over de weerhaak te duwen. Om een goede aansluiting te garanderen en de kans op lekken en/of vervuiling te verkleinen, moet u ervoor zorgen dat de slang in contact is met het deksel door deze helemaal naar beneden over de connector te duwen. Sluit de instroomslang op dezelfde manier aan. Zodra een lijn volledig op het apparaat is aangesloten (in- en uitstroom), opent u de driewegkranen.
- Herhaal de vorige stap met de epitheellijn en vervolgens met de bacterielijn. Houd de pomp op een debiet van 2 tpm. Verhoog de pompsnelheid tot 2,5 tpm, maar niet hoger, om lekkages door drukopbouw te voorkomen. Laat de pomp de kamers in het apparaat vullen.
- Houd de uitstroomserumflessen te allen tijde in de gaten. Als er luchtbellen vast komen te zitten in de kamers, leidingen of connector, zal een slangleiding met een luchtbel erin niet meer in de uitstroomkamer vallen. Om luchtbellen te verwijderen, laat u de apparaten eerst een paar minuten draaien. Als dit het probleem niet oplost, sluit u een van de andere lijnen die voor een korte tijd worden verwijderd door de driewegkraan van de uitstroom te sluiten.
- Zodra alle kamers van het apparaat volledig zijn gevuld - alle kamers zijn gevuld met celkweekmedium en er blijven geen luchtbellen achter in het apparaat - verlaagt u de pompsnelheid tot 0.5 tpm. Het apparaat is nu klaar voor celinoculatie.
4. Celvoorbereiding en inoculatie
NOTITIE: In dit gedeelte wordt beschreven hoe de verschillende celtypen die nodig zijn om het apparaat te inoculeren, moeten worden voorbereid en hoe u ze op een steriele manier en zonder luchtbellen in het apparaat kunt inoculeren. Verder wordt beschreven hoe medium refreshment voor de neuronale cellen kan worden uitgevoerd en hoe medium kan worden voorbereid voor de bacteriecultuur in het apparaat.
- Epitheelcellen
- Maak de Caco-2-cellen los van de kolf met behulp van trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), resuspendeer in RPMI 1640 + 10% FBS en tel ze in een Neubauer-celteller met behulp van de trypanblauwuitsluitingstest. Centrifugeer de Caco-2-celsuspensie (3 min, 300 × g) en gooi het supernatans weg om de resterende trypsine-EDTA te verwijderen. Resuspendeer de Caco-2-cellen in RMPI 1640 + 10% FBS om een suspensie van 350.000 cellen/ml te verkrijgen. Voor elk apparaat is een volume van 1,5 ml nodig.
- Breng 1,5 ml van de Caco-2-celsuspensie over in een steriele spuit van 2 ml en verwijder alle lucht of bellen die in de spuit zijn achtergebleven.
- Sluit de driewegafsluiters van de slangen van de bacteriële en neuronale kamers. Koppel de slang van de bacteriële en neuronale kamers los van de pomp door de cassettes met de betreffende slang van de rotor te verwijderen.
- Open de dop van de driewegafsluiter van de instroomslang die naar de epitheelkamer leidt en draai aan de driewegafsluiter om de mediumstroom van het apparaat naar de 'open connector' om te leiden (Figuur 5C). Laat het medium stromen totdat er een druppel medium verschijnt aan het open uiteinde van de driewegkraanklep.
- Steek de spuit met de epitheelcellen in de 'open connector' met behulp van de druppelverbindingsmethode om de spuit in de connector te kunnen inbrengen zonder dat er luchtbellen ontstaan. Draai aan de klep van de driewegkraan om de stroom van het medium uit de instroomfles (via de pomp) te stoppen en om de stroom van de aangesloten spuit naar het oorspronkelijke apparaat mogelijk te maken. Koppel het epitheelkanaal los van de pomp.
- Druk langzaam op de spuit om de epitheelkamer te inoculeren met de celsuspensie. Zorg ervoor dat er ongeveer één druppel per 3 s in de uitstroomfles valt.
- Voeg 1,5 ml van de celsuspensie toe en sluit vervolgens de klep van de driewegkraan voor de uitstroom. Koppel de spuit los en sluit het open uiteinde van de driewegkraan met de dop. Houd de kamer minimaal 2 uur gesloten. Inoculeer in de tussentijd de neuronale cellen.
- Neuronale cellen
- Maak de neuronale cellen los van het putje door de cellen in de media van de respectievelijke putjes opnieuw te suspenderen met behulp van een pipet. Inoculeer elk apparaat met volledig confluente cellen uit één putje (9.6cm2) van een plaat met 6 putjes.
- Resuspendeer de celpellet in het overeenkomstige N2B27 medium volume (1,5 ml media per apparaat) + 1 μl fibronectine/ml celsuspensie. Breng 1,5 ml van de suspensie met geresuspendeerde cellen over in een spuit van 2 ml en verwijder eventuele luchtbellen die in de spuit zijn achtergebleven. Plaats de gevulde spuit in een steriele conische buis van 50 ml en breng deze over naar de bioveiligheidskast met het geprimed HuMiX-apparaat.
- Volg hetzelfde inoculatieproces als eerder beschreven voor de inoculatie van de epitheelkamer, behalve het vervangen van de buisleiding. Koppel hier de bacteriële en epitheliale buisleidingen los van de pomp.
- Sluit na inoculatie van neuronale cellen alle driewegafsluitkranen van de buisleidingen en koppel ze los van de pomp. Plaats het apparaat in de incubator bij 37 °C en 5% CO2. Houd alle kanalen 2 uur gesloten zodat de cellen zich kunnen hechten.
- Sluit na 2 uur de bacteriële en epitheelkanalen aan op de pomp en open de in- en uitstroomkranen in drie richtingen van beide leidingen. Houd de neuronale kamer gesloten gedurende de komende 14 dagen van de eerste keer dat het apparaat wordt gebruikt, behalve tijdens de mediumverandering.
- Vervang tijdens de 14-daagse run het medium van de neuronale kamer elke 3-4 dagen. Voor medium refresh, bereid 3 ml verse N2B27 medium per apparaat en doe het over in een steriele serumfles van 20 ml. Sluit de serumfles met medium met behulp van een steriel septum en een aluminium krimpafdichting.
- Steek een beluchting en een naald van 80 mm in het septum van de nieuwe fles. Vervang de oude mediafles door de nieuwe in de couveuse door de mannelijke Luer los te koppelen van de naald van de oude fles naar de naald van de nieuwe fles.
- Sluit de cassette met de pompslang van de neuronale kamer aan op de pomp en open de driewegafsluiters. Laat het medium gedurende 2 uur met 0,5 tpm stromen voordat u de driewegafsluitkranen van de neuronale slang sluit en loskoppelt van de pomp, tot de volgende mediumwissel.
5. Bacteriecultuur en inoculatie
OPMERKING: In deze studie werd op dag 12 een vloeibare cultuur van Limosilactobacillus reuteri stam F275 gereanimeerd uit een glycerolvoorraad. Afhankelijk van de behoeften of onderzoeksopzet kunnen andere bacteriesoorten worden gebruikt.
- Bereid drie buisjes voor met 5 ml MRS-bouillon - één steriel controlebuisje en twee voor L. reuteri-inoculatie. Schraap met een inoculatielus de bovenkant van de glycerolvoorraad eraf en breng deze over in één buis. Herhaal dit met een tweede inoculatiebuis. Incubeer de buizen een nacht bij 37 °C, 170 rpm.
LET OP: Laat de glycerolvoorraad niet ontdooien. - Bereid vers medium voor de eerste apparaten door Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 + 10% FBS te mengen met 5% MRS-bouillon. Bereid 25 ml per apparaat en breng het onder steriele omstandigheden over in serumflessen van 100 ml. Sluit de flessen af met een steriel septum en aluminium krimp. Plaats de flessen een nacht in de incubator bij 37 °C, 5% CO2 .
- Voordat u de flessen aansluit op de bacteriële buisleiding, voegt u een beluchtingsnaald en een naald van 80 mm toe aan elke fles RPMI 1640/MRS-media.
- Bereid nieuwe buisjes, elk met 3 ml RPMI 1640 + 10% FBS + 5% MRS-bouillon. Bereid ten minste twee slangen voor, één bedieningsbuis en één buis per apparaat. Inoculeer 15 μL van de L. reuteri 's nachts cultuur (optische dichtheid [OD] > 2) in twee van de nieuw geprepareerde buisjes.
- Incubeer de buizen gedurende 1 uur bij 37 °C, 170 rpm, waarna een OD van 0,05-0,10 wordt bereikt, overeenkomend met ~1 × 107 kolonievormende eenheden (CFU)/ml. Breng 1,5 ml over in een spuit van 2 ml (één per apparaat). Gebruik de rest van de bacteriële suspensie voor CFU-beplating en levende/dode kleuring.
- Voor bacteriële inoculatie van het apparaat volgt u dezelfde procedure als vermeld in stap 4.1, behalve dat hier de neuronale en epitheelbuislijnen gesloten zijn.
- Sluit na inoculatie ook de leiding van de bacteriële buis door de kleppen te sluiten en gedurende 30 minuten los te koppelen van de pomp. Sluit de epitheel- en bacteriebuisleidingen aan en open ze weer. Laat de apparaten nog 24 uur draaien op 37 °C en 0,5 rpm.
6. HuMiX openen en bemonsteren
OPMERKING: In het onderstaande gedeelte wordt de bemonstering van verschillende celtypen beschreven. Neuronale celpellets worden bijvoorbeeld gebruikt voor RNA-extractie en daaropvolgende kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), bacteriële pellets voor DNA-extractie en 16S rRNA-gensequencing, en supernatanten voor enzymgekoppelde immunosorbentassays (ELISA's) en andere assays (bijv. lactaatassay).
- Sluit op dag 14, de openingsdag, alle driewegkranen, koppel de slangen los van de pomp en haal het apparaat van de incubator naar de laboratoriumbank.
NOTITIE: Zorg er bij het verplaatsen van het apparaat voor dat u het eigenlijke apparaat horizontaal houdt. - Verwijder de slangleidingen die op het apparaat zijn aangesloten voordat u de clamp langzaam opent en verwijder het clamp deksel. Verwijder voorzichtig het bovenste pc-deksel, verzamel het media in een microcentrifugebuisje van 1.5 ml en plaats het op ijs.
- Verwijder voorzichtig de sandwichpakking terwijl u de media uit de epitheelkamer verzamelt; Pas op dat u de cellaag niet aanraakt. Plaats de sandwichpakking in een vierkante petrischaal en voeg steriele 0,9% NaCl-oplossing in H2O toe aan de bacteriekamer totdat de kamer volledig bedekt is (ongeveer 1 ml).
- Verwijder langzaam de collageenpakking terwijl u de media uit de neuronale kamer verzamelt en overbrengt naar een microcentrifugebuis. Plaats alle mediabuizen op ijs. Plaats de collageenpakking in een vierkante schaal en voeg voorzichtig een paar milliliter 1x PBS toe aan de Caco-2-laag totdat de cellaag volledig bedekt is.
- Plaats het onderste PC-deksel in een vierkante petrischaal en voeg voorzichtig ongeveer 2 ml 1x PBS toe aan de neuronale cellen, zodat ze niet uitdrogen tijdens het bemonsteringsproces.
- Centrifugeer de bacteriële mediabuis bij 5.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Centrifugeer de epitheel- en neuronale mediabuizen bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng na het centrifugeren het supernatans van elke buis over in een nieuwe microcentrifugebuis en plaats deze onmiddellijk op droogijs.
- Epitheelcellen
- Verwijder de PBS voorzichtig uit de pakking en verzamel deze in een conische buis van 15 ml. Voeg 2 ml trypsine toe aan de cellen en incubeer de pakking gedurende 5 minuten bij 37 °C, 5% CO2. Voeg na incubatie 2 ml RPMI 1640 toe aan de pakking, repsuspendeer de cellen en verzamel ze in een andere conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer beide buisjes gedurende 5 minuten bij 300 × g. Gooi de supernatant weg. Resuspendeer de pellet uit de PBS-was in 300 μL PBS en de celpellet in 1 ml PBS.
- Breng 50 μL van elk buisje over naar een microcentrifugebuisje van 0,5 ml voor de geautomatiseerde celteller en het aantal trypanblauwe uitsluitingscellen. Breng de geresuspendeerde celpellet (1 ml) over in een buis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g .
- Verwijder het supernatans en resuspendeer de celpellet in 250 μL lysisbuffer + 1% bèta-mercaptoethanol en plaats de buis op droogijs.
- Neuronale cellen
- Breng de vierkante petrischaal, met het onderste, transparante PC-deksel met neuronale cellen uit de vorige stap (6.5) naar een omgekeerde fasecontrastmicroscoop.
NOTITIE: Wees heel voorzichtig bij het verplaatsen van het pc-deksel met PBS erop, omdat het neuronale netwerk heel gemakkelijk losraakt. - Voer een laatste kwaliteitscontrole uit voorafgaand aan de inoculatie door de morfologie en celdichtheid van de neuronale cellen te observeren met behulp van helderveldmicroscopie. Controleer of de cellen uit de sferoïden zijn gemigreerd en of er een neuronaal netwerk is gevormd. Het neuronale netwerk moet voor ongeveer 90% samenvloeiend zijn. Voor meer details, zie Fattahi et al.6.
- Resuspendeer op de bank de cellen in PBS en verzamel ze in een buis van 1,5 ml. Centrifugeer de buis bij 300 × g gedurende 3 minuten. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de celpellet in 250 μL lysisbuffer + 1% bèta-mercaptoethanol en leg op droogijs.
OPMERKING: Immunofluorescentie (IF)-kleuring kan worden uitgevoerd op de neuronale cellen op het pc-deksel. Als IF-kleuring de voorkeurstest is om het neuronale netwerk niet te vernietigen, moeten de cellen op het pc-deksel worden gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA), wat hergebruik van het pc-deksel in toekomstige experimenten belemmert.
- Breng de vierkante petrischaal, met het onderste, transparante PC-deksel met neuronale cellen uit de vorige stap (6.5) naar een omgekeerde fasecontrastmicroscoop.
- Bacteriële cellen
- Resuspendeer de bacteriecellen die aan het membraan zijn bevestigd in 0,9% NaCl-oplossing. Als de cellen stevig vastzitten, maak dan voorzichtig gebruik van een celschraper om de bacteriecellen los te maken van het membraan.
OPMERKING: Het gebruik van een schraper kan de cellen beschadigen, waardoor de kans groter wordt dat u meer dode cellen ziet. - Vang de celsuspensie op in een conische buis van 15 ml. Voeg de pellet die overblijft van het eerder verzamelde medium toe aan de conische buis van 15 ml. Centrifugeer bij 5.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 1 ml 0,9% NaCl-oplossing.
- Verdeel dit volume in drie delen: één voor het invriezen van een bacteriepellet voor nucleïnezuurextractie (650 μL), één voor CFU-plating (50 μL) op MRS-platen en één voor levende/dode kleuring (300 μL). Voor de bereiding van de pellet voor nucleïnezuurextractie wordt de celsuspensie in een microcentrifugebuis gedaan, gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 5.000 × g gecentrifugeerd en het supernatant weggegooid. Leg de celpellet op droogijs.
- Breng aan het einde van de bemonstering alle buisjes op droogijs over naar een vriezer van -80 °C om ze op te slaan voor latere stroomafwaartse analyses.
OPMERKING: Supernatans kan verder worden gebruikt voor analyse van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS). Bovendien kan het met collageen gecoate membraan tijdens de opening in verschillende delen worden verdeeld voor verschillende analyses - de ene helft wordt gebruikt voor IF-occludinekleuring, een ander deel voor RNA-extractie voor verdere analyse van genexpressie en een ander deel voor het tellen van cellen.
- Resuspendeer de bacteriecellen die aan het membraan zijn bevestigd in 0,9% NaCl-oplossing. Als de cellen stevig vastzitten, maak dan voorzichtig gebruik van een celschraper om de bacteriecellen los te maken van het membraan.
Representative Results
In neuroHuMiX hebben we drie verschillende celtypen samen gekweekt: bacteriële, epitheliale en neuronale cellen (Figuur 1). Om er zeker van te zijn dat de cellen allemaal levensvatbaar waren, voerden we verschillende testen uit op de verschillende celtypen. Zo voerden we CFU-tellingen uit op bacteriële cellen, celgetal- en cellevensvatbaarheidstesten op de epitheelcellen, terwijl de neuronale cellen werden beoordeeld via microscopische analyses.
Figuur 1: Schematische weergave van neuroHuMiX en de experimentele opstelling . (A) De drie kamers worden tussen twee pc-deksels gehouden om ze gesloten te houden. Elke kamer is gevuld met een specifiek medium voor de cellen die erin groeien. De verschillende kamers worden gescheiden door semi-permeabele membranen die celcommunicatie mogelijk maken via oplosbare factoren die de membranen passeren. (B) Weergave van de neuroHuMiX-opstelling. Elke kamer is verbonden met verschillende mediaflessen. Voor de bacteriekamer is de kamer de eerste 12,5 dagen aangesloten op RPMI + 10% FBS, voordat deze de laatste 36 uur wordt vervangen door RPMI + 10% FBS + 5% MRS. Afkortingen: PC = polycarbonaat; P/L/F = poly L-ornithine/laminine/fibronectine; RPMI = Roswell Park Memorial Institute celkweekmedium; MRS = De Man, Rogosa en Shapre cultuurmedium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om te bepalen of de cellen op de juiste manier waren bevestigd, beoordeelden we bij het openen van de apparaten de vorming van een cellaag op het met collageen beklede membraan (Figuur 6A). Om er zeker van te zijn dat de cellen in het apparaat levensvatbaar waren, werden een geautomatiseerde telling van de cellenteller (Figuur 6B) en een telling van de trypan-blauwe uitsluitingstest uitgevoerd (Figuur 6C). De testen werden uitgevoerd op Caco-2-cellen uit drie verschillende HuMiX-opstellingen: (i) Caco-2 in kweek met EN's, (ii) Caco-2 in kweek met L. reuteri, en (iii) het apparaat met co-cultuur van alle drie de celtypen. Statistische tests met behulp van een eenrichtings-ANOVA leverden geen significante verschillen op tussen de celtypen, wat suggereert dat de Caco-2-cellen levensvatbaar bleven in al deze initiële apparaatopstellingen en omstandigheden die in deze studie werden getest. Dit onderstreept het feit dat de bacteriële dichtheid die wordt bereikt tijdens de co-cultuur van L. reuteri en de twee menselijke celtypen geen cytotoxische effecten heeft op de menselijke cellen.
Figuur 6: Beoordeling van Caco-2-cellen op het met collageen beklede membraan. (A) Laag Caco-2-cellen op het met collageen beklede membraan na opening. De pijl geeft het met collageen beklede membraan aan, dat is omgeven door een gestippelde cirkel. De Caco-2-cellen groeiden op de spiraalvorm op het membraan. Cellevensvatbaarheid van Caco-2-cellen na 14 dagen in HuMiX. Celtellingen werden verkregen met behulp van (B) de geautomatiseerde celteller en (C) het aantal trypanblauwe exclusiecellen. Het aantal Caco-2-cellen werd bepaald aan de hand van verschillende kweekopstellingen in het oorspronkelijke apparaat: co-cultuur met enterische neuronen (EN's) (zwart), co-cultuur met L. reuteri (oranje) en in het apparaat (EN's en L. reuteri) (blauw). Er werd een eenrichtings-ANOVA uitgevoerd, waaruit bleek dat er geen significant verschil is tussen de verschillende cultuuropstellingen (eenrichtings-ANOVA, p = 0,1234 [ns]; foutbalken geven standaardfout aan). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om L. reuteri te kunnen kweken met zoogdiercellen, hebben we eerst de kweekmedia geoptimaliseerd en aangepast voor gebruik in het apparaat. We ontdekten dat een mix van 5% MRS in RPMI 1640 (aangevuld met 10% FBS) optimaal geschikt was voor de groei van L. reuteri, terwijl het niet cytotoxisch was voor de zoogdiercellen die in deze testen werden gebruikt. Vervolgens werd een CFU-telling uitgevoerd om de groei van L. reuteri te beoordelen wanneer deze gedurende 24 uur in het apparaat werd gekweekt. Het aantal CFU's werd beoordeeld voor twee verschillende initiële apparaatopstellingen (Figuur 7): L. reuteri in co-cultuur met Caco-2 en L. reuteri in het apparaat . In beide opstellingen verschilden de CFU-tellingen significant van het HuMiX-inoculum en de geoogste cellen (eenrichtings-ANOVA, p = 0,0002), wat wijst op groei van de bacteriële cellen in het oorspronkelijke apparaat.
Figuur 7: Limosilactobacillus reuteri CFU-telling van het inoculum (verdund 1:100.000) en na 24 uur in HuMiX. Twee verschillende opstellingen: Caco-2-cellen in co-cultuur met L. reuteri en het apparaat. Een eenrichtings-ANOVA toont een significant verschil (p = 0,0002 [***]) tussen het inoculum en de geoogste cellen, wat betekent dat de bacteriën in HuMiX groeien. Foutbalken geven de standaardfout aan. Afkortingen: CB. HX = Caco-2 bacterie HuMiX; nHX = neuroHuMiX. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om te beoordelen of het kweken van de EN's in het apparaat het fenotype van de cellen zou veranderen, werd de grove morfologie van de EN's waargenomen met behulp van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop. Tijdens deze stap werden zowel de confluentie als de EN-morfologie beoordeeld. Het opzetten van een confluent neuronaal netwerk gaf aan dat de cellen goed waren gehecht aan het pc-deksel van het gecoate apparaat. Belangrijk is dat dit het idee benadrukt dat ze groeiden in co-cultuur met Caco-2 en L. reuteri. De rand tussen het confluente neuronale netwerk en de door pakkingen afgebakende spiraal was duidelijk zichtbaar (Figuur 8).
Figuur 8: Enterische neuronen na 14 dagen kweek in het apparaat. Aan de linkerkant van het beeld zijn de neuronen uitgegroeid tot een samenvloeiende laag op de spiraal. De rand, tussen de neuronale laag en de ruimte zonder cellen, is de rand van de spiraal; 10x vergroot, schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 2: Deksels die in het apparaat worden gebruikt. Afbeeldingen tonen de bovenste (links) en onderste (rechts) pc-deksels. Elke zijde van het pc-deksel is 6,4 cm. Afkorting: PC = polycarbonaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 3: Pakking van de epitheelkamer op het onderste pc-deksel. Bovenaanzicht van de epitheelkamerpakking die op het onderste pc-deksel is geplaatst (links) en onderaanzicht (rechts) met de uitlijning van de epitheelkamerpakking met de inlaten en uitlaten van het onderste pc-deksel. Elke kant van de pakkingen, evenals het pc-deksel, meet 6,4 cm. Afkorting: PC = polycarbonaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 4: Montage van het apparaat. (A) Verschillende onderdelen voor het assembleren van HuMiX: (1) onderste PC-deksel; (2) pakking met met collageen gecoat microporeus membraan, dat bovenop (1) wordt geplaatst; (3) sandwichpakking met daartussen een met mucine gecoat nanoporeus membraan en bovenop (2); (4) bovenste pc-deksel bovenop (3). Elke zijde van de pakkingen en PC-deksels meet 6,4 cm. (B) Alle onderdelen van (A) bij elkaar geplaatst. (C,D) Geassembleerd apparaat - boven- (links) en zijaanzicht (rechts). B wordt in het klemsysteem geplaatst om het systeem te sluiten. (C) Elke zijde van de bovenste klem meet 8 cm. Afkorting: PC = polycarbonaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 5: Onderdelen die nodig zijn voor de slangleiding en de geassembleerde slangleiding voor één kamer. (A) Verschillende onderdelen om een slangleiding te bouwen: a. pompslangleiding; b. driewegkraan; ca. naald van 40 mm; d. naald van 80 mm; e. naald van 120 mm; f. lange slanglijn (20 cm); g. korte slanglijn (8 cm); h. mannelijke Luer; i. vrouwelijke Luer; J. Adapter. (B) Geassembleerde slangleiding voor de bacteriële of epitheelkamer. Voor de neuronale kamer zou de naald van 120 mm moeten worden vervangen door een naald van 80 mm. (C) Driewegkraan die is gedraaid om de mediumstroom van het apparaat om te leiden naar de 'open connector' en om de kamer te sluiten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Dag | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| Samenstelling van de media | 100% E6 | 100% E6 | 75% E6 | 50% E6 | 25% E6 | 100% N2 |
| + LDN | + LDN | 25% N2 | 50% N2 | 75% N2 | + LDN | |
| + SB | + SB | + LDN | + LDN | + LDN | + SB | |
| + CHIR | + SB | + SB | + SB | + CHIR | ||
| + CHIR | + CHIR | + CHIR | + RA | |||
| + RA | + RA | |||||
| Molecuul | [concentratie] | |||||
| LDN (LDN) | 100 miljoen | |||||
| SB | 10 μM | |||||
| CHIR | 3 μM | |||||
| Retinoïnezuur (RA) | 1 μM |
Tabel 1: Mediasamenstelling.
| Media | Componenten (concentraties vermeld in de materiaaltabel) | Volume (ml) |
| N2-media (50 ml) | DMEM-F12 | 48 |
| N2 Supplement | 0.5 | |
| L-Glutamine | 0.5 | |
| Penicilline/Streptomycine | 0.5 | |
| NEAA | 0.5 | |
| N2B27/ENS Media (50 ml) | Neurobasaal | 48 |
| N2 Supplement | 0.5 | |
| L-Glutamine | 0.5 | |
| Penicilline/Streptomycine | 0.5 | |
| B27-A | 0.5 |
Tabel 2: Mediarecepten.
| Sterilisatie Temperatuur (°C) | 116 |
| Sterilisatietijd (min) | 20 |
| Droogtijd (min) | 10 |
| Pulsen | 3 |
| Eindtemperatuur (°C) | 99 |
Tabel 3: HuMiX-autoclaafrun.
| Omwentelingen per minuut (rpm) | Gemiddeld debiet (μL/min) |
| 0.5 | 13 |
| 2 | 79 |
| 5 | 180 |
Tabel 4: Debieten van de peristaltische pomp.
Discussion
Het is nu vastgesteld dat het menselijke darmmicrobioom de gezondheid en ziekte van de gastheer beïnvloedt. Ondanks de kennis die het belang van ons microbioom suggereert, vooral bij neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer of Parkinson 3,13, blijft het grotendeels onbekend hoe het darmmicrobioom interageert met het enterische zenuwstelsel en vervolgens met de hersenen.
Een representatief model om de interacties tussen het darmmicrobioom en het zenuwstelsel te bestuderen was tot nu toe niet beschikbaar. Studies met betrekking tot de darm-hersenas worden traditioneel uitgevoerd met behulp van muizenmodellen13. Muizen en mensen delen 85% van hun genomische sequenties14, maar er zijn significante verschillen waarmee rekening moet worden gehouden bij het vergelijken van muizen met mensen. Wat de darm betreft, is het belangrijk op te merken dat muizen, in vergelijking met mensen, uitsluitend herbivoren zijn. Hierdoor verschilt hun maagdarmkanaal in lengte en kenmerken, zoals de 'maaglediging'14. Muizenhersenen vertonen ook belangrijke verschillen, waarbij de algehele structuur tussen muizen en mensen anders is15. Belangrijk is dat mensen langere celcyclustijden hebben van neurale voorlopers15. Daarom is het belangrijk om representatieve modellen te ontwikkelen die van mensen afkomstige cellen omvatten, waaronder darm- en neuronale cellen5. In deze context vermindert de ontwikkeling van meer reproduceerbaar onderzoek via in-vitromodellen de noodzaak om diermodellen te gebruiken en verbetert de reproduceerbaarheid.
neuroHuMiX is een geavanceerde versie van het vorige HuMiX model9. HuMiX is een darm-op-een-chip-model dat proximale en representatieve co-culturen van epitheel- en bacteriële cellen mogelijk maakt. Cel-cel communicatie is mogelijk door de proximale co-cultuur en diffusie van uitgescheiden factoren en metabolieten via semipermeabele membranen. Om het nut van het oorspronkelijke apparaat om de menselijke darmomgeving te bestuderen uit te breiden, is echter de introductie van een extra celtype vereist. Om dit aan te pakken, maakt neuroHuMiX, ontwikkeld met de introductie van iPSC-afgeleide EN's, een proximale co-cultuur van bacteriën, darmepitheelcellen en EN's mogelijk. Het resulterende in-vitromodel stelt ons in staat om vragen te beantwoorden met betrekking tot het menselijke darmmicrobioom in relatie tot het menselijk zenuwstelsel. Het samen kweken van verschillende celtypen, met name co-culturen van zoogdiercellen en bacteriën, brengt verschillende uitdagingen met zich mee, waaronder het verlies van levensvatbaarheid, slechte hechting en algeheel verlies bij samenvloeiing16. Hier hebben we aangetoond dat we binnen dit apparaat in staat zijn om drie verschillende celtypen binnen hetzelfde systeem te co-cultureren en tegelijkertijd de levensvatbaarheid van de cel hoog te houden.
Een cruciale stap in het protocol is om te zorgen voor samenvloeiing van de neuronale cellen - 80%-90% celsamenvloeiing en levensvatbaarheid - voordat ze in het apparaat worden geïnoculeerd. Aangezien het niet mogelijk is om de celgroei tijdens de run te beoordelen, is het van het grootste belang om ervoor te zorgen dat de cellen goed samenvloeien en groeien voordat ze in het model worden geïntroduceerd. Hoewel dit een beperkende factor kan zijn, is de algehele levensvatbaarheid en samenvloeiendheid die in het apparaat wordt waargenomen over het algemeen hoog.
Het apparaat is via slangen verbonden met een peristaltische pomp. Elke celkamer heeft zijn specifieke slanglijn. De slang bestaat uit een pompslang die het gebruik van een peristaltische pomp voor de perfusie van het medium mogelijk maakt, evenals een slang die de pompslang met het apparaat verbindt en een slang die het apparaat verbindt met de uitstroom-/afvalflessen. Voor en na het apparaat zijn bemonsteringspoorten opgenomen om de inoculatie en bemonstering van het uitstroommedium mogelijk te maken. Elke kamer kan worden aangesloten op een ander medium, waardoor de beste kweekomstandigheden voor elk afzonderlijk celtype mogelijk zijn. Elke kamer kan worden geopend of gesloten, afhankelijk van de specifieke behoeften aan mediumtoevoer. In het apparaat blijft de neuronale kamer het grootste deel van het experiment gesloten, terwijl de bacteriële en epitheelkamers de hele tijd open zijn, wat betekent dat ze gedurende de hele experimentele run vers medium krijgen. Om ervoor te zorgen dat het medium zonder onderbreking stroomt, is het van cruciaal belang dat er geen lucht in de slangen, connectoren of in het apparaat achterblijft. Daarom is het belangrijk om de apparaten eerst een paar minuten te laten draaien bij de aanzuigstap. Dit lost het probleem vaak op. Als dit niet het geval is, kan een van de andere lijnen die vallen voor een korte tijd worden gesloten door de driewegkraan van de uitstroom te sluiten. Hierdoor wordt het medium omgeleid naar de lijn met de luchtbel, waardoor het probleem wordt opgelost door de bel door de slang naar buiten te duwen.
Voor elk celkweekexperiment is het medium een belangrijk onderdeel, waarbij elk celtype zijn respectievelijke medium heeft. In een co-cultuuropstelling moet het medium niet alleen compatibel zijn met het celtype dat erin groeit, maar ook met de andere celtypen binnen de cocultuur. Dit is niet anders voor het apparaat, wat een extra uitdaging vormt omdat we drie verschillende compartimenten hebben met drie verschillende celtypen binnenin: bacteriële, epitheliale en neuronale cellen. We hebben echter aangetoond dat door het modificeren van de bacteriële media - met toevoeging van 5% MRS aan RPMI 1640 met 10% FBS - alle celtypen, in het bijzonder bacteriële en epitheelcellen, met succes kunnen worden gecocultureerd binnen het systeem. In het apparaat worden echter verschillende celtypen in de buurt samen gekweekt en staan ze dus niet in direct contact met elkaar. Hoewel dit niet volledig representatief is voor het directe contact tussen cellen in de menselijke darm, en dus een beperking, is de proximale en representatieve co-cultuurconditie een sterk punt voor stroomafwaartse analyses. Oplosbare factoren wisselen uit tussen de verschillende kamers en celtypen; vandaar dat de cellen nog steeds met elkaar in wisselwerking staan. Bovendien stelt het feit dat de celtypen afzonderlijk kunnen worden geoogst en geanalyseerd, ons in staat om het effect van een gezond en/of ziek microbioom op verschillende celtypen (inclusief neuronale cellen) te bestuderen en daarmee celtype-specifieke uitlezingen te bepalen/op te halen. Een andere beperking is dat de morfologie van de cellen niet kan worden opgevolgd tijdens de experimentele run, omdat het apparaat alleen aan het einde van elk experiment kan worden geopend en de cellen kunnen worden gecontroleerd.
Voor zover wij weten, is neuroHuMiX het eerste gut-on-a-chip-model dat EN's bevat. Dit is een stap in de richting van het ophelderen van de communicatie tussen de darmmicrobiota en het enterische zenuwstelsel. Het is een model dat onderzoek mogelijk maakt naar de wisselwerking tussen een bacteriesoort, een epitheellaag en EN's. Het ontwerp stelt ons in staat om de uitwisseling van oplosbare factoren die door de verschillende celtypen worden uitgescheiden en hun effect op elkaar te bestuderen. In de toekomst zou het belangrijk zijn om niet alleen iPSC-afgeleide EN's te hebben, maar ook iPSC-afgeleide epitheelcellen in het apparaat, om het apparaat om te zetten in een gepersonaliseerd model. Belangrijk is dat dit gepersonaliseerde model kan worden gebruikt om pre-, pro- en synbiotica te testen 10,11 en mogelijk gepersonaliseerde screening- en therapeutische benaderingen te ontwikkelen17. Gepersonaliseerde neuroHuMiX zou uiteindelijk licht kunnen werpen op de 'donkere materie' van het menselijke darmmicrobioom en de interacties met het zenuwstelsel langs de as darmmicrobioom-zenuwstelsel, wat de weg vrijmaakt voor therapeutische beoordeling en interventies.
We kunnen concluderen dat het kunnen hebben van een darm-op-een-chip inclusief het enterische neuronale systeem cruciaal is voor vooruitgang in de studie en het begrip van interacties langs de as van het darmmicrobioom-zenuwstelsel. NeuroHuMiX stelt ons in staat om de effecten van bacteriesoorten op gastheercellen te bestuderen en geeft ons een goede basis om het model nog verder te verbeteren op een nog fysiologisch representatievere manier.
Disclosures
P.W. verklaart als uitvinder te zijn vermeld op de octrooien PCT/EP2013/056607, PCT/EP2016/062024, PCT/US2017/061602 en PCT/EP2019/081424. P.W., C.S. en L.G. verklaren dat ze op octrooi LU503075 als uitvinders worden vermeld.
Acknowledgments
De auteurs willen Dr. Jared Sterneckert bedanken voor het verstrekken van de cellen uit de K7-lijn. We willen ook de langdurige medewerkers Dr. Frederic Zenhausern en Matthew W. Barret van de Universiteit van Arizona bedanken voor hun hulp bij de technische aspecten. We willen ook Dr. Valentina Galata bedanken voor haar hulp bij het ontwerpen van de schematische weergave van neuroHuMiX. Dit project is gefinancierd door de European Research Council (ERC) in het kader van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie (subsidieovereenkomst 863664). Figuur 1 is gedeeltelijk gemaakt met Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 10712 | |
| Aeration cannula (length: 1.10 diameter: 30 mm) | VWR (B.Braun) | BRAU4190050 | |
| Agar-agar | Merck Millipore | 1.01614.1000 | |
| Aluminium Crimp | Glasgerätebau Ochs | 102050 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bacterial Cell Membrane, pore size: 1 µm | VWR (Whatman) | 515-2084 | |
| Caco-2 cells | DSMZ | ACC169 | |
| Cell Counter & Analyzer CASY | OMNI Life Sceince | ||
| CHIR | Axon Mechem BV | CT99021 | |
| Collagen I, Rat Tail | Invitrogen | A1048301 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3471 | |
| Difco Lactobacilli MRS Broth | BD Biosciences | 288130 | |
| Discofix 3-way stopcock | B. Braun | BRAU40951111 | |
| DMEM/F12, no glutamine | Thermofisher Scientific | 21331020 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, D-PBS | Sigma Aldrich | 14190-169 | |
| Essential 6 Medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| Essential 8 Medium | Thermofisher Scientific | A1517001 | |
| Female Luer Lock to Barb Connector | Qosina | 11733 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Foetal Bovine Serum, FBS | Thermofisher Scientific | 10500-064 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Human Cell Membrane, pore size: 50 nm | Sigma Aldrich (GE Healthcare) | WHA111703 | |
| HuMiX Gasket Collagen | Auer Precision | 216891-003 | |
| HuMiX Gasket Sandwich Bottom | Auer Precision | 216891-002 | |
| HuMiX Gasket Sandwich Top | Auer Precision | 216891-001 | |
| iPSC | Max Planck Institute for Molecular Biomedicine | K7 line | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Laminin from Engelbreth-Holmswarm | Sigma Aldrich | L2020 | |
| LDN193189 | Sigma Aldrich | SML0559 | |
| Limosilactobacillus reuteri | ATCC | 23272 | |
| Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit | Thermofisher Scientific | L7012 | |
| Male Luer with Spin Lock to Barb | Qosina | 11735 | |
| Marprene tubing (0.8 mm x 1.6 mm) | Watson-Marlow | 902.0008.J16 | |
| Matrigel hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | |
| Mucin, from porcine stomach | Sigma Aldrich | T3924 | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEAA | Thermofisher Scientific | 11140050 | |
| Needle (length: 120 mm; diameter: 0.80 mm) | B.Braun (color code: green) | 466 5643 | |
| Needle (length: 40 mm; diameter: 0.70 mm) | Henke Sass Wolf (color code: black) | 4710007040 | |
| Needle (length: 80 mm; diameter: 0.60 mm) | B.Braun (color code: blue) | 466 5635 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| PE/Cy7 anti-human CD49d antibody | Biolegend | 304314 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Peristaltic pump | Watson-Marlow | 205CA | |
| Poly-L-ornithine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Polycarbonate lids (HuMiX) | University of Arizona | HuMiX 1.0 / 2.0 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | |
| RLT Buffer (RNeasy Minikit) | Qiagen | 74104 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermofisher Scientific | 72400-021 | |
| SB431542, ALK inhibitor | Abcam | ab120163 | |
| Serum bottles | Glasgerätebau Ochs | 102091 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309110 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |
References
- Heintz-Buschart, A., Wilmes, P. Human gut microbiome: function matters. Trends in Microbiology. 26 (7), 563-574 (2018).
- Toor, D., et al. Dysbiosis disrupts gut immune homeostasis and promotes gastric diseases. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2432 (2019).
- Braak, H., de Vos, R. A. I., Bohl, J., Del Tredici, K. Gastric α-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neuroscience Letters. 396 (1), 67-72 (2006).
- Schmit, K. J., et al. Dietary fibre deprivation and bacterial curli exposure shift gut microbiome and exacerbate Parkinson's disease-like pathologies in an alpha-synuclein-overexpressing mouse. bioRxiv. , (2022).
- Fritz, J. V., Desai, M. S., Shah, P., Schneider, J. G., Wilmes, P. From meta-omics to causality: experimental models for human microbiome research. Microbiome. 1 (1), 14 (2013).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Wu, Q., et al. Organ-on-a-chip: Recent breakthroughs and future prospects. BioMedical Engineering Online. 19 (1), 9 (2020).
- May, S., Evans, S., Parry, L. Organoids, organs-on-chips and other systems, and microbiota. Emerging Topics in Life Sciences. 1 (4), 385-400 (2017).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535 (2016).
- Greenhalgh, K., et al. Integrated in vitro and in silico modeling delineates the molecular effects of a synbiotic regimen on colorectal-cancer-derived cells. Cell Reports. 27 (5), 1621-1632 (2019).
- Mao, J. H., et al. Genetic and metabolic links between the murine microbiome and memory. Microbiome. 8 (1), 53 (2020).
- Moysidou, C. M., Owens, R. M. Advances in modelling the human microbiome-gut-brain axis in vitro. Biochemical Society Transactions. 49 (1), 187-201 (2021).
- Kim, S., et al. Transneuronal propagation of pathologic α-synuclein from the gut to the brain models Parkinson's disease. Neuron. 103 (4), 627-641 (2019).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Marshall, J. J., Mason, J. O. Mouse vs man: Organoid models of brain development & disease. Brain Research. 1724, 146427 (2019).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Sedrani, C., Wilmes, P. Toward hypothesis-driven, personalized microbiome screening. Cell Reports Methods. 2 (1), 100139 (2022).
