Summary
neuroHuMiX är en avancerad gut-on-a-chip-modell för att studera interaktionerna mellan bakterie-, epitel- och neuronala celler under proximala och representativa samodlingsförhållanden. Denna modell gör det möjligt att reda ut de molekylära mekanismerna som ligger till grund för kommunikationen mellan tarmmikrobiomet och nervsystemet.
Abstract
Människokroppen koloniseras av minst lika många mikrobiella celler som den består av mänskliga celler, och de flesta av dessa mikroorganismer finns i tarmen. Även om samspelet mellan tarmmikrobiomet och värden har studerats i stor utsträckning, är det fortfarande i stort sett okänt hur tarmmikrobiomet interagerar med det enteriska nervsystemet. Hittills finns det ingen fysiologiskt representativ in vitro-modell för att studera interaktioner mellan tarmmikrobiom och nervsystem.
För att fylla denna lucka vidareutvecklade vi den human-mikrobiella överhörningen (HuMiX) gut-on-chip-modellen genom att introducera inducerade pluripotenta stamcellshärledda enteriska neuroner i enheten. Den resulterande modellen, "neuroHuMiX", möjliggör samodling av bakterie-, epitel- och neuronala celler över mikrofluidiska kanaler, separerade av semipermeabla membran. Trots att de olika celltyperna är separerade kan cellerna kommunicera med varandra genom lösliga faktorer, samtidigt som det ger möjlighet att studera varje celltyp för sig. Denna inställning möjliggör första insikter i hur tarmmikrobiomet påverkar de enteriska neuronala cellerna. Detta är ett viktigt första steg för att studera och förstå axeln mellan människans tarmmikrobiom och nervsystem.
Introduction
Den mänskliga tarmmikrobiomen spelar en avgörande roll för människors hälsa och sjukdomar. Det har studerats utförligt under de senaste ett och ett halvt decenniet, och dess potentiella roll i modulering av hälsa och sjukdom är nu fastställd1. En störning i mikrobiomet som leder till ett obalanserat mikrobiellt samhälle (dysbios) har antagits vara involverad i patogenesen av många kroniska sjukdomar, såsom fetma, inflammatorisk tarmsjukdom och kolorektal cancer, eller till och med neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom 2,3.
Även om människans tarmmikrobiom har förknippats med neurologiska tillstånd är det fortfarande oklart hur tarmmikrobiomet kommunicerar med och påverkar det enteriska nervsystemet. Eftersom det mänskliga enteriska nervsystemet inte är lättillgängligt för omedelbara studier har djurmodeller hittills använts i experiment4. Men med tanke på de uppenbara skillnaderna mellan djurmodeller och människor5 är utvecklingen av in vitro-modeller som efterliknar den mänskliga tarmen av omedelbart intresse. I detta sammanhang har det växande och framåtskridande området av humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) gjort det möjligt för oss att erhålla representativa enteriska neuroner (EN)6. iPSC-härledda EN möjliggör studier av det enteriska nervsystemet i in vitro-odlingsmodeller, såsom cellodlingsinsatser, organoider eller organs-on-a-chip 7,8.
HuMiX-modellen (human-microbial crosstalk) är en gut-on-a-chip-modell som efterliknar den mänskliga tarmen9. Den ursprungliga HuMiX-modellen (hädanefter kallad den första enheten) innehöll epitelceller (Caco-2) och bakterieceller10,11. Men för att studera kopplingen mellan tarmmikrobiom och nervsystem har iPSC-härledda ENs6 också introducerats i systemet (Figur 1). Den proximala samodlingen av neuronala, epitel- och bakterieceller möjliggör analys av de olika celltyperna individuellt och studier av interaktionerna mellan de olika celltyperna i en miljö som efterliknar den mänskliga tarmen.
Under de senaste åren har framsteg gjorts i utvecklingen av modeller för att studera organ på mer fysiologiskt representativa sätt genom att använda organs-on-a-chip (t.ex. gut-on-a-chip) modeller. Dessa modeller är mer representativa för den mänskliga tarmmiljön på grund av konstant tillförsel av näringsämnen och avlägsnande av avfall, samt realtidsövervakning av till exempel syrenivåer eller barriärintegritet 8,12. Dessa modeller gör det möjligt att studera tarmbakteriernas effekter på värdceller. Men för att kunna använda organs-on-a-chip för att studera sambanden mellan tarmmikrobiomet och nervsystemet måste neuronala celler integreras i sådana system. Syftet med att vidareutveckla HuMiX och etablera neuroHuMiX-systemet (hädanefter kallat enheten) var därför att utveckla en gut-on-a-chip-modell, som inkluderar enteriska neuronala celler i proximal samkultur med tarmepitelceller och bakterier.
Protocol
1. Cellodling och sortering
- Inducerade pluripotenta stamcellshärledda enteriska nervceller
OBS: Odla iPSCs 6 veckor innan en körning startar. Differentieringsprotokollet för EN har anpassats från Fattahi et al.6.- Odla iPSCs på en matrisgelbelagd 6-hålsplatta i 2 ml/brunn iPSC-odlingsmedium kompletterat med 1 % penicillin-streptomycin (P/S).
- Vid 80%-90% sammanflöde, passera cellerna, frö i en matrisgelbelagd platta med samma medium, inkubera vid 37 °C, 5% CO 2 och 90% relativ luftfuktighet (RH).
- För iPSC-härledning, efter två passager efter upptining, vid 80%-90% sammanflöde, sås cellerna i en matrisgelbelagd 6-brunnsplatta med en densitet av 100 000 celler/brunn. Inkubera i ovan beskrivna medier + ROCK-hämmare Y-27632 (1:2 000) i 24 timmar vid 37 °C.
- Efter 24 timmar byts supernatanten ut mot dag 0-medium, enligt tabell 1. Inkludera en kontrollbrunn som ska användas som negativ kontroll under cellsortering för härledningsprocessen. Håll kontrollen väl i mediesammansättningen dag 0 under hela härledningsperioden. Byt medium varannan dag från dag 2 till 10, enligt tabell 1.
- På dag 11 sorterar du cellerna för CD49d-positiva celler, som kommer att användas i följande steg i detta protokoll.
- Slå samman cellerna som ska sorteras baserat på CD49d-positiva celler, samt kontrollbrunnen. Centrifugera cellerna i 3 minuter vid 300 × g. Återsuspendera cellpelleten i 2 % bovint serumalbumin (BSA) + 1 % P/S i 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Dela varje cellparti (poolat och kontroll) i två delar: färga den ena fraktionen med antihumana CD49d-antikroppar och den andra fraktionen med en isotypkontrollantikropp.
- Grinda huvudcellpopulationen och grinda sedan enskilda celler, baserat på vilka cellerna som presenterar CD49d på sin yta kommer att väljas. Samla in dessa celler för nästa steg i differentieringen.
OBS: Vanligtvis är 30%-40% av de sorterade cellerna CD49d-positiva.
- Överför två till fyra miljoner av de sorterade cellerna till en 6-hålsplatta med en ultralåg fästplatta i N2B27-media (se tabell 2) + FGF2 + CHIR i 4 dagar för att tillåta sfäroidbildning.
- På dag 15, omplätera sfäroiderna på en poly L-ornitin/laminin/fibronektin (P/L/F)-belagd 6-hålsplatta i 2 ml/brunn N2B27-media med GDNF och askorbinsyra (AA). Byt ut mediet var 2-3:e dag.
OBS: Beläggningsförhållande: poly L-ornitin, 15 μg/ml; laminin, 2 μg/ml; fibronektin, 2 μg/ml i 1x PBS. - Efter 3 veckor, använd cellerna för inokulering i enheten.
- Caco-2
OBS: Tina Caco-2-celler minst 1 vecka före en körning.- Sådd av en T75-kolv med 1 × 106 Caco-2-celler i RPMI 1640 glutamintillskott + HEPES + 10 % fetalt bovint serum (FBS); inkubera vid 37 °C, 5 % CO2 och 90 % RH.
OBS: För dessa experiment, använd helst Caco-2 vid deras första eller andra passage efter upptining.
- Sådd av en T75-kolv med 1 × 106 Caco-2-celler i RPMI 1640 glutamintillskott + HEPES + 10 % fetalt bovint serum (FBS); inkubera vid 37 °C, 5 % CO2 och 90 % RH.
2. Förberedelse av HuMiX-körning
- Förberedelse och beläggning av polykarbonatlock
- Autoklavera ett par lock av polykarbonat (PC) (figur 2) tillsammans med fyra skruvar med hjälp av enhetens initiala instrumentcykel (se tabell 3 för detaljer).
- I ett biosäkerhetsskåp, sätt in fyra skruvar i varje hörn av det nedre PC-locket (se figur 3) och överför till en steril fyrkantig petriskål för en tvåstegsbeläggningsprocess.
- Den första dagen, tillsätt 2 ml 1,5 % poly L-ornitin i PBS (1x) i mitten av PC-locket. Inkubera över natten vid 37 °C, 5 % CO2 och 90 % RH.
- Nästa dag, ta bort lösningen och ersätt den med en lösning som innehåller 0,2 % laminin och 0,2 % fibronektin i PBS (1x) för att täcka ytan på den neuronala cellkammaren. Inkubera locket över natten vid 37 °C, 5 % CO 2 och 90 % RH.
- Efter inkubationen, behåll beläggningslösningen på PC-locket och stäng petriskålen med en förseglingsfilm. Förvara dem vid 4 °C fram till användning.
- Före användning, ta bort beläggningslösningen och lufttorka i ett biosäkerhetsskåp i 30 minuter tills beläggningen är helt torr.
- Packningsförberedelse och beläggning
OBS: Det här avsnittet beskriver hur man förbereder packningar genom att fästa semipermeabla membran på silikonpackningar. Efter ett första autoklaveringssteg beläggs packningarna med kollagen eller mucin för att möjliggöra vidhäftning av tarmepitelceller eller bakterier. Det mucinbelagda membranet efterliknar den slembarriär som finns i den mänskliga tarmen.- Fäst ett polykarbonatmembran med en porstorlek på 1 μm på kollagenpackningen och ett polykarbonatmembran med en porstorlek på 50 nm mellan de nedre och övre sandwichpackningarna. Autoklavera packningarna med de anslutna membranen med hjälp av den initiala instrumentcykeln (se tabell 3).
- För att belägga membranen, placera varje packning i en steril fyrkantig skål.
OBS: Beläggningen görs under sterila förhållanden i ett biosäkerhetsskåp.- För kollagenpackningen, tillsätt 3 ml kollagen (50 μg/ml) till membranet och inkubera i 3 timmar vid 37 °C.
OBS: Var försiktig så att du inte rör vid membranet med pipettspetsen när du tillsätter kollagenet för att undvika att skada membranet. - För mucinbeläggningen, placera sandwichpackningen med den övre packningssidan uppåt i en petriskål för att belägga membranets ovansida med 3 ml mucin (0,025 mg/ml). Inkubera packningarna vid 37 °C i 1 timme.
- För kollagenpackningen, tillsätt 3 ml kollagen (50 μg/ml) till membranet och inkubera i 3 timmar vid 37 °C.
- Efter inkubationstiden, aspirera kollagen- och mucinlösningarna från deras respektive packningar och lufttorka membranet i ett biosäkerhetsskåp i 30 minuter. Stäng disken, försegla med laboratorieförseglingsfilm och förvara packningarna vid 4 °C fram till användning.
- Montering av slangar
OBS: Det här avsnittet beskriver hur man monterar slangen för perfusion av enheten. Före montering, autoklavera alla delar och/eller köp de som är förpackade individuellt i en steril förpackning. Placera alla komponenter i ett biosäkerhetsskåp.- Använd tre slangar för varje anordning och för varje slangledning, en bit pumpslang, två stycken långa Marprene-slangar (20 cm), två stycken korta Marprene-slangar (8 cm), en 40 mm nål för utloppsflaskan, en 120 mm nål för 250 ml inflödesflaskorna eller 80 mm nål för mindre inflödesflaskor, tre han- och sju honkontakter för Luer till hulling, tre Luer-adaptrar och två trevägsventiler för avstängning.
- Montera slangledningar från vänster till höger med hjälp av de autoklaverade och steriliserade komponenterna som anges ovan (Figur 4).
OBS: Spraya varje komponent med 70 % etanol mellan varje anslutningssteg.
- Förberedelse av media
OBS: Det här avsnittet beskriver hur man förbereder mediet för de olika celltyperna i enheten, samt hur man överför mediet till serumflaskor på ett sterilt sätt.- Komplettera RPMI 1640 med 10% 0,22 μm filtrerad, värmeinaktiverad FBS. Komplettera N2B27-mediet på nytt med GDNF och AA.
- Överför mediet till serumflaskor under sterila förhållanden. Överför 200 ml RPMI 1640-media till 250 ml flaskor och 30 ml N2B27-media till 50 ml flaskor.
- Bered bakteriemedium (RPMI 1640 + 10 % FBS + 5 % De Man, Rogosa och Shapre odlingsmedium [MRS]) i ett senare skede, eftersom detta endast krävs under de sista 24 timmarna av experimentet.
- Stäng flaskorna med en septum, krymp dem av aluminium och autoklav.
- För att överföra mediet, ta bort aluminiumkrympningen med en lämplig avkapare (diameter = 20 mm). Ta bort septumet också. Häll försiktigt det förberedda mediet i serumflaskorna utan att röra flaskan.
- För att sterilisera, flamma flaskans öppning med en bärbar bunsenbrännare. Försegla flaskorna genom att spraya septum med 70 % etanol, tillsätt det i flaskan och stäng det med en aluminiumkrympning med en tätningspress.
- Placera de stängda flaskorna i inkubatorn vid 37 °C, 5 % CO2 i 24 timmar för att värma upp mediet till 37 °C, samt för att säkerställa att det inte finns några synliga tecken på kontaminering innan du använder mediaflaskor för enheten.
3. HuMiX start
- NeuroHuMiX-sammansättning
OBS: Det här avsnittet förklarar hur du monterar enheten. Kort sagt, klämsystemet steriliseras och dras åt igen, varefter det nedre PC-locket placeras på klämmans botten. Sedan staplas de belagda packningarna och de övre PC-locken på varandra, följt av den övre delen av klämman. Slutligen dras klämman åt för att komprimera packningarna och göra systemet läckagefritt och gastätt. Figur 4 visar de olika delarna som behövs för monteringen.- Autoklavera clamps och de två PC-locken (topp och botten) före montering.
- Dra åt skruvarna som används för att montera de övre och nedre delarna av clamp (Figur 4C,D). Öppna skruvarna före autoklaveringsprocessen och dra åt dem igen senare.
- Överför det belagda och torkade (steg 2.2.3) nedre PC-locket (Figur 4 A1) från den fyrkantiga petriskålen till toppen av klämbasen genom att hålla i de fyra skruvarna i hörnen på PC-locket.
OBS: Undvik att vidröra PC-locket för att minska risken för kontaminering. - Placera epitelkammarpackningen uppåt (dvs. med membranet ovanpå) på PC-locket med en steril pincett. Använd skruvarna för att rikta in packningen och PC-locket för att säkerställa att inlopps- och utloppsportarna i lockets hörn är i linje med öppningarna i packningen (Figur 3).
- Använd den sterila pincetten och placera smörgåspackningen ovanpå kollagenpackningen, med ovansidan uppåt.
- Placera det övre PC-locket ovanpå sandwichpackningen. För att minska risken för kontaminering, gör detta genom att endast röra vid lockets kanter (rör inte vid den övre eller nedre delen av locket). Se till att hullingarna på clamp lock är i linje med inlopps- och utloppsöppningen på membranenheten, och att skruvarna från det nedre PC-locket passar in i öppningen på det övre PC-locket.
- För att stänga enheten, placera clamp lock (den övre delen av clamp) ovanpå PC-locket. Se till att lockets öppningar sammanfaller med inlopps- och utloppshullingarna på det övre PC-locket. Stäng spärrarna. Håll den stängda enheten (Figur 5) under huven för att ansluta till de grundade slangledningarna (steg 3.2.6).
- Fyllning av slangledningar
OBS: Detta avsnitt beskriver hur man ansluter slangen till in- och utflödesflaskorna, såväl som till pumpen, därefter fyller slangen med medium för att avlägsna eventuella restprodukter som används under rengöring och sterilisering, och säkerställer att inga bubblor finns i slangen.- Fyllning av slangledningarna utförs i biosäkerhetsskåpet. Sätt in luftningsnålar med filter i septumet på varje inflödes- och utflödesflaska. Använd en ren, steril pincett och sätt in 120 mm nålarna i 250 ml serumflaskorna. Stick in 80 mm nålarna i 50 ml serumflaskorna.
- Sätt in 40 mm-nålarna, i slutet av varje slang, i en serumflaska med utflöde. Per enhet finns det två utloppsflaskor för de tre slangledningarna. De 40 mm långa nålarna i epitel- och neuronalslangarna är anslutna till samma utflödesflaska för att kassera medium. Bakterieslangen går till den andra utloppsflaskan.
- Sätt in pumpslangledningarna i pumpkassetterna. Se till att alla trevägskranar på slangledningarna är öppna.
- Ställ in den peristaltiska pumpen i början på att rikta media från inflödet till utloppsflaskan med en hastighet av 5 rpm (se tabell 4).
OBS: Under fyllning av slangledningen kan hastigheten ökas upp till 10 rpm för att påskynda processen. - Starta pumpen genom att trycka på startknappen och se till att pumpningsriktningen är medurs. När mediet faller ner i utflödesflaskorna, se till att det inte finns några läckor och att inga luftbubblor finns kvar i slangledningarna och anslutningspunkterna. Ta bort eventuella kvarvarande bubblor genom att knacka på slangen och anslutningarna eller genom att öka pumphastigheten.
- När alla rörledningar faller ner i utflödesflaskorna, ställ in flödeshastigheten på 2 rpm för anslutning av den första enheten.
- Priming av enheten
OBS: Det här avsnittet beskriver hur man primar enheten med cellodlingsmedium för att säkerställa att alla kammare är fyllda och förbelagda med medium, så att inga bubblor finns kvar i systemet och cellerna lätt kan fästa under inokuleringen.- Priming av enheten utförs i biosäkerhetsskåpet under sterila förhållanden. För att ansluta enheten, börja med att ansluta neuronallinjen, enhetens nedre kammare.
- För att ansluta en ledning, stäng trevägsavstängningsventilerna (Figur 5C), börja först med utflödessidan, där den korta slangen kopplas bort från Luer-honkontakten och ansluts till utloppsporten från enheten, genom att trycka slangen över hullingen. För att säkerställa korrekt anslutning och minska risken för läckage och/eller kontaminering, se till att slangen är i kontakt med locket genom att trycka den hela vägen ner över kontakten. Anslut inloppsslangen på samma sätt. När en ledning är helt ansluten till enheten (inflöde och utflöde), öppna trevägskranarna.
- Upprepa föregående steg med epitellinjen och sedan med bakterielinjen. Håll pumpen vid en flödeshastighet på 2 rpm. Öka pumphastigheten till 2.5 rpm, men inte högre, för att undvika läckage på grund av tryckuppbyggnad. Låt pumpen fylla kamrarna i enheten.
- Övervaka utflödesserumflaskorna hela tiden. Om luftbubblor fastnar i kamrarna, ledningarna eller anslutningen, kommer en slangledning med en luftbubbla inuti inte längre att falla i utflödeskammaren. För att bli av med luftbubblor, låt först enheterna gå i några minuter. Om detta inte löser problemet, stäng en av de andra raderna som faller under en kort tid genom att stänga trevägskranen för utflödet.
- När alla kamrar i enheten är helt fyllda - alla kammare är fyllda med cellodlingsmedium och inga bubblor finns kvar i enheten - sänk pumphastigheten till 0.5 rpm. Enheten är nu redo för cellinokulering.
4. Cellberedning och inokulering
OBS: Det här avsnittet beskriver hur man förbereder de olika celltyperna som behövs för att inokulera enheten, samt hur man inokulerar dem i enheten på ett sterilt sätt och utan att införa luftbubblor. Dessutom beskriver den hur man utför medium förfriskning för neuronala celler och hur man förbereder medium för bakteriekulturen i enheten.
- Epitelceller
- Lossa Caco-2-cellerna från kolven med trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA), återsuspendera i RPMI 1640 + 10 % FBS och räkna i en Neubauer-cellräknare med hjälp av trypanblå uteslutningsanalys. Centrifugera Caco-2-cellsuspensionen (3 min, 300 × g) och kassera supernatanten för att avlägsna kvarvarande trypsin-EDTA. Återsuspendera Caco-2-cellerna i RMPI 1640 + 10 % FBS för att erhålla en suspension på 350 000 celler/ml. För varje enhet behövs en volym på 1,5 ml.
- Överför 1,5 ml av Caco-2-cellsuspensionen till en steril 2 ml spruta och avlägsna eventuell luft eller bubblor som finns kvar i sprutan.
- Stäng trevägsventilerna på slangen till bakterie- och neuronalkamrarna. Koppla bort slangen till bakterie- och neuronalkamrarna från pumpen genom att ta bort kassetterna med respektive slang från rotorn.
- Öppna locket på trevägskranventilen på inloppsslangen som leder till epitelkammaren och vrid trevägskranventilen för att omdirigera medieflödet från enheten till den "öppna kontakten" (Figur 5C). Låt mediet flöda tills en droppe medium dyker upp i den öppna änden av trevägsavstängningsventilen.
- Sätt in sprutan som innehåller epitelcellerna i den "öppna kopplingen" med dropp-dropp-anslutningsmetoden så att sprutan kan föras in i anslutningen utan att luftbubblor tillförs. Vrid ventilen på trevägskranen för att stoppa flödet av mediet från inloppsflaskan (via pumpen) och för att tillåta flöde från den anslutna sprutan till den ursprungliga enheten. Koppla bort epitelkanalen från pumpen.
- Tryck långsamt på sprutan för att inokulera epitelkammaren med cellsuspensionen. Se till att ungefär en droppe per 3 s faller ner i utloppsflaskan.
- Tillsätt 1,5 ml av cellsuspensionen och stäng sedan ventilen på utflödeskranen. Lossa sprutan och stäng den öppna änden av trevägskranen med locket. Håll kammaren stängd i minst 2 timmar. Under tiden inokulerar du neuronala celler.
- Neuronala celler
- Lossa neuronala celler från brunnen genom att återsuspendera cellerna i mediet från respektive brunnar med hjälp av en pipett. Inokulera varje enhet med helt sammanflytande celler från en brunn (9,6 cm2) på en 6-hålsplatta.
- Återsuspendera cellpelleten i motsvarande N2B27-medium (1,5 ml media per enhet) + 1 μl fibronektin/ml cellsuspension. Överför 1,5 ml av den återsuspenderade cellsuspensionen till en 2 ml spruta och avlägsna eventuella luftbubblor som finns kvar i sprutan. Placera den fyllda sprutan i ett sterilt 50 ml koniskt rör och överför till biosäkerhetsskåpet som innehåller den primade HuMiX-enheten.
- Följ samma inokuleringsprocess som beskrivits tidigare för inokuleringen av epitelkammaren, med undantag för byte av slanglinje. Koppla här bort bakterie- och epitelrörledningarna från pumpen.
- Efter neuronal cellinokulering, stäng alla trevägskranar på rörledningarna och koppla bort från pumpen. Placera enheten i inkubatorn vid 37 °C och 5 % CO2 . Håll alla kanaler stängda i 2 timmar så att cellerna kan fästa.
- Efter 2 timmar, anslut bakterie- och epitelkanalerna till pumpen och öppna in- och utflödet trevägskranar på båda ledningarna. Håll neuronalkammaren stängd under de kommande 14 dagarna av den första enhetskörningen, förutom under mediebyte.
- Under 14 dagars körning, byt medium i neuronalkammaren var 3-4: e dag. För medium uppfräschning, förbered 3 ml färskt N2B27-medium per enhet och överför till en steril 20 ml serumflaska. Stäng serumflaskan med medium med en steril septum och en krympförsegling av aluminium.
- Sätt in en luftning och en 80 mm nål i septum på den nya flaskan. Byt ut den gamla mediaflaskan mot den nya i inkubatorn genom att koppla bort hanluern från nålen på den gamla flaskan till nålen på den nya flaskan.
- Anslut kassetten med pumpslangen i neuronalkammaren till pumpen och öppna trevägskranarna. Låt mediet flöda med 0.5 rpm i 2 timmar innan du stänger trevägskranarna på neuronalslangen och kopplar bort från pumpen, tills nästa mediebyte.
5. Bakterieodling och inokulering
OBS: I denna studie, på dag 12, återupplivades en flytande kultur av Limosilactobacillus reuteri stam F275 från ett glycerollager. Beroende på behov eller studiedesign kan andra bakteriearter användas.
- Förbered tre rör med 5 ml MRS-buljong – ett sterilt kontrollrör och två för inokulering av L. reuteri. Skrapa av toppen av glycerolbuljongen med en inokuleringsslinga och överför den till ett rör. Upprepa med ett andra inokuleringsrör. Inkubera rören vid 37 °C, 170 rpm över natten.
OBS: Låt inte glycerollagret tina. - Förbered färskt medium för de första enheterna genom att blanda Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 + 10 % FBS med 5 % MRS-buljong. Förbered 25 ml per enhet och överför till 100 ml serumflaskor under sterila förhållanden. Stäng flaskorna med en steril septum och aluminiumkrympning. Placera flaskorna i inkubatorn vid 37 °C, 5 % CO2 över natten.
- Innan du ansluter flaskorna till bakterieslangen, tillsätt en luftningsnål och en 80 mm nål till varje flaska RPMI 1640/MRS-media.
- Förbered nya rör, var och en med 3 ml RPMI 1640 + 10 % FBS + 5 % MRS-buljong. Förbered minst två rör, en kontroll och ett rör per enhet. Inokulera 15 μl av L. reuteri-odlingen över natten (optisk densitet [OD] > 2) i två av de nypreparerade rören.
- Inkubera rören i 1 timme vid 37 °C, 170 rpm, varefter en OD på 0,05-0,10 uppnås, motsvarande ~1 × 107 kolonibildande enheter (CFU)/ml. Överför 1,5 ml till en 2 ml spruta (en per enhet). Använd resten av bakteriesuspensionen för CFU-plätering och levande/död färgning.
- För bakteriell inokulering av enheten, följ samma procedur som nämns i steg 4.1, förutom att här är neuronala och epitelrörslinjer stängda.
- Efter inokuleringen, stäng även bakterieslangen genom att stänga ventilerna och koppla bort från pumpen i 30 minuter. Anslut epitel- och bakterierörsledningarna och öppna igen. Låt enheterna gå i ytterligare 24 timmar vid 37 °C och 0.5 rpm.
6. HuMiX öppning och provtagning
OBS: Avsnittet nedan beskriver sampling av olika celltyper. Till exempel används neuronala cellpellets för RNA-extraktion och efterföljande kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR), bakteriepellets för DNA-extraktion och 16S rRNA-gensekvensering och supernatanter för enzymkopplade immunadsorberande analyser (ELISA) och andra analyser (t.ex. laktatanalys).
- På dag 14, öppningsdagen, stänger du alla trevägskranar, kopplar bort slangarna från pumpen och tar ut inkubatorns enhet till labbbänken.
OBS: När du flyttar enheten, se till att hålla den faktiska enheten horisontell. - Ta bort slangledningarna som är anslutna till enheten innan du långsamt öppnar clamp och ta bort clamp lock. Ta försiktigt bort det övre PC-locket, samla upp mediet i ett 1.5 ml mikrocentrifugrör och lägg det på is.
- Ta försiktigt bort smörgåspackningen samtidigt som du samlar upp mediet från epitelkammaren; Var försiktig så att du inte vidrör celskiktet. Placera smörgåspackningen i en fyrkantig petriskål och tillsätt steril 0,9 % NaCl-lösning i H2O i bakteriekammaren tills kammaren är helt täckt (cirka 1 ml).
- Ta långsamt bort kollagenpackningen samtidigt som du samlar upp mediet från neuronalkammaren och överför det till ett mikrocentrifugrör. Lägg alla mediarör på is. Placera kollagenpackningen i en fyrkantig skål och tillsätt försiktigt några milliliter 1x PBS till Caco-2-skiktet tills celskiktet är helt täckt.
- Placera det nedre PC-locket i en fyrkantig petriskål och tillsätt försiktigt cirka 2 ml 1x PBS ovanpå neuronala celler, så att de inte torkar ut under provtagningsprocessen.
- Centrifugera bakteriemedieröret vid 5 000 × g i 5 minuter vid 4 °C. Centrifugera epitel- och neuronalmedierören vid 300 × g i 5 minuter vid 4 °C. Efter centrifugering, överför supernatanten i varje rör till ett nytt mikrocentrifugrör och placera det omedelbart på torris.
- Epitelceller
- Ta försiktigt bort PBS från packningen och samla upp i ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt 2 ml trypsin till cellerna och inkubera packningen i 5 minuter vid 37 °C, 5 % CO2 . Tillsätt 2 ml RPMI 1640 till packningen efter inkubation, återsuspendera cellerna och samla upp i ett annat 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera båda rören i 5 minuter vid 300 × g. Kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten från PBS-tvätten i 300 μL PBS och cellpelleten i 1 ml PBS.
- Överför 50 μl av varje rör till ett 0,5 ml mikrocentrifugrör för den automatiska cellräknaren och trypan blue exclusion testcellantal. Överför pelleten med återsuspenderad cell (1 ml) till ett rör på 1,5 ml och centrifugera vid 300 × g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 250 μl lyseringsbuffert + 1 % beta-merkaptoetanol och placera röret på torris.
- Neuronala celler
- Ta den fyrkantiga petriskålen, med det nedre, genomskinliga PC-locket med neuronala celler från föregående steg (6.5) till ett inverterat faskontrastmikroskop.
OBS: När du flyttar PC-locket med PBS ovanpå, var mycket försiktig, eftersom det neuronala nätverket lossnar mycket lätt. - Utför en sista kvalitetskontroll före inokulering genom att observera neuronalcellernas morfologi och celltäthet med hjälp av ljusfältsmikroskopi. Kontrollera att cellerna har migrerat från sfäroiderna och att ett neuronalt nätverk har bildats. Det neuronala nätverket bör vara cirka 90 % konfluentt. För mer information, se Fattahi et al.6.
- Vid bänken återsuspenderar du cellerna i PBS och samlar upp dem i ett 1,5 ml rör. Centrifugera röret vid 300 × g i 3 min. Kassera supernatanten, återsuspendera cellpelleten i 250 μl lyseringsbuffert + 1 % beta-merkaptoetanol och lägg den på torris.
OBS: Immunofluorescens (IF) färgning kan göras på neuronala celler på PC-locket. Om IF-färgning är att föredra för att inte förstöra det neuronala nätverket, bör cellerna fixeras på PC-locket med 4 % paraformaldehyd (PFA), vilket hindrar återanvändning av PC-locket i framtida experiment.
- Ta den fyrkantiga petriskålen, med det nedre, genomskinliga PC-locket med neuronala celler från föregående steg (6.5) till ett inverterat faskontrastmikroskop.
- Bakteriella celler
- Återsuspendera bakteriecellerna som är fästa vid membranet i 0,9 % NaCl-lösning. Om cellerna sitter fast ordentligt, använd försiktigt en cellskrapa för att lossa bakteriecellerna från membranet.
OBS: Att använda en skrapa kan skada cellerna, vilket ökar sannolikheten för att se fler döda celler. - Samla upp cellsuspensionen i ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt pelleten som blir över från det tidigare uppsamlade mediet till det 15 ml koniska röret. Centrifugera vid 5 000 × g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml 0,9 % NaCl-lösning.
- Dela upp denna volym i tre delar: en för frysning av en bakteriepellet för nukleinsyraextraktion (650 μL), en för CFU-plätering (50 μL) på MRS-plattor och en för levande/död färgning (300 μL). För beredning av pelleten för nukleinsyraextraktion, överför cellsuspensionen till ett mikrocentrifugrör, centrifugera vid 5 000 × g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten. Placera cellpelleten på torris.
- I slutet av provtagningen överförs alla rör på torris till en frys på -80 °C för lagring för senare nedströmsanalyser.
OBS: Supernatanten kan vidare användas för analys av gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS). Dessutom kan det kollagenbelagda membranet delas upp i olika delar för olika analyser – en halva för att användas för IF-ockludinfärgning, en annan del för RNA-extraktion för vidare genuttrycksanalys och en annan del för cellräkning.
- Återsuspendera bakteriecellerna som är fästa vid membranet i 0,9 % NaCl-lösning. Om cellerna sitter fast ordentligt, använd försiktigt en cellskrapa för att lossa bakteriecellerna från membranet.
Representative Results
I neuroHuMiX samodlade vi tre olika celltyper tillsammans - bakterie-, epitel- och neuronala celler (Figur 1). För att säkerställa att alla celler var livskraftiga utförde vi olika analyser på de olika celltyperna. Till exempel utförde vi CFU-räkningar på bakterieceller, cellantal och cellviabilitetsanalyser på epitelcellerna, medan neuronala celler bedömdes via mikroskopiska analyser.
Figur 1: Schematisk representation av neuroHuMiX och dess experimentella uppställning . (A) De tre kamrarna hålls mellan två PC-lock för att hålla dem stängda. Varje kammare är fylld med ett specifikt medium för cellerna som odlas inuti. De olika kamrarna är åtskilda av semipermeabla membran som möjliggör cellkommunikation via lösliga faktorer som passerar membranen. (B) Representation av neuroHuMiX-inställningen. Varje kammare är ansluten till olika mediaflaskor. För bakteriekammaren, under de första 12,5 dagarna, är kammaren ansluten till RPMI + 10 % FBS, innan den under de senaste 36 timmarna ändras till RPMI + 10 % FBS + 5 % MRS. Förkortningar: PC = polykarbonat; P/L/F = poly L-ornitin/laminin/fibronektin; RPMI = Roswell Park Memorial Institute cellodlingsmedium; MRS = De Man, Rogosa och Shapre kulturmedium. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För att avgöra om cellerna var ordentligt fastsatta, bedömde vi bildandet av ett celskikt på det kollagenbelagda membranet när vi öppnade enheterna (figur 6A). För att säkerställa att cellerna i enheten var livskraftiga utfördes en automatisk cellräknare (figur 6B) och en testcellräkning med trypanblå uteslutning (figur 6C). Analyserna utfördes på Caco-2-celler från tre olika HuMiX-uppställningar: (i) Caco-2 i odling med ENs, (ii) Caco-2 i odling med L. reuteri, och (iii) enheten som involverar samodling av alla tre celltyperna. Statistiska tester med hjälp av en envägs ANOVA gav inga signifikanta skillnader mellan celltyperna, vilket tyder på att Caco-2-cellerna förblev livskraftiga i alla dessa initiala enhetsuppsättningar och förhållanden som testades i denna studie. Detta understryker det faktum att den bakterietäthet som uppnås under samodlingen av L. reuteri och de två humana celltyperna inte har cytotoxiska effekter på de mänskliga cellerna.
Figur 6: Bedömning av Caco-2-celler på det kollagenbelagda membranet. (A) Skikt av Caco-2-celler på det kollagenbelagda membranet efter öppning. Pilen indikerar det kollagenbelagda membranet, som är omgivet av en streckad cirkel. Caco-2-cellerna växte på spiralformen på membranet. Cellviabilitet för Caco-2-celler efter 14 dagar i HuMiX. Cellräkningar erhölls med hjälp av (B) den automatiserade cellräknaren och (C) trypanblå exklusionstestcelltalet. Caco-2-cellantalet bestämdes från olika odlingsuppställningar i den initiala enheten: samodling med enteriska neuroner (EN) (svart), samodling med L. reuteri (orange) och i enheten (EN och L. reuteri) (blå). En envägs ANOVA utfördes, som visade att det inte finns någon signifikant skillnad mellan de olika odlingsuppställningarna (enkelriktad ANOVA, p = 0,1234 [ns]; felstaplar indikerar standardfel). Klicka här för att se en större version av denna figur.
För att kunna odla L. reuteri med däggdjursceller optimerade och anpassade vi först odlingsmediet för användning i enheten. Vi fann att en 5% blandning av MRS i RPMI 1640 (kompletterat med 10% FBS) var optimalt lämpad för tillväxt av L. reuteri, samtidigt som den inte var cytotoxisk för de däggdjursceller som användes i dessa analyser. Därefter utfördes en CFU-räkning för att bedöma tillväxten av L. reuteri när den odlades i enheten i 24 timmar. CFU-antalet bedömdes för två olika initiala enhetskonfigurationer (figur 7) - L. reuteri samodlad med Caco-2 och L. reuteri i enheten. I båda uppställningarna skilde sig CFU-antalet signifikant från HuMiX-inokulet och de skördade cellerna (envägs ANOVA, p = 0,0002), vilket tyder på tillväxt av bakteriecellerna inuti den ursprungliga enheten.
Figur 7: Limosilactobacillus reuteri CFU-räkning i inokulum (utspätt 1:100 000) och efter 24 timmar i HuMiX. Två olika uppställningar: Caco-2-celler i samodling med L. reuteri och enheten. En envägs ANOVA visar en signifikant skillnad (p = 0,0002 [***]) mellan inokulet och de skördade cellerna, vilket innebär att bakterierna växer inuti HuMiX. Felstaplar anger standardfelet. Förkortningar: CB. HX = Caco-2-bakterier HuMiX; nHX = neuroHuMiX. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För att bedöma om odling av EN i enheten skulle förändra cellernas fenotyp, observerades den grova morfologin hos EN med hjälp av ett inverterat faskontrastmikroskop. Under detta steg bedömdes både sammanflödet och EN-morfologin. Etableringen av ett konfluentt neuronalt nätverk indikerade att cellerna hade fäst väl på den belagda enhetens PC-lock. Viktigt är att detta belyser uppfattningen att de växte i samkultur med Caco-2 och L. reuteri. Gränsen mellan det konfluenta neuronala nätverket och den packningsavgränsade spiralen var tydligt uppenbar (Figur 8).
Figur 8: Enteriska neuroner efter 14 dagars odling i enheten. På vänster sida av bilden har neuronerna vuxit till ett sammanflytande lager på spiralen. Kanten, mellan neuronalskiktet och utrymmet utan celler, är spiralens kant; förstorad 10x, skalstapel = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Lock som används i enheten. Bilderna visar de övre (vänster) och nedre (höger) PC-locken. Varje sida av PC-locket är 6,4 cm. Förkortning: PC = polykarbonat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Epitelkammarpackning på nedre PC-locket. Topp view av epitelkammarpackningen placerad på det nedre PC-locket (vänster) och botten view (höger) som visar inriktningen av epitelkammarpackningen med inloppen och utloppen på det nedre PC-locket. Varje sida av packningarna, liksom PC-locket, mäter 6,4 cm. Förkortning: PC = polykarbonat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Montering av enheten. (A) Olika delar för montering av HuMiX: (1) nedre PC-lock; (2) packning med kollagenbelagt mikroporöst membran, som placeras ovanpå (1); (3) Sandwichpackning med ett mucinbelagt nanoporöst membran emellan och placerat ovanpå (2). (4) övre PC-lock placerat ovanpå (3). Varje sida av packningarna och PC-locken mäter 6,4 cm. (B) Alla delar från (A) placeras tillsammans. (C,D) Monterad enhetstopp (vänster) och sida (höger) view. B placeras i spännsystemet för att stänga systemet. (C) Varje sida av toppklämman mäter 8 cm. Förkortning: PC = polykarbonat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Delar som behövs för slangledning och monterad slangledning för en kammare. (A) Olika delar för att bygga en slangledning: a. Pumpslangledning; b) Trevägs avstängningskran. c. 40 mm nål; d) 80 mm nål; e) 120 mm nål; f. lång slang (20 cm); g. Kort slangledning (8 cm); h. hane Luer; i. honluer; j. adapter. (B) Monterad slangledning för bakterie- eller epitelkammaren. För neuronalkammaren skulle 120 mm-nålen behöva bytas ut mot en 80 mm-nål. (C) Trevägskranventil vriden för att omdirigera medieflödet från anordningen till den "öppna anslutningen" och för att stänga kammaren. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Dag | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| Mediernas sammansättning | 100% E6 | 100% E6 | 75% E6 | 50% E6 | 25% E6 | 100% N2 |
| + LDN | + LDN | 25% N2 | 50 % N2 | 75% N2 | + LDN | |
| + SB | + SB | + LDN | + LDN | + LDN | + SB | |
| + CHIR | + SB | + SB | + SB | + CHIR | ||
| + CHIR | + CHIR | + CHIR | + RA | |||
| + RA | + RA | |||||
| Molekyl | [koncentration] | |||||
| LDN (LDN) | 100 nM | |||||
| SB | 10 μM | |||||
| CHIR CHIR | 3 μM | |||||
| Retinsyra (RA) | 1 μM |
Tabell 1: Mediesammansättning.
| Media | Beståndsdelar (koncentrationer listade i materialförteckningen) | Volym (ml) |
| N2-media (50 ml) | DMEM-F12 | 48 |
| N2 Tillägg | 0.5 | |
| L-glutamin | 0.5 | |
| Penicillin/Streptomycin | 0.5 | |
| NEAA | 0.5 | |
| N2B27/ENS Media (50 ml) | Neurobasal | 48 |
| N2 Tillägg | 0.5 | |
| L-glutamin | 0.5 | |
| Penicillin/Streptomycin | 0.5 | |
| B27-A | 0.5 |
Tabell 2: Medierecept.
| Steriliseringstemperatur (°C) | 116 |
| Steriliseringstid (min) | 20 |
| Torktid (min) | 10 |
| Pulser | 3 |
| Sluttemperatur (°C) | 99 |
Tabell 3: HuMiX autoklavkörning.
| Varv per minut (rpm) | Genomsnittligt flöde (μL/min) |
| 0.5 | 13 |
| 2 | 79 |
| 5 | 180 |
Tabell 4: Flödeshastigheter för den peristaltiska pumpen.
Discussion
Det är nu fastställt att människans tarmmikrobiom påverkar värdens hälsa och sjukdom. Trots den kunskap som tyder på vikten av vårt mikrobiom, särskilt vid neurologiska sjukdomar som Alzheimers eller Parkinsons sjukdom 3,13, är det fortfarande i stort sett okänt hur tarmmikrobiomet interagerar med det enteriska nervsystemet och därefter med hjärnan.
En representativ modell för att studera samspelet mellan tarmmikrobiomet och nervsystemet har hittills inte varit tillgänglig. Studier av tarm-hjärna-axeln har traditionellt utförts med hjälp av murina modeller13. Möss och människor delar 85 % av sina genomsekvenser14, men det finns betydande skillnader att ta hänsyn till när man jämför möss med människor. När det gäller tarmen är det viktigt att notera att möss jämfört med människor uteslutande är växtätare. Som ett resultat av detta skiljer sig deras mag-tarmkanal åt i längd och egenskaper, såsom "magtömning"14. Murina hjärnor uppvisar också viktiga skillnader, där den övergripande strukturen mellan möss och människor är olika15. Det är viktigt att människor har längre cellcykeltider för neurala stamceller15. Följaktligen är det viktigt att utveckla representativa modeller som inkluderar celler från människa, inklusivetarm- och neuronala celler. I detta sammanhang minskar utvecklingen av mer reproducerbar forskning via in vitro-modeller behovet av att använda djurmodeller och förbättrar reproducerbarheten.
neuroHuMiX är en avancerad version av den tidigare HuMiX modell9. HuMiX är en gut-on-a-chip-modell som möjliggör proximala och representativa samkulturer av epitel- och bakterieceller. Cell-cell-kommunikation är möjlig genom proximal samodling och diffusion av utsöndrade faktorer och metaboliter via semipermeabla membran. Men för att utöka användbarheten av den första enheten för att studera den mänskliga tarmmiljön krävs införandet av ytterligare en celltyp. För att ta itu med detta möjliggör neuroHuMiX, som utvecklats med introduktionen av iPSC-härledda ENs, en proximal samodling av bakterier, tarmepitelceller och ENs. Den resulterande in vitro-modellen gör det möjligt för oss att ta itu med frågor om det mänskliga tarmmikrobiomet i förhållande till det mänskliga nervsystemet. Samodling av olika celltyper, särskilt samkulturer av däggdjursceller och bakterier, har flera utmaningar, inklusive förlust av livskraft, dålig vidhäftning och total förlust i sammanflöde16. Här har vi visat att vi inom denna enhet kan samodla tre olika celltyper inom samma system samtidigt som vi håller cellviabiliteten hög.
Ett kritiskt steg i protokollet är att säkerställa sammanflöde av neuronala celler - 80%-90% cellsammanflöde och livskraft - innan inokulering i enheten. Eftersom det inte är möjligt att bedöma celltillväxten under körningen är det av yttersta vikt att se till att cellerna är sammanflytande och växer bra innan de introduceras i modellen. Även om detta kan vara en begränsande faktor, är den övergripande livskraften och sammanflödet som observerats i enheten i allmänhet hög.
Enheten är ansluten via slangledningar till en peristaltisk pump. Varje cellkammare har sin specifika slangledning. Slangen består av en pumpslang som gör det möjligt att använda en peristaltisk pump för perfusion av medium, samt slangar som ansluter pumpslangen till enheten och slangar som ansluter enheten till utlopps-/avfallsflaskorna. Provtagningsportar ingår före och efter enheten för att möjliggöra inokulering och provtagning av utflödesmedium. Varje kammare kan anslutas till ett annat medium, vilket ger de bästa odlingsförhållandena för varje enskild celltyp. Varje kammare kan öppnas eller stängas beroende på de specifika behoven av medelhög tillförsel. I enheten förblir neuronalkammaren stängd under större delen av experimentet, medan bakterie- och epitelkamrarna är öppna hela tiden, vilket innebär att de får färskt medium under hela experimentkörningen. För att säkerställa att mediet flödar utan avbrott är det avgörande att det inte finns någon luft kvar i slangarna, kopplingarna eller i enheten. Därför är det viktigt att först låta enheterna gå i några minuter vid primingsteget. Detta löser ofta problemet. Om inte, kan en av de andra ledningarna som faller stängas under en kort tid genom att stänga utflödets trevägskran. Detta omdirigerar mediet till ledningen med luftbubblan, vilket löser problemet genom att trycka bubblan utåt genom slangen.
För alla cellodlingsexperiment är mediet en nyckelkomponent, där varje celltyp har sitt respektive medium. I en samodling måste mediet vara kompatibelt inte bara för den celltyp som växer i det, utan också för de andra celltyperna inom samkulturen. Detta är inte annorlunda för enheten, vilket utgör en extra utmaning eftersom vi har tre olika fack med tre olika celltyper inuti - bakteriella, epitel- och neuronala celler. Vi har dock visat att genom att modifiera de bakteriella medierna - med tillsats av 5 % MRS till RPMI 1640 med 10 % FBS – kan alla celltyper, särskilt bakterie- och epitelceller, framgångsrikt samodlas inom systemet. I enheten odlas dock olika celltyper tillsammans i närheten och är därför inte i direkt kontakt med varandra. Även om detta inte är helt representativt för den direkta kontakten mellan celler i den mänskliga tarmen, och därför en begränsning, är det proximala och representativa samodlingsbetingelsen en styrka för nedströmsanalyser. Lösliga faktorer utbyter mellan de olika kamrarna och celltyperna; Därför interagerar cellerna fortfarande med varandra. Det faktum att celltyperna kan skördas och analyseras separat gör det dessutom möjligt för oss att studera effekten av ett friskt och/eller sjukt mikrobiom på olika celltyper (inklusive neuronala celler) och därigenom bestämma/hämta celltypsspecifika avläsningar. En annan begränsning är att cellernas morfologi inte kan följas upp under experimentkörningen, eftersom enheten endast kan öppnas och cellerna kontrolleras i slutet av varje experiment.
Så vitt vi vet är neuroHuMiX den första tarm-på-en-chip-modellen som inkluderar ENs. Detta är ett steg mot att belysa kommunikationen mellan tarmmikrobiotan och det enteriska nervsystemet. Det är en modell som gör det möjligt att undersöka samspelet mellan en bakterieart, ett epitelskikt och EN. Dess design gör det möjligt att studera utbytet av lösliga faktorer som utsöndras av de olika celltyperna och deras effekt på varandra. Framöver skulle det vara viktigt att inte bara ha iPSC-härledda EN, utan även iPSC-härledda epitelceller inuti enheten, för att överföra enheten till en personlig modell. Viktigt är att denna personliga modell kan användas för att testa pre-, pro- och synbiotika 10,11 och potentiellt utveckla personlig screening och terapeutiska metoder17. Individanpassad neuroHuMiX kan så småningom kasta ljus över den "mörka materian" i det mänskliga tarmmikrobiomet och dess interaktioner med nervsystemet längs axeln tarmmikrobiom och nervsystemet, vilket banar väg för terapeutisk bedömning och interventioner.
Vi kan dra slutsatsen att det är avgörande att kunna ha en tarm-på-ett chip som inkluderar det enteriska neuronala systemet för att gå vidare i studien och förståelsen av interaktioner längs axeln tarmmikrobiom och nervsystemet. NeuroHuMiX gör det möjligt för oss att studera bakteriearters effekter på värdceller och ger oss en bra grund för att förbättra modellen ytterligare på ett ännu mer fysiologiskt representativt sätt.
Disclosures
P.W. deklarerar att han är listad som uppfinnare på patenten PCT/EP2013/056607, PCT/EP2016/062024, PCT/US2017/061602 och PCT/EP2019/081424. P.W., C.S. och L.G. uppger att de är upptagna som uppfinnare på patent LU503075.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Jared Sterneckert för att ha försett oss med cellerna från K7-linjen. Vi vill också tacka de mångåriga medarbetarna Dr. Frederic Zenhausern och Matthew W. Barret från University of Arizona för deras hjälp med de tekniska aspekterna. Vi vill också tacka Dr. Valentina Galata för hennes hjälp med att utforma den schematiska representationen av neuroHuMiX. Detta projekt har fått finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för EU:s forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 (bidragsavtal 863664). Figur 1 skapades delvis med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 10712 | |
| Aeration cannula (length: 1.10 diameter: 30 mm) | VWR (B.Braun) | BRAU4190050 | |
| Agar-agar | Merck Millipore | 1.01614.1000 | |
| Aluminium Crimp | Glasgerätebau Ochs | 102050 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bacterial Cell Membrane, pore size: 1 µm | VWR (Whatman) | 515-2084 | |
| Caco-2 cells | DSMZ | ACC169 | |
| Cell Counter & Analyzer CASY | OMNI Life Sceince | ||
| CHIR | Axon Mechem BV | CT99021 | |
| Collagen I, Rat Tail | Invitrogen | A1048301 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3471 | |
| Difco Lactobacilli MRS Broth | BD Biosciences | 288130 | |
| Discofix 3-way stopcock | B. Braun | BRAU40951111 | |
| DMEM/F12, no glutamine | Thermofisher Scientific | 21331020 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, D-PBS | Sigma Aldrich | 14190-169 | |
| Essential 6 Medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| Essential 8 Medium | Thermofisher Scientific | A1517001 | |
| Female Luer Lock to Barb Connector | Qosina | 11733 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Foetal Bovine Serum, FBS | Thermofisher Scientific | 10500-064 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Human Cell Membrane, pore size: 50 nm | Sigma Aldrich (GE Healthcare) | WHA111703 | |
| HuMiX Gasket Collagen | Auer Precision | 216891-003 | |
| HuMiX Gasket Sandwich Bottom | Auer Precision | 216891-002 | |
| HuMiX Gasket Sandwich Top | Auer Precision | 216891-001 | |
| iPSC | Max Planck Institute for Molecular Biomedicine | K7 line | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Laminin from Engelbreth-Holmswarm | Sigma Aldrich | L2020 | |
| LDN193189 | Sigma Aldrich | SML0559 | |
| Limosilactobacillus reuteri | ATCC | 23272 | |
| Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit | Thermofisher Scientific | L7012 | |
| Male Luer with Spin Lock to Barb | Qosina | 11735 | |
| Marprene tubing (0.8 mm x 1.6 mm) | Watson-Marlow | 902.0008.J16 | |
| Matrigel hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | |
| Mucin, from porcine stomach | Sigma Aldrich | T3924 | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEAA | Thermofisher Scientific | 11140050 | |
| Needle (length: 120 mm; diameter: 0.80 mm) | B.Braun (color code: green) | 466 5643 | |
| Needle (length: 40 mm; diameter: 0.70 mm) | Henke Sass Wolf (color code: black) | 4710007040 | |
| Needle (length: 80 mm; diameter: 0.60 mm) | B.Braun (color code: blue) | 466 5635 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| PE/Cy7 anti-human CD49d antibody | Biolegend | 304314 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Peristaltic pump | Watson-Marlow | 205CA | |
| Poly-L-ornithine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Polycarbonate lids (HuMiX) | University of Arizona | HuMiX 1.0 / 2.0 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | |
| RLT Buffer (RNeasy Minikit) | Qiagen | 74104 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermofisher Scientific | 72400-021 | |
| SB431542, ALK inhibitor | Abcam | ab120163 | |
| Serum bottles | Glasgerätebau Ochs | 102091 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309110 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |
References
- Heintz-Buschart, A., Wilmes, P. Human gut microbiome: function matters. Trends in Microbiology. 26 (7), 563-574 (2018).
- Toor, D., et al. Dysbiosis disrupts gut immune homeostasis and promotes gastric diseases. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2432 (2019).
- Braak, H., de Vos, R. A. I., Bohl, J., Del Tredici, K. Gastric α-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neuroscience Letters. 396 (1), 67-72 (2006).
- Schmit, K. J., et al. Dietary fibre deprivation and bacterial curli exposure shift gut microbiome and exacerbate Parkinson's disease-like pathologies in an alpha-synuclein-overexpressing mouse. bioRxiv. , (2022).
- Fritz, J. V., Desai, M. S., Shah, P., Schneider, J. G., Wilmes, P. From meta-omics to causality: experimental models for human microbiome research. Microbiome. 1 (1), 14 (2013).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Wu, Q., et al. Organ-on-a-chip: Recent breakthroughs and future prospects. BioMedical Engineering Online. 19 (1), 9 (2020).
- May, S., Evans, S., Parry, L. Organoids, organs-on-chips and other systems, and microbiota. Emerging Topics in Life Sciences. 1 (4), 385-400 (2017).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535 (2016).
- Greenhalgh, K., et al. Integrated in vitro and in silico modeling delineates the molecular effects of a synbiotic regimen on colorectal-cancer-derived cells. Cell Reports. 27 (5), 1621-1632 (2019).
- Mao, J. H., et al. Genetic and metabolic links between the murine microbiome and memory. Microbiome. 8 (1), 53 (2020).
- Moysidou, C. M., Owens, R. M. Advances in modelling the human microbiome-gut-brain axis in vitro. Biochemical Society Transactions. 49 (1), 187-201 (2021).
- Kim, S., et al. Transneuronal propagation of pathologic α-synuclein from the gut to the brain models Parkinson's disease. Neuron. 103 (4), 627-641 (2019).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Marshall, J. J., Mason, J. O. Mouse vs man: Organoid models of brain development & disease. Brain Research. 1724, 146427 (2019).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Sedrani, C., Wilmes, P. Toward hypothesis-driven, personalized microbiome screening. Cell Reports Methods. 2 (1), 100139 (2022).
