Summary
neuroHuMiX, proksimal ve temsili ko-kültür koşulları altında bakteriyel, epitelyal ve nöronal hücrelerin etkileşimlerini incelemek için gelişmiş bir çip üzerinde bağırsak modelidir. Bu model, bağırsak mikrobiyomu ile sinir sistemi arasındaki iletişimin altında yatan moleküler mekanizmaların çözülmesini sağlar.
Abstract
İnsan vücudu, insan hücrelerinden oluştuğu kadar az sayıda mikrobiyal hücre tarafından kolonize edilir ve bu mikroorganizmaların çoğu bağırsakta bulunur. Bağırsak mikrobiyomu ve konakçı arasındaki etkileşim kapsamlı bir şekilde çalışılmış olsa da, bağırsak mikrobiyomunun enterik sinir sistemi ile nasıl etkileşime girdiği büyük ölçüde bilinmemektedir. Bugüne kadar, bağırsak mikrobiyom-sinir sistemi etkileşimlerini incelemek için fizyolojik olarak temsili bir in vitro model mevcut değildir.
Bu boşluğu doldurmak için, cihaza indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı enterik nöronlar ekleyerek insan-mikrobiyal karışma (HuMiX) çip üzerinde bağırsak modelini daha da geliştirdik. Ortaya çıkan 'neuroHuMiX' modeli, yarı geçirgen zarlarla ayrılmış mikroakışkan kanallar boyunca bakteriyel, epitelyal ve nöronal hücrelerin birlikte kültürüne izin verir. Farklı hücre tiplerinin ayrılmasına rağmen, hücreler çözünür faktörler aracılığıyla birbirleriyle iletişim kurabilir ve aynı anda her hücre tipini ayrı ayrı inceleme fırsatı sunar. Bu kurulum, bağırsak mikrobiyomunun enterik nöronal hücreleri nasıl etkilediğine dair ilk içgörüleri sağlar. Bu, insan bağırsak mikrobiyom-sinir sistemi eksenini incelemek ve anlamak için kritik bir ilk adımdır.
Introduction
İnsan bağırsak mikrobiyomu, insan sağlığı ve hastalığında çok önemli bir rol oynar. Son on yılda ve bir buçuk yılda kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve sağlık ve hastalığın modüle edilmesindeki potansiyel rolü artık kurulmuştur1. Dengesiz bir mikrobiyal topluluğa (disbiyoz) yol açan mikrobiyomdaki bir bozulmanın, obezite, inflamatuar bağırsak hastalığı ve kolorektal kanser gibi birçok kronik bozukluğun ve hatta Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde rol oynadığı varsayılmıştır 2,3.
İnsan bağırsak mikrobiyomu nörolojik durumlarla ilişkilendirilmiş olsa da, bağırsak mikrobiyomunun enterik sinir sistemi ile nasıl iletişim kurduğu ve onu nasıl etkilediği hala belirsizdir. İnsan enterik sinir sistemi hemen çalışma için kolayca erişilebilir olmadığından, şimdiye kadar deneylerde hayvan modelleri kullanılmıştır4. Bununla birlikte, hayvan modelleri ve insanlar arasındaki belirgin farklılıklar göz önüne alındığında5, insan bağırsağını taklit eden in vitro modellerin geliştirilmesi hemen ilgi çekicidir. Bu bağlamda, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) gelişen ve ilerleyen alanı, temsili enterik nöronlar (EN'ler) elde etmemizi sağlamıştır6. iPSC'den türetilen EN'ler, hücre kültürü ekleri, organoidler veya çip üzerinde organlar gibi in vitro kültür modellerinde enterik sinir sisteminin incelenmesine izin verir 7,8.
İnsan-mikrobiyal karışma (HuMiX) modeli, insan bağırsağını taklit eden bir çip üzerinde bağırsak modelidir9. İlk HuMiX modeli (bundan böyle ilk cihaz olarak anılacaktır) epitel hücrelerini (Caco-2) ve bakteri hücrelerinibarındırıyordu 10,11. Bununla birlikte, bağırsak mikrobiyomu-sinir sistemi bağlantısını incelemek için, sisteme iPSC'den türetilmiş ENs6 da eklenmiştir (Şekil 1). Nöronal, epitelyal ve bakteriyel hücrelerin proksimal ko-kültürü, farklı hücre tiplerinin ayrı ayrı analiz edilmesine ve insan bağırsağını taklit eden bir ortamda farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimlerin incelenmesine olanak tanır.
Son yıllarda, çip üzerinde organlar (örneğin, çip üzerinde bağırsak) modelleri kullanılarak organları fizyolojik olarak daha temsili yollarla incelemek için modellerin geliştirilmesinde ilerlemeler kaydedilmiştir. Bu modeller, sürekli besin temini ve atıkların uzaklaştırılmasının yanı sıra örneğin oksijen seviyelerinin veya bariyer bütünlüğünün gerçek zamanlı izlenmesi nedeniyle insan bağırsak ortamını daha iyi temsil eder 8,12. Bu modeller özellikle bağırsak bakterilerinin konakçı hücreler üzerindeki etkilerinin incelenmesine izin verir. Bununla birlikte, bağırsak mikrobiyomu ile sinir sistemi arasındaki ilişkileri incelemek için çip üzerindeki organları kullanabilmek için, nöronal hücrelerin bu tür sistemlere entegre edilmesi gerekir. Bu nedenle, HuMiX'i daha da geliştirmenin ve nöroHuMiX sistemini (bundan böyle cihaz olarak anılacaktır) kurmanın amacı, bağırsak epitel hücreleri ve bakterileri ile proksimal ko-kültürde enterik nöronal hücreleri içeren bir çip üzerinde bağırsak modeli geliştirmekti.
Protocol
1. Hücre kültürü ve sıralama
- İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı enterik nöronlar
NOT: Koşunun başlamasından 6 hafta önce kültür iPSC'leri. EN'ler için farklılaşma protokolü Fattahi ve ark.6'dan uyarlanmıştır.- iPSC'leri,% 1 penisilin-streptomisin (P / S) ile desteklenmiş 2 mL / oyuklu iPSC kültür ortamında matris jel kaplı 6 oyuklu bir plaka üzerinde kültürleyin.
- %80-90 birleşmede, hücreleri geçirin, aynı ortamı kullanarak matris jel kaplı bir plakada tohumlayın, 37 °C, %5CO2 ve %90 bağıl nemde (RH) inkübe edin.
- iPSC türevi için, çözüldükten sonra iki pasajı takiben,% 80 -% 90 birleşmede, hücreleri 100.000 hücre / kuyu yoğunluğunda matris jel kaplı 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın. Yukarıda tarif edilen ortam + ROCK inhibitörü Y-27632 (1: 2.000) içinde 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
- 24 saat sonra, süpernatan ortamı Tablo 0'e göre Gün 1 ortamıyla değiştirin. Türetme işlemi için hücre sıralaması sırasında negatif kontrol olarak kullanılacak bir kontrol kuyusu ekleyin. Tüm türetme dönemi boyunca 0. gün medya bileşiminde kontrolü iyi tutun. Tablo 1'e göre ortamı 2. günden 10. güne kadar her gün değiştirin.
- 11. Günde, bu protokolün sonraki adımlarında kullanılacak olan CD49d pozitif hücreler için hücreleri sıralayın.
- CD49d pozitif hücrelere ve kontrol kuyusuna göre sıralanacak hücreleri bir araya getirin. Hücreleri 300 × g'da 3 dakika santrifüj edin. Hücre peletini 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 2 sığır serum albümini (BSA) +% 1 P / S içinde yeniden süspanse edin.
- Her hücre lotunu (havuzlanmış ve kontroller) ikiye bölün: bir fraksiyonu anti-insan CD49d antikoru ile ve diğer fraksiyonu bir izotip kontrol antikoru ile boyayın.
- Ana hücre popülasyonunu kapatın ve ardından yüzeylerinde CD49d sunan hücrelerin seçileceği tek hücreleri kapılayın. Farklılaşmanın bir sonraki adımı için bu hücreleri toplayın.
NOT: Genellikle, sıralanan hücrelerin% 30-40'ı CD49d pozitiftir.
- Sıralanan hücrelerin iki ila dört milyonunu, küresel oluşumuna izin vermek için 4 gün boyunca N2B27 ortamında (bkz. Tablo 2) + FGF2 + CHIR'de ultra düşük bir bağlantı plakasının 6 oyuklu bir plakasına aktarın.
- 15. günde, sferoidleri GDNF ve askorbik asit (AA) ile 2 mL/oyuklu N2B27 ortamında poli L-ornitin/laminin/fibronektin (P/L/F) kaplı 6 oyuklu plaka üzerinde yeniden plakalayın. Ortamı 2-3 günde bir değiştirin.
NOT: Kaplama oranı: poli L-ornitin, 15 μg/mL; laminin, 2 μg/mL; fibronektin, 1x PBS'de 2 μg/mL. - 3 hafta sonra, hücreleri cihazda aşılama için kullanın.
- Caco-2
NOT: Caco-2 hücrelerini çalıştırmadan en az 1 hafta önce çözün.- RPMI 1640 glutamin takviyesi + HEPES +% 10 fetal sığır serumu (FBS) içinde 1 ×10 6 Caco-2 hücreli bir T75 şişesi tohumlayın; 37 °C, %5CO2 ve %90 RH'de inkübe edin.
NOT: Bu deneyler için ideal olarak Caco-2'yi çözüldükten sonra birinci veya ikinci geçişlerinde kullanın.
- RPMI 1640 glutamin takviyesi + HEPES +% 10 fetal sığır serumu (FBS) içinde 1 ×10 6 Caco-2 hücreli bir T75 şişesi tohumlayın; 37 °C, %5CO2 ve %90 RH'de inkübe edin.
2. HuMiX çalıştırma hazırlığı
- Polikarbonat kapak hazırlama ve kaplama
- İlk cihaz enstrüman döngüsünü kullanarak bir çift polikarbonat (PC) kapağı (Şekil 2) dört vidayla birlikte otoklavlayın (ayrıntılar için Tablo 3'e bakın).
- Bir biyogüvenlik kabininde, alt PC kapağının her bir köşesine dört vida yerleştirin (bkz. Şekil 3) ve iki aşamalı bir kaplama işlemi için steril bir kare Petri kabına aktarın.
- İlk gün, PC kapağının ortasına PBS'de (1x) 2 mL %1.5 poli L-ornitin ekleyin. Gece boyunca 37 °C, %5CO2 ve %90 RH'de inkübe edin.
- Ertesi gün, çözeltiyi çıkarın ve nöronal hücre odasının yüzeyini kaplamak için PBS'de (1x) %0.2 laminin ve %0.2 fibronektin içeren bir çözelti ile değiştirin. Kapağı gece boyunca 37 °C, %5CO2 ve %90 bağıl nemde inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, kaplama solüsyonunu PC kapağında tutun ve Petri kabını bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. Kullanana kadar saklamak için 4 °C'ye koyun.
- Kullanmadan önce, kaplama solüsyonunu çıkarın ve kaplama tamamen kuruyana kadar bir biyogüvenlik kabininde 30 dakika havayla kurutun.
- Conta hazırlama ve kaplama
NOT: Bu bölümde, silikon contalara yarı geçirgen membranlar yapıştırılarak contaların nasıl hazırlanacağı açıklanmaktadır. İlk otoklavlama adımından sonra, contalar bağırsak epitel hücrelerinin veya bakterilerin yapışmasına izin vermek için kollajen veya müsin ile kaplanır. Müsin kaplı zar, insan bağırsağında bulunan mukus bariyerini taklit eder.- Kollajen contaya 1 μm gözenek boyutunda polikarbonat membran ve alt ve üst sandviç contalar arasına 50 nm gözenek boyutunda polikarbonat membran takın. İlk cihaz alet döngüsünü kullanarak contaları ekli membranlarla otoklavlayın (bkz. Tablo 3).
- Membranları kaplamak için, her bir contayı steril bir kare tabağa yerleştirin.
NOT: Kaplama, biyogüvenlik kabininde steril koşullarda yapılır.- Kollajen conta için membrana 3 mL kollajen (50 μg/mL) ekleyin ve 37 °C'de 3 saat inkübe edin.
NOT: Membrana zarar vermemek için kolajeni eklerken pipet ucuyla membrana dokunmamaya dikkat edin. - Müsin kaplaması için, membranın üst tarafını 3 mL müsin (0.025 mg/mL) ile kaplamak için sandviç contayı üst conta tarafı yukarı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirin. Contaları 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
- Kollajen conta için membrana 3 mL kollajen (50 μg/mL) ekleyin ve 37 °C'de 3 saat inkübe edin.
- İnkübasyon süresinden sonra, kollajen ve müsin solüsyonlarını ilgili contalarından aspire edin ve membranı bir biyogüvenlik kabininde 30 dakika havayla kurutun. Bulaşıkları kapatın, laboratuvar sızdırmazlık filmi ile kapatın ve contaları kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- Boru montajı
NOT: Bu bölüm, cihazın perfüzyonu için borunun nasıl monte edileceğini açıklar. Montajdan önce, tüm parçaları otoklavlayın ve/veya steril bir pakette ayrı ayrı paketlenmiş olanları satın alın. Tüm bileşenleri bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin.- Her cihaz ve her tüp hattı için üç boru hattı, bir adet pompa boru hattı, iki adet uzun Marprene boru (20 cm), iki adet kısa Marprene boru (8 cm), çıkış şişesi için bir adet 40 mm iğne, 250 mL giriş şişeleri için bir adet 120 mm iğne veya daha küçük giriş şişeleri için 80 mm iğne kullanın, üç erkek ve yedi dişi Luer - dikenli konektör, üç Luer adaptörü ve iki üç vana.
- Yukarıda listelenen otoklavlanmış ve sterilize edilmiş bileşenleri kullanarak boru hatlarını soldan sağa monte edin (Şekil 4).
NOT: Her bağlantı adımı arasında her bileşene %70 etanol püskürtün.
- Medya hazırlığı
NOT: Bu bölüm, besiyerinin cihazdaki farklı hücre tipleri için nasıl hazırlanacağını ve besiyerinin steril bir şekilde serum şişelerine nasıl aktarılacağını açıklar.- RPMI 1640'ı %10 0,22 μm filtrelenmiş, ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS ile destekleyin. N2B27 ortamını GDNF ve AA ile taze bir şekilde destekleyin.
- Ortamı steril koşullar altında serum şişelerine aktarın. 200 mL RPMI 1640 ortamını 250 mL'lik şişelere ve 30 mL N2B27 ortamını 50 mL'lik şişelere aktarın.
- Bakteri ortamını (RPMI 1640 +% 10 FBS +% 5 De Man, Rogosa ve Shapre kültür ortamı [MRS]) daha sonraki bir aşamada hazırlayın, çünkü bu yalnızca deneyin son 24 saatinde gereklidir.
- Şişeleri bir septum ile kapatın, alüminyum kıvırın ve otoklavlayın.
- Ortamı aktarmak için, uygun bir decapper (çap = 20 mm) kullanarak alüminyum kıvrımı çıkarın. Septumu da çıkarın. Hazırlanan besiyerini şişeye dokunmadan dikkatlice serum şişelerine dökün.
- Sterilize etmek için, portatif bir Bunsen brülörü kullanarak şişenin açıklığını alevlendirin. Septuma% 70 etanol püskürterek, şişeye ekleyerek ve bir conta kıvırıcı kullanarak alüminyum bir kıvrımla kapatarak şişeleri kapatın.
- Ortamı 37 °C'ye ısıtmak için kapalı şişeleri 37 °C, %5CO2'de 24 saat boyunca inkübatöre yerleştirin ve ayrıca cihaz için ortam şişelerini kullanmadan önce görünür kontaminasyon belirtisi olmadığından emin olun.
3. HuMiX başlangıcı
- NeuroHuMiX montajı
NOT: Bu bölüm, cihazın nasıl monte edileceğini açıklamaktadır. Kısacası, sıkıştırma sistemi sterilize edilir ve yeniden sıkılır, ardından alt PC kapağı kelepçenin tabanına yerleştirilir. Daha sonra, kaplanmış contalar ve üst PC kapakları birbiri üzerine istiflenir, ardından kelepçenin üst kısmı gelir. Son olarak, contaları sıkıştırmak ve sistemi sızdırmaz ve gaz geçirmez hale getirmek için kelepçe sıkılır. Şekil 4 , montaj için gereken farklı parçaları göstermektedir.- cl'yi otoklavlayınampmontajdan önce ve iki PC kapağı (üst ve alt).
- cl'nin üst ve alt kısımlarını monte etmek için kullanılan vidaları sıkınamp (Şekil 4C,D). Otoklavlama işleminden önce vidaları açın ve daha sonra tekrar sıkın.
- Kaplanmış ve kurutulmuş (adım 2.2.3) alt PC kapağını (Şekil 4 A1) kare Petri kabından cl'nin üstüne aktarın.amp PC kapağının köşelerindeki dört vidayı tutarak temel.
NOT: Kontaminasyon riskini azaltmak için PC kapağına dokunmaktan kaçının. - Epitel haznesi contasını yukarı bakacak şekilde (yani membran üstte olacak şekilde) steril cımbız kullanarak PC kapağına yerleştirin. Kapağın köşelerindeki giriş ve çıkış portlarının contadaki açıklıklarla hizalandığından emin olmak için contayı ve PC kapağını hizalamak için vidaları kullanın (Şekil 3).
- Steril cımbız kullanarak, sandviç contayı üst tarafı yukarı bakacak şekilde kollajen contanın üzerine yerleştirin.
- Üst PC kapağını sandviç contanın üzerine yerleştirin. Kontaminasyon riskini azaltmak için bunu yalnızca kapağın kenarlarına dokunarak yapın (kapağın üst veya alt kısmına dokunmayın). cl cl üzerindeki dikenleramp kapağı, membran tertibatındaki giriş ve çıkış açıklığı ile hizalanır ve alt PC kapağındaki vidaların üst PC kapağının açıklığına oturur.
- Cihazı kapatmak için, cl'yi yerleştirinamp kapağı (cl'nin üst kısmıamp) PC kapağının üstüne. Kapağın açıklıklarının üst PC kapağının giriş ve çıkış çubuklarıyla çakıştığından emin olun. Mandalları kapatın. Astarlanmış boru hatlarına bağlanmak için kapalı cihazı (Şekil 5) kaputun altında tutun (adım 3.2.6).
- Boru hatlarının astarlanması
NOT: Bu bölüm, borunun giriş ve çıkış şişelerine ve ayrıca pompaya nasıl bağlanacağını, ardından temizlik ve sterilizasyon sırasında kullanılan artık ürünleri çıkarmak için boruyu ortamla nasıl dolduracağınızı ve boruda kabarcık bulunmadığından nasıl emin olunacağını açıklar.- Boru hatlarının astarlanması biyogüvenlik kabininde yapılır. Her giriş ve çıkış şişesinin septumuna filtreli havalandırma iğneleri yerleştirin. Temiz, steril cımbız kullanarak 120 mm'lik iğneleri 250 mL'lik serum şişelerine yerleştirin. 80 mm'lik iğneleri 50 mL'lik serum şişelerine yerleştirin.
- Her boru hattının sonundaki 40 mm'lik iğneleri bir çıkış serum şişesine yerleştirin. Cihaz başına, üç boru hattı için iki çıkış şişesi vardır. Epitelyal ve nöronal boru hatlarının 40 mm'lik iğneleri, orta atma için aynı çıkış şişesine bağlanır. Bakteri tüpü hattı ikinci çıkış şişesine gider.
- Pompa boru hatlarını pompa kasetlerine yerleştirin. Boru hatlarının üç vanalarının hepsinin açık olduğundan emin olun.
- Başlangıçta, peristaltik pompayı, ortamı girişten çıkış şişesine 5 rpm hızında yönlendirecek şekilde ayarlayın (bkz. Tablo 4).
NOT: Boru hattı hazırlama sırasında, işlemi hızlandırmak için hız 10 rpm'ye kadar artırılabilir. - Başlat düğmesine basarak pompayı çalıştırın ve pompalama hareketinin yönünün saat yönünde olduğundan emin olun. Medya çıkış şişelerine düştüğünde, boru hatlarında ve bağlantı noktalarında sızıntı olmadığından ve hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Boruya ve konektörlere dokunarak veya pompa hızını artırarak kalan kabarcıkları çıkarın.
- Tüm boru hatları çıkış şişelerine düştüğünde, ilk cihazı bağlamak için akış hızını 2 rpm'ye ayarlayın.
- Cihazın astarlanması
NOT: Bu bölüm, sistemde kabarcık kalmaması ve hücrelerin aşılama sırasında kolayca yapışabilmesi için tüm odaların ortamla doldurulmasını ve önceden kaplanmasını sağlamak için cihazın hücre kültürü ortamıyla nasıl doldurulacağını açıklar.- Cihazın astarlama işlemi steril şartlarda biyogüvenlik kabininde yapılır. Cihazı bağlamak için, cihazın alt odası olan nöronal hattı bağlayarak başlayın.
- Bir hattı bağlamak için, üç vanaları kapatın (Şekil 5C), önce kısa borunun dişi Luer konektöründen ayrıldığı ve cihazdan çıkış portuna bağlandığı çıkış tarafından başlayarak, boruyu diken üzerinden iterek. Doğru bağlantıyı sağlamak ve sızıntı ve/veya kirlenme olasılığını azaltmak için, hortumu konektörün üzerinden sonuna kadar iterek kapakla temas halinde olduğundan emin olun. Giriş borusunu da aynı şekilde bağlayın. Bir hat cihaza tamamen bağlandığında (giriş ve çıkış), üç muslukları açın.
- Önceki adımı epitel çizgisi ve ardından bakteri çizgisi ile tekrarlayın. Pompayı 2 rpm akış hızında tutun. Basınç oluşumundan kaynaklanan sızıntıları önlemek için pompa hızını 2,5 rpm'ye yükseltin, ancak daha yükseğe çıkarmayın. Pompanın cihazdaki odaları doldurmasına izin verin.
- Çıkış serum şişelerini her zaman izleyin. Hava kabarcıkları odalara, hatlara veya konektöre sıkışırsa, içinde hava kabarcığı bulunan bir boru hattı artık çıkış odasına düşmeyecektir. Hava kabarcıklarından kurtulmak için önce cihazların birkaç dakika çalışmasına izin verin. Bu sorunu çözmezse, çıkışın üç vanasını kapatarak kısa bir süre için düşen diğer hatlardan birini kapatın.
- Cihazın tüm bölmeleri tamamen doldurulduktan sonra - tüm bölmeler hücre kültürü ortamı ile doldurulur ve cihazda kabarcık kalmaz - pompa hızını 0,5 rpm'ye düşürün. Cihaz artık hücre aşılaması için hazırdır.
4. Hücre hazırlama ve aşılama
NOT: Bu bölüm, cihazı aşılamak için gereken farklı hücre tiplerinin nasıl hazırlanacağını ve bunların cihazda steril bir şekilde ve hava kabarcığı oluşturmadan nasıl aşılanacağını açıklar. Ayrıca, nöronal hücreler için ortam tazelemesinin nasıl gerçekleştirileceğini ve cihazdaki bakteri kültürü için ortamın nasıl hazırlanacağını açıklar.
- Epitel hücreleri
- Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kullanarak Caco-2 hücrelerini şişeden ayırın, RPMI 1640 +% 10 FBS'de yeniden süspanse edin ve tripan mavisi dışlama testini kullanarak bir Neubauer hücre sayacında sayın. Caco-2 hücre süspansiyonunu (3 dakika, 300 × g) santrifüjleyin ve kalan tripsin-EDTA'yı çıkarmak için süpernatanı atın. 350.000 hücre/mL'lik bir süspansiyon elde etmek için Caco-2 hücrelerini RMPI 1640 +% 10 FBS'de yeniden süspanse edin. Her cihaz için 1,5 mL'lik bir hacme ihtiyaç vardır.
- 1.5 mL Caco-2 hücre süspansiyonunu steril 2 mL'lik bir şırıngaya aktarın ve şırıngada kalan hava veya kabarcıkları çıkarın.
- Bakteri ve nöronal odaların borularının üç vanalarını kapatın. İlgili boruya sahip kasetleri rotordan çıkararak bakteri ve nöronal odaların borularını pompadan ayırın.
- Epitel odasına giden giriş borusunun üç vanasının kapağını açın ve orta akışı cihazdan 'açık konektöre' yönlendirmek için üç vanayı çevirin (Şekil 5C). Üç vananın açık ucunda bir damla ortam görünene kadar ortamın akmasına izin verin.
- Epitel hücrelerini içeren şırıngayı, şırınganın hava kabarcığı girmeden konektöre yerleştirilmesine izin vermek için damla-damla bağlantı yöntemini kullanarak 'açık konektöre' yerleştirin. Ortamın giriş şişesinden (pompa aracılığıyla ) akışını durdurmak ve bağlı şırıngadan ilk cihaza akışa izin vermek için üç vananın valfini çevirin. Epitel kanalını pompadan ayırın.
- Epitel odasını hücre süspansiyonu ile aşılamak için şırıngaya yavaşça bastırın. Çıkış şişesine her 3 saniyede yaklaşık bir damla damladığından emin olun.
- 1,5 mL hücre süspansiyonu ekleyin, ardından çıkış üç vananın valfini kapatın. Şırıngayı ayırın ve üç musluğun açık ucunu kapakla kapatın. Hazneyi en az 2 saat kapalı tutun. Bu arada, nöronal hücreleri aşılayın.
- Nöronal hücreler
- Ortamdaki hücreleri bir pipet kullanarak ilgili kuyulardan yeniden süspanse ederek nöronal hücreleri kuyudan ayırın. Her cihazı, 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğundan (9,6cm2) tamamen birleşik hücrelerle aşılayın.
- Hücre peletini karşılık gelen N2B27 orta hacminde (cihaz başına 1.5 mL ortam) + 1 μL fibronektin/mL hücre süspansiyonunda yeniden süspanse edin. 1.5 mL askıya alınmış hücre süspansiyonunu 2 mL'lik bir şırıngaya aktarın ve şırıngada kalan hava kabarcıklarını çıkarın. Doldurulmuş şırıngayı steril 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve astarlanmış HuMiX cihazını içeren biyogüvenlik kabinine aktarın.
- Tüp hattı değişikliği dışında, epitel odası aşılaması için daha önce tarif edilenle aynı aşılama sürecini izleyin. Burada, bakteri ve epitel tüp hatlarını pompadan ayırın.
- Nöronal hücre aşılamasından sonra, tüp hatlarının tüm üç vanalarını kapatın ve pompadan ayırın. Cihazı 37 °C ve %5 CO2'de inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin yapışmasına izin vermek için tüm kanalları 2 saat kapalı tutun.
- 2 saat sonra, bakteri ve epitel kanallarını pompaya bağlayın ve her iki hattın giriş ve çıkış üç vanalarını açın. Nöronal odayı, orta değişim dışında, ilk cihaz çalışmasının önümüzdeki 14 günü boyunca kapalı tutun.
- 14 günlük çalışma sırasında, her 3-4 günde bir nöronal odanın ortamını değiştirin. Orta tazeleme için, cihaz başına 3 mL taze N2B27 ortamı hazırlayın ve 20 mL'lik steril bir serum şişesine aktarın. Serum şişesini steril bir septum ve alüminyum kıvrımlı bir conta kullanarak ortamla kapatın.
- Yeni şişenin septumuna bir havalandırma ve 80 mm'lik bir iğne yerleştirin. Erkek Luer'i eski şişenin iğnesinden yeni şişenin iğnesine ayırarak eski medya şişesini inkübatördeki yenisiyle değiştirin.
- Kaseti nöronal haznenin pompa borusuna bağlayın ve üç vanaları açın. Nöronal borunun üç vanalarını kapatmadan ve bir sonraki ortam değişimine kadar pompadan ayrılmadan önce ortamın 2 saat boyunca 0,5 rpm'de akmasına izin verin.
5. Bakteri kültürü ve aşılama
NOT: Bu çalışmada, 12. günde, sıvı bir Limosilactobacillus reuteri suşu F275 kültürü, bir gliserol stoğundan yeniden canlandırıldı. İhtiyaca veya çalışma tasarımlarına bağlı olarak, diğer bakteri türleri kullanılabilir.
- 5 mL MRS et suyu içeren üç tüp hazırlayın - bir steril kontrol tüpü ve L. reuteri aşısı için iki. Bir aşılama döngüsü ile gliserol stoğunun üst kısmını kazıyın ve bir tüpe aktarın. İkinci bir aşılama tüpü ile tekrarlayın. Tüpleri gece boyunca 37 °C, 170 rpm'de inkübe edin.
NOT: Gliserol stoğunun çözülmesine izin vermeyin. - Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 + %10 FBS'yi %5 MRS suyu ile karıştırarak ilk cihazlar için taze ortam hazırlayın. Cihaz başına 25 mL hazırlayın ve steril koşullar altında 100 mL'lik serum şişelerine aktarın. Şişeleri steril bir septum ve alüminyum kıvrımla kapatın. Şişeleri gece boyunca 37 °C, %5CO2'de inkübatöre yerleştirin.
- Şişeleri bakteri tüpü hattına bağlamadan önce, her bir RPMI 1640/MRS ortamı şişesine bir havalandırma iğnesi ve 80 mm'lik iğne ekleyin.
- Her biri 3 mL RPMI 1640 + %10 FBS + %5 MRS suyu içeren yeni tüpler hazırlayın. Cihaz başına bir kontrol ve bir tüp olmak üzere en az iki tüp hazırlayın. Yeni hazırlanan tüplerin ikisine 15 μL L. reuteri gece kültürü (optik yoğunluk [OD] > 2) aşılayın.
- Tüpleri 37 °C, 170 rpm'de 1 saat inkübe edin, ardından ~1 × 107 koloni oluşturan birim (CFU)/mL'ye karşılık gelen 0.05-0.10'luk bir OD'ye ulaşılır. 1,5 mL'yi 2 mL'lik bir şırıngaya aktarın (cihaz başına bir tane). CFU kaplama ve canlı/ölü boyama için bakteri süspansiyonunun geri kalanını kullanın.
- Cihazın bakteriyel aşılanması için, burada nöronal ve epitelyal tüp hatlarının kapalı olması dışında, adım 4.1'de belirtilenle aynı prosedürü izleyin.
- Aşılamadan sonra, vanaları kapatarak ve pompadan 30 dakika ayırarak bakteri tüpü hattını da kapatın. Epitel ve bakteri tüp hatlarını bağlayın ve tekrar açın. Cihazları 37 °C ve 0,5 rpm'de 24 saat daha çalıştırın.
6. HuMiX açılışı ve örneklemesi
NOT: Aşağıdaki bölümde, farklı hücre tiplerinin örneklemesi açıklanmaktadır. Örneğin, nöronal hücre peletleri, RNA ekstraksiyonu ve müteakip kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), DNA ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen dizilimi için bakteriyel peletler ve enzime bağlı immünosorbent testleri (ELISA'lar) ve diğer testler (örneğin, laktat testi) için süpernatanlar kullanılır.
- Açılış günü olan 14. günde, tüm üç muslukları kapatın, boruları pompadan ayırın ve inkübatörün cihazını laboratuvar tezgahına çıkarın.
NOT: Cihazı taşırken, gerçek cihazı yatay tuttuğunuzdan emin olun. - cl'yi yavaşça açmadan önce cihaza bağlı boru hatlarını çıkarın.amp ve cl'yi çıkarınamp kapak. Dikkatli bir şekilde üst PC kapağını çıkarın, ortamı 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve buzun üzerine yerleştirin.
- Ortamı epitel odasından toplarken sandviç contayı yavaşça çıkarın; Hücre katmanına dokunmamaya dikkat edin. Sandviç contayı kare bir Petri kabına yerleştirin ve hazne tamamen kaplanana kadar (yaklaşık 1 mL) bakteri odasına H2O içinde steril% 0.9 NaCl çözeltisi ekleyin.
- Ortamı nöronal odadan toplarken ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarırken kollajen contayı yavaşça çıkarın. Tüm medya tüplerini buzun üzerine yerleştirin. Kollajen contayı kare bir tabağa yerleştirin ve hücre tabakası tamamen kaplanana kadar Caco-2 tabakasına birkaç mililitre 1x PBS ekleyin.
- Alt PC kapağını kare bir Petri kabına yerleştirin ve nöronal hücrelerin üzerine nazikçe yaklaşık 2 mL 1x PBS ekleyin, böylece örnekleme işlemi sırasında kurumazlar.
- Bakteriyel ortam tüpünü 5,000 ° C'de 5 dakika boyunca 4 × g'da santrifüjleyin. Epitelyal ve nöronal ortam tüplerini 300 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, her tüpün süpernatanını yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hemen kuru buz üzerine yerleştirin.
- Epitel hücreleri
- PBS'yi contadan yavaşça çıkarın ve 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Hücrelere 2 mL tripsin ekleyin ve contayı 37 °C, %5CO2'de 5 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra contaya 2 mL RPMI 1640 ekleyin, hücreleri yeniden süspanse edin ve başka bir 15 mL konik tüpte toplayın.
- Her iki tüpü de 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Peleti PBS yıkamasından 300 μL PBS'de ve hücre peletini 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
- Otomatik hücre sayacı ve tripan mavisi dışlama testi hücre sayımı için her tüpün 50 μL'sini 0.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Yeniden süspanse hücre peletini (1 mL) 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 250 μL lizis tamponu +% 1 beta-merkaptoetanol içinde yeniden süspanse edin ve tüpü kuru buz üzerine yerleştirin.
- Nöronal hücreler
- Bir önceki adımdan (6.5) nöronal hücrelere sahip alt, şeffaf PC kapaklı kare Petri kabını ters faz kontrast mikroskobuna alın.
NOT: Üzerinde PBS bulunan PC kapağını hareket ettirirken, nöronal ağ çok kolay ayrıldığı için çok nazik olun. - Parlak alan mikroskobu kullanarak nöronal hücrelerin morfolojisini ve hücre yoğunluğunu gözlemleyerek aşılamadan önce son bir kalite kontrolü yapın. Hücrelerin sferoidlerden göç ettiğini ve bir nöronal ağın oluştuğunu doğrulayın. Nöronal ağ yaklaşık% 90 birleşik olmalıdır. Daha fazla ayrıntı için Fattahi ve ark.6'ya bakın.
- Tezgahta, hücreleri PBS'de yeniden süspanse edin ve 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın. Tüpü 300 × g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücre peletini 250 μL lizis tamponu +% 1 beta-merkaptoetanol içinde yeniden süspanse edin ve kuru buz üzerine yerleştirin.
NOT: PC kapağındaki nöronal hücrelerde immünofloresan (IF) boyama yapılabilir. Nöronal ağı tahrip etmemek için IF boyama tercih edilen test ise, hücreler %4 paraformaldehit (PFA) ile PC kapağına sabitlenmelidir, bu da gelecekteki deneylerde PC kapağının tekrar kullanılmasını engeller.
- Bir önceki adımdan (6.5) nöronal hücrelere sahip alt, şeffaf PC kapaklı kare Petri kabını ters faz kontrast mikroskobuna alın.
- Bakteri hücreleri
- Membrana bağlı bakteri hücrelerini% 0.9 NaCl çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Hücreler sıkıca tutturulmuşsa, bakteri hücrelerini zardan ayırmak için nazikçe bir hücre kazıyıcı kullanın.
NOT: Kazıyıcı kullanmak hücrelere zarar verebilir ve daha fazla ölü hücre görme olasılığını artırabilir. - Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Önceden toplanan ortamdan arta kalan peleti 15 mL'lik konik tüpe ekleyin. 5.000 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL% 0.9 NaCl çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
- Bu hacmi üç parçaya bölün: biri nükleik asit ekstraksiyonu (650 μL) için bir bakteri peletini dondurmak için, biri MRS plakalarında CFU kaplama (50 μL) için ve diğeri canlı/ölü boyama (300 μL) için. Peletin nükleik asit ekstraksiyonu için hazırlanması için, hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, 5,000 ° C'de 5 dakika boyunca 4 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre peletini kuru buzun üzerine yerleştirin.
- Numune alma işleminin sonunda, daha sonraki sonraki analizler için saklamak üzere kuru buz üzerindeki tüm tüpleri -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın.
NOT: Süpernatant ayrıca gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS) analizi için de kullanılabilir. Ayrıca, açılma sırasında, kollajen kaplı membran farklı analizler için farklı parçalara bölünebilir - bir yarısı IF oklüdin boyama için kullanılacak, başka bir kısım daha fazla gen ekspresyon analizi için RNA ekstraksiyonu için ve hücre sayımı için başka bir kısım.
- Membrana bağlı bakteri hücrelerini% 0.9 NaCl çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Hücreler sıkıca tutturulmuşsa, bakteri hücrelerini zardan ayırmak için nazikçe bir hücre kazıyıcı kullanın.
Representative Results
NeuroHuMiX'te, bakteriyel, epitelyal ve nöronal hücreler olmak üzere üç farklı hücre tipini birlikte kültürledik (Şekil 1). Hücrelerin hepsinin canlı olduğundan emin olmak için, farklı hücre tipleri üzerinde farklı testler yaptık. Örneğin, bakteri hücrelerinde CFU sayımları, epitel hücrelerinde hücre sayımı ve hücre canlılığı deneyleri yaparken, nöronal hücreler mikroskobik analizlerle değerlendirildi.
Şekil 1: neuroHuMiX'in şematik gösterimi ve deney düzeneği . (A) Üç odacık, onları kapalı tutmak için iki PC kapağı arasında tutulur. Her oda, içinde büyüyen hücreler için belirli bir ortamla doldurulur. Farklı odalar, zarlardan geçen çözünür faktörler aracılığıyla hücre iletişimine izin veren yarı geçirgen zarlarla ayrılır. (B) neuroHuMiX kurulumunun temsili. Her hazne farklı medya şişelerine bağlanır. Bakteri odası için, ilk 12,5 gün boyunca, oda RPMI +% 10 FBS'ye bağlanır, son 36 saat için RPMI +% 10 FBS +% 5 MRS olarak değiştirilir. Kısaltmalar: PC = polikarbonat; P / L / F = poli L-ornitin / laminin / fibronektin; RPMI = Roswell Park Memorial Enstitüsü hücre kültürü ortamı; MRS = De Man, Rogosa ve Shapre kültür ortamı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Hücrelerin uygun şekilde bağlanıp bağlanmadığını belirlemek için, cihazları açtıktan sonra, kollajen kaplı membran üzerinde bir hücre tabakasının oluşumunu değerlendirdik (Şekil 6A). Cihazdaki hücrelerin canlı olduğundan emin olmak için, otomatik bir hücre sayacı sayımı (Şekil 6B) ve bir tripan mavisi dışlama testi hücre sayımı yapıldı (Şekil 6C). Tahliller, üç farklı HuMiX kurulumundan Caco-2 hücreleri üzerinde gerçekleştirildi: (i) ENs ile kültürde Caco-2, (ii) L. reuteri ile kültürde Caco-2 ve (iii) her üç hücre tipinin birlikte kültürünü içeren cihaz. Tek yönlü bir ANOVA kullanılarak yapılan istatistiksel testler, hücre tipleri arasında önemli bir fark sağlamadı, bu da Caco-2 hücrelerinin bu çalışmada test edilen tüm bu ilk cihaz kurulumlarında ve koşullarında canlı kaldığını düşündürdü. Bu, L. reuteri ve iki insan hücre tipinin birlikte kültürü sırasında ulaşılan bakteri yoğunluğunun insan hücreleri üzerinde sitotoksik etkilere sahip olmadığının altını çizmektedir.
Şekil 6: Kollajen kaplı membran üzerindeki Caco-2 hücrelerinin değerlendirilmesi. (A) Açıldıktan sonra kollajen kaplı membran üzerinde Caco-2 hücrelerinin tabakası. Ok, kesikli bir daire ile çevrili kollajen kaplı zarı gösterir. Caco-2 hücreleri, zar üzerindeki spiral şekil üzerinde büyüyordu. HuMiX'te 14 gün sonra Caco-2 hücrelerinin hücre canlılığı. Hücre sayımları, (B) otomatik hücre sayacı ve (C) tripan mavisi dışlama testi hücre sayımı kullanılarak elde edildi. Caco-2 hücre sayımları, ilk cihazdaki farklı kültür kurulumlarından belirlendi: enterik nöronlarla ko-kültür (ENs) (siyah), L. reuteri ile ko-kültür (turuncu) ve cihazda (ENs ve L. reuteri) (mavi). Farklı kültür kurulumları arasında anlamlı bir fark olmadığını gösteren tek yönlü bir ANOVA gerçekleştirildi (tek yönlü ANOVA, p = 0.1234 [ns]; hata çubukları standart hatayı gösterir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
L. reuteri'yi memeli hücreleri ile kültürleyebilmek için önce kültür ortamını cihazda kullanılmak üzere optimize ettik ve uyarladık. RPMI 1640'ta (% 10 FBS ile desteklenmiş)% 5'lik bir MRS karışımının, bu testlerde kullanılan memeli hücreleri için sitotoksik olmamakla birlikte, L. reuteri'nin büyümesi için en uygun olduğunu bulduk. Daha sonra, 24 saat boyunca cihazda kültürlendiğinde L. reuteri'nin büyümesini değerlendirmek için bir CFU sayımı yapıldı. CFU sayımı, iki farklı başlangıç cihazı kurulumu için değerlendirildi (Şekil 7)-L. reuteri, cihazda Caco-2 ve L. reuteri ile birlikte kültürlendi. Her iki kurulumda da, CFU sayımları HuMiX aşısından ve hasat edilen hücrelerden (tek yönlü ANOVA, p = 0.0002) önemli ölçüde farklıydı, bu da ilk cihazın içindeki bakteri hücrelerinin büyümesini gösteriyordu.
Şekil 7: Limosilactobacillus reuteri İnokulumun CFU sayısı (1:100.000 seyreltilmiş) ve HuMiX'te 24 saat sonra. İki farklı kurulum: L. reuteri ile ko-kültürde Caco-2 hücreleri ve cihaz. Tek yönlü bir ANOVA, aşı ile hasat edilen hücreler arasında önemli bir fark (p = 0.0002 [***]) gösterir, bu da bakterilerin HuMiX içinde büyüdüğü anlamına gelir. Hata çubukları standart hatayı gösterir. Kısaltmalar: CB. HX = Caco-2 bakterisi HuMiX; nHX = nöroHuMiX. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
EN'lerin cihaz içinde kültürlenmesinin hücrelerin fenotipini değiştirip değiştirmeyeceğini değerlendirmek için, EN'lerin brüt morfolojisi, ters çevrilmiş bir faz kontrast mikroskobu kullanılarak gözlemlendi. Bu adımda, hem birleşme hem de EN morfolojisi değerlendirildi. Birleşen bir nöronal ağın kurulması, hücrelerin kaplanmış cihazın PC kapağına iyi bir şekilde yapıştığını gösterdi. Daha da önemlisi, bu, Caco-2 ve L. reuteri ile birlikte kültürde büyüdükleri fikrini vurgulamaktadır. Birleşen nöronal ağ ile conta ile tanımlanmış spiral arasındaki kenar açıkça belirgindi.
Şekil 8: Cihazdaki 14 günlük kültürden sonra enterik nöronlar. Görüntünün sol tarafında, nöronlar spiral üzerinde birleşen bir tabakaya dönüşmüştür. Nöronal tabaka ile hücresiz boşluk arasındaki kenar, spiralin kenarıdır; büyütülmüş 10x, ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Cihazda kullanılan kapaklar. Resimlerde üst (sol) ve alt (sağ) PC kapakları gösterilmektedir. PC kapağının her iki tarafı 6,4 cm'dir. Kısaltma: PC = polikarbonat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Alt PC kapağındaki epitel odası contası. Alt PC kapağına yerleştirilen epitel odası contasının üstten görünümü (solda) ve epitel odası contasının alt PC kapağının giriş ve çıkışlarıyla hizalanmasını gösteren alttan görünüm (sağda). Contaların her iki tarafı ve PC kapağı 6,4 cm'dir. Kısaltma: PC = polikarbonat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Cihazın montajı. (A) HuMiX'i monte etmek için farklı parçalar: (1) alt PC kapağı; (2) (1)'in üzerine yerleştirilen kollajen kaplı mikro gözenekli membranlı conta; (3) aralarında müsin kaplı nano gözenekli membran bulunan ve (2)'nin üzerine yerleştirilen sandviç conta; (4) üst PC kapağı (3)'ün üzerine yerleştirilmiştir. Contaların ve PC kapaklarının her iki tarafı 6,4 cm'dir. (B) (A)'daki tüm parçalar bir araya getirilmiştir. (C,D) Montajlı cihaz üstü (sol) ve yan (sağ) görünüm. B, sistemi kapatmak için sıkıştırma sistemine yerleştirilir. (C) Üst kelepçenin her iki tarafı 8 cm'dir. Kısaltma: PC = polikarbonat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Boru hattı ve bir oda için monte edilmiş boru hattı için gerekli parçalar. (A) Bir boru hattı oluşturmak için farklı parçalar: A. pompa boru hattı; b. üç musluk; c. 40 mm iğne; d. 80 mm iğne; e. 120 mm iğne; f. uzun boru hattı (20 cm); g. kısa boru hattı (8 cm); h. erkek Luer; i. dişi Luer; j. Adaptör. (B) Bakteri veya epitel odası için monte edilmiş boru hattı. Nöronal oda için 120 mm'lik iğnenin 80 mm'lik bir iğneye değiştirilmesi gerekir. (C) Üç vana vanası, ortam akışını cihazdan 'açık konektöre' yönlendirmek ve hazneyi kapatmak için döndürüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Gün | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| Medya Kompozisyonu | %100 E6 | %100 E6 | %75 E6 | %50 E6 | %25 E6 | % 100 N2 |
| + LDN | + LDN | % 25 N2 | % 50 N2 | % 75 N2 | + LDN | |
| + SB | + SB | + LDN | + LDN | + LDN | + SB | |
| + CIVIL ÇİR | + SB | + SB | + SB | + CIVIL ÇİR | ||
| + CIVIL ÇİR | + CIVIL ÇİR | + CIVIL ÇİR | + RA | |||
| + RA | + RA | |||||
| Molekül | [konsantrasyon] | |||||
| LDN (LDN) | 100 nM | |||||
| SB | 10 μM | |||||
| CHIR (Türkçe) | 3 μM | |||||
| Retinoik Asit (RA) | 1 μM |
Tablo 1: Medya kompozisyonu.
| Medya | Bileşenler (Malzeme tablosunda listelenen konsantrasyonlar) | Hacim (mL) |
| N2 ortamı (50 mL) | DMEM-F12 Serisi | 48 |
| N2 Takviyesi | 0.5 | |
| L-Glutamin | 0.5 | |
| Penisilin / Streptomisin | 0.5 | |
| NEAA (NEAA) | 0.5 | |
| N2B27/ENS Medya (50 mL) | Nörobazal | 48 |
| N2 Takviyesi | 0.5 | |
| L-Glutamin | 0.5 | |
| Penisilin / Streptomisin | 0.5 | |
| B27-A | 0.5 |
Tablo 2: Medya tarifleri.
| Sterilizasyon Sıcaklığı (°C) | 116 |
| Sterilizasyon Süresi (dk) | 20 |
| Kuruma Süresi (dk) | 10 |
| Bakliyat | 3 |
| Bitiş Sıcaklığı (°C) | 99 |
Tablo 3: HuMiX otoklav çalışması.
| Dakikadaki devir sayısı (rpm) | Ortalama akış hızı (μL/dak) |
| 0.5 | 13 |
| 2 | 79 |
| 5 | 180 |
Tablo 4: Peristaltik pompanın akış hızları.
Discussion
Artık insan bağırsak mikrobiyomunun konakçının sağlığını ve hastalığını etkilediği tespit edilmiştir. Mikrobiyomumuzun özellikle Alzheimer veya Parkinson hastalığı gibi nörolojik bozukluklarda önemini öne süren bilgilere rağmen 3,13, bağırsak mikrobiyomunun enterik sinir sistemi ve ardından beyin ile nasıl etkileşime girdiği büyük ölçüde bilinmemektedir.
Bağırsak mikrobiyomu ve sinir sistemi arasındaki etkileşimleri incelemek için temsili bir model şu ana kadar mevcut değildi. Bağırsak-beyin ekseni ile ilgili çalışmalar geleneksel olarak murin modelleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir13. Fareler ve insanlar genomik dizilerinin %85'ini paylaşırlar14, ancak fareleri insanlarla karşılaştırırken dikkate alınması gereken önemli farklılıklar vardır. Bağırsakla ilgili olarak, insanlarla karşılaştırıldığında, farelerin yalnızca otobur olduğuna dikkat etmek önemlidir. Sonuç olarak, gastrointestinal sistemleri uzunluk ve 'mide boşalması' gibi özellikler bakımından farklılık gösterir14. Murin beyinleri de önemli farklılıklar gösterir, bu sayede fareler ve insanlar arasındaki genel yapı farklıdır15. Daha da önemlisi, insanlar nöral progenitörlerin daha uzun hücre döngü sürelerine sahiptir15. Sonuç olarak, bağırsak ve nöronal hücreler de dahil olmak üzere insan kaynaklı hücreleri içeren temsili modeller geliştirmek önemlidir5. Bu bağlamda, in vitro modeller aracılığıyla daha tekrarlanabilir araştırmaların geliştirilmesi, hayvan modellerinin kullanılması ihtiyacını azaltmakta ve tekrarlanabilirliği artırmaktadır.
neuroHuMiX, önceki HuMiX model9'un gelişmiş bir sürümüdür. HuMiX, epitelyal ve bakteriyel hücrelerin proksimal ve temsili ko-kültürlerine izin veren bir çip üzerinde bağırsak modelidir. Hücre-hücre iletişimi, proksimal ko-kültür ve salgılanan faktörlerin ve metabolitlerin yarı geçirgen membranlar yoluyla difüzyonu ile mümkündür. Bununla birlikte, insan bağırsak ortamını incelemek için ilk cihazın faydasını genişletmek için, ek bir hücre tipinin tanıtılması gerekir. Bunu ele almak için, iPSC'den türetilen EN'lerin eklenmesiyle geliştirilen neuroHuMiX, bakterilerin, bağırsak epitel hücrelerinin ve EN'lerin proksimal bir ko-kültürünü mümkün kılar. Ortaya çıkan in vitro model, insan sinir sistemi ile ilgili olarak insan bağırsak mikrobiyomu ile ilgili soruları ele almamızı sağlar. Farklı hücre tiplerinin, özellikle memeli hücrelerinin ve bakterilerinin birlikte kültürlenmesinin, canlılık kaybı, zayıf yapışma ve birleşmede genel kayıp dahil olmak üzere çeşitli zorlukları vardır16. Burada, bu cihazda, hücre canlılığını yüksek tutarken aynı sistem içinde üç farklı hücre tipini birlikte kültürleyebildiğimizi gösterdik.
Protokoldeki kritik bir adım, cihaza aşılamadan önce nöronal hücrelerin (% 80 -% 90 hücre birleşmesi ve canlılığı) birleşmesini sağlamaktır. Çalışma sırasında hücre büyümesini değerlendirmek mümkün olmadığından, hücrelerin modele dahil edilmeden önce birleştiğinden ve iyi büyüdüğünden emin olmak son derece önemlidir. Bu sınırlayıcı bir faktör olsa da, cihaz içinde gözlemlenen genel canlılık ve birleşme genellikle yüksektir.
Cihaz, boru hatları üzerinden peristaltik bir pompaya bağlanır. Her hücre odasının kendine özgü boru hattı vardır. Boru, ortamın perfüzyonu için peristaltik bir pompanın kullanılmasına izin veren bir pompa borusunun yanı sıra pompa borusunu cihaza bağlayan boruyu ve cihazı çıkış / atık şişelerine bağlayan boruyu içerir. Çıkış ortamının aşılanmasına ve örneklenmesine izin vermek için cihazdan önce ve sonra örnekleme portları dahildir. Her bölme farklı bir ortama bağlanabilir ve bu da her bir hücre tipi için en iyi kültür koşullarına izin verir. Her oda, orta tedarik için özel ihtiyaçlara bağlı olarak açılabilir veya kapatılabilir. Cihazda, nöronal oda deneyin çoğu için kapalı kalırken, bakteri ve epitel odaları her zaman açıktır, yani tüm deney çalışması boyunca taze ortam alırlar. Ortamın kesintisiz aktığından emin olmak için borularda, konektörlerde veya cihazda hava kalmaması çok önemlidir. Bu nedenle, hazırlama adımında cihazların birkaç dakika çalışmasına izin vermek önemlidir. Bu genellikle sorunu çözer. Aksi takdirde, düşen diğer hatlardan biri, çıkışın üç vanası kapatılarak kısa bir süre için kapatılabilir. Bu, ortamı hava kabarcığı ile çizgiye yönlendirir, böylece kabarcığı borudan dışarı doğru iterek sorunu çözer.
Herhangi bir hücre kültürü deneyi için ortam, her hücre tipinin kendi ortamına sahip olduğu önemli bir bileşendir. Bir ko-kültür kurulumunda, ortamın sadece içinde büyüyen hücre tipi için değil, aynı zamanda ko-kültür içindeki diğer hücre tipleri için de uyumlu olması gerekir. Bu, bakteriyel, epitelyal ve nöronal hücreler olmak üzere üç farklı hücre tipine sahip üç farklı bölmeye sahip olduğumuz için ek bir zorluk teşkil eden cihaz için farklı değildir. Bununla birlikte, bakteri ortamını modifiye ederek -% 10 FBS ile RPMI 1640'a% 5 MRS ilavesi ile% - tüm hücre tiplerinin, özellikle bakteri ve epitel hücrelerinin, sistem içinde başarılı bir şekilde birlikte kültürlenebileceğini gösterdik. Bununla birlikte, cihazda, farklı hücre tipleri birbirine yakın olarak birlikte kültürlenir ve bu nedenle birbirleriyle doğrudan temas halinde değildir. Bu, insan bağırsağındaki hücreler arasındaki doğrudan teması tam olarak temsil etmese ve bu nedenle bir sınırlama olmasa da, proksimal ve temsili ko-kültür koşulu, aşağı akış analizleri için bir güçtür. Çözünür faktörler, farklı odalar ve hücre tipleri arasında değiş tokuş edilir; Bu nedenle, hücreler hala birbirleriyle etkileşime girmektedir. Ek olarak, hücre tiplerinin ayrı ayrı toplanabilmesi ve analiz edilebilmesi, sağlıklı ve/veya hastalıklı bir mikrobiyomun farklı hücre tipleri (nöronal hücreler dahil) üzerindeki etkisini incelememize ve böylece hücre tipine özgü okumaları belirlememize/almamıza olanak tanır. Diğer bir sınırlama, her deneyin sonunda cihaz sadece açılabildiği ve hücreler kontrol edilebildiği için deney çalışması sırasında hücrelerin morfolojisinin takip edilememesidir.
Bildiğimiz kadarıyla, neuroHuMiX, EN'leri içeren ilk çip üzerinde bağırsak modelidir. Bu, bağırsak mikrobiyotası ile enterik sinir sistemi arasındaki iletişimi aydınlatmaya yönelik bir adımdır. Bir bakteri türü, bir epitel tabakası ve EN'ler arasındaki etkileşimin araştırılmasına izin veren bir modeldir. Tasarımı, farklı hücre tipleri tarafından salgılanan çözünür faktörlerin değişimini ve bunların birbirleri üzerindeki etkilerini incelememizi sağlar. İleriye dönük olarak, cihazı kişiselleştirilmiş bir modele dönüştürmek için yalnızca iPSC'den türetilmiş EN'lere değil, aynı zamanda cihazın içinde iPSC'den türetilmiş epitel hücrelerine de sahip olmak önemli olacaktır. Daha da önemlisi, bu kişiselleştirilmiş model, ön, profesyonel ve sinbiyotikleri10,11 test etmek ve potansiyel olarak kişiselleştirilmiş tarama ve terapötik yaklaşımlargeliştirmek için kullanılabilir 17. Kişiselleştirilmiş nöroHuMiX, sonunda insan bağırsak mikrobiyomunun 'karanlık maddesine' ve bağırsak mikrobiyomu-sinir sistemi ekseni boyunca sinir sistemi ile etkileşimlerine ışık tutabilir ve terapötik değerlendirme ve müdahalelerin önünü açabilir.
Enterik nöronal sistem de dahil olmak üzere bir çip üzerinde bağırsağa sahip olabilmenin, bağırsak mikrobiyomu-sinir sistemi ekseni boyunca etkileşimlerin incelenmesi ve anlaşılması için çok önemli olduğu sonucuna varabiliriz. NeuroHuMiX, bakteri türlerinin konakçı hücreler üzerindeki etkilerini incelememize olanak tanır ve modeli fizyolojik olarak daha temsili bir şekilde daha da geliştirmek için bize iyi bir temel sağlar.
Disclosures
P.W., PCT/EP2013/056607, PCT/EP2016/062024, PCT/US2017/061602 ve PCT/EP2019/081424 patentlerinde mucit olarak listelendiğini beyan eder. P.W., C.S. ve L.G., patent LU503075 mucitleri olarak listelendiklerini beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, bize K7 hattındaki hücreleri sağladığı için Dr. Jared Sterneckert'e teşekkür eder. Ayrıca, Arizona Üniversitesi'nden uzun süredir birlikte çalıştığımız Dr. Frederic Zenhausern ve Matthew W. Barret'e mühendislik konularındaki yardımları için teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca Dr. Valentina Galata'ya neuroHuMiX'in şematik gösterimini tasarlamadaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı (hibe anlaşması 863664) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC) fon almıştır. Şekil 1 kısmen Biorender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 10712 | |
| Aeration cannula (length: 1.10 diameter: 30 mm) | VWR (B.Braun) | BRAU4190050 | |
| Agar-agar | Merck Millipore | 1.01614.1000 | |
| Aluminium Crimp | Glasgerätebau Ochs | 102050 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bacterial Cell Membrane, pore size: 1 µm | VWR (Whatman) | 515-2084 | |
| Caco-2 cells | DSMZ | ACC169 | |
| Cell Counter & Analyzer CASY | OMNI Life Sceince | ||
| CHIR | Axon Mechem BV | CT99021 | |
| Collagen I, Rat Tail | Invitrogen | A1048301 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3471 | |
| Difco Lactobacilli MRS Broth | BD Biosciences | 288130 | |
| Discofix 3-way stopcock | B. Braun | BRAU40951111 | |
| DMEM/F12, no glutamine | Thermofisher Scientific | 21331020 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, D-PBS | Sigma Aldrich | 14190-169 | |
| Essential 6 Medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| Essential 8 Medium | Thermofisher Scientific | A1517001 | |
| Female Luer Lock to Barb Connector | Qosina | 11733 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Foetal Bovine Serum, FBS | Thermofisher Scientific | 10500-064 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Human Cell Membrane, pore size: 50 nm | Sigma Aldrich (GE Healthcare) | WHA111703 | |
| HuMiX Gasket Collagen | Auer Precision | 216891-003 | |
| HuMiX Gasket Sandwich Bottom | Auer Precision | 216891-002 | |
| HuMiX Gasket Sandwich Top | Auer Precision | 216891-001 | |
| iPSC | Max Planck Institute for Molecular Biomedicine | K7 line | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Laminin from Engelbreth-Holmswarm | Sigma Aldrich | L2020 | |
| LDN193189 | Sigma Aldrich | SML0559 | |
| Limosilactobacillus reuteri | ATCC | 23272 | |
| Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit | Thermofisher Scientific | L7012 | |
| Male Luer with Spin Lock to Barb | Qosina | 11735 | |
| Marprene tubing (0.8 mm x 1.6 mm) | Watson-Marlow | 902.0008.J16 | |
| Matrigel hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | |
| Mucin, from porcine stomach | Sigma Aldrich | T3924 | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEAA | Thermofisher Scientific | 11140050 | |
| Needle (length: 120 mm; diameter: 0.80 mm) | B.Braun (color code: green) | 466 5643 | |
| Needle (length: 40 mm; diameter: 0.70 mm) | Henke Sass Wolf (color code: black) | 4710007040 | |
| Needle (length: 80 mm; diameter: 0.60 mm) | B.Braun (color code: blue) | 466 5635 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| PE/Cy7 anti-human CD49d antibody | Biolegend | 304314 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Peristaltic pump | Watson-Marlow | 205CA | |
| Poly-L-ornithine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Polycarbonate lids (HuMiX) | University of Arizona | HuMiX 1.0 / 2.0 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | |
| RLT Buffer (RNeasy Minikit) | Qiagen | 74104 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermofisher Scientific | 72400-021 | |
| SB431542, ALK inhibitor | Abcam | ab120163 | |
| Serum bottles | Glasgerätebau Ochs | 102091 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309110 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |
References
- Heintz-Buschart, A., Wilmes, P. Human gut microbiome: function matters. Trends in Microbiology. 26 (7), 563-574 (2018).
- Toor, D., et al. Dysbiosis disrupts gut immune homeostasis and promotes gastric diseases. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2432 (2019).
- Braak, H., de Vos, R. A. I., Bohl, J., Del Tredici, K. Gastric α-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neuroscience Letters. 396 (1), 67-72 (2006).
- Schmit, K. J., et al. Dietary fibre deprivation and bacterial curli exposure shift gut microbiome and exacerbate Parkinson's disease-like pathologies in an alpha-synuclein-overexpressing mouse. bioRxiv. , (2022).
- Fritz, J. V., Desai, M. S., Shah, P., Schneider, J. G., Wilmes, P. From meta-omics to causality: experimental models for human microbiome research. Microbiome. 1 (1), 14 (2013).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Wu, Q., et al. Organ-on-a-chip: Recent breakthroughs and future prospects. BioMedical Engineering Online. 19 (1), 9 (2020).
- May, S., Evans, S., Parry, L. Organoids, organs-on-chips and other systems, and microbiota. Emerging Topics in Life Sciences. 1 (4), 385-400 (2017).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535 (2016).
- Greenhalgh, K., et al. Integrated in vitro and in silico modeling delineates the molecular effects of a synbiotic regimen on colorectal-cancer-derived cells. Cell Reports. 27 (5), 1621-1632 (2019).
- Mao, J. H., et al. Genetic and metabolic links between the murine microbiome and memory. Microbiome. 8 (1), 53 (2020).
- Moysidou, C. M., Owens, R. M. Advances in modelling the human microbiome-gut-brain axis in vitro. Biochemical Society Transactions. 49 (1), 187-201 (2021).
- Kim, S., et al. Transneuronal propagation of pathologic α-synuclein from the gut to the brain models Parkinson's disease. Neuron. 103 (4), 627-641 (2019).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Marshall, J. J., Mason, J. O. Mouse vs man: Organoid models of brain development & disease. Brain Research. 1724, 146427 (2019).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Sedrani, C., Wilmes, P. Toward hypothesis-driven, personalized microbiome screening. Cell Reports Methods. 2 (1), 100139 (2022).
