Summary
Vi presenterer en trinnvis protokoll for isolering av langsiktige hematopoietiske stamceller (LT-HSC) og kortsiktige HSCs (ST-HSC) ved hjelp av Hoxb5 reportersystemet.
Abstract
Selvfornyelseskapasitet og multi-lineage differensieringspotensial anses generelt som de definerende egenskapene til hematopoietiske stamceller (HSC). Imidlertid har mange studier antydet at funksjonell heterogenitet eksisterer i HSC-rommet. Nylige enkeltcelleanalyser har rapportert HSC-kloner med forskjellige celleskjebner i HSC-rommet, som refereres til som partiske HSC-kloner. Mekanismene bak heterogene eller dårlig reproduserbare resultater er lite forstått, spesielt med hensyn til lengden på selvfornyelse når rensede HSC-fraksjoner transplanteres ved konvensjonell immunfarging. Derfor er etablering av en reproduserbar isolasjonsmetode for langsiktige HSC-er (LT-HSC) og kortsiktige HSC-er (ST-HSC), definert av lengden på selvfornyelsen, avgjørende for å overvinne dette problemet. Ved hjelp av objektiv flertrinnsscreening identifiserte vi en transkripsjonsfaktor, Hoxb5, som kan være en eksklusiv markør for LT-HSC i musens hematopoietiske system. Basert på dette funnet etablerte vi en Hoxb5 reportermuselinje og isolerte vellykket LT-HSCs og ST-HSCs. Her beskriver vi en detaljert protokoll for isolering av LT-HSC og ST-HSC ved bruk av Hoxb5 reportersystem. Denne isolasjonsmetoden vil hjelpe forskere bedre å forstå mekanismene for selvfornyelse og det biologiske grunnlaget for slik heterogenitet i HSC-rommet.
Introduction
Hematopoietiske stamceller (HSC), som har selvfornyelseskapasitet og multipotens, ligger på toppen av det hematopoietiske hierarkiet 1,2. I 1988 demonstrerte Weissman og kolleger for første gang at isolering av HSC hos mus kunne oppnås ved hjelp av flowcytometri3. Deretter ble en fraksjon definert ved en kombinasjon av celleoverflatemarkører, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, rapportert å inneholde alle HSCer hos mus 4,5,6,7,8.
Immunfenotypisk definert (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSCs (heretter pHSC) ble tidligere ansett som funksjonelt homogene. Nylige enkeltcelleanalyser har imidlertid vist at pHSC fortsatt viser heterogenitet med hensyn til deres selvfornyelseskapasitet9,10 og multipotens11,12. Spesielt synes to populasjoner å eksistere i pHSC-fraksjonen med hensyn til deres selvfornyelseskapasitet: langsiktige hematopoietiske stamceller (LT-HSC), som har kontinuerlig selvfornyelseskapasitet, og kortsiktige hematopoietiske stamceller (ST-HSC), som har forbigående selvfornyelseskapasitet 9,10.
Til dags dato er de molekylære mekanismene for selvfornyelseskapasitet som skiller LT-HSC og ST-HSC fortsatt dårlig forstått. Det er avgjørende å isolere begge cellepopulasjonene basert på deres selvfornyelseskapasitet og å oppdage underliggende molekylære mekanismer. Flere reportersystemer har også blitt introdusert for å rense LT-HSC13,14,15; LT-HSC-renheten definert av hvert rapporteringssystem er imidlertid variabel, og eksklusiv LT-HSC-rensing er ikke oppnådd til dags dato.
Derfor vil utviklingen av et isolasjonssystem for LT-HSC og ST-HSC akselerere forskningen om selvfornyelseskapasitet i pHSC-fraksjonen. I isolasjonen av LT-HSC og ST-HSC identifiserte en studie ved bruk av flertrinns, objektiv screening et enkelt gen, Hoxb5, som er heterogent uttrykt i pHSC-fraksjonen16. I tillegg viste benmargsanalyse av Hoxb5-reportermusene at omtrent 20% -25% av pHSC-fraksjonen består av Hoxb5 pos-celler. En konkurransedyktig transplantasjonsanalyse ved bruk av Hoxb5 pos pHSCs og Hoxb5 neg pHSCs viste at bare Hoxb5pos pHSCs har langsiktig selvfornyelseskapasitet, mens Hoxb5 neg pHSCs mister sin selvfornyelseskapasitet innen kort tid, noe som indikerer at Hoxb5 identifiserer LT-HSC i pHSC-fraksjonen16.
Her demonstrerer vi en trinnvis protokoll for å isolere LT-HSC-er og ST-HSC-er ved hjelp av Hoxb5-reportersystemet . I tillegg presenterer vi en konkurransedyktig transplantasjonsanalyse for å vurdere selvfornyelseskapasiteten til Hoxb5pos/neg pHSCs (figur 1). Dette Hoxb5 reportersystemet lar oss prospektivt isolere LT-HSCs og ST-HSCs og bidrar til forståelsen av LT-HSC-spesifikke egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de beskrevne dyreforsøkene ble godkjent av RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.
1. Prekondisjonering av mottakermusene
- Forbered mannlige C57BL/6 congenic mus i alderen 8-10 uker gamle som mottakermus. Antall mottakermus avhenger av den eksperimentelle protokollen. Vi forbereder vanligvis 10-20 mus for hver tilstand.
- Fôr musene med sterilisert vann supplert med enrofloxacin (170 mg / L). Siden bestrålte resipientmus er svært utsatt for smitte, bør merdene holdes så rene som mulig.
MERK: Tilskudd med antibiotika starter 24 timer før bestrålingen og fortsetter i 3 uker etter transplantasjonen for å unngå infeksjoner.
- Fôr musene med sterilisert vann supplert med enrofloxacin (170 mg / L). Siden bestrålte resipientmus er svært utsatt for smitte, bør merdene holdes så rene som mulig.
- Bestråling av hele kroppen
- Bestråling av hele kroppen ødelegger mottakerens benmargceller for å sikre transplantasjon av donorcellene. Overfør mottakermusene til et bestrålingsbur. Bestråle resipientmusene letisk med en enkeltdose på 8,7 Gy 12-16 timer før transplantasjon.
MERK: Stråledosen og tiden kan variere avhengig av utstyret. Den dødelige stråledosen skal bekreftes med forskerens bestråler og musestamme. - Sett dem tilbake til burene sine etter den totale kroppsbestrålingen.
- Bestråling av hele kroppen ødelegger mottakerens benmargceller for å sikre transplantasjon av donorcellene. Overfør mottakermusene til et bestrålingsbur. Bestråle resipientmusene letisk med en enkeltdose på 8,7 Gy 12-16 timer før transplantasjon.
2. Innsamling av donor benmargceller
- Forbered en mannlig Hoxb5-tri-mCherry-mus i alderen 12 uker gammel, og avlive musen ved CO2-eksponering etterfulgt av cervikal dislokasjon eller ved hjelp av metoder godkjent av den lokale dyreetiske komiteen.
MERK: Reagensvolumet per mus er beskrevet i følgende trinn. - Under sterile forhold, fjern huden og utsett beinene (lårben, tibia, bekken, humerus). Klipp de store musklene, og ta beinene (lårben, tibia, bekken, humerus) fra musen. Legg dem i sterile cellekulturfat med Ca 2+- og Mg2+-fri, iskald PBS.
- Trim muskler og fibrøst vev fra beinene ved hjelp av pinsett, liten saks og våtservietter for å forhindre forurensning. Vær forsiktig så du ikke brekker beinene i løpet av dette trinnet. Kast eventuelle knuste bein for å opprettholde sterilitet.
- Steriliser en morter og støt med 70% etanol (EtOH), og la dem tørke helt. Likevekt med cellefargebuffer (Ca 2+- og Mg2+-fri PBS supplert med 2% varmeinaktivert FBS, 2 mM EDTA, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin).
- Sett beinene i mørtelen, og tilsett 3 ml cellefargingsbuffer. Knus beinene åpne med pestle. Disaggregere celleklumpene ved forsiktig pipettering, og overfør cellesuspensjonen gjennom en 100 μm cellesil til et 50 ml rør.
- Gjenta trinn 2.5 til oppløsningen er klar. Vanligvis er tre ganger nok.
3. Separasjon av c-kit+ cellene ved magnetisk sortering
- Antistofffarging for magnetisk sortering
- Sentrifuger prøvene ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter. Aspirer supernatanten, og resuspender pelleten i 1 ml cellefargebuffer. Tilsett 10 μL rotte-IgG (5 mg/ml) for å redusere uspesifikk antistoffbinding, og piper forsiktig opp og ned med en P1000-pipette. Inkuber på is i 15 min.
- Tilsett c-Kit antistoffet (klon 2B8) i en konsentrasjon på 4 μg / ml, og bland med en P1,000 pipette. Inkuber på is i 15 min.
- Tilsett 5 ml cellefargebuffer, og bland godt. Sentrifuger prøvene ved 400 x g, 4 °C, 5 min. Aspirer supernatanten, og resuspender pelleten i 500 μL cellefargebuffer.
- Tilsett 35 μL anti-APC-mikroperler for å berike c-Kit+ -cellene, og bland med en P1,000-pipette. Inkuber på is i 15 min.
- Tilsett 4-5 ml cellefargebuffer. Sentrifuger prøvene ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter. Aspirer supernatanten, og resuspender pelleten i 1 ml cellefargebuffer.
- Sortere c-Kit+ -cellene magnetisk
- Følg produsentens instruksjoner for å sortere cellene. Kort sagt, prime en magnetisk sorteringskolonne med 3 ml cellefargebuffer. Filtrer prøven (1 ml) gjennom en 40 μm cellesil og last prøven på den magnetiske sorteringskolonnen.
- Vask ved å tilsette 3 ml cellefargebuffer tre ganger. Legg til cellefargebufferen bare når kolonnereservoaret er tomt.
- Sett den magnetiske sorteringskolonnen på toppen av et iskaldt 15 ml rør og tilsett 5 ml cellefargebuffer. Skyll ut cellene ved å trykke stempelet bestemt inn i kolonnen. Hold gjennomstrømningen på is.
MERK: I tilfelle utilsiktet prøvetap, beholder vi gjennomstrømningen til slutten av eksperimentet.
4. Hematopoietisk stamcellefarging
- Sentrifuge prøven fremstilt i trinn 3.2.3 ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter. Aspirer supernatanten.
- Tilsett CD34-antistoffet (klon RAM34) i en konsentrasjon på 50 μg/ml til pelleten, og rug på is i 60 minutter.
MERK: Fremstilling av støttecellene i løpet av den første timen av inkubasjon med CD34 anbefales for å forkorte behandlingstiden. - Klargjør antistoffblandingen i henhold til tabell 1. Tilsett 100 μL av masterblandingen i prøven, og rug på is i 30 minutter. Antistoffet for CD34 antigenet (klone; RAM34) krever 90 min for tilstrekkelig farging.
- Tilsett 4-5 ml cellefargebuffer. Sentrifuger prøven ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter. Aspirer supernatanten. Tilsett streptapavidin-BUV737 i en konsentrasjon på 3 μg/ml til pelleten, og rug på is i 30 minutter.
- Tilsett 4-5 ml cellefargebuffer. Sentrifuger prøven ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter. Aspirer supernatanten, og resuspender pelleten i 400 μL cellefargebuffer. Hold prøven på is.
5. Støtte cellepreparasjon
- Forbered en CD45.1+ CD45.2+ congenic mus i alderen 12 uker gammel; Ideelt sett bør dette være i samme alder som donormusen. Avlive musen ved CO2 eksponering etterfulgt av cervical dislokasjon eller ved hjelp av metoder godkjent av den lokale dyreetiske komiteen.
MERK: I det oppgitte eksemplet ble CD45.1+ CD45.2+ kongene mus avlet internt ved å krysse B6. CD45.1 congenic mus med C57BL/6J mus16. - Under sterile forhold, ta både lårben og tibiae, og legg dem i sterile cellekulturskåler med Ca 2+- og Mg2+-fri, iskald PBS. Trim muskler og fibrøst vev fra beinene ved hjelp av pinsett og liten saks.
- Klipp begge ender av beinene med skarp, steril saks. Bruk en 23 G kanyle og en 5 ml sprøyte fylt med iskald cellesuspensjonsbuffer (Ca 2+- og Mg2+-fri PBS supplert med 2% varmeinaktivert FBS, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) for å skylle benmargen ut i en steril cellekulturskål med cellesuspensjonsbuffer. Disaggregere celleklumpene ved forsiktig pipettering.
- Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 40 μm cellesil ved hjelp av en P1000-pipette. Telle cellenummeret til cellesuspensjonen ved hjelp av et hemocytometer og klargjør en benmargscellesuspensjon inneholdende 1 x 106 celler/ml.
- Overfør 200 μL av benmargscellesuspensjonen (2 x 105 celler) til en 96-brønns, rundbunnsplate. Oppbevares på is til bruk.
MERK: Rundbunnsplater anbefales for enkel celleoppsamling.
6. Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC sortering
- Oppsett av gatting
- Overfør 400 μL av prøven fremstilt i trinn 4.5 til et lavbunns polystyren reagensrør med en 35 μm cellesil snap cap. Forbered dødcellefargingsreagens, og legg det til prøven før analysen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Slå på et flowcytometer, og start analyseprogramvaren i henhold til produsentens instruksjoner. Trykk deretter Last inn, og hent dataene.
MERK: Et flowcytometer utstyrt med fem lasere og en 70 μm dyse anbefales for å forbedre renheten til de sorterte cellene. - Etter å ha ekskludert dubletter, døde celler og avstamningspositive celler, gate Lineage-c-Kit + Sca-1 + fraksjonen. Deretter tar du ut Flk2+-brøken. Deretter gate Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSCs i CD150 + CD34 - / lav fraksjon (figur 2). Utfør kompensasjon for spektral overlapping i det første eksperimentet.
MERK: Hoxb5 positive celler forventes å representere 20% -25% av Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 - / lavFlk2 - fraksjon.
- Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC sortering
- Forbered et 1,5 ml lavproteinbindingsrør med 600 μL Ca 2+- og Mg2+-fri PBS supplert med 10% varmeinaktivert FBS.
- Sett 1,5 ml bindingsrøret med lavt proteininnhold på en sorteringsenhet, og sorter Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC-er i 1,5 ml røret ved hjelp av gating-strategien angitt i trinn 6.1.3. I den første sorteringen bruker du utbyttet fra sorteringspresisjonsmodus.
- Sett 96-brønnsplaten med støttecellene som ble utarbeidet i trinn 5.5 på ACDU-trinnet (Automated Cell Deposition Unit). Sett 1,5 ml lavproteinbindingsrøret klargjort i trinn 6.2.2 til lasteporten til et flowcytometer.
- Sorter Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSCs i en 96-brønns plate med støttecellene ved hjelp av gating-strategien angitt i trinn 6.1.3. Sorter 10 Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC-er for å teste deres selvfornyelseskapasitet.
MERK: Dobbeltsortering anbefales for å forbedre renheten. I den andre sorteringen bruker du renhet som anbefalt sorteringspresisjonsmodus. - Vanligvis høstes 500-1,000 Hoxb5pos pHSCs og 1,500-4,000 Hoxb5neg pHSCs etter dobbeltsortering. Fortsett med transplantasjonsprosedyrene så snart som mulig etter HSC-sorteringen for å forbedre cellens levedyktighet (ideelt innen 1-2 timer).
7. Transplantasjon
- Legg den HSC-sorterte platen med 96 brønner klargjort i trinn 6.2.4 på is. Håndter den HSC-sorterte platen med 96 brønner under sterile forhold, ideelt sett i en cellehette.
- Bedøv en mottakermus med 2% isofluran i et induksjonskammer for gassanestesi. Når dyret er fullt bedøvet, fjern det og legg det på siden. For å sikre tilstrekkelig anestesi, bekreft ingen bevegelse som svar på en skadelig stimulus.
- Etter bekreftelse av riktig anestesi, utfør en retro-orbital injeksjon så snart som mulig for å forhindre at musen gjenvinner bevisstheten. Den retro-orbitale injeksjonen tar mindre enn 30 s.
MERK: Siden injeksjonstiden er kort, fullfører vi prosedyren uten å bruke oftalmisk salve i øynene. Men hvis prosedyren tar lengre tid, anbefaler vi bruk av oftalmisk salve. - Pipetter cellene forsiktig i den HSC-sorterte 96-brønnsplaten for å blande dem. Samle donorcellene i sorteringsplaten ved hjelp av en 30 G insulinsprøyte, og injiser dem i den retroorbitale venøse plexus hos mottakermusene. Det anbefalte injiserbare volumet er ≤200 μL.
- Observer til musene er bevisste og beveger seg rundt i et rent bur. Returner dem til burene sine etter å ha bekreftet utvinningen.
8. Perifer blodanalyse
- Samle 50 μL perifert blod fra halvenen, og resuspender det med 100 μL Ca 2+- og Mg2+-fri PBS med 2 mM EDTA. Overfør alle prøvene til en 96-brønnsplate. Sentrifuger ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter, og kast supernatanten.
- Tilsett 200 μL lysisbuffer for røde blodlegemer, og rug på is i 3 minutter. Sentrifuger prøvene ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter, og kast supernatanten. Gjenta en gang til.
- Tilsett 200 μL cellefargebuffer. Sentrifuger prøvene ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter, og kast supernatanten.
- Klargjør antistoff master mix i henhold til tabell 2. Tilsett 50 μL antistoffmasterblanding, og rug på is i 30 minutter.
- Tilsett 150 μL cellefargebuffer. Sentrifuger prøvene ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter, og kast supernatanten.
- Tilsett 200 μL cellefargebuffer. Sentrifuger prøvene ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter, og kast supernatanten. Resuspender i 200 μL cellefargebuffer, og tilsett dødcellefargingsreagens før analysen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Analyser perifer blodkimerisme ved hjelp av et flowcytometer som beskrevet tidligere16. Samle blod ved 4 uker, 8 uker, 12 uker og 16 uker etter transplantasjon for å følge flerlinjet rekonstituering. Representative flowcytometriplott er vist i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidligere har selvfornyelseskapasitet blitt målt ved hjelp av konkurrerende transplantasjonsanalyser, der donor-HSC antas å beholde sin selvfornyelsesevne bare hvis multi-lineage donorceller i mottakerens perifere blod observeres17. I tillegg definerer flere rapporter LT-HSCs som celler som fortsetter å produsere perifere blodceller flere måneder etter den andre benmargstransplantasjonen10,18. Derfor, for å sammenligne deres selvfornyelsesevner, ble 10 Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSCs isolert fra Hoxb5 reportermus transplantert til dødelig bestrålte primære mottakermus med 2 x 105 hele benmargceller. Deretter, 16 uker etter primærtransplantasjonen, ble 1 x 107 benmargsceller isolert fra primærmottakermusene transplantert til lethalt bestrålte sekundærmottakermus for å vurdere langtidsfornyelsesevnen (figur 1). Figur 2 viser representative flowcytometriplott av beinmargsanalysen til Hoxb5-tri-mCherry-musene. Omtrent 20% -25% av cellene i pHSC-fraksjonen definert av Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 - / loFlk2 - var Hoxb5pos pHSC, som utgjør bare 0,001% -0,00125% av musebenmargen. Figur 3 viser representative flowcytometriplott av analysen av perifert blod hos resipientmusene. CD45.2-donormusene (Hoxb5-tri-mCherry-musene), CD45.1/CD45.2-støtteceller og CD45.1-mottakermus ble forberedt på henholdsvis å analysere donor-, støtte- og mottakerceller separat.
Figur 4 viser perifere blodanalyser hos mottakermus ved 4 uker, 8 uker, 12 uker og 16 uker etter transplantasjon for å bekrefte donorkimerisme. Disse analysene viste at selv om Hoxb5 pos og Hoxb5neg pHSC har lignende donorkimerisme 4 uker etter transplantasjon, ble kontinuerlig hematopoiese kun observert hos Hoxb5pos pHSC-mottakere (figur 4A,B). På den annen side begynte Hoxb5neg HSCs å miste evnen til å produsere hematopoietiske celler 8 uker etter transplantasjon (figur 4A,B). I sekundærtransplantasjonsanalysen var det kun Hoxb5pos pHSC-mottakerne som presenterte robust hematopoiese (figur 5A,B). I motsetning til dette ble donorceller knapt observert i Hoxb5 neg pHSC-mottakermus, noe som tyder på at Hoxb5neg pHSCs mister sin selvfornyelsesevne innen 16 uker etter transplantasjon hos primære mottakermus. Disse dataene viser at Hoxb5-uttrykk kan brukes som en spesifikk markør for LT-HSC.
Figur 1: Eksperimentelt skjematisk for langsiktige hematopoietiske rekonstitusjonstester. Mottakermusene ble lethalt bestrålt og konkurransedyktig transplantert med 10 HSC og 2 x 105 hele beinmargsceller (støtteceller). Ved sekundærtransplantasjoner ble 1 x 107 hele beinmargsceller overført fra primærmottakermus. Forkortelser: PB = perifert blod; WBM = hele benmargen. Denne figuren er modifisert fra Chen et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Gating strategi for sortering av Hoxb5pos og Hoxb5neg pHSCs. Representativ flowcytometrigating for å isolere LKS, Flk2−, pHSC, Hoxb5pos og Hoxb5neg pHSCs etter utelukkelse av dubletter og døde celler. Verdiene angir prosentandelen av hver fraksjon ± s.d. (n = 3). Linjene inkluderer B220, CD3ε, CD4, CD8a, Gr-1 og Ter-119. Denne figuren er modifisert fra Chen et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Representative FACS-plott av perifert blod i mottakermus. Gating skjema for å identifisere perifere blodceller (NK-celle, granulocytt, monocytt, T-celle og B-celle) i en mottakermus etter utelukkelse av dubletter og døde celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Kimerisme hos mottakermus etter primærtransplantasjon. (A) Prosentandel kimerisme ved 4 uker, 8 uker, 12 uker og 16 uker hos primærmottakere som fikk 10 Hoxb5neg (n = 9), Hoxb5lo (n = 13) eller Hoxb5hi (n = 18) pHSC. Hver kolonne representerer en individuell mus. Hoxb5hi-fraksjonen ble definert som den øverste 5% av Hoxb5-uttrykket og andre som Hoxb5 lo-fraksjonen. (B) Det gjennomsnittlige bidraget fra donoravstamning i 10 celleprimærtransplantasjoner. Feilfeltene angir s.d. Denne figuren er modifisert fra Chen et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kimerisme hos mottakermus etter sekundærtransplantasjon. (A) Prosentandel kimerisme ved 4 uker, 8 uker, 12 uker og 16 uker etter heltransplantasjon av sekundærtransplantasjon i benmargen. (B) Individuell donorkimerisme etter avstamning hos sekundære mottakere av hele benmargen. Hver linje representerer en individuell mus. Denne figuren er modifisert fra Chen et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Antistoff | Klon | Konsentrasjon | Fluorokromer |
| FLK-2 | A2-F10 | 4 mikrogram/ml | PerCP/eFlour710 |
| CD150 | TC15-12F12.2 | 4 mikrogram/ml | BV421 |
| CD11b | M1/70 | 4 mikrogram/ml | BV711 |
| SCA-1 | D7 | 4 mikrogram/ml | BUV395 |
| CD16/32 | 93 | 4 mikrogram/ml | A-700 |
| CD127 | A7R34 | 4 mikrogram/ml | A-700 |
| CD3ε | 145-2C11 | 10 mikrogram/ml | Biotin |
| CD4 | GK1.5 | 10 mikrogram/ml | Biotin |
| CD8a | 53-6.7 | 10 mikrogram/ml | Biotin |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 10 mikrogram/ml | Biotin |
| B220 | RA3-6B2 | 10 mikrogram/ml | Biotin |
| Ter119 | TER119 | 10 mikrogram/ml | Biotin |
Tabell 1: Antistoff master mix for hematopoietisk stamcellefarging.
| Antistoff | Klon | Konsentrasjon | Fluorokromer |
| CD45.1 | A20 | 1 mikrogram/ml | FITC |
| CD45.2 | 104 | 1 mikrogram/ml | PE |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 2,5 μg/ml | A700 |
| NK1.1 | PK136 | 1 mikrogram/ml | PerCP-cyanin5.5 |
| CD11b | M1/70 | 1 mikrogram/ml | BUV395 |
| CD3ε | 145-2C11 | 1 mikrogram/ml | BV421 |
| TCRβ | H57-597 | 1 mikrogram/ml | BV421 |
| B220 | RA3-6B2 | 1 mikrogram/ml | BV786 |
Tabell 2: Antistoff master mix for perifere blodceller farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tradisjonelt har celleoverflatemarkørdefinerte HSC-er blitt forberedt på å studere funksjonene til HSC-er, for eksempel selvfornyelseskapasitet og multipotens 19,20,21. Den immunfenotypisk definerte (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC-fraksjonen inneholder imidlertid to diskrete HSC-populasjoner: LT-HSCs og ST-HSCs 9,10. Derfor er den spesifikke analysen av bonafide HSC, LT-HSC, ennå ikke oppnådd. Følgelig vil en isolasjonsmetode for LT-HSC ved bruk av Hoxb5-reportersystemet gi betydelig fordel for søket etter molekylære mekanismer for selvfornyelseskapasitet.
Her vil vi diskutere kritiske trinn i denne protokollen. Først må trinn 1 til trinn 7 fullføres uten avbrudd. Disse trinnene tar vanligvis 9-12 timer, og det er viktig å holde prøvene ved 4 ° C gjennom disse prosedyrene, så mye som mulig, for å opprettholde prøvens levedyktighet. Deretter høstes ca. 1 x 108 benmargceller fra mus. Dermed må vi bruke et tilstrekkelig volum antistoffer for å reprodusere fargeytelsen. I tillegg antistoffet for CD34 antigenet (klone; RAM34) krever 90 min for tilstrekkelig farging, mens 30 min er nok for andre antistoffer. For det andre forårsaker bestråling vanligvis pancytopeni hos mottakermusene. Hvis mottakerderiverte nøytrofiler vedvarer i mange mottakermus, indikerer dette at stråledosen var utilstrekkelig. I slike tilfeller anbefales optimalisering av stråledosen. For det tredje, hvis de fleste musene dør kort tid etter transplantasjonen, er det to mulige forklaringer: et utilstrekkelig antall støtteceller eller mislykket retroorbital injeksjon.
I flere tiår har det vært kontroversielt om bonafid HSC-fraksjonen er homogen eller heterogen22,23,24. I denne studien presenterte mottakermusene som fikk Hoxb5pos pHSC-transplantasjon forskjellige donorkimærer og differensieringsmønstre (figur 4A), noe som indikerer at denne fraksjonen kunne være heterogen. Imidlertid kan disse svingningene skyldes både bruk av urensede benmargceller som støtteceller og de forskjellige radiosensitivitetene til individuelle mus25.
Oppsummert har vi demonstrert en trinnvis protokoll for isolering av LT-HSCs og ST-HSCs ved hjelp av Hoxb5 reportersystemet. Hittil har påvisning av LT-HSC vært avhengig av den konkurrerende transplantasjonsanalysen, som krever mer enn 8 måneder. I motsetning til dette gjør Hoxb5 reportersystemet oss i stand til å identifisere både LT-HSCs og ST-HSCs prospektivt og bruke dem til ulike funksjonelle analyser. Figur 4 og figur 5 viser også at Hoxb5-uttrykksnivået ser ut til å være korrelert med graden av donorkimerisme hos andre mottakermus. I tillegg, ved å dra nytte av Hoxb5-reportersystemet, avslørte vi tidligere at LT-HSCs og ST-HSCs fungerer på en komplementær måte for kontinuerlig hematopoietisk rekonstitusjon etter hematopoietisk stamcelletransplantasjon26. Videre demonstrerte vi at eksogent Hoxb5-uttrykk delvis kunne reversere celleskjebnen til ST-HSC til LT-HSC, noe som indikerer at tilstedeværelsen eller fraværet av Hoxb5 forklarer heterogeniteten av selvfornyelsesevne i celleoverflatemarkørdefinert HSC-fraksjon27.
I tillegg til disse funnene, tillater den potensielle isoleringen av LT-HSC oss å analysere LT-HSC under ulike fysiologiske forhold, som aldring, betennelse og så videre. Disse analysene vil i stor grad lette forståelsen av funksjonene til LT-HSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter knyttet til denne studien.
Acknowledgments
Vi takker Hiroshi Kiyonari for dyrepleie og for å gi mottakermus ved RIKEN BDR, samt Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka og Masaki Miyahashi for laboratorieledelse ved Kobe University. Forfatterne setter også stor pris på den løpende støtten til dette arbeidet. Masanori Miyanishi ble støttet av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 og JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for medisinsk og farmasøytisk forskning, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders, og AMED-PRIME, AMED under tilskuddsnummer JP18gm6110020. Taro Sakamaki støttes av JSPS KAKENHI tilskuddsnumre JP21K20669 og JP22K16334 og ble støttet av JSPS Core-to-Core Program og RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi ble støttet av JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
References
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
- Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
- Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
- Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075 (2016).
- Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
- Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
- Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
- Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
- Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
- Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
- Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
- Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).
