Summary
Apresentamos um protocolo passo a passo para o isolamento de células-tronco hematopoéticas de longa duração (CT-HSCs) e CTHs de curta duração (CTH-ST) utilizando o sistema repórter Hoxb5.
Abstract
A capacidade de autorrenovação e o potencial de diferenciação de múltiplas linhagens são geralmente considerados como as características definidoras das células-tronco hematopoéticas (CTH). No entanto, numerosos estudos têm sugerido que existe heterogeneidade funcional no compartimento das CTH. Análises recentes de célula única relataram clones de HSC com diferentes destinos celulares dentro do compartimento HSC, que são referidos como clones de HSC tendenciosos . Os mecanismos subjacentes aos resultados heterogêneos ou pouco reprodutíveis são pouco compreendidos, especialmente em relação ao tempo de auto-renovação quando frações purificadas de HSC são transplantadas por imunomarcação convencional. Portanto, estabelecer um método de isolamento reprodutível para HSCs de longa duração (CT-HSCs) e de curta duração (HSCs-ST), definido pelo tempo de sua auto-renovação, é crucial para superar essa questão. Usando triagem multi-etapa imparcial, identificamos um fator de transcrição, Hoxb5, que pode ser um marcador exclusivo de LT-HSCs no sistema hematopoiético de camundongos. Com base nesse achado, estabelecemos uma linhagem de camundongos repórteres Hoxb5 e isolamos com sucesso LT-HSCs e ST-HSCs. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de LT-HSCs e ST-HSCs usando o sistema de repórteres Hoxb5 . Este método de isolamento ajudará os pesquisadores a entender melhor os mecanismos de auto-renovação e as bases biológicas para tal heterogeneidade no compartimento HSC.
Introduction
As células-tronco hematopoéticas (CTH), que possuem capacidade de autorrenovação e multipotência, residem no ápice da hierarquia hematopoética 1,2. Em 1988, Weissman e colaboradores demonstraram pela primeira vez que o isolamento de HSCs de camundongos poderia ser obtido usando citometria de fluxo3. Posteriormente, uma fração definida por uma combinação de marcadores de superfície celular, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, foi relatada como contendo todas as CTHs em camundongos 4,5,6,7,8.
As HSCs imunofenotipicamente definidas (Linhagem−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/lo Flk2−) (doravante, pHSCs) foram previamente consideradas funcionalmente homogêneas. No entanto, análises recentes de células únicas têm revelado que as pHSCs ainda exibem heterogeneidade em relação à sua capacidade de autorrenovação 9,10 e multipotência11,12. Especificamente, duas populações parecem existir na fração pHSC no que diz respeito à sua capacidade de autorrenovação: as células-tronco hematopoéticas de longa duração (CTH-LT), que têm capacidade de auto-renovação contínua, e as células-tronco hematopoéticas de curto prazo (CTH-ST), que têm capacidade de autorrenovação transitória 9,10.
Até o momento, os mecanismos moleculares da capacidade de auto-renovação que distinguem LT-HSCs e ST-HSCs permanecem pouco compreendidos. É crucial isolar ambas as populações celulares com base em suas capacidades de auto-renovação e descobrir mecanismos moleculares subjacentes. Vários sistemas repórteres também foram introduzidos para purificar LT-HSCs13,14,15; no entanto, a pureza LT-HSC definida por cada sistema repórter é variável, e a purificação exclusiva de LT-HSC não foi alcançada até o momento.
Portanto, o desenvolvimento de um sistema de isolamento para LT-HSCs e ST-HSCs acelerará as pesquisas sobre a capacidade de auto-renovação na fração pHSC. No isolamento de LT-HSCs e ST-HSCs, um estudo utilizando triagem em várias etapas e sem viés identificou um único gene, Hoxb5, que é heterogeneamente expresso na fração pHSC16. Além disso, a análise da medula óssea dos camundongos repórteres Hoxb5 revelou que aproximadamente 20%-25% da fração pHSC consiste de células Hoxb5 pos. Um ensaio competitivo de transplante usando pHSCs Hoxb5 pos e pHSCs Hoxb5 neg revelou que apenas as pHSCs Hoxb5pos possuem capacidade de auto-renovação de longo prazo, enquanto aspHSCs Hoxb5neg perdem sua capacidade de auto-renovação em um curto período, indicando que Hoxb5 identifica LT-HSCs na fraçãopHSC 16.
Aqui, demonstramos um protocolo passo a passo para isolar LT-HSCs e ST-HSCs usando o sistema de relatório Hoxb5 . Além disso, apresentamos um ensaio competitivo de transplante para avaliar a capacidade de autorrenovação das pHSCs Hoxb5pos/neg (Figura 1). Este sistema de reporte Hoxb5 nos permite isolar prospectivamente LT-HSCs e ST-HSCs e contribui para o entendimento das características específicas de LT-HSC.
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Protocol
Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.
1. Pré-condicionamento dos camundongos receptores
- Preparar camundongos machos C57BL/6 congênicos com idade entre 8-10 semanas de idade como camundongos receptores. O número de camundongos receptores depende do protocolo experimental. Normalmente, preparamos de 10 a 20 camundongos para cada condição.
- Alimentar os camundongos com água esterilizada suplementada com enrofloxacina (170 mg/L). Como os camundongos receptores irradiados são altamente suscetíveis à infecção, mantenha as gaiolas o mais limpas possível.
NOTA: A suplementação com antibióticos começa 24 h antes da irradiação e continua por 3 semanas após o transplante para evitar infecções.
- Alimentar os camundongos com água esterilizada suplementada com enrofloxacina (170 mg/L). Como os camundongos receptores irradiados são altamente suscetíveis à infecção, mantenha as gaiolas o mais limpas possível.
- Irradiação corporal total
- A irradiação corporal total destrói as células da medula óssea receptora para garantir o enxerto das células do doador. Transfira os camundongos receptores para uma gaiola de irradiação. Irradiar letalmente os camundongos receptores com dose única de 8,7 Gy em 12-16 h antes do transplante.
NOTA: A dose e o tempo de radiação podem variar dependendo do equipamento. A dose letal de radiação deve ser confirmada com o irradiador do pesquisador e a cepa do camundongo. - Devolvê-los às suas gaiolas após a irradiação total do corpo.
- A irradiação corporal total destrói as células da medula óssea receptora para garantir o enxerto das células do doador. Transfira os camundongos receptores para uma gaiola de irradiação. Irradiar letalmente os camundongos receptores com dose única de 8,7 Gy em 12-16 h antes do transplante.
2. Coleta das células da medula óssea do doador
- Preparar um camundongo Hoxb5-tri-mCherry macho com 12 semanas de idade e eutanasiar o camundongo por exposição ao CO2 seguida de deslocamento cervical ou usando métodos aprovados pelo comitê de ética animal local.
Observação : O volume de reagente por mouse é descrito nas etapas a seguir. - Sob condições estéreis, remova a pele e exponha os ossos (fêmur, tíbia, pelve, úmero). Corte os principais músculos e tire os ossos (fêmur, tíbia, pelve, úmero) do rato. Coloque-os em placas de cultura celular estéril com Ca 2+ e Mg2+-free, PBS gelado.
- Corte os músculos e tecidos fibrosos dos ossos usando pinças, pequenas tesouras e lenços umedecidos para evitar a contaminação. Tenha cuidado para não quebrar os ossos durante esta etapa. Descarte os ossos quebrados para manter a esterilidade.
- Esterilizar uma argamassa e pilão com etanol 70% (EtOH), e deixá-los secar completamente. Equilibre com tampão de coloração celular (PBS livre de Ca 2+ e Mg2+ suplementado com FBS inativado pelo calor a 2%, EDTA 2 mM, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 μg/mL).
- Coloque os ossos na argamassa e adicione 3 mL de tampão de coloração celular. Esmague os ossos abertos com o pilão. Desagregar os aglomerados celulares por pipetagem suave e transferir a suspensão celular através de um filtro celular de 100 μm para um tubo de 50 mL.
- Repita o passo 2.5 até que a solução fique límpida. Normalmente, três vezes é suficiente.
3. Separação das células c-kit+ por classificação magnética
- Coloração de anticorpos para classificação magnética
- Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de tampão de coloração celular. Adicionar 10 μL de IgG de rato (5 mg/mL) para reduzir a ligação de anticorpos inespecíficos e pipetar suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta P1.000. Incubar no gelo por 15 min.
- Adicionar o anticorpo c-Kit (clone 2B8) na concentração de 4 μg/mL e misturar com uma pipeta P1.000. Incubar no gelo por 15 min.
- Adicione 5 mL de tampão de coloração celular e misture bem. Centrifugar as amostras a 400 x g, 4 °C, 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 μL de tampão de coloração celular.
- Adicione 35 μL de microesferas anti-APC para enriquecer as células c-Kit+ e misture com uma pipeta P1.000. Incubar no gelo por 15 min.
- Adicionar 4-5 mL de tampão de coloração celular. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de tampão de coloração celular.
- Classificando as células c-Kit+ magneticamente
- Siga as instruções do fabricante para classificar as células. Em resumo, prima uma coluna de classificação magnética com 3 mL de tampão de coloração celular. Filtrar a amostra (1 ml) através de um filtro celular de 40 μm e carregar a amostra na coluna de classificação magnética.
- Lavar adicionando três vezes 3 mL de tampão de coloração celular. Adicione o buffer de coloração de célula somente quando o reservatório da coluna estiver vazio.
- Coloque a coluna de classificação magnética em cima de um tubo gelado de 15 mL e adicione 5 mL de tampão de coloração celular. Limpe as células empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna. Mantenha o fluxo no gelo.
OBS: Em caso de perda acidental da amostra, mantemos o fluxo-through até o final do experimento.
4. Coloração de células-tronco hematopoéticas
- Centrifugar a amostra preparada na etapa 3.2.3 a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
- Adicionar o anticorpo CD34 (clone RAM34) na concentração de 50 μg/mL ao pellet e incubar no gelo por 60 min.
NOTA: A preparação das células de suporte durante a primeira hora de incubação com CD34 é recomendada para encurtar o tempo de processamento. - Preparar a mistura mestra de anticorpos de acordo com a Tabela 1. Adicionar 100 μL da mistura principal à amostra e incubar no gelo durante 30 minutos. O anticorpo para o antígeno CD34 (clone; RAM34) requer 90 min para coloração suficiente.
- Adicionar 4-5 mL de tampão de coloração celular. Centrifugar a amostra a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Adicionar estreptavidina-BUV737 a uma concentração de 3 μg/mL ao pellet e incubar no gelo por 30 min.
- Adicionar 4-5 mL de tampão de coloração celular. Centrifugar a amostra a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 400 μL de tampão de coloração celular. Mantenha a amostra no gelo.
5. Apoio à preparação celular
- Preparar um camundongo CD45.1+ CD45.2+ congênico com 12 semanas de idade; O ideal é que este tenha a mesma idade do camundongo doador. Eutanásia do camundongo por exposição ao CO2 seguida de luxação cervical ou usando métodos aprovados pelo comitê de ética animal local.
NOTA: No exemplo fornecido, camundongos CD45.1+ CD45.2+ congênicos foram criados internamente cruzando B6. Camundongos CD45.1 congênicos com camundongos C57BL/6J16. - Sob condições estéreis, pegue os fêmures e as tíbias e coloque-os em placas de cultura de células estéreis com PBS gelado sem Ca 2+ e Mg2+. Aparar os músculos e tecidos fibrosos dos ossos usando pinças e pequenas tesouras.
- Corte as duas extremidades dos ossos com uma tesoura afiada e estéril. Use uma agulha de 23 G e uma seringa de 5 mL preenchida com tampão de suspensão de células geladas (PBS livre de Ca 2+ e Mg2+ suplementado com SFB inativado pelo calor a 2%, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 μg/mL) para liberar a medula óssea em uma placa de cultura celular estéril com tampão de suspensão celular. Desagregar os aglomerados celulares por pipetagem suave.
- Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm usando uma pipeta P1.000. Contar o número de células da suspensão celular usando um hemocitômetro e preparar uma suspensão de células da medula óssea contendo 1 x 106 células/mL.
- Transferir 200 μL da suspensão de células da medula óssea (2 x 105 células) para uma placa de fundo redondo de 96 poços. Manter no gelo até o uso.
NOTA: Placas de fundo redondo são recomendadas para facilitar a coleta de células.
6. Hoxb5pos ou Hoxb5neg pHSC classificação
- Configuração do Gating
- Transferir 400 μL da amostra preparada na etapa 4.5 para um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo com uma tampa de encaixe do filtro de células de 35 μm. Preparar o reagente de coloração de células mortas e adicioná-lo à amostra antes da análise de acordo com as instruções do fabricante.
- Ligue um citômetro de fluxo e inicie o software de análise de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, pressione Carregar e adquira os dados.
NOTA: Um citômetro de fluxo equipado com cinco lasers e um bico de 70 μm é recomendado para aumentar a pureza das células classificadas. - Depois de excluir duplos, células mortas e células positivas para linhagem, abra a fração Lineage−c-Kit+Sca-1+ . Em seguida, cancele a fração Flk2+ . Em seguida, gate Hoxb5pos ou Hoxb5neg pHSCs na fração CD150+CD34−/baixa (Figura 2). Realizar compensação para a sobreposição espectral no primeiro experimento.
NOTA: Espera-se que as células positivas para Hoxb5 representem 20%-25% da fração Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/Flk2− baixa.
- Hoxb5pos ou Hoxb5neg pHSC classificação
- Preparar um tubo de 1,5 mL de baixa ligação à proteína com 600 μL de PBS livre de Ca 2+ e Mg2+ suplementado com FBS inativado pelo calor a 10%.
- Coloque o tubo de 1,5 mL de baixa ligação à proteína em um dispositivo de coleta de classificação e classifique ospHSCs Hoxb5 pos ou Hoxb5neg no tubo de 1,5 mL usando a estratégia de gating definida na etapa 6.1.3. Na primeira classificação, use o rendimento do modo de precisão de classificação.
- Ajuste a placa de 96 poços com as células de suporte preparadas na etapa 5.5 no estágio da unidade de deposição celular automatizada (ACDU). Ajustar o tubo de ligação de 1,5 ml de baixa proteína preparado no passo 6.2.2 para a porta de carregamento de um citómetro de fluxo.
- Classifique ospHSCs Hoxb5 pos ou Hoxb5neg em uma placa de 96 poços com as células de suporte usando a estratégia de gating definida na etapa 6.1.3. Classifique 10pHSCs Hoxb5 pos ou Hoxb5neg para testar suas capacidades de autorrenovação.
NOTA: Recomenda-se a dupla classificação para aumentar a pureza. Na segunda classificação, use a pureza como o modo de precisão de classificação recomendado. - Normalmente, 500-1.000pHSCs Hoxb5 pos e 1.500-4.000 pHSCs Hoxb5neg são colhidos após dupla classificação. Prossiga com os procedimentos de transplante o mais rápido possível após a triagem do HSC para melhorar a viabilidade celular (idealmente dentro de 1-2 h).
7. Transplante
- Coloque no gelo a placa de 96 poços preparada na etapa 6.2.4 classificada por HSC. Manuseie a placa de 96 poços classificada para HSC em condições estéreis, idealmente em uma capela celular.
- Anestesiar camundongo receptor com isoflurano a 2% em câmara de indução gasosa para anestesia. Assim que o animal estiver totalmente anestesiado, retire-o e coloque-o de lado. Para garantir anestesia suficiente, confirme que nenhum movimento em resposta a um estímulo nocivo.
- Após a confirmação da anestesia adequada, realize uma injeção retro-orbital o mais rápido possível para evitar que o camundongo recupere a consciência. A injeção retro-orbital leva menos de 30 s.
NOTA: Como o tempo de injeção é curto, terminamos o procedimento sem aplicar pomada oftálmica nos olhos. No entanto, se o procedimento demorar mais, recomendamos o uso de pomada oftálmica. - Pipetar suavemente as células na placa de 96 poços selecionada para HSC para misturá-las. Recolher as células do dador na placa de triagem utilizando uma seringa de insulina de 30 G e injetá-las no plexo venoso retro-orbital dos ratinhos receptores. O volume injetável recomendado é de ≤200 μL.
- Observe até que os ratos estejam conscientes e se movendo em uma gaiola limpa. Devolva-os às suas gaiolas depois de confirmar a sua recuperação.
8. Análise do sangue periférico
- Coletar 50 μL de sangue periférico da veia caudal e ressuspendê-lo com 100 μL de PBS livre de Ca 2+ e Mg2+ com EDTA 2 mM. Transfira todas as amostras para uma placa de 96 poços. Centrifugar a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante.
- Adicionar 200 μL de tampão de lise de hemácias e incubar no gelo por 3 min. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Repita mais uma vez.
- Adicionar 200 μL de tampão de coloração celular. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante.
- Preparar a mistura mestre de anticorpos de acordo com a Tabela 2. Adicionar 50 μL de mistura mestra de anticorpos e incubar no gelo por 30 min.
- Adicionar 150 μL de tampão de coloração celular. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante.
- Adicionar 200 μL de tampão de coloração celular. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Ressuspender em 200 μL de tampão de coloração celular e adicionar reagente de coloração de células mortas antes da análise de acordo com as instruções do fabricante.
- Analise o quimerismo do sangue periférico por citômetro de fluxo conforme descrito anteriormente16. Coletar sangue em 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas e 16 semanas após o transplante para seguir a reconstituição de múltiplas linhagens. Gráficos representativos de citometria de fluxo são apresentados na Figura 3.
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Representative Results
Anteriormente, a capacidade de auto-renovação foi medida por meio de ensaios competitivos de transplante, nos quais acredita-se que as CTHs do doador retenham sua capacidade de auto-renovação apenas se forem observadas células de doadores de várias linhagens no sangue periférico do receptor17. Além disso, vários relatos definem LT-HSCs como células que continuam a produzir células do sangue periférico vários meses após o segundo transplante de medula óssea10,18. Portanto, a fim de comparar suas habilidades de auto-renovação, 10pHSCs Hoxb5 pos ou Hoxb5neg isolados de camundongos repórteres Hoxb5 foram transplantados em camundongos receptores primários letalmente irradiados com 2 x 105 células da medula óssea inteira. Em seguida, 16 semanas após o transplante primário, 1 x 107 células da medula óssea isoladas dos camundongos receptores primários foram transplantadas em camundongos receptores secundários irradiados letalmente para avaliar a capacidade de autorrenovação a longo prazo (Figura 1). A Figura 2 mostra gráficos representativos da citometria de fluxo da análise da medula óssea dos camundongos Hoxb5-tri-mCherry. Aproximadamente 20%-25% das células da fração pHSC definida pela Linhagem−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2− eram Hoxb5 pos pHSCs, que representam apenas 0,001%-0,00125% da medula óssea de camundongos. A Figura 3 mostra gráficos representativos de citometria de fluxo da análise do sangue periférico nos camundongos receptores. Os camundongos doadores CD45.2 (camundongos Hoxb5-tri-mCherry), células de suporte CD45.1/CD45.2 e camundongos receptores CD45.1 foram preparados, respectivamente, para analisar separadamente as células doadoras, de suporte e receptoras.
A Figura 4 mostra as análises de sangue periférico nos camundongos receptores em 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas e 16 semanas após o transplante para confirmar o quimerismo do doador. Essas análises revelaram que, embora os pHSCs Hoxb5pos e Hoxb5neg apresentem quimerismo semelhante ao do doador 4 semanas após o transplante, hematopoese contínua foi observada apenas nos receptores Hoxb5pos pHSC (Figura 4A,B). Por outro lado, as HSCs Hoxb5neg começaram a perder a capacidade de produzir células hematopoéticas 8 semanas após o transplante (Figura 4A,B). Na análise do transplante secundário, apenas os receptores Hoxb5pos pHSC apresentaram hematopoese robusta (Figura 5A,B). Em contraste, células doadoras foram pouco observadas nos camundongos receptores de pHSC Hoxb5neg, sugerindo que os pHSCs de Hoxb5neg perdem sua capacidade de autorrenovação dentro de 16 semanas após o transplante em camundongos receptores primários. Esses dados demonstram que a expressão de Hoxb5 pode ser utilizada como marcador específico para CT-HSCs.
Figura 1: Esquema experimental para ensaios de reconstituição hematopoética a longo prazo. Os camundongos receptores foram letalmente irradiados e transplantados competitivamente com 10 CTHs e 2 x 105 células da medula óssea total (células de suporte). Para transplantes secundários, 1 x 107 células da medula óssea total foram transferidas dos camundongos receptores primários. Abreviações: PB = sangue periférico; WBM = medula óssea total. Esse valor foi modificado de Chen et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estratégia de Gating para classificar Hoxb5pos e Hoxb5neg pHSCs. Citometria de fluxo representativa para isolar LKS, Flk2−, pHSC, Hoxb5pS e Hoxb5neg pHSCs após a exclusão de duplos e células mortas. Os valores indicam a porcentagem de cada fração ± d.p. (n = 3). As linhagens incluem B220, CD3ε, CD4, CD8a, Gr-1 e Ter-119. Esse valor foi modificado de Chen et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gráficos FACS representativos de sangue periférico em um camundongo receptor. Esquema de gating para identificar células do sangue periférico (células NK, granulócitos, monócitos, células T e células B) em um camundongo receptor após a exclusão de duplos e células mortas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quimerismo em camundongos receptores após transplante primário. (A) Porcentagem de quimerismo em 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas e 16 semanas em receptores primários que receberam 10 pHSCs Hoxb5neg (n = 9), Hoxb5lo (n = 13) ou Hoxb5hi (n = 18). Cada coluna representa um mouse individual. A fraçãohi de Hoxb5 foi definida como os 5% superiores da expressão de Hoxb5 e os demais como a fração de Hoxb5lo. (B) A contribuição média da linhagem doadora em 10 transplantes primários de células. As barras de erro indicam o s.d. Esse valor foi modificado de Chen et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Quimerismo nos camundongos receptores após o transplante secundário. (A) Porcentagem de quimerismo em 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas e 16 semanas após o transplante secundário de medula óssea total. (B) Quimerismo de doador individual por linhagem em receptores secundários de medula óssea inteira. Cada linha representa um mouse individual. Esse valor foi modificado de Chen et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Anticorpo | Clone | Concentração | Fluorocromos |
| Flk-2 | A2-F10 | 4 μg/mL | PerCP/eFlour710 |
| CD150 | TC15-12F12.2 | 4 μg/mL | BV421 |
| CD11b | M1/70 | 4 μg/mL | BV711 |
| SCA-1 | D7 | 4 μg/mL | BUV395 |
| CD16/32 | 93 | 4 μg/mL | A-700 |
| CD127 | A7R34 | 4 μg/mL | A-700 |
| CD3ε | 145-2C11 | 10 μg/mL | Biotina |
| CD4 | GK1,5 | 10 μg/mL | Biotina |
| CD8a | 53-6.7 | 10 μg/mL | Biotina |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 10 μg/mL | Biotina |
| B220 | RA3-6B2 | 10 μg/mL | Biotina |
| Ter119 | TER119 | 10 μg/mL | Biotina |
Tabela 1: Mistura mestre de anticorpos para coloração de células-tronco hematopoéticas.
| Anticorpo | Clone | Concentração | Fluorocromos |
| CD45,1 | A20 | 1 μg/mL | FITC |
| CD45,2 | 104 | 1 μg/mL | PE |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 2,5 μg/mL | A700 |
| NK1,1 | PK136 | 1 μg/mL | PerCP-Cianina5,5 |
| CD11b | M1/70 | 1 μg/mL | BUV395 |
| CD3ε | 145-2C11 | 1 μg/mL | BV421 |
| TCRβ | H 57-597 | 1 μg/mL | BV421 |
| B220 | RA3-6B2 | 1 μg/mL | BV786 |
Tabela 2: Mistura mestre de anticorpos para coloração de células do sangue periférico.
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Discussion
Tradicionalmente, as CTHs definidas por marcadores de superfície celular têm sido preparadas para estudar as funções das CTHs, como a capacidade de autorrenovação e a multipotência19,20,21. Entretanto, a fração HSC imunofenotipicamente definida (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) contém duas populações discretas de HSC: LT-HSCs e ST-HSCs 9,10. Portanto, a análise específica das HSCs de boa-fé, LT-HSCs, ainda não foi realizada. Assim, um método de isolamento para LT-HSCs usando o sistema repórter Hoxb5 beneficiará significativamente a busca pelos mecanismos moleculares da capacidade de auto-renovação.
Aqui, discutiremos etapas críticas neste protocolo. Primeiro, a etapa 1 para a etapa 7 precisa ser concluída sem interrupção. Essas etapas geralmente levam de 9 a 12 h, e é importante manter as amostras a 4 °C durante esses procedimentos, tanto quanto possível, a fim de manter a viabilidade da amostra. Em seguida, aproximadamente 1 x 108 células da medula óssea são colhidas de um camundongo. Assim, precisamos utilizar um volume suficiente de anticorpos para reproduzir o desempenho da coloração. Além disso, o anticorpo para o antígeno CD34 (clone; RAM34) requer 90 min para coloração suficiente, enquanto 30 min é suficiente para outros anticorpos. Em segundo lugar, a irradiação geralmente causa pancitopenia nos camundongos receptores. Se os neutrófilos derivados do receptor persistirem em muitos camundongos receptores, isso indica que a dose de radiação foi insuficiente. Nesse caso, recomenda-se a otimização da dose de radiação. Em terceiro lugar, se a maioria dos camundongos morrer logo após o transplante, há duas explicações possíveis: um número inadequado de células de suporte ou injeção retro-orbital malsucedida.
Há décadas é controverso se a fração de CAR é homogênea ou heterogênea22,23,24. Neste estudo, os camundongos receptores que receberam o transplante Hoxb5pos pHSC apresentaram diferentes quimeras e padrões de diferenciação do doador (Figura 4A), indicando que essa fração pode ser heterogênea. No entanto, essas flutuações podem ser causadas tanto pelo uso de células não purificadas da medula óssea como células de suporte e pelas diferentes radiossensibilidades de camundongosindividuais 25.
Em resumo, demonstramos um protocolo passo-a-passo para o isolamento de LT-HSCs e ST-HSCs usando o sistema de repórteres Hoxb5. Até o momento, a detecção de CTH-LT tem dependido do ensaio competitivo de transplante, que requer mais de 8 meses. Em contraste, o sistema de repórteres Hoxb5 nos permite identificar prospectivamente tanto LT-HSCs quanto ST-HSCs e usá-los para várias análises funcionais. A Figura 4 e a Figura 5 também mostram que o nível de expressão de Hoxb5 parece estar correlacionado com o grau de quimerismo do doador no segundo camundongo receptor. Além disso, aproveitando o sistema repórter Hoxb5, revelamos anteriormente que LT-HSCs e ST-HSCs funcionam de forma complementar para reconstituição hematopoética contínua após transplante de células-tronco hematopoéticas26. Além disso, demonstramos que a expressão exógena de Hoxb5 poderia reverter parcialmente o destino celular das CTH-ST para o destino das CT-HSCs, indicando que a presença ou ausência de Hoxb5 explica a heterogeneidade da capacidade de autorrenovação na fração de CTHS definida pelo marcador de superfície celular27.
Além desses achados, o isolamento prospectivo das CTH-LL permite analisar as CT-HSCs sob diversas condições fisiológicas, como envelhecimento, inflamação, entre outras. Essas análises facilitarão muito o entendimento das funções dos LT-HSCs.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse associados a este estudo.
Acknowledgments
Agradecemos a Hiroshi Kiyonari pelo cuidado com os animais e por fornecer camundongos receptores na RIKEN BDR, bem como Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka e Masaki Miyahashi pela gestão do laboratório na Universidade de Kobe. Os autores também apreciam muito o apoio contínuo a este trabalho. Masanori Miyanishi foi apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 e JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders, e AMED-PRIME, AMED sob o número de concessão JP18gm6110020. Taro Sakamaki é suportado por JSPS KAKENHI Grant Numbers JP21K20669 e JP22K16334 e foi apoiado por o Programa Core-to-Core da JSPS e o Programa Associado de Pesquisa Júnior RIKEN. Katsuyuki Nishi foi apoiado pelo JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
References
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