Summary
Ce protocole décrit une méthode efficace pour différencier les CSPhi en groupes de champs oculaires et générer des organoïdes neuro-rétiniens en utilisant des conditions de culture simplifiées impliquant à la fois des systèmes de culture adhérents et en suspension. D’autres types de cellules oculaires, telles que l’EPR et l’épithélium cornéen, peuvent également être isolés à partir de champs oculaires matures dans des cultures rétiniennes.
Abstract
Les cellules souches pluripotentes peuvent générer des organoïdes tissulaires complexes qui sont utiles pour les études de modélisation in vitro des maladies et pour le développement de thérapies régénératives. Ce protocole décrit une méthode plus simple, robuste et progressive de génération d’organoïdes rétiniens dans un système de culture hybride composé de cultures monocouches adhérentes pendant les 4 premières semaines de différenciation rétinienne jusqu’à l’émergence d’amas primordiaux (EFP) distincts et auto-organisés. De plus, les îlots neuro-rétiniens circulaires et translucides en forme de beignet dans chaque EFP sont cueillis manuellement et cultivés sous suspension à l’aide de boîtes de culture non adhérentes dans un milieu de différenciation rétinienne pendant 1 à 2 semaines pour générer des ventouses optiques 3D multicouches (OC-1M). Ces organoïdes rétiniens immatures contiennent des précurseurs rétiniens multipotents proliférants PAX6+ et ChX10+. Les cellules précurseurs sont auto-assemblées linéairement dans les organoïdes et apparaissent comme des stries radiales distinctes. 4 semaines après la culture en suspension, les progéniteurs rétiniens subissent un arrêt post-mitotique et une différenciation de la lignée pour former des organoïdes rétiniens matures (OC-2M). La lignée photoréceptrice a commis des précurseurs dans les couches les plus externes des organoïdes rétiniens. Ces cellules photoréceptrices CRX+ et RCVRN+ mûrissent morphologiquement pour afficher des extensions de type segment interne. Cette méthode peut être adoptée pour générer des organoïdes rétiniens à l’aide de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Toutes les étapes et procédures sont clairement expliquées et démontrées pour assurer la reproductibilité et pour des applications plus larges en science fondamentale et en recherche translationnelle.
Introduction
La rétine est un tissu sensible à la lumière présent à l’arrière de l’œil des vertébrés qui convertit les signaux lumineux en impulsions nerveuses par un phénomène biochimique connu sous le nom de voie de photo-transduction. Les impulsions nerveuses initiales générées dans les cellules photoréceptrices de la rétine sont transduites à d’autres interneurones rétiniens et cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) et atteignent le cortex visuel du cerveau, ce qui aide à la perception de l’image et à la réponse visuelle.
Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 1,5 million d’enfants sont aveugles, dont 1 million en Asie. La dystrophie rétinienne héréditaire (IRD) est une maladie cécitante majeure qui touche 1 personne sur 4 000 dans le monde 1,2,3, tandis que la prévalence de la cécité associée à la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) varie de 0,6 % à 1,1 % dans les pays en développement 4. Les IRD sont causés par des défauts génétiques héréditaires dans plus de 300 gènes différents impliqués dans le développement et la fonction rétinienne5. De tels changements génétiques entraînent la perturbation des fonctions rétiniennes normales et la dégénérescence progressive des cellules rétiniennes, à savoir les cellules photoréceptrices et l’épithélium pigmenté rétinien (EPR), entraînant ainsi une perte de vision sévère et la cécité. D’énormes progrès ont été réalisés dans d’autres conditions de mise en aveugle impliquant la cornée, le cristallin, etc. Cependant, les dystrophies rétiniennes et les atrophies du nerf optique n’ont pas de traitement éprouvé à ce jour. Étant donné qu’une rétine humaine adulte n’a pas de cellules souches6, d’autres sources telles que les cellules souches embryonnaires (CSE) et les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) dérivées de patients peuvent fournir un approvisionnement illimité de types cellulaires souhaités et sont très prometteuses pour le développement d’organoïdes tissulaires complexes nécessaires aux études de modélisation in vitro des maladies et au développement de thérapies régénératives7, 8,9,10.
Plusieurs années de recherche rétinienne ont permis de mieux comprendre les événements moléculaires qui orchestrent le développement rétinien précoce. La plupart des protocoles de génération de cellules rétiniennes et d’organoïdes 3D à partir de CSP visent à récapituler ces événements de développement in vitro, en cultivant les cellules dans un cocktail complexe de facteurs de croissance et de petites molécules pour moduler les processus biologiques connus de manière progressive. Les organoïdes rétiniens ainsi générés sont composés de cellules rétiniennes majeures : cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), interneurones, photorécepteurs et épithélium pigmenté rétinien (EPR)11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Malgré des tentatives réussies de modélisation des IRD à l’aide d’organoïdes rétiniens, l’exigence du cocktail complexe de facteurs de croissance et de petites molécules lors de la différenciation et l’efficacité relativement faible de la génération d’organoïdes rétiniens posent un défi majeur avec la plupart des protocoles. Ils comprennent principalement la formation de corps embryoïdes, suivie de leur différenciation progressive en lignées rétiniennes en utilisant des conditions de culture complexes à différents stades de développement in vitro 20,21,22.
Ici, une méthode simplifiée et robuste de développement d’organoïdes neuro-rétiniens 3D complexes à partir d’un contrôle sain et de CSPh spécifiques à une maladie rétinienne est rapportée. Le protocole décrit ici utilise la différenciation directe des cultures de CSPhi quasi confluentes sans avoir besoin de formation de corps embryoïdes. En outre, la complexité du milieu de culture est simplifiée, ce qui en fait une technique rentable et reproductible qui peut être facilement adoptée par les nouveaux chercheurs. Il s’agit d’un système de culture hybride constitué de cultures monocouches adhérentes pendant les 4 premières semaines de différenciation rétinienne jusqu’à l’émergence d’amas primordiaux (EFP) distincts et auto-organisés. De plus, les îlots neuro-rétiniens circulaires de chaque EFP sont cueillis manuellement et cultivés dans des cultures en suspension pendant 1 à 2 semaines pour préparer des coupes rétiniennes 3D multicouches ou des organoïdes constitués de précurseurs neuro-rétiniens proliférants PAX6+ et CHX10+. Une culture prolongée d’organoïdes rétiniens dans un milieu contenant de la taurine de 100 μM pendant 4 semaines supplémentaires a entraîné l’émergence de précurseurs de photorécepteurs RCVRN+ et CRX+ et de cellules matures avec des extensions rudimentaires en forme de segment interne.
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Protocol
Toutes les expériences impliquant des CSPh ont été réalisées de manière aseptique, conformément aux pratiques de laboratoire standard, aux lignes directrices en matière d’éthique et de biosécurité, et avec l’approbation d’organismes de réglementation tels que le Comité d’éthique institutionnel (CEI), le Comité institutionnel pour la recherche sur les cellules souches (IC-SCR) et le Comité institutionnel de biosécurité (IBSC).
1. Préparation de la culture iPSC et du milieu de différenciation rétinienne et des réactifs
- Culture iPSC et support de maintenance
- Cultiver et maintenir la lignée hiPSCnormale 23 (hiPSC-F2-3F1) et une lignée RB1-/ - hiPSC éditée par CRISPR (LVIP15-RB1-CS3, avec délétion biallélique, décalage de trame de 10 pb dans l’exon 18 du gène RB1 humain) dans un milieu Essential 8 sur des plaques de culture recouvertes de matrigel (recouvertes de matrice membranaire base; voir le tableau des matériaux) dans des conditions de culture sans alimentation.
REMARQUE: Ce protocole peut être rendu totalement exempt de xéno en remplaçant la matrice de membrane basale par le revêtement de vitronectine recombinante (VTN-N). Préparer le milieu Essential 8 complet en ajoutant 50x le supplément Essential 8 (fourni avec le kit Essential 8 medium; voir le tableau des matières) et 100 U/ml de solutions de pénicilline-streptomycine. Alternativement, les hiPSC peuvent également être cultivés en utilisant le milieu mTeSR1 complet.
- Cultiver et maintenir la lignée hiPSCnormale 23 (hiPSC-F2-3F1) et une lignée RB1-/ - hiPSC éditée par CRISPR (LVIP15-RB1-CS3, avec délétion biallélique, décalage de trame de 10 pb dans l’exon 18 du gène RB1 humain) dans un milieu Essential 8 sur des plaques de culture recouvertes de matrigel (recouvertes de matrice membranaire base; voir le tableau des matériaux) dans des conditions de culture sans alimentation.
- Solution de dissociation cellulaire (1x CDS)
- Pour une dissociation et un passage sans enzymes des CSPi humaines, préparer le CDS contenant 0,5 mM d’EDTA, pH 8,0 et 30 mM de NaCl dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco (voir le tableau des matériaux).
- Pour préparer 100 mL de 1x CDS, ajouter 100 μL de 0,5M d’EDTA et 1 mL de 3 M de solutions mères de NaCl à 99 mL de 1x DPBS, bien mélanger et filtrer stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
- Milieu d’induction de différenciation (DIM)
- Préparer le DIM en utilisant le milieu basal DMEM-F12 complété par 10% de remplacement de sérum knockout (KOSR), 1x acide aminé non essentiel (NEAA), 2 mM de GlutaMax, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine, 200 μM d’acide L-ascorbique et 1% de supplément de N2 (voir le tableau des matériaux).
- Milieu de différenciation rétinienne (RDM)
- Préparer le RDM en utilisant le milieu basal DMEM-F12 complété par 10% de sérum knockout (KOSR), 1x acide aminé non essentiel (NEAA), 2 mM de GlutaMax, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine, 200 μM d’acide L-ascorbique et 2% de supplément de B27 (avec vitamine A) (voir le tableau des matériaux).
- Surfaces de culture cellulaire recouvertes d’une matrice extracellulaire
- Décongeler la matrice membranaire basale homologuée CSEh pendant une nuit dans un seau à glace, de préférence à l’intérieur d’un réfrigérateur à une température de 4 à 8 °C. Diluer le stock matriciel 100x décongelé (5 mL) dans un rapport de 1:5 en ajoutant 20 mL de milieu basal DMEM-F12 glacé et mélanger en remuant doucement pour préparer une solution mère 20x.
- Préparer des aliquotes de 0,5 mL sur de la glace à l’aide d’embouts de pipettes préréfrigérés et de tubes de microcentrifugation stériles. Étiquetez les flacons comme des stocks 20x et conservez-les congelés dans un congélateur à -80 °C jusqu’à 6 mois.
- Pour le revêtement des surfaces de culture cellulaire (boîtes de culture ou plaques à 6 puits), décongeler une partie aliquote de 20x matrice sur glace et la diluer dans un rapport de 1:20 en utilisant un milieu basal DMEM-F12 glacé pour préparer 10 ml de solution de revêtement matriciel 1x, ce qui est suffisant pour enduire une capsule de 100 mm ou une plaque à 6 puits (1,5 mL/puits).
REMARQUE : Prérefroidir les pipettes/micropointes en aspirant du DPBS glacé et stérile avant de manipuler la solution matricielle. La décongélation et toute manipulation de la matrice doivent être effectuées sur de la glace, à l’aide de pipettes ou de micropointes pré-réfrigérées pour éviter la polymérisation et la gélification à température ambiante. - Ajouter 1,5 mL de solution de revêtement matriciel 1x à chaque puits d’une plaque à 6 puits, agiter doucement la plaque pour assurer un revêtement uniforme et incuber les plaques à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 . Laisser les plaques intactes pendant au moins 1 h pour assurer un revêtement uniforme de la matrice sur les surfaces de culture.
- Avant d’ensemencer les cellules, aspirez la solution d’enrobage à l’aide d’une pipette stérile de 5 ml et jetez les déchets liquides. Ajouter immédiatement le milieu de culture frais (2 mL/puits d’une plaque à 6 puits) et ensemencer les cellules à une densité de 150 000 à 200 000 cellules/puits. Ne laissez pas les plaques sécher pendant la manipulation.
REMARQUE : Alternativement, un revêtement de vitronectine recombinante (VTN-N) à une concentration finale de 0,5 μg/mL peut être utilisé pour un protocole de culture sans xéno.
- Décongeler la matrice membranaire basale homologuée CSEh pendant une nuit dans un seau à glace, de préférence à l’intérieur d’un réfrigérateur à une température de 4 à 8 °C. Diluer le stock matriciel 100x décongelé (5 mL) dans un rapport de 1:5 en ajoutant 20 mL de milieu basal DMEM-F12 glacé et mélanger en remuant doucement pour préparer une solution mère 20x.
2. Établir des cultures humaines de CSPi
- Décongélation et renaissance des CSPh
- Enduisez un puits d’une plaque à 6 puits avec 1x solution de matrice membranaire. Incuber à 37 °C pendant 1 h pour permettre la polymérisation et l’enrobage uniforme de la surface de culture.
- Après 1 h d’incubation, retirer la solution d’enrobage et ajouter 1 mL de milieu Essential 8 complet préchauffé contenant 10 μM d’inhibiteur de la rho-kinase, Y-27632 (1 μL/mL de 10 mM de stock; voir Tableau des matériaux), avant de raviver les cellules.
- Retirer un stock cryovial hiPSC (1 x 106 cellules/flacon) du récipient d’azote liquide. Décongeler rapidement le cryovial dans un bain-marie à 37 °C en tourbillonnant doucement.
REMARQUE : Ne décongelez pas complètement le flacon; Notez le numéro de passage, stérilisez le flacon en surface et essuyez-le à l’aide d’un écouvillon non pelucheux contenant 70% d’alcool isopropylique. - À l’aide d’un embout de pipette stérile de 1 mL, aspirer le contenu cryovial dans un tube frais de 15 mL composé de 2 mL de milieu Essential 8 complet préchauffé sans Y-27632. Centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 4 min à température ambiante. Jetez le surnageant.
- Remettez en suspension la pastille de cellule dans 1,0 mL de milieu Essential 8 complet contenant 10 μM Y-27632.
- Ajoutez cette suspension cellulaire sur les surfaces recouvertes de matrice sans perturber la matrice en la distribuant le long des parois. Balancez doucement la plaque dans le sens transversal pour assurer la répartition uniforme des cellules.
- Incuber les plaques à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 pour permettre aux cellules d’adhérer et de commencer à proliférer.
- Après 12-24 h, remplacer le milieu usé et maintenir les cultures dans un milieu Essential 8 complet préchauffé sans Y-27632.
- Changez le milieu de culture toutes les 24 heures et passez les cultures une fois qu’elles atteignent 70%-80% de confluence.
NOTE: Un rapport fractionné de 1:6 est systématiquement suivi pour les cultures hiPSC et est passé à intervalles réguliers de 3-4 jours.
- Passage et placage des CSPh pour initier la différenciation de la lignée rétinienne
- Aspirer le milieu usé à partir de cultures iPSC humaines confluentes à 70% à 80% dans des plaques à 6 puits.
- Ajouter 1 mL de CDS (étape 1.2) à chaque puits et incuber à 37 °C pendant 5-7 minutes jusqu’à ce que les cellules s’arrondissent. Retirer délicatement le CDS, en prenant soin de ne pas détacher les cellules, ajouter 2 ml de milieu frais Essential 8 et triturer doucement à l’aide d’une pipette.
- Recueillir la suspension cellulaire d’un puits d’une plaque à 6 cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml et faire tourner le tube à 1 000 x g pendant 4 minutes à température ambiante. Jetez le surnageant.
- Resuspendre la pastille de la cellule dans 1,2 mL de milieu Essential 8 et distribuer 200 μL de la cellule 200 μL de la suspension cellulaire (rapport de fractionnement 1:6) dans chaque puits d’une plaque à 6 puits revêtue de matrice contenant 1,5 mL de milieu de culture iPSC contenant 10 μM Y-27632, comme décrit à l’étape 1.5.
- Après 12-24 h, remplacer le milieu usé et maintenir les cultures dans un milieu Essential 8 complet préchauffé sans Y-27632.
- Changez le milieu de culture toutes les 24 heures jusqu’à ce que les cultures atteignent 70%-80% de confluence.
3. Différenciation des CSPh en champs oculaires et lignée rétinienne
REMARQUE : Un aperçu schématique du processus de différenciation est présenté à la figure 1.
- Lancer la procédure de différenciation une fois que les cultures hiPSC atteignent 70%-80% de confluence.
- Au jour 0, remplacer le milieu d’entretien hiPSC par DIM (étape 1.3) contenant 1 ng/mL de FGFb et 1 ng/mL de Noggin. Ajouter 2,0 mL de milieu par puits d’une plaque à 6 puits et maintenir les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .
NOTE: Le retrait progressif du FGFb induit la différenciation des CSP, et l’ajout de concentrations croissantes de Noggin (inhibiteur de plusieurs BMP) au cours des stades initiaux induit la différenciation de la lignée ectodermique et la neuralisation11,12 et bloque l’engagement du mésoderme et de l’endoderme. Alternativement, Noggin peut être remplacé par LDN193189. Contrairement à la stratégie d’inhibition SMAD double rapportée précédemment20,21, ce protocole ne nécessite pas l’ajout d’Activin ou de SB-431542. - Le jour 1, changer le milieu usé et ajouter DIM contenant 1 ng/mL de FGFb et 10 ng/mL de Noggin. Ajouter 2,0 mL par puits d’une plaque de 6 puits. Incuber et maintenir les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 .
- Le jour 2-3, retirer le milieu usé et ajouter DIM contenant seulement 10 ng/mL de Noggin. Ajouter 2,0 mL par puits d’une plaque de 6 puits et changer le milieu toutes les 24 heures. Incuber et maintenir les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 .
NOTE: Toujours préchauffer le milieu de culture à 30-37 ° C avant utilisation. Un excès de corps flottants et de cellules mortes peut être observé dans les cultures de différenciation précoce. Dans de telles conditions, laver les cultures une fois avec 1x DPBS et ajouter le milieu de différenciation rétinienne. Les tests de stérilité sur le milieu usé peuvent être effectués chaque semaine ou au besoin. - Le jour 4, retirez le milieu usé et ajoutez le RDM (étape 1.4). Ajouter 2,0 mL par puits d’une plaque à 6 puits et continuer à maintenir les cultures en RDM à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 , avec un changement de milieu frais tous les jours.
NOTE : Alternativement, les CSP peuvent être cultivées en suspension du jour 1 au jour 3, dans des plaques non adhérentes et à fond rond à 96 puits, à une densité cellulaire de 5 x 103 cellules/100 μL/puits pour former des corps embryoïdes (EB) dans des conditions de culture identiques en DIM. Les EB bien formés au jour 4 peuvent être plaqués sur des plaques recouvertes de matrice contenant RDM et sont autorisés à adhérer, prolifèrent et se différencient comme décrit ci-dessous. - Vers le 14-18e jour, observer les cultures au microscope à un grossissement de 10x pour l’émergence de domaines neuronaux ressemblant à des rosettes constitués de progéniteurs précoces du champ oculaire (Figure 2B).
- Vers le jour 21-28 (3-4 semaines), observer les cultures au microscope à un grossissement de 4x et 10x pour observer l’émergence de PFE auto-organisés et distincts, avec un îlot central de structures neuro-rétiniennes 3D circulaires entourées d’excroissances contiguës du neuroépithélium et de l’épithélium de surface oculaire (Figure 2C,D).
NOTE: Environ 20-30 EFP peuvent être observés par puits d’une plaque à 6 puits d’une culture normale de différenciation rétinienne hiPSC. Ce nombre peut varier avec d’autres lignées hiPSC spécifiques à la maladie, en fonction de leur bagage génétique et de leur potentiel de différenciation de la lignée rétinienne.
4. Prélèvement d’organoïdes rétiniens
- Traction à la flamme de pipettes Pasteur en verre pour la cueillette manuelle des tasses rétiniennes.
REMARQUE: Utilisez des pipettes Pasteur en verre autoclavées et stériles pour la cueillette du champ oculaire.- Allumez un brûleur Bunsen. Prenez une pipette Pasteur stérile et tenez la base dans une main et l’extrémité capillaire dans l’autre. Stériliser à la flamme et chauffer la région près du milieu de la pointe capillaire, avec des mouvements de rotation jusqu’à ce que le verre devienne souple. Ensuite, éloignez-vous de la flamme et tirez rapidement vers l’extérieur pour créer une pointe capillaire fine avec une lumière fermée.
- Tenez la pointe fine horizontalement devant la flamme et passez-la rapidement à travers la flamme dans un mouvement vers l’extérieur pour créer un crochet lisse ou une pointe capillaire en forme de L.
- Utilisez la zone de courbure externe lisse du crochet capillaire comme une fine cuillère pour soulever et détacher doucement les cupules neuro-rétiniennes intactes des grappes EFP.
REMARQUE: L’angle lisse du crochet capillaire en verre ne cause pas d’endommager les cellules ni ne crée de rayures sur les surfaces de culture. Cet outil simple peut également être utilisé efficacement pour la division individuelle des colonies de hiPSC dans des modèles de grille et pour les faire passer sous forme de petits amas cellulaires pendant l’expansion clonale.
- Culture et entretien de cupules rétiniennes pour générer des organoïdes rétiniens 3D.
- Au jour 25-30, ajouter 4,0 mL de milieu de différenciation rétinienne préchauffé dans une boîte de 60 mm à faible attachement avant de préparer la récolte des coupes neuro-rétiniennes.
- Travaillez sous un stéréomicroscope à un grossissement de 0,63 x à 4,5 x pour observer et prélever manuellement des coupes neuro-rétiniennes bien formées parmi les PFE individuels.
REMARQUE: L’apparition de procroissances de cellules pigmentées RPE aide à identifier facilement les EFP et les cupules neuro-rétiniennes placées au centre. Les cupules rétiniennes apparaissent comme des structures 3D circulaires et translucides en forme de beignet, avec des stries radiales claires, formées par les cellules souches rétiniennes disposées linéairement et auto-assemblées, par opposition aux amas sphériques ou irréguliers étroitement emballés et formés par les neurones du SNC ou les cellules de la crête neurale23. - Utilisez les crochets de pipette Pasture tirés au feu pour pousser doucement et extraire l’îlot neuro-rétinien central dans les EFP individuels.
- Régler une micropipette de 1 mL pour aspirer 100 μL et utiliser des micropointes de 1 mL avec des ouvertures larges pour aspirer et transférer les gobelets rétiniens flottants dans les plats de culture frais et peu adhérents préparés à l’étape 4.2.1.
REMARQUE: L’utilisation d’embouts avec une taille d’alésage plus petite et une pression d’aspiration plus élevée peut provoquer un cisaillement et affecter l’intégrité des ventouses rétiniennes. Les dimensions approximatives des cupules rétiniennes sont d’environ 1-2 mm de diamètre. - Maintenir les cupules rétiniennes dans le RDM sous forme de cultures de suspension non adhérentes et les incuber à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 .
- Jour 30-45: Changez le milieu tous les jours en inclinant doucement le plat et en laissant les ventouses rétiniennes se déposer pendant environ 30 s. Suivre une méthode d’alimentation partielle, en retirant la moitié des volumes de milieu épuisé et en les remplaçant par des volumes égaux de milieu frais.
REMARQUE: Évitez les aspirations et les transferts répétés pour éviter tout dommage aux cupules rétiniennes. Après 1 à 2 semaines de culture en suspension, les cupules rétiniennes grossissent légèrement (1 à 3 mm) et se transforment en organoïdes rétiniens 3D auto-organisés (OC-1M) composés de progéniteurs neuro-rétiniens précoces disposés linéairement exprimant PAX6 et CHX10 (Figure 3Bi). - Jour 45-60: Culture des organoïdes rétiniens pendant 4 semaines supplémentaires dans un RDM contenant 100 μM de taurine (voir le tableau des matériaux) pour soutenir une meilleure survie et différenciation de la lignée des progéniteurs neuro-rétiniens et le développement de type de cellules rétiniennes matures (OC-2M).
REMARQUE: Environ 70% à 80% des cupules rétiniennes ou optiques prélevées dans les EFP restent intactes, conservent leur lamination et se développent en organoïdes rétiniens matures après 4 semaines de culture en suspension (OC-2M). - Vérifier que les organoïdes rétiniens matures à 4 semaines de culture en suspension montrent l’émergence de précurseurs des photorécepteurs RCVRN+ et CRX+ et de cellules matures avec une extension rudimentaire en forme de segment interne dans les couches cellulaires les plus externes, récapitulant ainsi le développement rétinien normal et le processus de maturation in vitro (Figure 3Bii).
REMARQUE: Après avoir retiré les cupules neuro-rétiniennes, les cultures de différenciation peuvent être maintenues en continu dans RDM. Les excroissances épithéliales proximales entourant la neuro-rétine contiennent des précurseurs de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes (EPR), qui se dilatent et mûrissent pour former des monocouches pigmentées d’EPR avec une morphologie pavée typique (Figure 4). Les excroissances distales sont principalement constituées d’épithélium de surface oculaire qui contribue au cristallin et àl’épithélium cornéen. Les types de cellules souhaités peuvent être récoltés dans différentes zones d’excroissances EFP et enrichis davantage pour établir des cultures pures.
5. Caractérisation des organoïdes rétiniens
- Caractérisation morphologique et moléculaire
- Observez les EFP adhérents et les organoïdes rétiniens flottants au microscope à contraste de phase à un grossissement de 4x et 10x et documentez leur morphologie et leurs dimensions.
- Recueillir environ 20 organoïdes rétiniens à différents stades de maturation (étapes 4.2.3-4.2.6) dans des tubes microcentrifuges de 1,5 mL à l’aide d’embouts de 1 000 μL de grand alésage. Laissez les organoïdes s’installer au fond et aspirer le milieu. Lavez les tasses avec 1x PBS.
- Retirez l’excès de PBS et ajoutez 1,0 mL de réactif TRIzol (voir le tableau des matières). Incuber à température ambiante pendant 5 min. Homogénéiser le tissu à l’aide d’un pilon tubulaire et triturer à l’aide d’une pipette de 1,0 mL.
- Préparer l’ARN total en suivant la méthode standard d’isolement et de purification de l’ARN réactif, conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Vérifiez la qualité de l’ARN sur le gel d’agarose et quantifiez-la à l’aide du spectrophotomètre NanoDrop (voir le tableau des matériaux).
- Convertir 1 à 2 μg d’ARN total en ADNc à l’aide de l’enzyme transcriptase inverse conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Voir le tableau 1 pour une liste d’amorces spécifiques aux gènes.
- En bref, préparer le mélange maître ARN-amorce dans 10 μL de volume total comme mentionné dans le tableau 2 et incuber le tube à 65 °C pendant 5 minutes dans un cycleur thermique. Transférer le tube du thermocycleur à la glace pendant 2 min.
- Pendant ce temps, préparer le mélange maître 2 avec les réactifs mentionnés dans le tableau 3. Ajouter ce mélange maître au tube de mélange d’amorce à ARN préparé à l’étape 5.1.7. Mélanger délicatement.
- Incuber l’échantillon à 50 °C pendant 50 min, puis 85 °C pendant 5 min, puis maintenir à 4 °C pour arrêter la réaction.
- Utilisez l’ADNc synthétisé comme modèle dans les réactions PCR pour vérifier l’expression du progéniteur neuro-rétinien et des marqueurs cellulaires rétiniens matures.
- Normaliser les modèles d’ADNc totaux de chaque échantillon, à savoir F2-UD (hiPSC-F2-3F1; cellules indifférenciées), OC-1M (coupelle optique de 1 semaine en culture de suspension) et OC-2M (coupelle optique de 4 semaines en culture de suspension) par PCR semi-quantitative en utilisant les gènes ménagers tels que hE1fα ou GAPDH.
- Préparer le mélange maître pour la PCR semi-quantitative, comme mentionné dans le tableau 4, et placer les tubes d’échantillon d’essai pour l’amplification dans un cycleur thermique. Les conditions d’amplification de la PCR sont mentionnées dans le tableau 5.
- Histologie et immunohistochimie
- Recueillir les ventouses optiques dans un tube microcentrifuge de 2,0 ml et aspirer l’excès de milieu (étapes 4.2.3-4.2.6). Rincer les organoïdes avec 1x PBS, puis les laver et les suspendre dans 500 μL de paraformaldéhyde à 4% pour les fixer pendant la nuit à température ambiante.
- Le lendemain, lavez les tasses à l’eau désionisée. Laisser les tasses reposer dans de l’alcool à 95% (trois changements, 15-20 min chacun), suivis de 100% d’alcool (trois changements, 15-20 min chacun), d’un mélange 1:1 d’alcool absolu et de xylène pendant 15 min, de xylène (deux changements, 15 min chacun) et de paraffine (trois changements, 15 min chacun). Intégrez ce tissu pour préparer un bloc de paraffine en suivant les procédures standard. Laissez-le refroidir et se solidifier.
- Préparer des sections minces (~4-5 μm d’épaisseur) à l’aide d’un microtome et les placer sur des lames microscopiques recouvertes de silane (voir le tableau des matériaux) en suivant les procédures histologiques standard.
- Pour la déparaffinisation, chauffer les lames à 70 °C sur un bloc chauffant pendant 15-20 min. Une fois la cire fondue, lavez les lames avec du xylène (trois changements, 3-4 min chacun), ce qui éliminera complètement la paraffine.
REMARQUE: L’élimination incomplète de la paraffine entraîne une coloration médiocre / inégale des sections avec une énorme quantité de bruit de fond. - Réhydrater les lames en utilisant différents pourcentages d’éthanol (100%, 90% et 80%) pendant 3 minutes chacune. Rincez les lames à l’eau distillée et procédez au prélèvement de l’antigène.
- Avant de commencer le prélèvement de l’antigène, préchauffer le tampon de citrate (pH 6,0) dans un pot Coplin (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un four à micro-ondes jusqu’à ce qu’il atteigne 95-100 °C.
- Plongez les lames dans un tampon de citrate préchauffé et chauffez le pot pendant 15 minutes dans un four à micro-ondes. Retirez le pot Coplin du four et laissez-le refroidir à température ambiante.
- Bloquer les sections pour la peroxydase endogène en ajoutant un mélange 1:1 de méthanol et de peroxyde d’hydrogène pendant 5 min, puis en lavant les sections trois fois avec 1x PBS.
- Perméabiliser les sections en utilisant 0,5% de Triton-X 100 pendant 15 min. Lavez les lames trois fois avec 1x PBS.
- Bloquer la liaison non spécifique de l’anticorps primaire en incubant les sections avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) dans 1x PBS pendant 1 h.
- Incuber les coupes avec l’anticorps primaire pendant 1 h à température ambiante ou pendant une nuit à 4 °C. Lavez les lames trois fois avec 1x PBS pendant 3-5 minutes chacune pour enlever l’anticorps non lié.
- Ajouter l’anticorps secondaire conjugué à un colorant fluorescent approprié et incuber pendant 45 min. Lavez les lames trois fois avec 1x PBS pendant 3-5 min chacune.
NOTE: Les anticorps et leurs dilutions respectives sont mentionnés dans le tableau des matériaux. Les coupes organoïdes rétiniennes ont été immunomarquées à l’aide de PAX6 et CHX10 pour détecter les cellules précurseurs neuro-rétiniennes précoces, et à l’aide de Recoverin et CRX pour détecter les cellules précurseurs rétiniennes et photoréceptrices engagées. De même, l’anti-PAX6 et l’anti-MITF ont été utilisés pour détecter les précurseurs de l’EPR, et l’anti-CRALBP et l’anti-RPE65 ont été utilisés pour détecter les cellules RPE matures pigmentées par immunocytochimie de cultures monocouches 2D. - Contre-teindre les sections avec DAPI ou PI et montez-les sur une lame de verre à l’aide du support de montage antidécoloration (voir Tableau des matériaux).
- Imager et documenter les coupes immunomarquées d’organoïdes rétiniens et de cultures d’EPR à l’aide d’un microscope à balayage laser confocale ou à fluorescence pour examiner différentes couches cellulaires exprimant différents marqueurs rétiniens.
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Representative Results
La différenciation des CSPh en lignées oculaires est obtenue en cultivant les cellules dans différents cocktails de milieu de culture contenant des suppléments et des facteurs de croissance par étapes séquentielles à différents moments, comme décrit à la figure 1. Les cultures hiPSC sont maintenues dans le milieu Essential 8, le milieu de maintien des cellules souches pluripotentes. Une fois qu’ils atteignent une confluence de 70 % à 80 % (Figure 2A), le milieu est remplacé par un milieu d’induction de différenciation (DIM) au jour 0 (voir l’étape 3.2) contenant 1 ng/mL de FGFb, 1 ng/mL de Noggin et 1 % de supplément de N2. Avec le supplément de N2 induisant les neurones, Noggin, l’inhibiteur de signalisation BMP, joue un rôle crucial dans la direction des cellules vers la lignée neuroectodermique en bloquant l’engagement mésodermique et endodermique. Le1er, le 2eet le 3e jour, la concentration de Noggin est augmentée à 10 ng/mL (voir les étapes 3.3 et 3.4). À partir du 4ème jour, le DIM est remplacé par un milieu de différenciation rétinienne (RDM) (étape 3.5), et les cultures sont maintenues en continu jusqu’à 30 jours. Le B27 dans le cocktail RDM contient des suppléments supplémentaires tels que de multiples antioxydants et du D-Galactose, qui favorise le métabolisme aérobie et aide à réduire le stress oxydatif, améliorant ainsi la viabilité des cellules progénitrices différenciantes. De plus, la présence d’acétate de rétinol (vitamine A) et d’hormones de croissance telles que la triiodo-I-thyronine (T3) favorise la différenciation de la lignée neuronale et rétinienne.
Du 14au 18e jour, on observe la formation de rosettes neurales, ce qui marque le début de l’engagement du champ oculaire (Figure 2B). Les précurseurs du champ oculaire dans les rosettes neuronales prolifèrent davantage et s’auto-organisent en groupes primordiaux distincts du champ oculaire (EFP) avec des structures neuro-rétiniennes circulaires au centre. D’autres types de cellules telles que l’épithélium pigmenté rétinien (EPR), l’épithélium de la crête neurale et ceux qui contribuent à la surface oculaire émergent et migrent sous forme d’épithélium contigu avec des marges bien définies. Des champs oculaires bien formés, tels que décrits ci-dessus, peuvent être observés entre le 21et le 28e jour de différenciation (Figure 2C,D). L’îlot central des coupes neuro-rétiniennes est récolté entre le jour 25 et le jour 30 à l’aide d’une pipette Pasteur en verre tiré à la flamme (figure 2E) et est maintenu sous forme de cultures de suspension non adhérentes dans RDM pendant 1 à 2 semaines supplémentaires, jusqu’au jour 45. Les progéniteurs rétiniens proliférants s’auto-organisent ensuite pour former des organoïdes rétiniens 3D multicouches d’environ 2 à 3 mm de diamètre (Figure 2F,G). À partir du jour 46, le RDM est complété par 100 μM de taurine pour favoriser la neurogenèse et améliorer la survie cellulaire dans des cultures organoïdes à long terme in vitro (Figure 2H).
Les organoïdes rétiniens sont caractérisés à différents stades de maturation pour l’expression de plusieurs marqueurs progéniteurs rétiniens en utilisant la PCR à transcription inverse (RT-PCR) et l’immunohistochimie (IHC). Pour cela, les organoïdes sont récoltés pour l’isolement total de l’ARN le 30 ème et 60ème jour de différenciation. Les résultats de la RT-PCR ont confirmé l’induction et l’expression de marqueurs neuro-rétiniens tels que NEUROD1, ChX10, CRX, PKCß1, RLBP1, RHOK, OPN1SW, RCVRN, ABCA4, RD3 et PDE6C chez des organoïdes rétiniens âgés de 1 semaine (4-5 semaines après différenciation, OC-1M) et des organoïdes rétiniens âgés de 4 semaines 8,12 (7-8 semaines après différenciation, OC-2M) (Figure 3A). L’immunohistochimie et l’imagerie par fluorescence ont confirmé l’expression des marqueurs progéniteurs rétiniens précoces PAX6, CHX10 et OTX2 dans OC-1M et des marqueurs rétiniens matures RCVRN et CRX dans OC-2M 8,12 (Figure 3Bi,ii).
En plus des cupules neuro-rétiniennes centrales, les autres types de cellules oculaires, tels que l’épithélium pigmenté rétinien (EPR), l’épithélium de la crête neurale et les cellules épithéliales de surface oculaire, émergent et migrent hors des EFP. Les progéniteurs de l’EPR dérivés du neuroectoderme apparaissent sous forme de cellules épithéliales disposées de manière compacte entourant les EFP, qui mûrissent progressivement et se pigmentent le long des marges migratoires du 30e au 45e jour (Figure 4A-C). Ces cultures de différenciation adhérente, après retrait des cupules rétiniennes, peuvent donc être prolongées jusqu’au jour 45, pour récolter les précurseurs de l’EPR proliférants (Figure 4D), qui peuvent être encore enrichis pour préparer des cultures monocouches de cellules RPE pigmentées complètement matures. Les EPR pigmentés matures peuvent être considérés comme des monocouches avec une morphologie pavée typique (Figure 4E). L’identité des cellules EPR est confirmée par immunocytochimie à l’aide d’anticorps dirigés contre des marqueurs spécifiques de l’EPR tels que MITF (marqueur progéniteur RPE), PAX6 (marqueur progéniteur et RPE mature) et RPE65 (marqueur RPE mature)10,12 (Figure 4F-H).
Les organoïdes rétiniens pluripotents dérivés de cellules souches peuvent ainsi servir de modèles in vitro pour l’étude de diverses maladies héréditaires de la rétine 7,8,9. Les modèles de cellules souches spécifiques à la maladie sont développés soit en générant des lignées iPSC spécifiques au patient, soit en introduisant des mutations spécifiques à la maladie dans des lignées iPSC témoins saines en utilisant l’approche d’édition de gènes basée sur CRISPR 7,8. Les CSPi mutantes peuvent ou non se différencier efficacement en types de cellules rétiniennes en fonction des mutations génétiques impliquées. Bien que la plupart des lignées cellulaires témoins saines aient suivi le calendrier décrit ci-dessus, il peut y avoir des écarts dans le cas des CSPi spécifiques à la maladie en termes de délais de différenciation, de morphologie EFP, de taille de la coupe rétinienne, de lamination et de maturation. Le potentiel de différenciation rétinienne d’une lignée RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3) qui porte une délétion biallélique de 10 pb dans l’exon 18 du gène RB1 humain a été examiné, ce qui entraîne un décalage de cadre et une perte complète de l’expression de la protéine RB1. Il a été observé que la perte d’expression de RB1 n’affectait pas l’œil et la différenciation précoce de la lignée rétinienne de la lignée mutante hiPSC. Cependant, un retard marqué dans les délais et une réduction de l’efficacité de formation des PFE ont été observés. Les PFE atypiques qui ont émergé présentaient des agrégats anormaux de progéniteurs rétiniens qui ne se stratifiaient pas et ne s’auto-organisaient pas en cupules rétiniennes appropriées (figure 5A, B) ou dépourvues de la zone environnante de l’EPR et de l’épithélium de surface oculaire (OSE) (figure 5C). Lorsqu’elles sont choisies et conservées sous forme de cultures en suspension, ces grappes de progéniteurs rétiniens forment des agrégats neuro-rétiniens irréguliers (Figure 5D).
Figure 1 : Chronologie représentant la différenciation des CSPi en organoïdes rétiniens. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Génération d’organoïdes rétiniens 3D auto-organisés. (A) Culture de cultures de CSPhi dans des conditions sans alimentation. (B) Développement de rosettes neuronales au jour 14 de différenciation (astérisque). (C, D) Grappes primordiales du champ oculaire (EFP) contenant une structure centrale en forme de coupe neuro-rétinienne (flèches noires) entourée par la zone de migration de l’épithélium (flèches blanches) au jour 21-28 de la différenciation. E) Pipette Pasteur en verre tiré au feu à pointe crochue. La courbe lisse au niveau de la région de la charnière est utilisée pour pousser et soulever les cupules rétiniennes (flèche). (F,G) Coupes rétiniennes récoltées au jour 25 et cultivées sous suspension pour générer des organoïdes rétiniens 3D auto-organisés. (H) Organoïdes rétiniens matures en culture en suspension au jour 45. Barres d’échelle: 100 μm (A, B, D, G); 200 μm (C,F,H). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Caractérisation des organoïdes rétiniens. (A) Profilage de l’expression génique rétinienne par RT-PCR de la lignée23 normale indifférenciée hiPSC (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) et des coupelles optiques normales différenciées prélevées à 3-4 semaines de différenciation et mûries en culture de suspension pendant 1 semaine (OC-1M) et 4 semaines (OC-2M) respectivement. Les ADNc de tous les échantillons d’essai ont été normalisés en utilisant eEF1a comme contrôle de charge. (B) Images confocales de coupes immunomarquées (i) d’organoïdes rétiniens immatures (OC-1M) utilisant des anticorps dirigés contre les marqueurs progéniteurs neuro-rétiniens CHX10, PAX6 et OTX2 (en rouge) et (ii) d’organoïdes rétiniens matures (OC-2M) utilisant des anticorps contre les marqueurs précurseurs photorécepteurs Recoverin et CRX (en rouge). La couche externe marquée des organoïdes rétiniens avec des cellules photoréceptrices différenciantes (boîte) dans les panneaux de gauche est zoomée et montrée dans les panneaux de droite. DAPI a été utilisé comme contre-teinture (en bleu). Les extensions internes rudimentaires en forme de segment sont marquées par des flèches blanches. Barre d’échelle: 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Émergence de différents types de cellules oculaires. (A) EFP regroupe avec la cupule neuro-rétinienne au centre et migre des excroissances RPE montrant une pigmentation le long des bords d’attaque (flèche blanche). (B) Excroissances épithéliales pigmentées bien différenciées provenant de multiples EFP tout autour de l’île neuro-rétinienne. (C) Un grossissement plus élevé d’une PFE montre la zone migratoire des progéniteurs de l’EPR (flèche blanche) et de l’épithélium de surface oculaire (astérisque) entourant une coupe neuro-rétinienne. (D) Cultures adhérentes étendues qui ont développé des monocouches de cellules EPR immatures contenant à la fois des cellules pigmentées et non pigmentées. (E) Cultures monocouches de cellules RPE complètement matures et pigmentées présentant une morphologie pavée au jour 60. (F-H) Cellules RPE exprimant PAX6, MITF et RPE65 en vert. Barre d’échelle: 200 μm (A,B); 100 μm (C-E); 20 μm (F-H). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Formation anormale de cupule rétinienne dans les CSPi mutantes RB1-/-. (A,B) EFP avec agrégats anormaux de progéniteurs rétiniens avec lamination déformée et absence de stries (C) EFP avec la coupe neuro-rétinienne miniature mais dépourvue de la zone environnante de RPE et de l’épithélium de surface oculaire (flèche). (D) Agrégats neuro-rétiniens irréguliers formés en culture en suspension. Barre d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nom de l’amorce | Séquence première (5'-3') | Taille de la bande (pb) | ID de référence | |||
| 1 | heEF1α | F: GAAGTCTGGTGATGCTGCCATTGT | 198 | NM_001402 | ||
| R: TTCTGAGCTTTCTGGGCAGACTTG | ||||||
| 2 | hNeuroD1 | F: CGCGCTTAGCATCACTAACT | 349 | NM_002500 | ||
| R : GCGTCTCTTTGGGCTTTTGAT | ||||||
| 3 | hCHX10 | F : CAAGTCAGCCAAGGATGGCA | 382 | NM_182894 | ||
| R: CTTGACCTAAGCCATGTCCT | ||||||
| 4 | hCRX | F: TCAACGCCTTGGCCCTAAGT | 357 | NM_000554 | ||
| R: ACACATCTGTGGAGGGTCTT | ||||||
| 5 | hPKC-β1 | F : AAAGGCAGCTTTGGCAAGGT | 376 | NM_212535 | ||
| R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT | ||||||
| 6 | RLBP1 | F: TGCACCATTGAAGCTGGCTA | 361 | NM_000326 | ||
| R: AGAAGGGCTTGACCACATTG | ||||||
| 7 | RHOK | F : CAAGCTGTATGCCTGCAAGA | 360 | NM_002929 | ||
| R: ATCCGGACATTGCCGTCATT | ||||||
| 8 | hOPN1SW | F: TGCTTCATTGTGCCTCTCTC | 373 | NM_001708 | ||
| R: AGCTGCATGTGTCGGATTCA | ||||||
| 9 | RCVRN | F: AGACCAGAAGCTGGAGT | 367 | NM_002903 | ||
| R: ACGGGTGTCATGTGAGTGGTA | ||||||
| 10 | hABCA4 | F : CACCGTAGCAGGCAAGAGTATT | 271 | NG_009073 | ||
| R: AATGAGTGCGATGGCTGTGGAGA | ||||||
| 11 | hRD3 | F : ATGGTGCTGGAGACGCTTAT | 328 | NM_183059 | ||
| R : CTTCCTGCTTCATCCTCTCCA | ||||||
| 12 | hPDE6C | F: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC | 351 | NM_006204 | ||
| R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT | ||||||
Tableau 1 : Liste des amorces spécifiques aux gènes de la RT-PCR.
| Composants pour mélange ARN-Primer | Volume (en μL) |
| ARN (1-2 μg) | n |
| 10 mM dNTP | 1 |
| 10 mM Oligo dT | 1 |
| Eau traitée DEPC | jusqu’à 10 |
| Volume total de réaction | 10 |
Tableau 2 : Mélange maître ARN-amorce pour la conversion de l’ADNc.
| Composants pour Mastermix 2 | Volume (en μL) |
| 10x tampon RT | 2 |
| 25 mM MgCl2 | 4 |
| 0,1 M TNT | 2 |
| SuperScript III Transcriptase inverse | 1 |
| RNaseOUT | 1 |
| Volume total de réaction | 10 |
Tableau 3 : Mélange maître 2 pour la conversion de l’ADNc.
| Composants de la PCR | Volume (en μL)/réaction |
| 10x tampon PCR | 2 |
| 2 mM dNTP | 2 |
| Amorce avant (5 μM) | 1 |
| Amorce inverse (5 μM) | 1 |
| Taq Polymérase | 0.2 |
| Modèle d’ADNc (50-100 ng) | 1 |
| Eau stérile Milli-Q | 12.8 |
| Volume total de réaction | 20 |
Tableau 4 : Mélange principal pour la PCR semi-quantitative.
| Température | Heure | Nombre de cycles | |
| Dénaturation | 95 °C | 5 min | x 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 30 s | x 35 |
| Recuit | 50-60 °C | 30 s | |
| Extension | 72 °C | 30 s | |
| Prolongation finale | 72 °C | 10 min | x 1 |
Tableau 5 : Conditions d’amplification de la PCR.
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Discussion
Les CSPhi sont un outil puissant pour étudier le développement des organes et des tissus in vitro. Récapituler le phénotype de la maladie en différenciant les CSPh saines des CSP spécifiques à la maladie vers la lignée rétinienne peut aider à mieux comprendre la physiopathologie des différentes formes de dystrophies rétiniennes héréditaires. Plusieurs protocoles ont été décrits et adoptés pour la différenciation in vitro des CSP en types de cellules rétiniennes. La plupart d’entre eux impliquent l’utilisation de milieu de culture contenant des cocktails complexes de facteurs de croissance recombinants, de suppléments, de petites molécules et de réactifs, tels que: suppléments N1, N2 et B27; les bloqueurs de signalisation BMP et TGFβ comme Noggin, SB431542, LDN193189 et Follistatin, ou les inducteurs tels que Activin A, Lefty et IDE1; des bloqueurs de signalisation Wnt canoniques tels que DKK1, SFRP, IWP-2 et IWR-1-endo, ou des inducteurs tels que CHIR99021, SB216763 et CKI-7; les bloqueurs de signalisation des récepteurs FGF tels que PD0325901 et PD173074 ou les inducteurs tels que bFGF; inhibiteurs de signalisation à encoche tels que DAPT; d’autres molécules de signalisation telles que le facteur de croissance analogue à l’insuline (IGF-1); acide rétinoïque; hormones de croissance telles que la triiodothyronine (T3) et l’hydrocortisone; et les antioxydants et autres facteurs favorables à la survie tels que l’acide ascorbique, le nicotinamide, la taurine, l’acide docosahexaénoïque, le 1-thioglycérol, etc. Ces composants sont inclus dans le milieu de culture à différents stades de différenciation des cellules souches pour stimuler ou moduler diverses cascades de signalisation afin d’induire l’engagement de la lignée oculaire et rétinienne 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22.
Ici, une méthode plus simple, robuste et efficace de génération d’organoïdes rétiniens directement à partir de cultures adhérentes quasi confluentes de CSPhi est décrite. Le protocole simplifié consiste à utiliser moins de suppléments, de facteurs de croissance et de petites molécules qui déclenchent principalement la différenciation initiale des CSP dans la lignée neuroectodermique. Les étapes de différenciation ultérieures reposent sur la capacité inhérente des CSP à se différencier de manière synchrone dans le type cellulaire de lignées apparentées, qui s’auto-organisent ensuite et régulent mutuellement le développement et l’organisation spatiale de plusieurs types de cellules qui contribuent à la formation de tissus complexes. Le retrait progressif du FGFb et l’ajout de Noggin aident à l’induction réussie de l’engagement précoce du destin neuro-ectodermique dans les 3 jours suivant la différenciation. Le maintien continu des cultures de différenciation dans les RDM induisant des neurones, sans ajouter de facteurs de croissance ou de petites molécules, entraîne l’induction de structures primordiales du champ oculaire (EFP) avec des marges claires, dans les 3-4 semaines suivant la différenciation. Les EFP contiennent des cellules progénitrices multipotentes qui, après un entretien non perturbé et continu, entraînent une différenciation et un auto-assemblage multi-lignées pour former des EFP complexes constitués de cupules neuro-rétiniennes ou de cupules optiques (OC) positionnées au centre, entourées d’autres types de cellules oculaires apparentées telles que l’épithélium pigmenté rétinien (EPR), l’épithélium de la crête neurale et l’épithélium de surface oculaire. Alternativement, les CSP peuvent être cultivées en suspension du jour 1 au 3 pour former des EB dans des conditions de culture identiques. Les EB peuvent être plaqués au jour 4 et cultivés en tant que cultures adhérentes sur des surfaces recouvertes de matrice dans RDM pour initier la différenciation de la lignée rétinienne, comme décrit ci-dessus. Des cultures différenciées saines donnent régulièrement lieu à environ 20 à 30 PFE par puits d’une plaque de 6 puits. Les CO peuvent être récoltés à partir des EFP à 3-4 semaines de différenciation rétinienne et sont maintenus dans des cultures en suspension pendant 30-60 jours supplémentaires, pour permettre la différenciation des progéniteurs neuro-rétiniens et générer des organoïdes rétiniens matures. Après 4 semaines de culture en suspension, environ 70% à 80% des cupules optiques prélevées dans les EFP restent intactes, conservent leur lamination et se développent en organoïdes rétiniens matures (OC-2M), avec des cellules photoréceptrices RCVRN + et CRX + engagées et des extensions de type segment interne dans les couches les plus externes.
La confluence des cultures de CSPi en croissance est essentielle au moment du début de la différenciation et du passage des cultures au DIM. Les cultures avec des colonies plus petites et une confluence inférieure à 60%, et celles qui se différencient précocement, entraînent une réduction significative des nombres EFP. Lorsque les grappes de champs oculaires émergent, l’îlot central des cupules neuro-rétiniennes doit être récolté dans un délai de 1 semaine. Cela peut être fait en poussant doucement et en soulevant les ventouses intactes en utilisant l’angle ou la région incurvée de la pointe capillaire en verre tirée par la flamme, comme décrit dans la section protocole. Il faut veiller à ne pas endommager les gobelets. D’autres retards dans la cueillette entraîneraient un aplatissement et une perte d’organisation 3D en raison de la prolifération et de la migration des cellules progénitrices neuro-rétiniennes, ce qui rend la récolte difficile et entraîne des organoïdes rétiniens atypiques.
L’efficacité de l’induction du champ oculaire et de la maturation des cupules rétiniennes varie entre différentes maladies ou lignées hiPSC spécifiques au patient, en fonction des défauts génétiques sous-jacents. Par exemple, l’engagement de la lignée rétinienne et l’efficacité de la formation de la PFE d’une lignée spécifique à la maladie RP étaient identiques à celles des cellules témoins saines, tandis qu’une lignée nulle RB1 n’a pas réussi à former des PFE (données non présentées). Certaines lignées porteuses de mutations liées à l’amaurose congénitale de Leber ont formé des PFE atypiques avec des défauts de taille, d’auto-assemblage, de laminage et de maturation des progéniteurs rétiniens (données non présentées). D’autres validations moléculaires et le profilage de l’expression génique des organoïdes rétiniens spécifiques au patient par rapport aux tissus témoins sains seraient nécessaires pour comprendre la physiopathologie d’une maladie. Compte tenu de la variabilité des génomes des patients et de l’implication des réseaux multigéniques dans les manifestations de la maladie, il peut également être important d’étudier les organoïdes rétiniens dérivés de lignées iPSC isogéniques afin d’établir une corrélation absolue génotype-phénotype dans les études de modélisation de la maladie. De telles lignées isogéniques peuvent être créées soit par des knockouts de gènes ciblés dans des lignées témoins saines, soit en corrigeant les mutations pathogènes dans les CSPi spécifiques au patient, en utilisant des techniques avancées d’édition du génome 8,9.
De tels organoïdes rétiniens intacts dérivés de lignées normales ou spécifiques à une maladie peuvent être utilisés dans le dépistage et l’essai de nouveaux médicaments. Les précurseurs des photorécepteurs dans les organoïdes rétiniens et d’autres types de cellules oculaires, tels que l’EPR et l’épithélium cornéen dans les excroissances EFP, peuvent être davantage isolés et enrichis pour leurs applications en recherche fondamentale et en médecine régénérative. Le protocole décrit ici peut être facilement adopté pour les processus conformes aux BPF pour la préparation de cellules de qualité clinique destinées aux évaluations précliniques et cliniques.
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Disclosures
Tous les auteurs n’ont pas de conflit d’intérêts ou de divulgation financière.
Acknowledgments
Les auteurs remercient la Dre Chitra Kannabiran, généticienne, pour son soutien scientifique et technique; Dr Subhadra Jalali, consultant en rétine; Dr Milind Naik, chirurgien oculoplastique; et le Dr Swathi Kaliki, oncologue oculaire au LV Prasad Eye Institute, Hyderabad, vers la génération de lignées iPSC normales et spécifiques au patient. Les auteurs remercient les subventions de R&D du Science and Engineering Research Board, Department of Science and Technology (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Department of Biotechnology (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) et les bourses de recherche senior de l’ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) et CSIR (V.K.P.), gouvernement de l’Inde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
References
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