Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا للتوليف الموسع ل ثلاثي بوتيل الوسيط (5-تولوين سلفونيل -5h-pyrrole [2،3-b] بيرازين -2-يل) كربامات (ACT051-3) من Upatinib.
Abstract
تم تطوير Upatinib ، وهو دواء مثبط لجانوس كيناز ، من قبل شركة للتكنولوجيا الحيوية لعلاج أمراض المناعة. مركب ثلاثي بوتيل (5-تولوين سلفونيل -5h-بيرول [2،3-ب] بيرازين -2-يل) كربامات (ACT051-3) هو وسيط مهم من Upatinib. حتى الآن ، لم يتم الإبلاغ عن الإنتاج الصناعي الثابت لهذا المركب الوسيط (ACT051-3). في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة التوليف المحددة وعملية المركب ACT051-3 من حيث التوليف المختبري ، والتوسع التجريبي ، والإنتاج الصناعي. أثناء استكشاف مسار العملية ل ACT051-3 ، تم إجراء العديد من التعديلات والتحسينات المناسبة على ظروف التفاعل ، مما أدى في النهاية إلى التطوير الناجح لعملية الإنتاج الصناعي المثلى ل ACT051-3. تضاعف وقت التفاعل تقريبا عن طريق تغيير حالة كربونات البوتاسيوم المشاركة في التفاعل ، مما أدى إلى تحسين كفاءة التفاعل بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال إدخال N ، N-diisopropylethylamine (DIPEA) إلى التفاعل ، تم تقليل كمية المحفز باهظ الثمن Pd (OAc) 2 بمقدار 2.5 ضعف ، مما أدى إلى خفض تكاليف الإنتاج بشكل كبير ، مما يؤكد جدوى مسار العملية هذا والإنتاج الصناعي ل ACT051-3 ، وتلبية طلب السوق على هذا الوسيط المهم.
Introduction
أصبح Upatinib مثبطا شائعا عالميا ل Janus kinase 1 (JAK1) لعلاج اضطرابات المناعة في السنوات الأخيرة 1,2. أظهر هذا الدواء آثارا علاجية كبيرة على التهاب المفاصل الصدفي (PsA) 3،4 ، والتهاب المفاصل الروماتويدي (RA) 5،6،7 ، والتهاب الجلد التأتبي (AD) 8،9. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لانتقائيتهاالعالية 10 ، فإن Upatinib لديها مجموعة واسعة من التطبيقات السريرية. تيرت بوتيل (5-توسيل-5h-بيرولو [2،3-ب] بيرازين-2-يل) كاربامات (ACT051-3) هو وسيط مهم من Upatinib. مكوناته الهيكلية الرئيسية هي حلقة pyrrole وحلقة pyrazine ، والتي يمكن استخدامها في إعداد مثبطات كيناز ثلاثية الحلقات تحتوي على النيتروجين لعلاج أمراض المناعة والأورام11.
التوسع التجريبي هو توسيع متوسط الحجم (50x-100x) لمسار العملية والظروف التي تحددها الدراسة التجريبية المختبرية ، يليها اختبار العملية والتحقيق الصناعي والتحسين لتحديد أفضل الإنتاج الصناعي وظروف التشغيل12.
في الوقت الحاضر ، تم الإبلاغ عن طرق التوليف المختبري لهذا المركب الوسيط (ACT051-3) ، ولكن تم إجراؤها فقط على نطاق صغير بسبب مشاكل انخفاض العائد ، والتفاعلات المعقدة ، ومتطلبات المعدات العالية ، والتي لا يزال لديها مساحة كبيرة ليتم تحسينها11،13،14،15. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن أي مسار عملية للتوسيع التجريبي والإنتاج الصناعي للمركب الوسيط ACT051-3 في الوقت الحاضر.
لذلك ، في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في التوسع التجريبي ومسار الإنتاج للمركب ACT051-3 ، مع الإشارة إلى الطرق الاصطناعية المختبرية التي تم الإبلاغ عنها بشكل أفضل. بالمقارنة مع مسار التوليف المختبري الأصلي ، تم إجراء العديد من التعديلات والتحسينات المناسبة على ظروف التفاعل ، وتم التحقيق في العوامل الأخرى التي قد تؤثر على نتائج التفاعل. أخيرا ، تم تحديد معلمات العملية الأكثر ملاءمة للمسار الأمثل ، وحصلنا على مسار عملية سهل التشغيل ومنخفض التكلفة وصديق للبيئة ، وهو مناسب للتوسع التجريبي وإنتاج ACT051-3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليف النطاق التجريبي للمركبات ACT051-2 و ACT051-3
- تخليق 2-برومو-5-توسيل-5H-بيرولو [2،3-ب] بيرازين (ACT051-2)
- في دورق مستدير القاع ، قم بإذابة 50.0 جم من المركب 2-برومو-5H-بيرولو [2،3-ب] بيرازين (ACT051-1 ؛ 0.25 م) في 15 مل من N ، N-ثنائي ميثيل فورماميد (DMF ؛ 3 فولت).
- أضف 65.3 جم من ثنائي أيزوبروبيل إيثيل أمين (DIPEA ؛ 0.51 م) إلى محلول التفاعل تحت حماية النيتروجين (توفير حاجز للغاز والرطوبة) وقم بتبريد درجة الحرارة إلى 0-5 درجة مئوية من خلال حمام مائي بارد. لحماية النيتروجين ، قم بضخ ضغط المفاعل إلى -0.75-0.8 ميجا باسكال ، ثم مرر N2 لموازنة الضغط عند 0.1 ميجا باسكال.
- أضف 60.20 جم من TsCl المذاب في 12 مل من DMF (0.32 m). ارفع درجة الحرارة إلى 20-30 درجة مئوية من خلال حمام الماء الدافئ وحركه لمدة 1 ساعة تقريبا. يضاف الماء البارد (600.0 مل ، 0-10 درجة مئوية) إلى الخليط ويحرك لمدة 1 ساعة أخرى.
- قم بتصفية المنتج تحت فراغ باستخدام قمع زجاجي مع لوح صنفرة مبطن بورق الترشيح. اغسل بالماء (200.0 مل) عدة مرات وجفف باستخدام فرن تجفيف ثرموستاتي كهربائي للحصول على مادة صلبة صفراء شاحبة (ACT051-2) بعائد 78٪.
- تخليق كربامات ثلاثي بوتيل (5-تولوين سلفونيل -5H-بيرول [2،3-ب] بيرازين -2-يل) (ACT051-3)
- قم بإذابة 176.11 جم من ACT051-2 في 366.31 جم من 1،4-ديوكسان في دورق دائري القاع ثلاثي المنافذ.
- أضف 65.75 جم من كربامات ثلاثي بوتيل ، و 138.21 جم من كربونات البوتاسيوم الحبيبية (2.0 مكافئ) ، و 11.57 جم من الزانتفوس (0.04 مكافئ) ، و 2.25 جم من Pd (OAc) 2 (1.28٪ بالوزن) إلى المحلول.
- سخني الخليط إلى 105 درجة مئوية وقلبي لمدة 7 ساعات تحت جو من النيتروجين. اترك الخليط يبرد إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتصفية المنتج باستخدام قمع Buchner (فتحة ورق الترشيح 80-120 ميكرومتر).
- اغسل بقايا المرشح بأسيتات الإيثيل (200 مل). استخدم مضخة تفريغ المياه المتداولة لتركيز المنتج تحت ضغط منخفض عند 50-60 درجة مئوية بقيمة ضغط -0.095 ميجا باسكال. حافظ على عمل المضخة للحفاظ على الضغط والحصول على زيت بني غامق.
- تنقية المنتج الخام باستخدام كروماتوغرافيا العمود ، مع استخلاص الأثير البترولي وخلات الإيثيل (V / V ، 10/1) للحصول على المركب المستهدف كمادة صلبة بيضاء بعائد 93.5٪.
2. التوليف التجريبي لتوسيع نطاق المركبات ACT051-2 و ACT051-3
- تخليق تجريبي لتوسيع نطاق 2-برومو-5-توسيل-5H-بيرولو [2،3-ب] بيرازين (ACT051-2)
- أضف 1.0 كجم من ACT051-1 (5.05 م) و 1.305 كجم من DIPEA (10.1 م) إلى دورق دائري القاع ثلاثي المنافذ. أضف 3 لتر من DMF (3 فولت) إلى القارورة وقم بإذابة المادة الصلبة. سخني خليط التفاعل إلى 35 درجة مئوية.
- أضف 1.203 كجم من TsCl (6.31 م) إلى محلول التفاعل وحركه لمدة ساعة واحدة. حرك الخليط حتى يتم تأكيد اكتمال التفاعل بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC). باختصار ، خذ كمية صغيرة من منتج التفاعل وأخضع هذا لمراقبة TLC. عندما يظهر TLC أنه لا توجد مادة خام متبقية تقريبا ، أرسل العينة إلى عنصر التحكم المركزي HPLC ، واكتشف التفاعل مع المواد الخام أو نسبة المنتج لتكون 0.1 / 99.9.
- صب في 8.4 لتر من الماء البارد ويقلب لمدة 0.5 ساعة أخرى. قم بتصفية جميع السوائل باستخدام قمع Buchner (فتحة ورق الترشيح 80-120 ميكرومتر) وشطف المنتج الخام ب 600 مل من الماء.
- جفف المنتج الناتج عند 70 درجة مئوية طوال الليل باستخدام فرن تجفيف ثرموستاتي كهربائي واحصل على منتج بعائد 94.9٪.
- تخليق تجريبي لتوسيع نطاق كربامات ثلاثي بوتيل (5-تولوين سلفونيل -5H-بيرول [2،3-ب] بيرازين -2-يل) (ACT051-3)
- أضف 3.31 لتر من كحول ثلاثي الأميل و 4.97 لتر من التولوين (V / V ، 2/3) إلى غلاية التفاعل.
- أضف إلى المحلول 1.66 كجم من ACT051-2 ، و 0.83 كجم من كربامات ثلاثي بوتيل ، و 1.301 كجم من كربونات البوتاسيوم المسحوقة ، و 0.11 كجم من الزانتفوس ، و 0.31 كجم من DIPEA.
- قم بإخلاء النيتروجين ثلاث مرات ، كما في الخطوة 1.1.2 ، كرر هذا 3x ، وأضف 10 جم من Pd (OAc) 2 (0.60٪ بالوزن) إلى محلول التفاعل تحت حماية النيتروجين.
- سخني خليط التفاعل إلى 90 درجة مئوية وقلبي لمدة 4 ساعات. يبرد المزيج إلى 40 درجة مئوية أو أقل.
- قم بتصفية محلول التفاعل باستخدام قمع Buchner (فتحة ورق الترشيح 80-120 ميكرومتر) باستخدام الدياتوميت كمساعد مرشح وغسل كعكة المرشح بالتولوين.
- جمع وتركيز المرشح. استخدم مضخة تفريغ المياه المتداولة لتركيز المرشح تحت ضغط منخفض عند 50-60 درجة مئوية بقيمة ضغط -0.095 ميجا باسكال. حافظ على عمل المضخة للحفاظ على الضغط.
- أضف 300 مل من الهيبتان وحركه لمدة 20 دقيقة. قم بتصفية محلول التفاعل مرة أخرى باستخدام قمع Buchner (فتحة ورق الترشيح 80-120 ميكرومتر) وشطف المنتج الخام بالهيبتان (50 مل ، ثلاث مرات). تجف والحصول على المنتج مع العائد من 96.3 ٪.
3. الإنتاج الصناعي للمركبات ACT051-2 و ACT051-3
- الإنتاج الصناعي ل 2-برومو-5-توسيل-5H-بيرولو [2،3-ب] بيرازين (ACT051-2)
- تأكد من أن المفاعل نظيف وخالي من الماء ، وتأكد من أن جهاز الخلط لا يصدر ضوضاء عند التشغيل وأن صمام التفريغ السفلي للمفاعل قد أغلق.
- أضف 355.50 كجم من DMF (3 فولت) إلى مفاعل المينا سعة 2000 لتر وابدأ في التقليب. أضف 125.04 كجم من ACT051-1 (1.0 مكافئ) و 164.8 كجم من DIPEA (2.0 مكافئ) إلى المحلول.
- خفض درجة الحرارة إلى 20-25 درجة مئوية تحت حماية النيتروجين. أضف 150.22 كجم من TsCl (1.25 مكافئ) عند 25-35 درجة مئوية في 10 دفعات خلال 3 ساعات.
- اترك الخليط يبقى عند 25-35 درجة مئوية وحركه لمدة 2 ساعة. تحضير 750.20 كجم من الماء البارد (3-4 درجة مئوية) في مفاعل آخر سعة 2000 لتر.
- راقب التفاعل بواسطة HPLC وتأكد من اكتمال التفاعل عندما تكون المادة الخام المتبقية 0.5٪.
- يضاف الماء البارد (3-4 درجة مئوية) إلى خليط التفاعل ويحرك على حرارة 15-30 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. اجمع المرشح واشطفه بالماء (250-500 كجم ، 2-4 فولت) حتى يصبح محايدا (تم اختباره باستخدام ورق الأس الهيدروجيني).
- جفف المنتج عند 60-65 درجة مئوية لمدة 30.5 ساعة للحصول على مادة صلبة بنية فاتحة بعائد 95.5٪.
- الإنتاج الصناعي لكربامات ثلاثي بوتيل (5-تولوين سلفونيل -5H-بيرول [2،3-ب] بيرازين -2-يل) (ACT051-3)
- تأكد من أن المفاعل نظيف وخالي من الماء، وتأكد من أن جهاز الخلط طبيعي وأن صمام التفريغ السفلي للمفاعل قد أغلق.
- أضف 340.10 كجم من كحول ثلاثي الأميل (2 فولت) و 552.50 كجم من التولوين (3 فولت) إلى مفاعل مينا سعة 2000 لتر وابدأ في التقليب.
- أضف 212.40 كجم من ACT051-2 (1.0 مكافئ) ، و 106.00 كجم من كربامات ثلاثي بوتيل (1.5 مكافئ) ، و 166.70 كجم من كربونات البوتاسيوم المسحوقة (2.0 مكافئ) ، و 14.10 كجم من الزانتفوس (0.04 مكافئ) ، و 39.40 كجم من DIPEA (0.5 مكافئ) ، و 1.06 كجم من Pd (OAc) 2 (0.5٪ بالوزن) إلى المحلول.
- استبدل النيتروجين أربع مرات ، واترك الخليط يسخن إلى 85-95 درجة مئوية تحت حماية النيتروجين ، وحركه لمدة 3 ساعات. راقب التفاعل بواسطة HPLC وتأكد من اكتمال التفاعل عندما تكون المادة الخام المتبقية 0.44٪.
- تبريد درجة حرارة التفاعل إلى 20-30 درجة مئوية. اجمع المحلول على دفعات وضعه في دلو بلاستيكي سعة 125 لترا لمدة 30 دقيقة.
- قم بتصفية محلول التفاعل باستخدام برميل مرشح شفط كيميائي (فتحة كيس المرشح هي 10-15 ميكرومتر) باستخدام الدياتوميت كمساعد مرشح وغسل كعكة المرشح بالتولوين (185.20-370.40 كجم ، 1-2 فولت).
- اجمع المرشح في وعاء المينا واستخدم مضخة تفريغ المياه المتداولة تحت ضغط منخفض عند 55-65 درجة مئوية لمدة 10 ساعات بقيمة ضغط -0.095 ميجا باسكال. حافظ على عمل المضخة للحفاظ على الضغط والحصول على مركب المنتج كسائل لزج.
- تبخر المنتج مرتين عن طريق ضخ التولوين ومواصلة التفاعل. تركيز المنتج النهائي لمدة 4 ساعات. قم بتنقية المنتج الناتج باستخدام كروماتوغرافيا العمود ، مع استخلاص الهيبتان وخلات الإيثيل (V / V ، 10 / 1-3 / 1) ، للحصول على مادة صلبة ذات عائد 98.5٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توفر هذه الدراسة عملية التوليف الموسعة للوسيط المهم ACT051-3 من Upatinib (الشكل 1 والشكل 2). يوضح قسم البروتوكول (الخطوات 1-3) على وجه التحديد التوليف بدرجة الجرام ، والتوليف على نطاق الكيلوجرام التجريبي ، وخطوة الإنتاج الموسعة للمركب ACT051-2 و ACT051-3 المتوسط.
في سياق استكشاف المسار الأمثل للمركب ACT051-2 ، كما هو موضح في الجدول 1 ، وجد أن TsCl الصلب كان أكثر مشاركة في التفاعل من السائل TsCl (المذاب في DMF ، الخطوة 3.1 من البروتوكول) وقلل بشكل كبير من كمية DMF بنحو ثلاثة أضعاف. بالإضافة إلى ذلك ، تم زيادة إنتاجية المنتج من 97.49٪ إلى 98.44٪ عن طريق زيادة درجة حرارة المحلول المختلط عند إضافة TsCl من 0-5 درجة مئوية إلى 23-35 درجة مئوية (كما هو موضح في الجدول 2). علاوة على ذلك ، أجريت تجارب على استهلاك مياه ما بعد المعالجة. كما هو موضح في الجدول 3 ، بعد انخفاض استهلاك المياه بمقدار 2.5 ضعف (من 15 مل / جم ACT051-2 إلى 6 مل / جم ACT051-2) ، انخفض عائد التفاعل بنسبة 2.5٪ ، ولكن تم تقليل توليد محلول النفايات ، وتحسنت كفاءة التفاعل بشكل ملحوظ.
تم تطوير سلسلة من الظروف التجريبية للحصول على مسار العملية الأمثل للوسيط ACT051-3. كما هو مبين في الجدول 4 ، من خلال إدخال DIPEA في التفاعل واستبدال مذيب التفاعل بكحول ثلاثي الأميل / التولوين (V / V ، 2/3) ، تم تقليل كمية Pd (OAc) 2 بمقدار 2.5 ضعف (من 1.28٪ بالوزن إلى 0.5٪ بالوزن) ، مما قلل بشكل كبير من تكلفة الإنتاج وزاد من تحسين جدوى زيادة الإنتاج. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال تغيير حالة K2CO 3 المشاركة في التفاعل ، تم تقليل وقت التفاعل من 7 ساعات إلى3.5 ساعة ، مما أدى إلى تحسن كبير في كفاءة التفاعل (كما هو موضح في الجدول 5). بالإضافة إلى ذلك ، من خلال التبديل من كحول ثلاثي الأميل / 1،4-ديوكسان (V / V ، 1/4) إلى كحول ثلاثي الأميل / التولوين (V / V ، 2/3) ، تم تقصير وقت التفاعل إلى 3 ساعات ، وزادت مساحة ذروة المنتج من 84.22٪ إلى 88.52٪ ، وتم تقصير الوقت الذي يستغرقه المنتج للتركيز بشكل كبير ، وكل ذلك أدى إلى تحسين كفاءة التفاعل (انظر الجدول 6).
تم تمييز كلا المركبين ACT051-2 و ACT051-3 كيميائيا بالرنين المغناطيسي النووي للبروتون (1H NMR) و HPLC وقياس الطيف الكتلي عالي الدقة. يمكن العثور على طرق التحليل (HPLC ، 1 H NMR ، والتحليل الطيفي بالتأين بالرش الكهربائي) ل ACT051-2 و ACT051-3 في العمل الداعم (الجدول التكميلي 1 ، الشكل التكميلي 1، الشكل التكميلي 2 ، الشكل التكميلي 3 ، الشكل التكميلي 4 ، الشكل التكميلي 5 ، والشكل التكميلي 6). وترد أدناه بيانات توصيف ACT051-2 وACT051-3:
2-برومو-5-توسيل-5H-بيرولو [2،3-ب] بيرازين (ACT051-2):
1H NMR (500 ميجاهرتز ، DMSO-d 6) δ8.59 (ثانية ، 1 ساعة) ، 8.37 (د ، J = 4.1 هرتز ، 1 ساعة) ، 8.00 (د ، J = 8.2 هرتز ، 2H) ، 7.46 (د ، J = 8.2 هرتز ، 2H) ، 7.02 (د ، J = 4.0 هرتز ، 1H) ، 3.29 (د ، J = 11.9 هرتز ، 3 ساعات). ESI: m / z محسوبة ل C13 H 10BrN3O2S [M] + 352.21 ، وجد أنها 352.00.
ثلاثي بوتيل (5-تولوين سلفونيل -5H-بيرول [2،3-ب] بيرازين -2-يل) كاربامات (ACT051-3):
1H NMR (500 ميجاهرتز ، CDCl3) δ8.98 (ثانية ، 1H) ، 7.95 (d ، J = 8.4 هرتز ، 2H) ، 7.84 (d ، J = 4.1 هرتز ، 1H) ، 7.21 (s ، 1H) ، 7.19-7.17 (m ، 1H) ، 6.53 (d ، J = 4.1 هرتز ، 1H) ، 2.30 (s ، 3H) ، 1.45 (s ، 9H). ESI: m / z محسوبة ل C 18 H20N 4 O4S [M +H] + 389.12 ، وجد أنها 389.15.
الشكل 1: مسار تخليق ACT051-3 الوسيط. (أ) مسار التفاعل وظروف ACT051-3 قبل التحسين: ط) DMF ، DIPEA ، TsCl ؛ ب) زانتفوس ، Pd (OAc) 2 ، K2CO3 ، كحول ثلاثي الأميل / 1،4-ديوكسان (V / V ، 1/4) ؛ (ب) مسار التفاعل وظروف ACT051-3 بعد التحسين: i) DMF ، DIPEA ، TsCl ؛ ب) زانتفوس ، Pd (OAc) 2 ، K 2 CO3 ، DIPEA ، كحول ثلاثي الأميل / التولوين (V / V ، 2/3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط تدفق العملية للمركبين ACT051-2 و ACT051-3 في زيادة الإنتاج. (أ) مخطط تدفق العملية ل ACT051-2 في توسيع نطاق الإنتاج. (ب) مخطط تدفق العملية ل ACT051-3 في توسيع نطاق الإنتاج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| رقم | ولاية TsCl | V (DMF) (اختبار معملي) | V (DMF) (توسيع نطاق تجريبي) |
| 1 | تذوب في DMF | 8.5 فولت | 54 فولت |
| 2 | صلب | 3.0 فولت | 18 فولت |
الجدول 1: تأثير أشكال مختلفة من TsCl على المركب الاصطناعي ACT051-2. تشمل الحالات المختلفة ل TsCl السائل TsCl (المذاب في DMF) و TsCl الصلب. تظهر النتائج التجريبية أن TsCl الصلب أكثر ملاءمة للإنتاج الصناعي.
| رقم | درجة الحرارة (°C) | حالة المزيج | ما إذا كان لديه عملية توضيح | أدر | نقاء |
| 1 | 0-5 | لزج | لا | 97.49% | 96.85% |
| 2 | 25-35 | خلط جيد | نعم | 98.44% | 96.99% |
الجدول 2: تأثير إضافة TsCl عند درجات حرارة مختلفة على تخليق ACT051-2. إضافة TsCl إلى التفاعل عند 0-5 درجة مئوية أو 23-35 درجة مئوية.
| رقم | استهلاك المياه | أدر | نقاء |
| 1 | 15 مل / غرام ACT051-1 | 97.49% | 96.85% |
| 2 | 6 مل / غرام ACT051-1 | 94.90% | 97.69% |
| 3 | 9 مل / غرام ACT051-1 | 95.07% | 96.71% |
الجدول 3: تأثير استهلاك المياه المختلفة بعد المعالجة على تخليق ACT051-2. جرب استهلاك المياه المختلفة بعد المعالجة ، بما في ذلك 15 مل / جم ACT051-1 و 9 مل / جم ACT051-1 و 6 مل / جم ACT051-1. تم تحقيق الظروف المثلى عند حجم مياه ما بعد المعالجة يبلغ 6 مل / جم ACT051-2.
| رقم | ما يعادل DIEPA | ما يعادل K2CO3 | ما يعادل Pd (OAc) 2 |
| 1 | 0.0 مكافئ | 3.0 مكافئ | 1.28٪ بالوزن |
| 2 | 2.0 مكافئ | 2.0 مكافئ | 0.60٪ بالوزن |
| 3 | 1.0 مكافئ | 2.0 مكافئ | 0.60٪ بالوزن |
| 4 | 0.5 مكافئ | 2.0 مكافئ | 0.60٪ بالوزن |
الجدول 4: تأثير إضافة DIPEA إلى التفاعل لتخليق ACT051-3. استكشاف تأثير إضافة DIPEA أم لا على التفاعل. أظهرت النتائج أن إدخال DIPEA قلل من كمية Pd (OAc) 2 بعامل 2.5 (من 1.28٪ بالوزن إلى 0.5٪ بالوزن).
| رقم | حالة K2CO3 | المكافئ | وقت رد الفعل (ح) |
| 1 | صلب | 2.0 مكافئ | 7 |
| 2 | مسحوق | 2.0 مكافئ | 3.5 |
الجدول 5: تأثير الحالات المختلفة ل K2CO 3 على تفاعل المركب الاصطناعي ACT051-3. حدد كربونات البوتاسيوم في شكل حبيبات أو مسحوق للمشاركة في التفاعل.
| رقم | جرعة من Pd (OAc) 2 | مذيب التفاعل | الخامس / الخامس | وقت رد الفعل / ساعة | منطقة ذروة المنتج / ٪ |
| 1 | 0.60٪ بالوزن | كحول ثلاثي الأميل / 1،4-ديوكسان | 1-4 | 3.5 | 84.22 |
| 2 | 0.60٪ بالوزن | كحول ثلاثي الأميل / 1،4-ديوكسان | 2-3 | 3.5 | 83.34 |
| 3 | 0.60٪ بالوزن | كحول ثلاثي الأميل / التولوين | 2-3 | 3 | 88.52 |
| 4 | 0.50٪ بالوزن | كحول ثلاثي الأميل / التولوين | 2-3 | 2.25 | 87.11 |
الجدول 6: تأثير مذيبات التفاعل المختلفة على تفاعل المركب الاصطناعي ACT051-3. يتم اختيار كحول ثلاثي الأميل / 1،4-ديوكسان (V / V ، 1/4) وكحول ثلاثي الأميل / التولوين (V / V ، 2/3) كمذيبات تفاعل.
الجدول التكميلي 1: الطريقة التحليلية للمركبين ACT051-2 و ACT051-3. الظروف الكروماتوغرافية المحددة لتحليل المركبات ACT051-2 و ACT051-3 ، بما في ذلك الأداة واسم الطريقة وعمود الطور السائل والطور المتحرك ودرجة حرارة العمود وسرعة التيار والطول الموجي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 1: الكروماتوجرام السائل عالي الأداء ل ACT051-2. تم الكشف عن نتائج البيانات بواسطة HPLC. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: الكروماتوجرام السائل عالي الأداء ل ACT051-3. تم الكشف عن نتائج البيانات بواسطة HPLC. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: طيف MS من ACT051-2. تم الكشف عن نتائج البيانات بواسطة التحليل الطيفي ESI. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 4: طيف MS من ACT051-3. تم الكشف عن نتائج البيانات بواسطة التحليل الطيفي ESI. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 5: طيف الرنينالمغناطيسي النووي 1 H من ACT051-2. تم تحليل نتائج البيانات باستخدام MestReNova. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 6: طيف الرنينالمغناطيسي النووي 1 H من ACT051-3. تم تحليل نتائج البيانات باستخدام MestReNova. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تؤثر ظروف تفاعل التوليف ، بما في ذلك درجة حرارة التفاعل والوقت واختيار كواشف التفاعل ونسبة المواد ، على جدوى التفاعل والغلة والنقاء وتكلفة الإنتاج ، خاصة بالنسبة لتوسيع نطاق الإنتاج.
في التوليف المختبري ل ACT051-2 ، يمكن استخدام TsCl في شكل سائل (مذاب في DMF ؛ الخطوة 1.1.3) في التفاعل ؛ ومع ذلك ، فهي ليست مناسبة للتوليف التجريبي أو الإنتاج الصناعي ، لأن استخدام السائل TsCl لهذا التفاعل يزيد من كمية المذيب في نظام التفاعل ، مما يؤدي إلى المزيد من سوائل النفايات. نتيجة لذلك ، اخترنا TsCl الصلب للتفاعل في التوسع التجريبي والإنتاج الصناعي (الخطوتان 2.1.2 و 3.1.3 من البروتوكول ، على التوالي) وحصلنا على نتائج تجريبية جيدة ، مع الأخذ في الاعتبار مفهوم حماية البيئة والكيمياء الخضراء (الجدول 1).
بالإضافة إلى ذلك ، وجد في تجارب التوسع التجريبية أن إضافة كمية كبيرة من TsCl عند درجة حرارة منخفضة يجعل نظام التفاعل لزجا جدا بحيث لا يمكن تحريكه ، مما يؤدي إلى خطر تغليف المواد الخام. ولمعالجة هذا الخطر، ارتفعت درجة الحرارة من 0-5 درجة مئوية إلى 25-35 درجة مئوية (الخطوات 2-1-1 أو 3-1-4 من البروتوكول)، وتم الحصول على تقليب كاف لمادة TsCl الصلبة، وكان لنظام محلول التفاعل سيولة جيدة، واستمر التفاعل بسلاسة (الجدول 2).
علاوة على ذلك ، كانت هناك حاجة إلى كمية كبيرة من الماء (15 مل / جم ACT051-1) لتجارب ما بعد المعالجة ل ACT051-2 ، والتي لم تكن مناسبة لتوسيع نطاق تجارب الإنتاج وتوليد المزيد من محلول النفايات. لذلك ، من منظور حماية البيئة ، تم التحقيق على الفور في الكمية المثلى من المياه المستخدمة في المعالجة اللاحقة في استكشاف ظروف عملية الإنتاج. كما هو موضح في الجدول 3 ، عندما تم تقليل كمية المياه بعد المعالجة إلى 6 مل / غرام ACT051-1 ، أظهر عائد التجربة تأثيرا طفيفا ، ولكن يمكن أن يحسن بشكل كبير من الكفاءة ويقلل من توليد سائل النفايات.
عند استكشاف مسار عملية الإنتاج الصناعي للوسيط ACT051-3 ، أجرينا عددا كبيرا من تجارب تحسين العملية وقمنا بحل العديد من مشكلات التحجيم. في تخليق ACT051-3 ، خضع ACT051-2 لتفاعل اقتران Buchwald-Hartwig مع كربامات ثلاثي بوتيل تم تحفيزه بواسطة Pd (OAc) 2 و xanthphos لإعطاء المركب ACT051-3. Pd (0) هو نوع نشط من البلاديوم يشيع استخدامه في استجابات الاقتران مثل سوزوكي وبوخوالد16،17،18،19. ومع ذلك، يشيع استخدام Pd(II) لتحفيز التفاعل. ونتيجة لذلك، استخدمنا مركب أمين (DIPEA) لتقليل Pd(II) إلى Pd(0)، تاركين النظام التحفيزي للتفاعل بأكمله في الدورة الحفازة Pd(0) وPd(II). مع إضافة DIPEA ، تم تخفيض كمية المحفز المكلف Pd (OAc) 2 بشكل كبير من 1.28٪ إلى 0.5٪ (الجدول 4) ، مما قلل بشكل كبير من تكلفة زيادة الإنتاج وعزز عقلانية وجدوى الطريقة.
يؤدي وقت رد الفعل الطويل إلى عدد كبير من ردود الفعل الجانبية ويولد شوائب ، وهو ما لا يفضي إلى زيادة الإنتاج. من خلال الدراسات المختبرية المكثفة ، وجد أن تغيير حالة كربونات البوتاسيوم من الحبيبية إلى المسحوق (الخطوات 1.2.2 أو 2.2.2 من البروتوكول) أدى إلى تقليل مناسب لوقت التفاعل ، وهو أكثر ملاءمة للإنتاج الصناعي (الجدول 5). وبالإضافة إلى ذلك، وبالنظر إلى أن 1،4-ديوكسان المستخدم في التجربة التجريبية الصغيرة النطاق كان أكثر صعوبة في التركيز (الخطوة 1-2-1 من البروتوكول)، نظرنا في الجمع بين التولوين وثلاثي البيوتانول (الخطوات 2-2-1 أو 3-2-2 من البروتوكول؛ والخطوة 2-2-1 أو 3-2-2 من البروتوكول؛ والخطوة 2-2-1 أو 3-2-2 من البروتوكول؛ والخطوة 2-2-1 من البروتوكول). V / V ، 2/3) ، وهي مذيبات أفضل تركيزا ، كمذيبات تفاعل للإنتاج الصناعي. أظهرت النتائج أن التفاعل حصل على معدل تعزيز كبير ، وقلل من وقت التفاعل ، وحسن كفاءة التفاعل (انظر الجدول 6).
في الختام ، بعد الاستكشاف المتكرر للظروف التجريبية ، تم الحصول أخيرا على الظروف المثلى لتوسيع نطاق العملية للمركبات ACT051-2 و ACT051-3 ، ويظهر مخطط تدفق العملية لهذا الإنتاج الموسع في الشكل 2. أظهرت نتائج الإنتاج الموسع أن العملية برمتها كانت مستقرة ، وأن عائد المنتج كان طبيعيا (الخطوات 3.1.7 أو 3.2.8 من البروتوكول).
مسار الإنتاج الصناعي الذي تم الحصول عليه في هذه الدراسة هو طريق جديد متاح ، كما تم تأكيد جدوى مسار العملية هذا في الإنتاج الصناعي المستقبلي. بالإضافة إلى ذلك ، توفر النتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة بعض أسس البحث الفني للبحث المستقبلي لمسار الإنتاج الصناعي للمركبات ACT051-2 و ACT051-3.
ومع ذلك ، لا يزال هناك مجال لتحسين وتحسين مسار العملية ، مثل مقدار TsCl (1.25 مكافئ) ، وهو مفرط في تخليق ACT051-2 ويمكن تخفيضه بشكل أكبر. بالإضافة إلى ذلك ، في تخليق ACT051-3 ، يمكن استخدام التولوين فقط كمذيب تفاعل لتسهيل المعالجة اللاحقة ، وقد تستمر كمية المحفز Pd (OAc) 2 في الانخفاض. يمكن مواصلة دراسة القضايا التقنية المذكورة أعلاه واستكشافها في العمل المستقبلي لزيادة إنتاج المركب الاصطناعي ACT051-3 بشكل أفضل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
لا توجد اعترافات لذكرها هنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-bromo-5H-pyrrolo[2,3-b]pyrazine | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | 19120110 | |
| 1,4-dioxane | Liaoning cook Biotechnology Co., Ltd | General Reagent | |
| 1H NMR | Bruker AVIII 500 | ||
| 37% chloride acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| 4-toluenesulfonyl chloride (TsCl) | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | AR A2010137 | |
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Circulating water vacuum pump | Guangzhou Zhiyan Instrument Co., Ltd | SHZ-D( ) |
|
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Diatomite | Guangzhou Qishuo Chemical Co., Ltd. | / | |
| Double cone rotary vacuum dryer | Jiangsu Yang-Yang Chemical Equipment Plant Inc | SZE-500T | |
| enamel kettle | Jiangsu Yang-Yang Chemical Equipment Plant Inc | CS-03-002 | 1000L / 2000L |
| heptane | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | General Reagent | |
| HPLC | Guangzhou aoyi Technology Trading Co., Ltd | LC-2030C 3D | |
| Large scale rotary evaporators | Guangzhou Xingshuo Instrument Co.,Ltd. | RE-2002 | |
| Low temperature and constant temperature stirring reaction bath | Guangzhou Yuhua Instrument Co., Ltd | XHDHJF-3005 | |
| Low temperature coolant circulating pump | Guangzhou Jincheng Scientific Instrument Co., Ltd | XHDLSB-5/25 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N, N-Diisopropyl ethylamine (DIPEA) | Apicci Pharm | General Reagent | |
| N-dimethylformamide (DMF) | Guangzhou bell Biotechnology Co., Ltd | General Reagent | |
| Octanoid acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Pd(OAc)2 | Xi'an Catalyst New Materials Co.,ltd. | 200704 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Potassium carbonate (K2CO3) | Guangzhou Zhonghua Trade Co.,Ltd. | General Reagent | |
| Tert amyl alcohol | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | General Reagent | |
| tert-Butyl carbamate | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | General Reagent | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R | |
| toluene | Liaoning cook Biotechnology Co., Ltd | General Reagent | |
| Vacuum drying oven | Guangzhou Yuhua Instrument Co., Ltd | DZF-6090 | |
| Water | / | / | |
| Xantphos | Liaoning cook Biotechnology Co., Ltd | Asp20-44892 |
References
- Kerschbaumer, A., et al. Points to consider for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases with Janus kinase inhibitors: a systematic literature research. RMD Open. 6 (3), e001374 (2020).
- Fragoulis, G. E., Brock, J., Basu, N., McInnes, I. B., Siebert, S. The role for JAK inhibitors in the treatment of immune- mediated rheumatic and related conditions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 941-952 (2021).
- Shaw, T., et al. P220 Long-term safety profile of upadacitinib in patients with rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, or ankylosing spondylitis. Rheumatology. 61, 133 (2022).
- Keeling, S., Maksymowych, W. P. JAK inhibitors, psoriatic arthritis, and axial spondyloarthritis: a critical review of clinical trials. Expert Review of Clinical Immunology. 17 (7), 701-715 (2021).
- Fleischmann, R., et al. Safety and efficacy of elsubrutinib or upadacitinib alone or in combination (ABBV-599) in patients with rheumatoid arthritis and inadequate response or intolerance to biological therapies: a multicentre, double-blind, randomised, controlled, phase 2 trial. The Lancet Rheumatology. 4 (6), e395-e406 (2022).
- Stamatis, P., Bogdanos, D. P., Sakka, L. I.
- Rubbert-Roth, A., et al. Trial of upadacitinib or abatacept in rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 383 (16), 1511-1521 (2020).
- Asfour, L., Getsos Colla, T., Moussa, A., Sinclair, R. D. Concurrent chronic alopecia areata and severe atopic dermatitis successfully treated with upadacitinib. International Journal of Dermatology. 61 (11), e416-e417 (2022).
- Cantelli, M., et al. Upadacitinib improved alopecia areata in a patient with atopic dermatitis: A case report. Dermatologic Therapy. 35 (4), e15346 (2022).
- Traves, P. G., et al. JAK selectivity and the implications for clinical inhibition of pharmacodynamic cytokine signalling by filgotinib, upadacitinib, tofacitinib and baricitinib. Annals of the Rheumatic Diseases. 80 (7), 865-875 (2021).
- Rozema, M. J., et al. Development of a scalable enantioselective synthesis of JAK inhibitor upadacitinib. Organic Process Research & Development. 26 (3), 949-962 (2022).
- Wynn, J. P., Hanchar, R., Kleff, S., Senyk, D., Tiedje, T. Biobased technology commercialization: the importance of lab to pilot scale-up. Metabolic Engineering for Bioprocess Commercialization. , Springer. 101-119 (2016).
- Tang, C., et al. Influenza virus replication inhibitor and use thereof. , US202000283454A1 (2020).
- Ren, Q., et al. Inhibitors of influenza virus replication and uses thereof. Center for Biotechnology Information. , US20200339564A1 (2020).
- Van Epps, S., et al. Design and synthesis of tricyclic cores for kinase inhibition. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 23 (3), 693-698 (2013).
- Paul, F., Patt, J., Hartwig, J. F. Palladium-catalyzed formation of carbon-nitrogen bonds. Reaction intermediates and catalyst improvements in the hetero cross-coupling of aryl halides and tin amides. Journal of the American Chemical Society. 116 (13), 5969-5970 (1994).
- Zhou, T., Ji, C. L., Hong, X., Szostak, M. Palladium-catalyzed decarbonylative Suzuki-Miyaura cross-coupling of amides by carbon-nitrogen bond activation. Chemical Science. 10 (42), 9865-9871 (2019).
- Sain, S., Jain, S., Srivastava, M., Vishwakarma, R., Dwivedi, J. Application of palladium-catalyzed cross-coupling reactions in organic synthesis. Current Organic Synthesis. 16 (8), 1105-1142 (2019).
- Takale, B. S., Kong, F. Y., Thakore, R. R. Recent applications of Pd-catalyzed Suzuki-Miyaura and Buchwald-Hartwig couplings in pharmaceutical process chemistry. Organics. 3 (1), 1-21 (2021).
