Summary
Burada, Upatinib'in ara tert-bütil (5-toluensülfonil-5h-pirrol [2,3-b] pirazin-2-il) karbamatının (ACT051-3) ölçeklendirilmiş sentezi için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Bir Janus kinaz inhibitörü ilacı olan Upatinib, bağışıklık hastalıklarını tedavi etmek için bir biyoteknoloji şirketi tarafından geliştirilmiştir. Tert-bütil (5-toluensülfonil-5h-pirrol [2,3-b] pirazin-2-il) karbamat bileşiği (ACT051-3), Upatinib'in önemli bir ara maddesidir. Bugüne kadar, bu ara bileşiğin (ACT051-3) istikrarlı endüstriyel üretimi bildirilmemiştir. Bu çalışmada, ACT051-3 bileşiğinin spesifik sentez yöntemini ve sürecini laboratuvar sentezi, pilot ölçek büyütme ve endüstriyel üretim açısından tanımladık. ACT051-3 için proses rotasının araştırılması sırasında, reaksiyon koşullarında birçok uygun ayarlama ve iyileştirme yapıldı ve sonunda ACT051-3 için optimum endüstriyel üretim prosesinin başarılı bir şekilde geliştirilmesine yol açtı. Reaksiyon süresi, reaksiyonda yer alan potasyum karbonatın durumunu değiştirerek neredeyse iki katına çıkarıldı ve bu da reaksiyon verimliliğini büyük ölçüde artırdı. Ek olarak, reaksiyona N, N-diizopropiletilamin (DIPEA) ekleyerek, pahalı katalizör Pd (OAc) 2'nin miktarı 2,5 kat azaltıldı, üretim maliyetlerini önemli ölçüde düşürdü, bu işlem yolunun fizibilitesini ve ACT051-3'ün endüstriyel üretimini doğruladı ve bu önemli ara ürün için pazar talebini karşıladı.
Introduction
Upatinib, son yıllarda bağışıklık bozukluklarının tedavisinde dünya çapında popüler bir Janus kinaz 1 (JAK1) inhibitörü haline gelmiştir 1,2. Bu ilaç psoriatik artrit (PsA)3,4, romatoid artrit (RA)5,6,7 ve atopik dermatit (AD)8,9 üzerinde önemli terapötik etkiler göstermiştir. Ek olarak, yüksek seçiciliği10 nedeniyle, Upatinib çok çeşitli klinik uygulamalara sahiptir. Tert-bütil (5-tosyl-5h-pyrolo [2,3-b] pyrazin-2-yl) karbamat (ACT051-3), Upatinib'in önemli bir ara maddesidir. Ana yapısal bileşenleri, bağışıklık ve tümör hastalıklarının tedavisi için yeni azot içeren trisiklik kinaz inhibitörlerinin hazırlanmasında kullanılabilen pirrol halkası ve pirazin halkasıdır11.
Pilot ölçek büyütme, laboratuvar pilot çalışması tarafından belirlenen proses rotasının ve koşullarının orta ölçekli bir ölçek büyütmesidir (50x-100x), ardından en iyi endüstriyel üretim ve işletme koşullarını belirlemek için proses testi, endüstriyel araştırma ve optimizasyon12.
Şu anda, bu ara bileşik (ACT051-3) için laboratuvar sentez yolları bildirilmiştir, ancak düşük verim, karmaşık reaksiyonlar ve yüksek ekipman gereksinimleri sorunları nedeniyle yalnızca küçük ölçekte gerçekleştirilmiştir ve bunlar hala optimize edilecek çok fazla alana sahiptir11,13,14,15. Bununla birlikte, şu anda ACT051-3 ara bileşiğinin pilot ölçek büyütme ve endüstriyel üretimi için herhangi bir proses rotası bildirilmemiştir.
Bu nedenle, bu çalışmada, daha iyi bildirilen laboratuvar sentetik yollarına atıfta bulunarak, ACT051-3 bileşiğinin pilot ölçek büyütme ve üretim rotasını araştırdık. Orijinal laboratuvar sentez yolu ile karşılaştırıldığında, reaksiyon koşullarında birçok uygun ayarlama ve iyileştirme yapılmış ve reaksiyon sonuçlarını etkileyebilecek diğer faktörler araştırılmıştır. Son olarak, optimum rota için en uygun proses parametreleri belirlendi ve ACT051-3'ün pilot ölçek büyütmesi ve üretimi için uygun, kullanımı kolay, düşük maliyetli ve çevre dostu bir proses rotası elde ettik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ACT051-2 ve ACT051-3 bileşiklerinin pilot ölçekli sentezi
- 2-bromo-5-tosyl-5H-pyrrolo[2,3-b]pyrazine sentezi (ACT051-2)
- Yuvarlak tabanlı bir şişede, 50.0 g bileşik 2-bromo-5H-pirolo [2,3-b] pirazin (ACT051-1; 0.25 M) 15 mL N, N-dimetilformamid (DMF; 3 V) içinde çözün.
- Azot koruması altındaki reaksiyon çözeltisine 65.3 g diizopropiletilamin (DIPEA; 0.51 M) ekleyin (bir gaz ve nem bariyeri sağlayın) ve sıcaklığı soğuk su banyosundan 0-5 ° C'ye soğutun. Azot koruması için, reaktörün basıncını -0.75--0.8 MPa'ya pompalayın, ardından basıncı 0.1 MPa'da dengelemek içinN2'yi geçin.
- 12 mL DMF (0.32 M) içinde çözünmüş 60.20 g TsCl ekleyin. Ilık su banyosundan sıcaklığı 20-30 ° C'ye yükseltin ve yaklaşık 1 saat karıştırın. Karışıma soğuk su (600.0 mL, 0-10 °C) ekleyin ve 1 saat daha karıştırın.
- Filtre kağıdı ile doldurulmuş bir zımpara tahtası ile cam bir huni kullanarak ürünü vakum altında filtreleyin. Birkaç kez suyla (200.0 mL) yıkayın ve% 78'lik bir verime sahip soluk sarı bir katı (ACT051-2) elde etmek için elektrikli bir termostatik kurutma fırını kullanarak kurutun.
- Tert-bütil (5-toluensülfonil-5H-pirrol [2,3-b] pirazin-2-il) karbamat sentezi (ACT051-3)
- 176.11 g ACT051-2'yi 366.31 g 1,4-dioksan içinde üç portlu yuvarlak tabanlı bir şişede çözün.
- Çözeltiye 65.75 g tert-bütil karbamat, 138.21 g granüler potasyum karbonat (2.0 eq), 11.57 g ksanfos (0.04 eq) ve 2.25 g Pd (OAc)2 (ağırlıkça% 1.28) ekleyin.
- Karışımı 105 ° C'ye ısıtın ve azot atmosferi altında 7 saat karıştırın. Karışımın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve ürünü bir Buchner hunisi ile filtreleyin (filtre kağıdı açıklığı 80-120 μm'dir).
- Filtre kalıntısını etil asetat (200 mL) ile yıkayın. Ürünü -0,095 MPa basınç değeri ile 50-60 ° C'de düşük basınç altında konsantre etmek için sirkülasyonlu bir su vakum pompası kullanın. Basıncı korumak ve koyu kahverengi bir yağ elde etmek için pompayı çalışır durumda tutun.
- Ham ürünü kolon kromatografisi ile saflaştırın, petrol eteri ve etil asetat (V / V, 10/1) ile salınım yaparak hedef bileşiği% 93.5'lik bir verime sahip beyaz bir katı olarak elde edin.
2. ACT051-2 ve ACT051-3 bileşiklerinin pilot ölçek büyütme sentezi
- 2-bromo-5-tosyl-5H-pyrrolo[2,3-b]pyrazine'in pilot ölçek büyütme sentezi (ACT051-2)
- Üç portlu yuvarlak tabanlı bir şişeye 1,0 kg ACT051-1 (5,05 M) ve 1,305 kg DIPEA (10,1 M) ekleyin. Şişeye 3 L DMF (3 V) ekleyin ve katıyı çözün. Reaksiyon karışımını 35 °C'ye ısıtın.
- Reaksiyon çözeltisine 1.203 kg TsCl (6.31 M) ekleyin ve 1 saat karıştırın. Reaksiyonun tamamlanması ince tabaka kromatografisi (TLC) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile doğrulanana kadar karışımı karıştırın. Kısacası, az miktarda reaksiyon ürünü alın ve bunu TLC izlemeye tabi tutun. TLC neredeyse hiç hammadde kalmadığını gösterdiğinde, numuneyi HPLC merkezi kontrolüne gönderin ve hammaddeye reaksiyonu veya ürün oranını 0.1 / 99.9 olarak tespit edin.
- 8.4 L soğuk suya dökün ve 0.5 saat daha karıştırın. Tüm sıvıları bir Buchner hunisi ile filtreleyin (filtre kağıdı açıklığı 80-120 μm'dir) ve ham ürünü 600 mL su ile durulayın.
- Elde edilen ürünü elektrikli termostatik etüv fırını kullanarak gece boyunca 70 ° C'de kurutun ve% 94.9 verime sahip bir ürün elde edin.
- Tert-bütil (5-toluensülfonil-5H-pirrol [2,3-b] pirazin-2-il) karbamatın (ACT051-3) pilot ölçek büyütme sentezi
- Reaksiyon su ısıtıcısına 3.31 L tert-amil alkol ve 4.97 L toluen (V / V, 2/3) ekleyin.
- Çözeltiye 1.66 kg ACT051-2, 0.83 kg tert-bütil karbamat, 1.301 kg toz potasyum karbonat, 0.11 kg ksantos ve 0.31 kg DIPEA ekleyin.
- Adım 1.1.2'de olduğu gibi azotu üç kez boşaltın, bu 3x'i tekrarlayın ve azot koruması altındaki reaksiyon çözeltisine 10 g Pd(OAc)2 (ağırlıkça %0,60) ekleyin.
- Reaksiyon karışımını 90 ° C'ye ısıtın ve 4 saat karıştırın. Karışımı 40 °C veya altına soğutun.
- Reaksiyon çözeltisini, filtre yardımcısı olarak diyatomit kullanarak ve filtre kekini tolüen ile yıkayarak bir Buchner hunisiyle (filtre kağıdı açıklığı 80-120 μm'dir) filtreleyin.
- Filtreyi toplayın ve konsantre edin. Filtreyi -0,095 MPa basınç değeri ile 50-60 ° C'de düşük basınç altında konsantre etmek için sirkülasyonlu bir su vakum pompası kullanın. Basıncı korumak için pompayı çalışır durumda tutun.
- 300 mL heptan ekleyin ve 20 dakika karıştırın. Reaksiyon çözeltisini bir Buchner hunisi ile tekrar filtreleyin (filtre kağıdı açıklığı 80-120 μm'dir) ve ham ürünü heptan ile durulayın (50 mL, üç kez). Kurutun ve% 96.3'lük bir verimle ürünü elde edin.
3. ACT051-2 ve ACT051-3 bileşiklerinin endüstriyel üretimi
- 2-bromo-5-tosyl-5H-pyrrolo[2,3-b]pyrazine endüstriyel üretimi (ACT051-2)
- Reaktörün temiz ve susuz olduğunu onaylayın ve karıştırma cihazının açılırken ses çıkarmadığından ve reaktörün alt tahliye vanasının kapatıldığından emin olun.
- 2.000 L emaye reaktörüne 355,50 kg DMF (3 V) ekleyin ve karıştırmaya başlayın. Çözeltiye 125,04 kg ACT051-1 (1,0 eq) ve 164,8 kg DIPEA (2,0 eq) ekleyin.
- Azot koruması altında sıcaklığı 20-25 °C'ye düşürün. 3 saat içinde 10 parti halinde 25-35 °C'de 150,22 kg TsCl (1,25 eq) ekleyin.
- Karışımın 25-35 ° C'de kalmasına izin verin ve 2 saat boyunca karıştırın. Başka bir 2.000 L reaktörde 750,20 kg soğuk su (3-4 ° C) hazırlayın.
- HPLC ile reaksiyonu izleyin ve kalan hammadde% 0,5 olduğunda reaksiyonun tamamlandığını onaylayın.
- Soğuk suyu (3-4 °C) reaksiyon karışımına ekleyin ve 15-30 °C'de 1,5 saat boyunca karıştırın. Filtratı toplayın ve nötr hale gelene kadar suyla (250-500 kg, 2-4 V) durulayın (pH kağıdı kullanılarak test edilmiştir).
- % 95.5 verime sahip açık kahverengi bir katı elde etmek için ürünü 60-65 ° C'de 30.5 saat kurutun.
- Tert-bütil (5-toluensülfonil-5H-pirrol [2,3-b] pirazin-2-il) karbamatın endüstriyel üretimi (ACT051-3)
- Reaktörün temiz ve susuz olduğunu onaylayın ve karıştırma cihazının normal olduğundan ve reaktörün alt tahliye vanasının kapalı olduğundan emin olun.
- 2.000 L emaye reaktörüne 340,10 kg tert-amil alkol (2 V) ve 552,50 kg toluen (3 V) ekleyin ve karıştırmaya başlayın.
- Çözeltiye 212.40 kg ACT051-2 (1.0 eq), 106.00 kg tert-bütil karbamat (1.5 eq), 166.70 kg toz potasyum karbonat (2.0 eq), 14.10 kg ksanthos (0.04 eq), 39.40 kg DIPEA (0.5 eq) ve 1.06 kg Pd(OAc)2 (ağırlıkça %0.5) ekleyin.
- Azotu dört kez değiştirin, karışımın azot koruması altında 85-95 ° C'ye ısınmasına izin verin ve 3 saat karıştırın. HPLC ile reaksiyonu izleyin ve kalan hammadde% 0.44 olduğunda reaksiyonun tamamlandığını onaylayın.
- Reaksiyon sıcaklığını 20-30 ° C'ye soğutun. Çözeltiyi gruplar halinde toplayın ve 30 dakika boyunca 125 L'lik plastik bir kovaya yerleştirin.
- Reaksiyon çözeltisini, filtre yardımı olarak diyatomit kullanarak ve filtre kekini toluen (185.20-370.40 kg, 1-2 V) ile yıkayarak kimyasal bir emme filtresi varili (filtre torbası açıklığı 10-15 μm'dir) ile filtreleyin.
- Filtreyi bir emaye kapta toplayın ve -0.095 MPa basınç değeri ile 10 saat boyunca 55-65 ° C'de düşük basınç altında sirkülasyonlu bir su vakum pompası kullanın. Basıncı korumak ve ürün bileşiğini viskoz bir sıvı olarak elde etmek için pompayı çalışır durumda tutun.
- Toluen pompalayarak ve reaksiyona devam ederek ürünü iki kez buharlaştırın. Nihai ürünü 4 saat konsantre edin. Elde edilen ürünü,% 98.5'lik bir verime sahip bir katı elde etmek için heptan ve etil asetat (V / V, 10/1-3 / 1) ile salınan kolon kromatografisi ile saflaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma, Upatinib'in önemli ara maddesi ACT051-3 için ölçeklendirilmiş sentez sürecini sağlamaktadır (Şekil 1 ve Şekil 2). Protokol bölümü (adım 1-3) özellikle ACT051-2 bileşiğinin gram dereceli sentezini, pilot ölçekli kilogram dereceli sentezini ve ölçek büyütme üretim adımını ve ara ACT051-3'ü gösterir.
ACT051-2 bileşiği için en uygun rotanın araştırılması sırasında, Tablo 1'de gösterildiği gibi, katı TsCl'nin reaksiyonda sıvı TsCl'den (DMF'de çözünmüş, protokolün 3.1. adımı) daha fazla yer aldığı ve DMF miktarını yaklaşık üç kat azalttığı bulunmuştur. Ek olarak, TsCl 0-5 ° C'den 23-35 ° C'ye ( Tablo 2'de gösterilmiştir) eklendiğinde karışık çözeltinin sıcaklığı artırılarak ürün verimi% 97.49'dan% 98.44'e çıkarılmıştır. Ayrıca, arıtma sonrası su tüketimi ile ilgili deneyler yapılmıştır. Tablo 3'te gösterildiği gibi, su tüketiminde 2,5 kat azalmadan sonra (15 mL/g ACT051-2'den 6 mL/g ACT051-2'ye), reaksiyon verimi %2,5 oranında azalmıştır, ancak atık çözelti üretimi azalmıştır ve reaksiyon verimliliği önemli ölçüde artmıştır.
Ara ACT051-3 için optimize edilmiş proses rotasını elde etmek için bir dizi deneysel koşul geliştirilmiştir. Tablo 4'te gösterildiği gibi, reaksiyona DIPEA sokularak ve reaksiyon çözücüsünün tert-amil alkol / toluen (V / V, 2/3) ile değiştirilmesiyle, Pd (OAc) 2 miktarı 2,5 kat azaltıldı (ağırlıkça% 1.28'den% 0.5'e), bu da üretim maliyetini önemli ölçüde düşürdü ve üretimi ölçeklendirmenin fizibilitesini daha da artırdı. Ek olarak, reaksiyonda yer alanK2CO 3'ün durumunu değiştirerek, reaksiyon süresi 7 saatten3.5 saate düşürüldü, bu da reaksiyon verimliliğini büyük ölçüde artırdı ( Tablo 5'te gösterildiği gibi). Ek olarak, tert-amil alkol/1,4-dioksandan (V/V, 1/4) tert-amil alkol/toluene (V/V, 2/3) geçilerek, reaksiyon süresi 3 saate kısaltılmış, ürünün tepe alanı %84,22'den %88,52'ye yükselmiş ve ürünün konsantre olması için geçen süre önemli ölçüde kısalmıştır, bunların hepsi reaksiyonun verimliliğini artırmıştır (bakınız Tablo 6).
Her iki bileşik ACT051-2 ve ACT051-3, proton nükleer manyetik rezonans (1H NMR), HPLC ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile kimyasal olarak karakterize edildi. ACT051-2 ve ACT051-3'ün analiz yöntemleri (HPLC, 1 H NMR ve elektrosprey iyonizasyon [ESI] spektroskopisi) destekleyici çalışmada bulunabilir (Ek Tablo 1, Ek Şekil 1, Ek Şekil 2, Ek Şekil 3, Ek Şekil 4, Ek Şekil 5 ve Ek Şekil 6). ACT051-2 ve ACT051-3 için karakterizasyon verileri aşağıda bildirilmiştir:
2-bromo-5-tosyl-5H-pyrrolo [2,3-b] pirazin (ACT051-2):
1Y NMR (500 MHz, DMSO-d 6)δ8,59 (s,1H), 8,37 (d, J = 4,1 Hz, 1H), 8,00 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,46 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,02 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 3,29 (d, J = 11,9 Hz, 3H). ESI: m/z, C13 H 10BrN3O2S [M] + 352.21 için hesaplanmış, 352.00 olarak bulunmuştur.
Tert-bütil (5-toluensülfonil-5H-pirrol [2,3-b] pirazin-2-il) karbamat (ACT051-3):
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ8.98 (s, 1H), 7.95 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.84 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H), 7.19-7.17 (m, 1H), 6.53 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 2.30 (s, 3H), 1.45 (s, 9H). ESI: m/z, C 18 H20N4O4S [M+H] + 389.12 için hesaplanmış, 389.15 olarak bulunmuştur.
Resim 1: ACT051-3 ara maddesinin sentez yolu. (A) ACT051-3'ün optimizasyondan önceki reaksiyon yolu ve koşulları: i) DMF, DIPEA, TsCl; ii) ksantfos, Pd(OAc)2,K2CO3, tert-amil alkol/1,4-dioksan (V/V, 1/4); (B) ACT051-3'ün optimizasyondan sonraki reaksiyon yolu ve koşulları: i) DMF, DIPEA, TsCl; ii) ksantfos, Pd(OAc)2,K2CO 3, DIPEA, tert-amil alkol/toluen (V/V, 2/3). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ölçek büyütme üretiminde ACT051-2 ve ACT051-3 bileşiklerinin proses akış diyagramı. (A) Ölçek büyütme üretiminde ACT051-2'nin proses akış diyagramı. (B) Ölçek büyütme üretiminde ACT051-3'ün proses akış diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Sayı | TsCl Eyaleti | V(DMF) (Laboratuvar testi) | V(DMF) (Pilot ölçek büyütme) |
| 1 | DMF'de çözünme | 8,5 V | 54 V |
| 2 | katı | 3,0 V | 18 V |
Tablo 1: Farklı TsCl formlarının sentetik bileşik ACT051-2 üzerindeki etkisi. TsCl'nin farklı durumları sıvı TsCl (DMF'de çözünmüş) ve katı TsCl'yi içerir. deneysel sonuçlar, katı TsCl'nin endüstriyel üretime daha elverişli olduğunu göstermektedir.
| Sayı | Sıcaklık (°C) | Karışımın durumu | Bir açıklama süreci olup olmadığı | Rekolte | Saflık |
| 1 | 0-5 | ağdalı | Hayır | 97.49% | 96.85% |
| 2 | 25-35 | iyi karıştırma | Evet | 98.44% | 96.99% |
Tablo 2: Farklı sıcaklıklarda TsCl eklenmesinin ACT051-2 sentezine etkisi. 0-5 °C veya 23-35 °C'de reaksiyona TsCl eklenmesi.
| Sayı | Su tüketimi | Rekolte | Saflık |
| 1 | 15 mL / g ACT051-1 | 97.49% | 96.85% |
| 2 | 6 mL / g ACT051-1 | 94.90% | 97.69% |
| 3 | 9 mL / g ACT051-1 | 95.07% | 96.71% |
Tablo 3: Farklı arıtma sonrası su tüketiminin ACT051-2 sentezine etkisi. 15 mL/g ACT051-1, 9 mL/g ACT051-1 ve 6 mL/g ACT051-1 dahil olmak üzere farklı arıtma sonrası su tüketimlerini deneyin. En uygun koşullar, 6 mL / g ACT051-2'lik bir arıtma sonrası su hacminde elde edildi.
| Sayı | DIEPA'ya eşdeğer | K2CO3'e eşdeğer | Pd(OAc)2 eşdeğeri |
| 1 | 0,0 eq | 3.0 EQ | %1,28 ağırlık |
| 2 | 2.0 EQ | 2.0 EQ | %0,60 ağırlık |
| 3 | 1.0 eq | 2.0 EQ | %0,60 ağırlık |
| 4 | 0,5 eq | 2.0 EQ | %0,60 ağırlık |
Tablo 4: ACT051-3 sentezi için reaksiyona DIPEA eklenmesinin etkisi. DIPEA ilavesinin veya olmamasının reaksiyon üzerindeki etkisinin araştırılması. Sonuçlar, DIPEA uygulamasının Pd (OAc) 2 miktarını 2,5 kat azalttığını göstermiştir (ağırlıkça% 1.28'den ağırlıkça% 0.5'e).
| Sayı | K2CO3 Durumu | Eşdeğer | Reaksiyon süresi (h) |
| 1 | katı | 2.0 EQ | 7 |
| 2 | Toz | 2.0 EQ | 3.5 |
Tablo 5:K2CO 3'ün farklı durumlarının sentetik bileşik ACT051-3'ün reaksiyonu üzerindeki etkisi. Reaksiyona katılmak için granül veya toz formunda potasyum karbonat seçin.
| Sayı | Pd(OAc)2 dozu | Reaksiyon çözücü | V/V | Reaksiyon süresi / saat | Ürün tepe alanı/ % |
| 1 | %0,60 ağırlık | tert amil alkol / 1,4-dioksan | 1-4 | 3.5 | 84.22 |
| 2 | %0,60 ağırlık | tert amil alkol / 1,4-dioksan | 2-3 | 3.5 | 83.34 |
| 3 | %0,60 ağırlık | tert amil alkol / Toluen | 2-3 | 3 | 88.52 |
| 4 | %0,50 ağırlıkça | tert amil alkol / Toluen | 2-3 | 2.25 | 87.11 |
Tablo 6: Farklı reaksiyon çözücülerinin sentetik bileşik ACT051-3'ün reaksiyonu üzerindeki etkisi. Tert-amil alkol/1,4-dioksan (V/V, 1/4) ve tert-amil alkol/toluen (V/V, 2/3) reaksiyon çözücüleri olarak seçilir.
Ek Tablo 1: ACT051-2 ve ACT051-3 bileşiklerinin analitik yöntemi. ACT051-2 ve ACT051-3 bileşiklerinin analizi için cihaz, yöntem adı, sıvı faz sütunu, mobil faz, sütun sıcaklığı, akım hızı ve dalga boyu dahil olmak üzere spesifik kromatografik koşullar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: ACT051-2'nin yüksek performanslı sıvı kromatogramları. Verilerin sonuçları HPLC tarafından tespit edildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: ACT051-3'ün yüksek performanslı sıvı kromatogramları. Verilerin sonuçları HPLC tarafından tespit edildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: ACT051-2'nin MS spektrumu. Verilerin sonuçları ESI spektroskopisi ile tespit edildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 4: ACT051-3'ün MS spektrumu. Verilerin sonuçları ESI spektroskopisi ile tespit edildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 5: ACT051-2'nin 1H NMR spektrumu. Verilerin sonuçları MestReNova kullanılarak analiz edilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 6: ACT051-3'ün 1H NMR spektrumu. Verilerin sonuçları MestReNova kullanılarak analiz edilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Reaksiyon sıcaklığı, zamanı, reaksiyon reaktiflerinin seçimi ve malzemelerin oranı dahil olmak üzere sentezin reaksiyon koşulları, özellikle ölçek büyütme üretimi için reaksiyonun fizibilitesini, verimini, saflığını ve üretim maliyetini etkiler.
ACT051-2'nin laboratuvar sentezinde, sıvı formdaki TsCl (DMF'de çözünmüş; adım 1.1.3) reaksiyonda kullanılabilir; Bununla birlikte, pilot ölçek büyütme sentezi veya endüstriyel üretim için uygun değildir, çünkü bu reaksiyon için sıvı TsCl kullanılması, reaksiyon sistemindeki çözücü miktarını arttırır ve daha fazla atık sıvı ile sonuçlanır. Sonuç olarak, pilot ölçek büyütme ve endüstriyel üretimdeki reaksiyon için katı TsCl'yi seçtik (sırasıyla protokolün 2.1.2 ve 3.1.3 adımları) ve çevre koruma ve yeşil kimya kavramını göz önünde bulundurarak iyi deneysel sonuçlar elde ettik (Tablo 1).
Ek olarak, pilot ölçek büyütme deneylerinde, düşük bir sıcaklıkta büyük miktarda TsCl eklenmesinin, reaksiyon sistemini karıştırılamayacak kadar viskoz hale getirdiği ve hammaddenin kapsüllenmesi riskine neden olduğu bulunmuştur. Bu riski ele almak için, sıcaklık 0-5 ° C'den 25-35 ° C'ye yükseltildi (protokolün 2.1.1 veya 3.1.4 adımları), eklenen katı TsCl için yeterli karıştırma elde edildi, reaksiyon çözeltisi sistemi iyi akışkanlığa sahipti ve reaksiyon sorunsuz bir şekilde ilerledi (Tablo 2).
Ayrıca, ACT051-2'nin arıtma sonrası deneyleri için büyük miktarda su (15 mL / g ACT051-1) gerekliydi, bu da üretim deneylerinin ölçeklendirilmesi için uygun değildi ve daha fazla atık çözeltisi üretti. Bu nedenle, çevre koruma perspektifinden, üretim süreci koşullarının araştırılmasında arıtma sonrası için kullanılan optimum su miktarı derhal araştırılmıştır. Tablo 3'te gösterildiği gibi, arıtma sonrası su miktarı 6 mL / g ACT051-1'e düşürüldüğünde, deneyin verimi biraz etki gösterdi, ancak verimliliği büyük ölçüde artırabilir ve atık sıvı oluşumunu azaltabilir.
ACT051-3 ara ürününün endüstriyel üretim süreci rotasını araştırırken, çok sayıda proses optimizasyonu deneyi gerçekleştirdik ve birçok ölçeklendirme problemini çözdük. ACT051-3'ün sentezinde, ACT051-2, ACT051-3 bileşiğini vermek için Pd (OAc) 2 ve xanthphos tarafından katalize edilen tert-bütil karbamat ile bir Buchwald-Hartwig kaplin reaksiyonuna tabi tutuldu. Pd(0), Suzuki ve Buchwald16,17,18,19 gibi eşleşme yanıtlarında yaygın olarak kullanılan aktif bir paladyum türüdür. Bununla birlikte, Pd (II) reaksiyonu katalize etmek için yaygın olarak kullanılır. Sonuç olarak, Pd(II)'yi Pd(0)'a indirgemek için bir amin bileşiği (DIPEA) kullandık ve tüm reaksiyonun katalitik sistemini bir Pd(0) ve Pd(II) katalitik döngüsünde bıraktık. DIPEA'nın eklenmesiyle, pahalı katalizör Pd(OAc)2'nin miktarı %1,28'den %0,5'e düşürüldü (Tablo 4), bu da ölçek büyütme üretim maliyetini büyük ölçüde azalttı ve yöntemin rasyonelliğini ve fizibilitesini daha da güçlendirdi.
Uzun reaksiyon süresi çok sayıda yan reaksiyona neden olur ve üretimi artırmaya elverişli olmayan safsızlıklar üretir. Kapsamlı laboratuvar çalışmaları sayesinde, potasyum karbonatın durumunun granülerden toza değiştirilmesinin (protokolün 1.2.2 veya 2.2.2 adımları), endüstriyel üretim için daha elverişli olan reaksiyon süresinin uygun bir şekilde azaltılmasına neden olduğu bulunmuştur (Tablo 5). Ek olarak, küçük ölçekli pilot deneyde kullanılan 1,4-dioksanın konsantre edilmesinin daha zor olduğunu göz önünde bulundurarak (protokolün 1.2.1. adımı), toluen ve tert-butanolün kombinasyonunu düşündük (protokolün 2.2.1 veya 3.2.2 adımları; V/V, 2/3), endüstriyel üretim için reaksiyon çözücüleri olarak daha iyi konsantre çözücülerdir. Sonuçlar, reaksiyonun büyük bir terfi oranı elde ettiğini, reaksiyon süresini azalttığını ve reaksiyonun verimliliğini artırdığını göstermiştir (bakınız Tablo 6).
Sonuç olarak, deneysel koşulların tekrar tekrar araştırılmasından sonra, ACT051-2 ve ACT051-3 bileşikleri için optimum proses ölçek büyütme koşulları nihayet elde edilmiştir ve bu ölçek büyütme üretiminin proses akış diyagramı Şekil 2'de gösterilmiştir. Ölçeklendirilmiş üretimin sonuçları, tüm sürecin istikrarlı olduğunu ve ürün veriminin normal olduğunu gösterdi (protokolün 3.1.7 veya 3.2.8 adımları).
Bu çalışmada elde edilen endüstriyel üretim rotası mevcut yeni bir rotadır ve bu proses rotasının gelecekteki endüstriyel üretimde fizibilitesi de doğrulanmıştır. Ek olarak, bu çalışmada elde edilen sonuçlar, ACT051-2 ve ACT051-3 bileşiklerinin endüstriyel üretim yolunun gelecekteki araştırmaları için bazı teknik araştırma temelleri sağlamaktadır.
Bununla birlikte, ACT051-2'nin sentezinde aşırı olan ve daha da azaltılabilen TsCl (1.25 eq) miktarı gibi proses yolunun optimizasyonu ve iyileştirilmesi için hala yer vardır. Ek olarak, ACT051-3'ün sentezinde, son işlemi kolaylaştırmak için reaksiyon çözücüsü olarak sadece toluen kullanılabilir ve katalizör Pd (OAc) 2 miktarı azalmaya devam edebilir. Yukarıdaki teknik konular, sentetik bileşik ACT051-3'ün üretimini daha iyi ölçeklendirmek için gelecekteki çalışmalarda daha fazla incelenebilir ve araştırılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Burada bahsedilecek bir onay yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-bromo-5H-pyrrolo[2,3-b]pyrazine | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | 19120110 | |
| 1,4-dioxane | Liaoning cook Biotechnology Co., Ltd | General Reagent | |
| 1H NMR | Bruker AVIII 500 | ||
| 37% chloride acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| 4-toluenesulfonyl chloride (TsCl) | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | AR A2010137 | |
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Circulating water vacuum pump | Guangzhou Zhiyan Instrument Co., Ltd | SHZ-D( ) |
|
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Diatomite | Guangzhou Qishuo Chemical Co., Ltd. | / | |
| Double cone rotary vacuum dryer | Jiangsu Yang-Yang Chemical Equipment Plant Inc | SZE-500T | |
| enamel kettle | Jiangsu Yang-Yang Chemical Equipment Plant Inc | CS-03-002 | 1000L / 2000L |
| heptane | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | General Reagent | |
| HPLC | Guangzhou aoyi Technology Trading Co., Ltd | LC-2030C 3D | |
| Large scale rotary evaporators | Guangzhou Xingshuo Instrument Co.,Ltd. | RE-2002 | |
| Low temperature and constant temperature stirring reaction bath | Guangzhou Yuhua Instrument Co., Ltd | XHDHJF-3005 | |
| Low temperature coolant circulating pump | Guangzhou Jincheng Scientific Instrument Co., Ltd | XHDLSB-5/25 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N, N-Diisopropyl ethylamine (DIPEA) | Apicci Pharm | General Reagent | |
| N-dimethylformamide (DMF) | Guangzhou bell Biotechnology Co., Ltd | General Reagent | |
| Octanoid acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Pd(OAc)2 | Xi'an Catalyst New Materials Co.,ltd. | 200704 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Potassium carbonate (K2CO3) | Guangzhou Zhonghua Trade Co.,Ltd. | General Reagent | |
| Tert amyl alcohol | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | General Reagent | |
| tert-Butyl carbamate | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | General Reagent | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R | |
| toluene | Liaoning cook Biotechnology Co., Ltd | General Reagent | |
| Vacuum drying oven | Guangzhou Yuhua Instrument Co., Ltd | DZF-6090 | |
| Water | / | / | |
| Xantphos | Liaoning cook Biotechnology Co., Ltd | Asp20-44892 |
References
- Kerschbaumer, A., et al. Points to consider for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases with Janus kinase inhibitors: a systematic literature research. RMD Open. 6 (3), e001374 (2020).
- Fragoulis, G. E., Brock, J., Basu, N., McInnes, I. B., Siebert, S. The role for JAK inhibitors in the treatment of immune- mediated rheumatic and related conditions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 941-952 (2021).
- Shaw, T., et al. P220 Long-term safety profile of upadacitinib in patients with rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, or ankylosing spondylitis. Rheumatology. 61, 133 (2022).
- Keeling, S., Maksymowych, W. P. JAK inhibitors, psoriatic arthritis, and axial spondyloarthritis: a critical review of clinical trials. Expert Review of Clinical Immunology. 17 (7), 701-715 (2021).
- Fleischmann, R., et al. Safety and efficacy of elsubrutinib or upadacitinib alone or in combination (ABBV-599) in patients with rheumatoid arthritis and inadequate response or intolerance to biological therapies: a multicentre, double-blind, randomised, controlled, phase 2 trial. The Lancet Rheumatology. 4 (6), e395-e406 (2022).
- Stamatis, P., Bogdanos, D. P., Sakka, L. I.
- Rubbert-Roth, A., et al. Trial of upadacitinib or abatacept in rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 383 (16), 1511-1521 (2020).
- Asfour, L., Getsos Colla, T., Moussa, A., Sinclair, R. D. Concurrent chronic alopecia areata and severe atopic dermatitis successfully treated with upadacitinib. International Journal of Dermatology. 61 (11), e416-e417 (2022).
- Cantelli, M., et al. Upadacitinib improved alopecia areata in a patient with atopic dermatitis: A case report. Dermatologic Therapy. 35 (4), e15346 (2022).
- Traves, P. G., et al. JAK selectivity and the implications for clinical inhibition of pharmacodynamic cytokine signalling by filgotinib, upadacitinib, tofacitinib and baricitinib. Annals of the Rheumatic Diseases. 80 (7), 865-875 (2021).
- Rozema, M. J., et al. Development of a scalable enantioselective synthesis of JAK inhibitor upadacitinib. Organic Process Research & Development. 26 (3), 949-962 (2022).
- Wynn, J. P., Hanchar, R., Kleff, S., Senyk, D., Tiedje, T. Biobased technology commercialization: the importance of lab to pilot scale-up. Metabolic Engineering for Bioprocess Commercialization. , Springer. 101-119 (2016).
- Tang, C., et al. Influenza virus replication inhibitor and use thereof. , US202000283454A1 (2020).
- Ren, Q., et al. Inhibitors of influenza virus replication and uses thereof. Center for Biotechnology Information. , US20200339564A1 (2020).
- Van Epps, S., et al. Design and synthesis of tricyclic cores for kinase inhibition. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 23 (3), 693-698 (2013).
- Paul, F., Patt, J., Hartwig, J. F. Palladium-catalyzed formation of carbon-nitrogen bonds. Reaction intermediates and catalyst improvements in the hetero cross-coupling of aryl halides and tin amides. Journal of the American Chemical Society. 116 (13), 5969-5970 (1994).
- Zhou, T., Ji, C. L., Hong, X., Szostak, M. Palladium-catalyzed decarbonylative Suzuki-Miyaura cross-coupling of amides by carbon-nitrogen bond activation. Chemical Science. 10 (42), 9865-9871 (2019).
- Sain, S., Jain, S., Srivastava, M., Vishwakarma, R., Dwivedi, J. Application of palladium-catalyzed cross-coupling reactions in organic synthesis. Current Organic Synthesis. 16 (8), 1105-1142 (2019).
- Takale, B. S., Kong, F. Y., Thakore, R. R. Recent applications of Pd-catalyzed Suzuki-Miyaura and Buchwald-Hartwig couplings in pharmaceutical process chemistry. Organics. 3 (1), 1-21 (2021).
