Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה מורחבת של tert-butyl ביניים (5-toluenesulfonyl-5h-pyrrole [2,3-b] pyrazine-2-yl) carbamate (ACT051-3) של Upatinib.
Abstract
אופטינב, תרופה מעכבת יאנוס קינאז, פותחה על ידי חברת ביוטק לטיפול במחלות חיסוניות. התרכובת tert-butyl (5-toluenesulfonyl-5h-pyrrole [2,3-b], pyrazine-2-yl) carbamate (ACT051-3) היא מתווך חשוב של Upatinib. עד כה, הייצור התעשייתי היציב של מתחם ביניים זה (ACT051-3) לא דווח. במחקר זה, תיארנו את שיטת הסינתזה הספציפית ואת התהליך של התרכובת ACT051-3 במונחים של סינתזה במעבדה, הרחבת פיילוט וייצור תעשייתי. במהלך חקר מסלול התהליך עבור ACT051-3, בוצעו התאמות ושיפורים מתאימים רבים בתנאי התגובה, שהובילו לבסוף לפיתוח מוצלח של תהליך הייצור התעשייתי האופטימלי עבור ACT051-3. זמן התגובה כמעט הוכפל על ידי שינוי מצב האשלגן הפחמתי המעורב בתגובה, מה ששיפר מאוד את יעילות התגובה. בנוסף, על ידי החדרת N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) לתגובה, כמות הזרז היקר Pd(OAc)2 הופחתה פי 2.5 , מה שהוריד משמעותית את עלויות הייצור, אישר את ההיתכנות של מסלול תהליך זה ואת הייצור התעשייתי של ACT051-3, וסיפק את הביקוש בשוק עבור ביניים חשוב זה.
Introduction
Upatinib הפך מעכב Janus kinase 1 (JAK1) פופולרי ברחבי העולם לטיפול בהפרעות חיסוניות בשנים האחרונות 1,2. תרופה זו הדגימה השפעות טיפוליות משמעותיות על פסוריאטיקה (PsA) 3,4, דלקת מפרקים שגרונית (RA)5,6,7, ואטופיק דרמטיטיס (AD)8,9. בנוסף, בשל הסלקטיביות הגבוהה שלה10, Upatinib יש מגוון רחב של יישומים קליניים. Tert-butyl (5-tosyl-5h-pyrolo [2,3-b] pyrazin-2-yl) carbamate (ACT051-3) הוא מתווך חשוב של Upatinib. המרכיבים המבניים העיקריים שלה הם טבעת פירול וטבעת פירזין, אשר ניתן להשתמש בהם להכנת מעכבי קינאז טריציקליים חדשים המכילים חנקן לטיפול במחלות חיסוניות וגידולים11.
Pilot scale-up הוא קנה מידה בינוני (50x-100x) של מסלול התהליך והתנאים שנקבעו על ידי מחקר פיילוט המעבדה, ואחריו בדיקות תהליך, חקירה תעשייתית ואופטימיזציה כדי לקבוע את הייצור התעשייתי הטוב ביותר ואת תנאי ההפעלה12.
נכון לעכשיו, מסלולי סינתזת מעבדה עבור תרכובת ביניים זו (ACT051-3) דווחו, אך הם בוצעו רק בקנה מידה קטן עקב בעיות של תפוקה נמוכה, תגובות מורכבות ודרישות ציוד גבוהות, שעדיין יש הרבה מקום לאופטימיזציה של11,13,14,15. עם זאת, נכון לעכשיו לא דווח על מסלול תהליך להרחבת פיילוט וייצור תעשייתי של מתחם הביניים ACT051-3.
לכן, במחקר זה, חקרנו את מסלול הפיילוט והייצור של התרכובת ACT051-3, תוך התייחסות למסלולים הסינתטיים המדווחים יותר במעבדה. בהשוואה למסלול הסינתזה המקורי במעבדה, בוצעו התאמות ושיפורים מתאימים רבים בתנאי התגובה, ונבדקו גורמים אחרים שעשויים להשפיע על תוצאות התגובה. לבסוף, זוהו פרמטרי התהליך המתאימים ביותר למסלול האופטימלי, וקיבלנו מסלול תהליך פשוט לתפעול, זול וידידותי לסביבה, המתאים להרחבת פיילוט וייצור ACT051-3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזה בקנה מידה פיילוט של תרכובות ACT051-2 ו- ACT051-3
- סינתזה של 2-bromo-5-tosyl-5H-pyrrolo[2,3-b]pyrazine (ACT051-2)
- בצלוחית בעלת תחתית עגולה, יש להמיס 50.0 גרם של התרכובת 2-bromo-5H-pyrrolo[2,3-b]pyrazine (ACT051-1; 0.25 M) ב-15 מ"ל של N,N-dimethylformamide (DMF; 3 V).
- הוסף 65.3 גרם של diisopropylethylamine (DIPEA; 0.51 M) לתמיסת התגובה תחת הגנת חנקן (לספק מחסום גז ולחות) ולקרר את הטמפרטורה ל 0-5 ° C באמצעות אמבט מים קרים. להגנה מפני חנקן, יש לשאוב את לחץ הכור ל-0.75--0.8 מגפ"ס, ואז להעביר את N2 כדי לאזן את הלחץ ב-0.1 מגפ"ס.
- הוסף 60.20 גרם של TsCl מומס ב 12 מ"ל של DMF (0.32 M). העלו את הטמפרטורה ל 20-30 מעלות צלזיוס דרך אמבט המים החמים וערבבו במשך כשעה. מוסיפים מים קרים (600.0 מ"ל, 0-10°C) לתערובת ומערבבים עוד שעה.
- מסננים את המוצר תחת ואקום באמצעות משפך זכוכית עם קרש שיוף מרופד בנייר פילטר. יש לשטוף במים (200.0 מ"ל) מספר פעמים ולייבש באמצעות תנור ייבוש תרמוסטטי חשמלי לקבלת מוצק צהוב-בהיר (ACT051-2) עם תפוקה של 78%.
- סינתזה של tert-butyl (5-toluenesulfonyl-5H-pyrrole [2,3-b] pyrazine-2-yl) carbamate (ACT051-3)
- יש להמיס 176.11 גרם של ACT051-2 ב-366.31 גרם של 1,4-דיוקסן בבקבוק עגול בעל שלוש יציאות.
- הוסף 65.75 גרם של טרט-בוטיל קרבמט, 138.21 גרם של אשלגן פחמתי גרגירי (2.0 eq), 11.57 גרם של xantphos (0.04 eq), ו 2.25 גרם של Pd(OAc)2 (1.28% wt) לתמיסה.
- מחממים את התערובת ל-105°C ומערבבים במשך 7 שעות תחת אווירת חנקן. מניחים לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר ומסננים את המוצר בעזרת משפך בוכנר (מפתח נייר הסינון הוא 80-120 מיקרומטר).
- לשטוף את שאריות המסנן עם אתיל אצטט (200 מ"ל). השתמש במשאבת ואקום מים במחזור כדי לרכז את המוצר בלחץ מופחת ב 50-60 ° C עם ערך לחץ של -0.095 MPa. שמור על המשאבה פועלת כדי לשמור על הלחץ ולקבל שמן חום כהה.
- לטהר את המוצר הגולמי עם כרומטוגרפיה עמודה, פולט עם אתר נפט ואתיל אצטט (V/V, 10/1) כדי לקבל את תרכובת המטרה כמו מוצק לבן עם תשואה של 93.5%.
2. פיילוט סינתזת סקייל-אפ של תרכובות ACT051-2 ו-ACT051-3
- סינתזת פיילוט של 2-bromo-5-tosyl-5H-pyrrolo[2,3-b]pyrazine (ACT051-2)
- הוסף 1.0 ק"ג של ACT051-1 (5.05 מ') ו-1.305 ק"ג של DIPEA (10.1 מ') לצלוחית בעלת שלוש יציאות בעלות תחתית עגולה. מוסיפים 3 ליטר DMF (3 V) לבקבוק וממיסים את המוצק. מחממים את תערובת התגובה ל-35°C.
- הוסף 1.203 ק"ג של TsCl (6.31 M) לתמיסת התגובה וערבב במשך שעה אחת. ערבבו את התערובת עד להשלמת התגובה שאושרה על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). בקיצור, קח כמות קטנה של מוצר תגובה וכפוף את זה לניטור TLC. כאשר ה-TLC מראה שכמעט ולא נותר חומר גלם, שלח את הדגימה לבקרה המרכזית של HPLC, וזהה שהתגובה לחומר הגלם או ליחס המוצר היא 0.1/99.9.
- יוצקים פנימה 8.4 ליטר מים קרים ומערבבים עוד 0.5 שעות. מסננים את כל הנוזלים בעזרת משפך Buchner (מפתח נייר הסינון הוא 80-120 מיקרומטר) ושוטפים את המוצר הגולמי ב-600 מ"ל מים.
- יבש את המוצר שהתקבל ב 70 ° C במשך הלילה באמצעות תנור ייבוש תרמוסטטי חשמלי ולקבל מוצר עם תפוקה של 94.9%.
- סינתזת פיילוט של tert-butyl (5-toluenesulfonyl-5H-pyrrole [2,3-b] pyrazine-2-yl) carbamate (ACT051-3)
- הוסף 3.31 ליטר אלכוהול טרט-עמיל ו-4.97 ליטר טולואן (V/V, 2/3) לקומקום התגובה.
- לתמיסה, הוסף 1.66 ק"ג של ACT051-2, 0.83 ק"ג של טרט-בוטיל קרבמט, 1.301 ק"ג של אבקת אשלגן פחמתי, 0.11 ק"ג של xantphos, ו 0.31 ק"ג של DIPEA.
- פנה חנקן שלוש פעמים, כמו בשלב 1.1.2, חזור על כך 3x, והוסף 10 גרם של Pd(OAc)2 (0.60% wt) לתמיסת התגובה תחת הגנת חנקן.
- מחממים את תערובת התגובה ל-90°C ומערבבים במשך 4 שעות. מצננים את התערובת ל-40°C ומטה.
- מסננים את תמיסת התגובה בעזרת משפך בוכנר (מפתח נייר הסינון הוא 80-120 מיקרומטר) באמצעות דיאטומיט כעזר לסינון ושטיפת עוגת המסנן בטולואן.
- אוספים ומרכזים את התסנין. השתמש במשאבת ואקום מים במחזור כדי לרכז את התסנין בלחץ מופחת ב 50-60 ° C עם ערך לחץ של -0.095 MPa. שמור על המשאבה פועלת כדי לשמור על הלחץ.
- מוסיפים 300 מ"ל של הפטן ומערבבים במשך 20 דקות. מסננים שוב את תמיסת התגובה בעזרת משפך Buchner (מפתח נייר הסינון הוא 80-120 מיקרומטר) ושוטפים את המוצר הגולמי בהפטן (50 מ"ל, שלוש פעמים). יבש ולקבל את המוצר עם תשואה של 96.3%.
3. ייצור תעשייתי של תרכובות ACT051-2 ו- ACT051-3
- ייצור תעשייתי של 2-bromo-5-tosyl-5H-pyrrolo[2,3-b]pyrazine (ACT051-2)
- ודא שהכור נקי ונקי ממים, וודא שמכשיר הערבול אינו משמיע רעש בעת ההפעלה ושסתום הפריקה התחתון של הכור נסגר.
- הוסיפו 355.50 ק"ג DMF (3 וולט) לכור האמייל בנפח 2,000 ליטר והתחילו לערבב. הוסף 125.04 ק"ג של ACT051-1 (1.0 eq) ו- 164.8 ק"ג של DIPEA (2.0 eq) לתמיסה.
- הורידו את הטמפרטורה ל-20-25 מעלות צלזיוס תחת הגנת חנקן. הוסף 150.22 ק"ג של TsCl (1.25 eq) ב 25-35 ° C ב 10 אצוות בתוך 3 שעות.
- הניחו לתערובת להישאר בטמפרטורה של 25-35°C וערבבו במשך שעתיים. הכינו 750.20 ק"ג מים קרים (3-4°C) בכור נוסף בנפח 2,000 ליטר.
- עקוב אחר התגובה על ידי HPLC ואשר את השלמת התגובה כאשר חומר הגלם הנותר הוא 0.5%.
- מוסיפים את המים הקרים (3-4 מעלות צלזיוס) לתערובת התגובה ומערבבים ב 15-30 ° C במשך 1.5 שעות. יש לאסוף את התסנין ולשטוף במים (250-500 ק"ג, 2-4 וולט) עד שהוא הופך לניטרלי (נבדק באמצעות נייר pH).
- יבש את המוצר ב 60-65 ° C במשך 30.5 שעות כדי לקבל מוצק חום בהיר עם תשואה של 95.5%.
- ייצור תעשייתי של tert-butyl (5-toluenesulfonyl-5H-pyrrole [2,3-b] pyrazine-2-yl) carbamate (ACT051-3)
- ודא שהכור נקי ונקי ממים, וודא שמכשיר הערבוב תקין ושסתום הפריקה התחתון של הכור נסגר.
- הוסיפו 340.10 ק"ג אלכוהול טרט-עמיל (2 וולט) ו-552.50 ק"ג טולואן (3 וולט) לכור אמייל בנפח 2,000 ליטר והתחילו לערבב.
- הוסף 212.40 ק"ג של ACT051-2 (1.0 eq), 106.00 ק"ג של tert-butyl carbamate (1.5 eq), 166.70 ק"ג של אבקת אשלגן פחמתי (2.0 eq), 14.10 ק"ג של xantphos (0.04 eq), 39.40 ק"ג של DIPEA (0.5 eq) ו 1.06 ק"ג של Pd(OAc)2 (0.5% wt) לתמיסה.
- החליפו את החנקן ארבע פעמים, תנו לתערובת להתחמם ל-85-95°C תחת הגנת חנקן, וערבבו במשך 3 שעות. עקוב אחר התגובה על ידי HPLC ואשר את השלמת התגובה כאשר חומר הגלם הנותר הוא 0.44%.
- מצננים את טמפרטורת התגובה ל-20-30 מעלות צלזיוס. אספו את התמיסה בקבוצות והניחו אותה בדלי פלסטיק של 125 ליטר למשך 30 דקות.
- סנן את תמיסת התגובה עם חבית מסנן יניקה כימית (צמצם שקית המסנן הוא 10-15 מיקרומטר) באמצעות דיאטומיט כעזר סינון ושטיפת עוגת המסנן עם טולואן (185.20-370.40 ק"ג, 1-2 V).
- אסוף את התסנין בכלי אמייל והשתמש במשאבת ואקום מים במחזור בלחץ מופחת ב 55-65 ° C במשך 10 שעות עם ערך לחץ של -0.095 MPa. שמור על המשאבה פועלת כדי לשמור על הלחץ ולקבל את תרכובת המוצר כנוזל צמיג.
- יש לאדות את המוצר פעמיים על ידי שאיבת טולואן והמשך התגובה. רכז את המוצר הסופי למשך 4 שעות. לטהר את המוצר המתקבל עם כרומטוגרפיה עמודה, eluting עם heptane ו ethyl אצטט (V/V, 10/1-3/1), כדי לקבל מוצק עם תשואה של 98.5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מחקר זה מספק את תהליך הסינתזה המוגדל עבור ACT051-3 הביניים החשוב של Upatinib (איור 1 ואיור 2). סעיף הפרוטוקול (שלבים 1-3) מציג באופן ספציפי את הסינתזה ברמת גרם, סינתזה ברמת קילוגרם בקנה מידה של פיילוט ושלב הייצור בקנה מידה גדול של התרכובת ACT051-2 ושל ACT051-3 הביניים.
במהלך בחינת המסלול האופטימלי עבור התרכובת ACT051-2, כפי שמוצג בטבלה 1, נמצא כי TsCl מוצק היה מעורב יותר בתגובה מאשר TsCl נוזלי (מומס ב- DMF, שלב 3.1 של הפרוטוקול) והפחית באופן משמעותי את כמות DMF כמעט פי שלושה. בנוסף, תפוקת המוצר הוגדלה מ- 97.49% ל- 98.44% על ידי העלאת הטמפרטורה של התמיסה המעורבת כאשר TsCl נוסף מ 0-5 ° C ל 23-35 ° C (מוצג בטבלה 2). יתר על כן, נערכו ניסויים על צריכת מים לאחר הטיפול. כפי שניתן לראות בטבלה 3, לאחר הפחתה של פי 2.5 בצריכת המים (מ-15 מ"ל/גרם ACT051-2 ל-6 מ"ל/גרם ACT051-2), תפוקת התגובה ירדה ב-2.5%, אך ייצור תמיסת הפסולת הופחת, ויעילות התגובה השתפרה משמעותית.
סדרה של תנאים ניסיוניים פותחו כדי להשיג את מסלול התהליך האופטימלי עבור ACT051-3 ביניים. כפי שניתן לראות בטבלה 4, על ידי הכנסת DIPEA לתגובה והחלפת ממס התגובה באלכוהול טרט-עמיל/טולואן (V/V, 2/3), כמות Pd(OAc)2 הופחתה פי 2.5 (מ-1.28% wt ל-0.5% wt), מה שהפחית משמעותית את עלות הייצור ושיפר עוד יותר את הכדאיות של הגדלת הייצור. בנוסף, על ידי שינוי המצב של K2CO 3 המעורב בתגובה, זמן התגובה הופחת מ-7 שעותל-3.5 שעות, מה ששיפר מאוד את יעילות התגובה (כפי שמוצג בטבלה 5). בנוסף, על ידי מעבר מאלכוהול טרט-עמיל/1,4-דיוקסן (V/V, 1/4) לטרט-עמיל אלכוהול/טולואן (V/V, 2/3), זמן התגובה התקצר ל-3 שעות, אזור שיא המוצר גדל מ-84.22% ל-88.52%, והזמן שלקח למוצר להתרכז התקצר משמעותית, כל אלה שיפרו את יעילות התגובה (ראו טבלה 6).
שתי התרכובות ACT051-2 ו-ACT051-3 אופיינו כימית בתהודה מגנטית גרעינית של פרוטונים (1H NMR), HPLC וספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה. ניתן למצוא את שיטות הניתוח (HPLC, 1 H NMR וספקטרוסקופיית יינון אלקטרוספריי [ESI]) של ACT051-2 ו-ACT051-3 בעבודה התומכת (טבלה משלימה 1, תרשים משלים 1, איור משלים 2, איור משלים 3, איור משלים 4, איור משלים 5 ותרשים משלים 6). נתוני האפיון עבור ACT051-2 ו- ACT051-3 מדווחים להלן:
2-ברומו-5-טוסיל-5H-פירולו[2,3-b]פירזין (ACT051-2):
1H NMR (500 מגה-הרץ, DMSO-d 6)δ8.59 (s,1H), 8.37 (d, J = 4.1 הרץ, 1H), 8.00 (d, J = 8.2 הרץ, 2H), 7.46 (d, J = 8.2 הרץ, 2H), 7.02 (d, J = 4.0 הרץ, 1H), 3.29 (d, J = 11.9 הרץ, 3H). ESI: m/z מחושב עבור C13 H 10BrN3O2S [M] + 352.21, נמצא 352.00.
טרט-בוטיל (5-טולואן סולפוניל-5H-פירול [2,3-b] פירזין-2-yl) קרבמט (ACT051-3):
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ8.98 (s, 1H), 7.95 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.84 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H), 7.19-7.17 (m, 1H), 6.53 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 2.30 (s, 3H), 1.45 (s, 9H). ESI: m/z מחושב עבור C 18 H20N 4 O4S [M+H] + 389.12, נמצא כ- 389.15.
איור 1: מסלול הסינתזה של ACT051-3 הביניים. (A) מסלול התגובה והתנאים של ACT051-3 לפני אופטימיזציה: i) DMF, DIPEA, TsCl; ii) xantphos, Pd(OAc)2, K2CO3, אלכוהול טרט-עמיל/1,4-דיוקסן (V/V, 1/4); (B) מסלול התגובה והתנאים של ACT051-3 לאחר אופטימיזציה: i) DMF, DIPEA, TsCl; ii) xantphos, Pd(OAc)2, K 2CO 3, DIPEA, טרט-עמיל אלכוהול/טולואן (V/V, 2/3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דיאגרמת זרימת התהליך של תרכובות ACT051-2 ו- ACT051-3 בייצור בקנה מידה גדול. (A) דיאגרמת זרימת תהליך של ACT051-2 בייצור בקנה מידה גדול. (B) דיאגרמת זרימת תהליך של ACT051-3 בייצור בקנה מידה גדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מספר | מדינת TsCl | V(DMF) (בדיקת מעבדה) | V(DMF) (הרחבת פיילוט) |
| 1 | להתמוסס ב-DMF | 8.5 וולט | 54 וולט |
| 2 | מוצק | 3.0 וולט | 18 V |
טבלה 1: ההשפעה של צורות שונות של TsCl על התרכובת הסינתטית ACT051-2. המצבים השונים של TsCl כוללים TsCl נוזלי (מומס ב- DMF) ו- TsCl מוצק. תוצאות הניסוי מראות כי TsCl מוצק תורם יותר לייצור תעשייתי.
| מספר | טמפרטורה (°C) | מצב התמהיל | האם יש תהליך בירור | תשואה | טוהר |
| 1 | 0-5 | צמיג | לא | 97.49% | 96.85% |
| 2 | 25-35 | ערבוב טוב | כן | 98.44% | 96.99% |
טבלה 2: השפעת הוספת TsCl בטמפרטורות שונות על הסינתזה של ACT051-2. הוספת TsCl לתגובה ב 0-5 ° C או 23-35 ° C.
| מספר | צריכת מים | תשואה | טוהר |
| 1 | 15 מ"ל / גרם ACT051-1 | 97.49% | 96.85% |
| 2 | 6 מ"ל / גרם ACT051-1 | 94.90% | 97.69% |
| 3 | 9 מ"ל / גרם ACT051-1 | 95.07% | 96.71% |
טבלה 3: השפעת צריכת מים שונה לאחר הטיפול על הסינתזה של ACT051-2. נסה את צריכת המים השונה לאחר הטיפול, כולל 15 מ"ל/גרם ACT051-1, 9 מ"ל/גרם ACT051-1 ו-6 מ"ל/גרם ACT051-1. התנאים האופטימליים הושגו בנפח מים לאחר הטיפול של 6 מ"ל/גרם ACT051-2.
| מספר | שווה ערך ל-DIEPA | שווה ערך ל-K2CO3 | שווה ערך ל-Pd(OAc)2 |
| 1 | 0.0 EQ | 3.0 EQ | 1.28% WT |
| 2 | 2.0 EQ | 2.0 EQ | 0.60% WT |
| 3 | 1.0 EQ | 2.0 EQ | 0.60% WT |
| 4 | 0.5 EQ | 2.0 EQ | 0.60% WT |
טבלה 4: השפעת הוספת DIPEA לתגובה לסינתזה של ACT051-3. בחינת ההשפעה של הוספת DIPEA או לא על התגובה. התוצאות הראו כי הכנסת DIPEA הפחיתה את כמות Pd(OAc)2 בפקטור של 2.5 (מ-1.28% wt ל-0.5% wt).
| מספר | מדינת K2CO3 | שווה ערך | זמן תגובה (h) |
| 1 | מוצק | 2.0 EQ | 7 |
| 2 | אבקת | 2.0 EQ | 3.5 |
טבלה 5: השפעת מצבים שונים של K2CO 3 על התגובה של התרכובת הסינתטית ACT051-3. בחר אשלגן פחמתי בצורה גרגירית או אבקה כדי להשתתף בתגובה.
| מספר | מינון של Pd(OAc)2 | ממס תגובה | V/V | זמן תגובה / h | אזור שיא המוצר/ % |
| 1 | 0.60% WT | אלכוהול טרט עמיל / 1,4-דיוקסן | 1-4 | 3.5 | 84.22 |
| 2 | 0.60% WT | אלכוהול טרט עמיל / 1,4-דיוקסן | 2-3 | 3.5 | 83.34 |
| 3 | 0.60% WT | אלכוהול טרט עמיל / טולואן | 2-3 | 3 | 88.52 |
| 4 | 0.50% WT | אלכוהול טרט עמיל / טולואן | 2-3 | 2.25 | 87.11 |
טבלה 6: השפעת ממיסי תגובה שונים על תגובת התרכובת הסינתטית ACT051-3. אלכוהול טרט-עמיל/1,4-דיוקסן (V/V, 1/4) וטרט-עמיל אלכוהול/טולואן (V/V, 2/3) נבחרים כממיסי תגובה.
טבלה משלימה 1: שיטה אנליטית של תרכובות ACT051-2 ו- ACT051-3. תנאים כרומטוגרפיים ספציפיים לניתוח תרכובות ACT051-2 ו- ACT051-3, כולל המכשיר, שם השיטה, עמודת הפאזה הנוזלית, הפאזה הניידת, טמפרטורת העמודה, מהירות הזרם ואורך הגל. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 1: הכרומטוגרמות הנוזליות בעלות הביצועים הגבוהים של ACT051-2. תוצאות הנתונים זוהו על ידי HPLC. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: הכרומטוגרמות הנוזליות בעלות הביצועים הגבוהים של ACT051-3. תוצאות הנתונים זוהו על ידי HPLC. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 3: ספקטרום טרשת נפוצה של ACT051-2. תוצאות הנתונים זוהו על ידי ספקטרוסקופיית ESI. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 4: ספקטרום טרשת נפוצה של ACT051-3. תוצאות הנתונים זוהו על ידי ספקטרוסקופיית ESI. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 5: 1 H ספקטרום NMR של ACT051-2. התוצאות עבור הנתונים נותחו באמצעות MestReNova. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 6: 1 H ספקטרום NMR של ACT051-3. התוצאות עבור הנתונים נותחו באמצעות MestReNova. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תנאי התגובה של הסינתזה, כולל טמפרטורת התגובה, הזמן, בחירת ריאגנטים של התגובה והיחס בין החומרים, משפיעים על היתכנות התגובה, התשואות, הטוהר ועלות הייצור, במיוחד עבור ייצור בקנה מידה גדול.
בסינתזה במעבדה של ACT051-2, TsCl בצורה נוזלית (מומס ב- DMF; שלב 1.1.3) יכול לשמש בתגובה; עם זאת, הוא אינו מתאים לסינתזה של פיילוט או לייצור תעשייתי, מכיוון ששימוש ב- TsCl נוזלי לתגובה זו מגדיל את כמות הממס במערכת התגובה, וכתוצאה מכך יותר נוזל פסולת. כתוצאה מכך, בחרנו ב-TsCl מוצק עבור התגובה בהרחבת הפיילוט ובייצור התעשייתי (שלבים 2.1.2 ו-3.1.3 של הפרוטוקול, בהתאמה) והשגנו תוצאות ניסוי טובות, תוך התחשבות ברעיון של הגנת הסביבה וכימיה ירוקה (טבלה 1).
בנוסף, נמצא בניסויי הפיילוט כי הוספת כמות גדולה של TsCl בטמפרטורה נמוכה הופכת את מערכת התגובה צמיגה מדי לערבוב, וכתוצאה מכך הסיכון לאנקפסולציה של חומר הגלם. כדי להתמודד עם סיכון זה, הטמפרטורה הועלתה מ 0-5 ° C ל 25-35 ° C (שלבים 2.1.1 או 3.1.4 של הפרוטוקול), ערבוב מספיק התקבל עבור TsCl מוצק הוסיף, מערכת פתרון התגובה היתה נזילות טובה, ואת התגובה המשיך בצורה חלקה (טבלה 2).
יתר על כן, כמות גדולה של מים (15 מ"ל / גרם ACT051-1) נדרשה לניסויים שלאחר הטיפול של ACT051-2, שלא התאימה לניסויי הייצור בקנה מידה גדול יותר ויצרה יותר תמיסת פסולת. לכן, מנקודת המבט של הגנת הסביבה, כמות אופטימלית של מים המשמשים לאחר הטיפול נחקר מיד בחקר תנאי תהליך הייצור. כפי שניתן לראות בטבלה 3, כאשר כמות המים לאחר הטיפול הופחתה ל-6 מ"ל/גרם ACT051-1, תפוקת הניסוי הראתה השפעה מועטה, אך יכלה לשפר מאוד את היעילות ולהפחית את ייצור נוזל הפסולת.
בחקר מסלול תהליך הייצור התעשייתי של ACT051-3 הביניים, ערכנו מספר רב של ניסויי אופטימיזציה של תהליכים ופתרנו בעיות קנה מידה רבות. בסינתזה של ACT051-3, ACT051-2 עבר תגובת צימוד של בוכוולד-הרטוויג עם טרט-בוטיל קרבמט שזרז על ידי Pd(OAc)2 וקסנטפוס כדי לתת לתרכובת ACT051-3. Pd(0) הוא מין פעיל של פלדיום המשמש בדרך כלל בתגובות צימוד כמו סוזוקי ובוכוולד16,17,18,19. עם זאת, Pd(II) משמש בדרך כלל כדי לזרז את התגובה. כתוצאה מכך, השתמשנו בתרכובת אמין (DIPEA) כדי להפחית את Pd(II) ל-Pd(0), והשארנו את המערכת הקטליטית של כל התגובה במחזור קטליטי של Pd(0) ו-Pd(II). עם הוספת DIPEA, כמות הזרז היקר Pd(OAc)2 הופחתה מאוד מ-1.28% ל-0.5% (טבלה 4), מה שהפחית מאוד את עלות הייצור בקנה מידה גדול וחיזק עוד יותר את הרציונליות וההיתכנות של השיטה.
זמן התגובה הארוך מביא למספר רב של תגובות לוואי ויוצר זיהומים, מה שאינו תורם להגדלת הייצור. באמצעות מחקרי מעבדה נרחבים, נמצא כי שינוי מצב האשלגן הפחמתי מגרגירי לאבקה (שלבים 1.2.2 או 2.2.2 של הפרוטוקול) הביא לקיצור מתאים של זמן התגובה, שהוא נוח יותר לייצור תעשייתי (טבלה 5). בנוסף, בהתחשב בכך ש-1,4-דיוקסן ששימש בניסוי הפיילוט בקנה מידה קטן היה קשה יותר לריכוז (שלב 1.2.1 של הפרוטוקול), שקלנו את השילוב של טולואן וטרט-בוטנול (שלבים 2.2.1 או 3.2.2 של הפרוטוקול; V/V, 2/3), שהם ממסים מרוכזים יותר, כממיסי תגובה לייצור התעשייתי. התוצאות הראו כי התגובה השיגה שיעור קידום גבוה, הפחיתה את זמן התגובה ושיפרה את יעילות התגובה (ראו טבלה 6).
לסיכום, לאחר חקירה חוזרת ונשנית של תנאי הניסוי, התקבלו לבסוף תנאי הרחבת התהליך האופטימליים עבור תרכובות ACT051-2 ו-ACT051-3, ודיאגרמת זרימת התהליך של ייצור קנה מידה זה מוצגת באיור 2. תוצאות הייצור המוגדל הראו כי התהליך כולו היה יציב, ותפוקת המוצר הייתה תקינה (שלבים 3.1.7 או 3.2.8 של הפרוטוקול).
מסלול הייצור התעשייתי שהתקבל במחקר זה הוא מסלול חדש זמין, ואוששה גם ההיתכנות של מסלול תהליך זה בייצור תעשייתי עתידי. בנוסף, התוצאות שהתקבלו במחקר זה מספקות בסיס מחקר טכני כלשהו למחקר עתידי של מסלול הייצור התעשייתי של תרכובות ACT051-2 ו- ACT051-3.
עם זאת, עדיין יש מקום לאופטימיזציה ושיפור של מסלול התהליך, כגון כמות TsCl (1.25 eq), שהיא מוגזמת בסינתזה של ACT051-2 וניתן להפחית אותה עוד יותר. בנוסף, בסינתזה של ACT051-3, רק טולואן יכול לשמש כממס התגובה כדי להקל על העיבוד שלאחר העיבוד, וכמות הזרז Pd(OAc)2 עשויה להמשיך לרדת. ניתן להמשיך ולחקור את הנושאים הטכניים הנ"ל בעבודה עתידית כדי להגדיל טוב יותר את הייצור של התרכובת הסינתטית ACT051-3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אין כאן תודות שצריך להזכיר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-bromo-5H-pyrrolo[2,3-b]pyrazine | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | 19120110 | |
| 1,4-dioxane | Liaoning cook Biotechnology Co., Ltd | General Reagent | |
| 1H NMR | Bruker AVIII 500 | ||
| 37% chloride acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| 4-toluenesulfonyl chloride (TsCl) | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | AR A2010137 | |
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Circulating water vacuum pump | Guangzhou Zhiyan Instrument Co., Ltd | SHZ-D( ) |
|
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Diatomite | Guangzhou Qishuo Chemical Co., Ltd. | / | |
| Double cone rotary vacuum dryer | Jiangsu Yang-Yang Chemical Equipment Plant Inc | SZE-500T | |
| enamel kettle | Jiangsu Yang-Yang Chemical Equipment Plant Inc | CS-03-002 | 1000L / 2000L |
| heptane | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | General Reagent | |
| HPLC | Guangzhou aoyi Technology Trading Co., Ltd | LC-2030C 3D | |
| Large scale rotary evaporators | Guangzhou Xingshuo Instrument Co.,Ltd. | RE-2002 | |
| Low temperature and constant temperature stirring reaction bath | Guangzhou Yuhua Instrument Co., Ltd | XHDHJF-3005 | |
| Low temperature coolant circulating pump | Guangzhou Jincheng Scientific Instrument Co., Ltd | XHDLSB-5/25 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N, N-Diisopropyl ethylamine (DIPEA) | Apicci Pharm | General Reagent | |
| N-dimethylformamide (DMF) | Guangzhou bell Biotechnology Co., Ltd | General Reagent | |
| Octanoid acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Pd(OAc)2 | Xi'an Catalyst New Materials Co.,ltd. | 200704 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Potassium carbonate (K2CO3) | Guangzhou Zhonghua Trade Co.,Ltd. | General Reagent | |
| Tert amyl alcohol | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | General Reagent | |
| tert-Butyl carbamate | Nanjing Cook Biotechnology Co., Ltd. | General Reagent | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R | |
| toluene | Liaoning cook Biotechnology Co., Ltd | General Reagent | |
| Vacuum drying oven | Guangzhou Yuhua Instrument Co., Ltd | DZF-6090 | |
| Water | / | / | |
| Xantphos | Liaoning cook Biotechnology Co., Ltd | Asp20-44892 |
References
- Kerschbaumer, A., et al. Points to consider for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases with Janus kinase inhibitors: a systematic literature research. RMD Open. 6 (3), e001374 (2020).
- Fragoulis, G. E., Brock, J., Basu, N., McInnes, I. B., Siebert, S. The role for JAK inhibitors in the treatment of immune- mediated rheumatic and related conditions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 941-952 (2021).
- Shaw, T., et al. P220 Long-term safety profile of upadacitinib in patients with rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, or ankylosing spondylitis. Rheumatology. 61, 133 (2022).
- Keeling, S., Maksymowych, W. P. JAK inhibitors, psoriatic arthritis, and axial spondyloarthritis: a critical review of clinical trials. Expert Review of Clinical Immunology. 17 (7), 701-715 (2021).
- Fleischmann, R., et al. Safety and efficacy of elsubrutinib or upadacitinib alone or in combination (ABBV-599) in patients with rheumatoid arthritis and inadequate response or intolerance to biological therapies: a multicentre, double-blind, randomised, controlled, phase 2 trial. The Lancet Rheumatology. 4 (6), e395-e406 (2022).
- Stamatis, P., Bogdanos, D. P., Sakka, L. I.
- Rubbert-Roth, A., et al. Trial of upadacitinib or abatacept in rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 383 (16), 1511-1521 (2020).
- Asfour, L., Getsos Colla, T., Moussa, A., Sinclair, R. D. Concurrent chronic alopecia areata and severe atopic dermatitis successfully treated with upadacitinib. International Journal of Dermatology. 61 (11), e416-e417 (2022).
- Cantelli, M., et al. Upadacitinib improved alopecia areata in a patient with atopic dermatitis: A case report. Dermatologic Therapy. 35 (4), e15346 (2022).
- Traves, P. G., et al. JAK selectivity and the implications for clinical inhibition of pharmacodynamic cytokine signalling by filgotinib, upadacitinib, tofacitinib and baricitinib. Annals of the Rheumatic Diseases. 80 (7), 865-875 (2021).
- Rozema, M. J., et al. Development of a scalable enantioselective synthesis of JAK inhibitor upadacitinib. Organic Process Research & Development. 26 (3), 949-962 (2022).
- Wynn, J. P., Hanchar, R., Kleff, S., Senyk, D., Tiedje, T. Biobased technology commercialization: the importance of lab to pilot scale-up. Metabolic Engineering for Bioprocess Commercialization. , Springer. 101-119 (2016).
- Tang, C., et al. Influenza virus replication inhibitor and use thereof. , US202000283454A1 (2020).
- Ren, Q., et al. Inhibitors of influenza virus replication and uses thereof. Center for Biotechnology Information. , US20200339564A1 (2020).
- Van Epps, S., et al. Design and synthesis of tricyclic cores for kinase inhibition. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 23 (3), 693-698 (2013).
- Paul, F., Patt, J., Hartwig, J. F. Palladium-catalyzed formation of carbon-nitrogen bonds. Reaction intermediates and catalyst improvements in the hetero cross-coupling of aryl halides and tin amides. Journal of the American Chemical Society. 116 (13), 5969-5970 (1994).
- Zhou, T., Ji, C. L., Hong, X., Szostak, M. Palladium-catalyzed decarbonylative Suzuki-Miyaura cross-coupling of amides by carbon-nitrogen bond activation. Chemical Science. 10 (42), 9865-9871 (2019).
- Sain, S., Jain, S., Srivastava, M., Vishwakarma, R., Dwivedi, J. Application of palladium-catalyzed cross-coupling reactions in organic synthesis. Current Organic Synthesis. 16 (8), 1105-1142 (2019).
- Takale, B. S., Kong, F. Y., Thakore, R. R. Recent applications of Pd-catalyzed Suzuki-Miyaura and Buchwald-Hartwig couplings in pharmaceutical process chemistry. Organics. 3 (1), 1-21 (2021).
