Summary
Detta protokoll beskriver en robust ympningsmetod för plantor som inte kräver någon tidigare erfarenhet eller utbildning och kan utföras till en mycket låg kostnad med hjälp av material som är lättillgängliga i de flesta molekylärbiologiska laboratorier.
Abstract
Ympning av plantor i tidigt stadium har blivit ett populärt verktyg inom molekylär genetik för att studera rotskottförhållanden inom växter. Ympning av plantor i tidigt skede av den lilla modellväxten, Arabidopsis thaliana, är tekniskt utmanande och tidskrävande på grund av plantornas storlek och bräcklighet. En växande samling publicerade metoder beskriver denna teknik med varierande framgångsgrad, svårighet och tillhörande kostnader. Detta dokument beskriver ett enkelt förfarande för att göra en intern återanvändbar ympningsanordning med silikonelastomerblandning och hur man använder denna enhet för ympning av plantor. Vid tidpunkten för denna publikation kostar varje återanvändbar ympningsanordning endast $ 0.47 i förbrukningsmaterial att producera. Med hjälp av denna metod kan nybörjare få sina första framgångsrikt ympade plantor på mindre än 3 veckor från början till slut. Detta mycket tillgängliga förfarande gör det möjligt för växtmolekylärgenetiska laboratorier att etablera ympning av plantor som en normal del av deras experimentella process. På grund av den fullständiga kontrollen som användarna har i skapandet och utformningen av dessa ympningsanordningar kan denna teknik enkelt justeras för användning i större växter, såsom tomat eller tobak, om så önskas.
Introduction
Ympning är en gammal trädgårdsteknik som blev en etablerad jordbruksmetod 500 f.Kr.1. Ympning av olika sorter av grödor för att förbättra avkastningen var den första användningen av denna teknik och fortsätter att användas för detta ändamål idag. Under det senaste decenniet har ympning väckt allt större uppmärksamhet som ett verktyg för molekylärbiologer att studera långdistanssignalering i växter 2,3,4,5. Medan ympning av vuxna växter är relativt lätt, är ympning av växter strax efter spiring utmanande. Trots detta är det ibland nödvändigt att bedöma effekterna av långdistanssignalering i processer som växtutveckling, miljörespons och blomning 6,7,8.
Arabidopsis thaliana har etablerats som modellorganism inom växtbiologi av många skäl, inklusive dess relativt lilla storlek, vilket gör det lätt att växa inuti ett labb. Den lilla storleken och bräckligheten hos Arabidopsis-plantor gör dock ympning av unga plantor mycket utmanande. I många fall krävs omfattande praktisk träning för att framgångsrikt få plantor. Det har skett många metodologiska förbättringar genom åren som har identifierat idealiska odlingsförhållanden och nya tekniker för att öka framgångsgraden för ympning av plantor 9,10,11. Det senaste verktyget som introducerades var ett Arabidopsis plantor ympningschip, som gör det möjligt för även oerfarna användare att uppnå acceptabla nivåer av ympningsframgång12. Även om detta framsteg avsevärt har sänkt den tekniska barriären för ympning av plantor, är chipanordningen dyr, och antalet transplantat som kan utföras parallellt blir snabbt kostnadsoöverkomligt.
Dessutom kan denna enhet endast användas för Arabidopsis-plantor som har hypokotyldimensioner som liknar plantor av vildtyp. Medan Arabidopsis är nyckelarten i världen av växtmolekylär genetik, har nyligen arbete gjorts i andra arter med hjälp av plantortransplantation. Exempel inkluderar ympning av sojabönor och den vanliga bönan, tobak till tomat och raps till Arabidopsis, och därefter provtagning av båda vävnaderna för små RNA13,14. Därför är en ympningsmetod som är tillgänglig för de flesta laboratorier och lätt kan anpassas till ett brett spektrum av växtarter utan några större tekniska förändringar mycket önskvärd.
Detta protokoll beskriver en metod som använder intern produktion av en enkel ympningsanordning som möjliggör fullständig anpassning av ympkanalens diameter och längd för att rymma alla plantors morfologi över de flesta växtarter. Produktionen av dessa enheter är mycket prisvärd och mycket skalbar, eftersom de enda komponenterna som behövs är silikonelastomer, ledningar eller rör av rätt storlek, ett blad med hög precision och en behållare för att fungera som en form. Enligt ympningsprotokollet som beskrivs här kan användare uppnå framgångsrika ympningshastigheter på 45% (n = 105), jämförbart med tidigare rapporterade ympningsresultat10,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av enhet
- Gör silikontransplantationsanordningen genom att gjuta silikonelastomerlösning i en fyrkantig petriskål (100 mm x 100 mm). Bered 15 ml av elastomerlösningen enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: Silikonelastomersatser innehåller vanligtvis en silikonbaserad vätska och ett härdningsmedel, som när de blandas ihop tillåter silikonet att stelna. - Förbered den fyrkantiga petriskålen genom att lägga fyra raka bitar av 29 G tråd i den fyrkantiga petriskålen, lika långt från varandra (figur 1A). Se till att tråden ligger i jämnhöjd med formens botten. För att räta ut tråden helt, rulla den på en hård enhetlig yta med ett tungt och plant föremål (t.ex. ett metallrörställ).
OBS: Twistband innehåller ofta 29 G tråd och kan användas efter att den yttre pappersbeläggningen har tagits bort med aceton. - Häll den blandade silikonelastomerlösningen ovanpå ledningarna och täck med toppen av petriskålen. Låt silikonet härda i 24-48 timmar vid rumstemperatur.
- Ta bort silikonarket från petriskålen med rena pincett och flytta till en ren plan yta.
- Ta bort ledningarna från silikonarket. Ta bort det tunna silikonskiktet som finns kvar på utsidan av kanalen med finspetspincett så att kanalen kan vara öppen på ena sidan (figur 1A).
- Skär silikonarket vinkelrätt mot kanalerna i 3 mm remsor med en ren sax. Flytta varje remsa till ett aluminiumfoliehölje och försegla med autoklavtejp.
- Autoklavera remsorna vid 121 °C i minst 30 minuter och förvara tills de är klara att användas.
2. Framställning av fröer
- Sterilisera och vernalisera frön.
- Suspendera upp till 100 Arabidopsisfrön i 1 ml 50% blekmedelslösning innehållande 0,1% Tween 20 i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och inkubera i 5-10 min. Avlägsna blekmedelslösningen genom pipettering eller aspiration under sterila förhållanden. Skölj frön med 1 ml steriliserad dH2O. Var noga med att invertera rören för att skölja fröna ordentligt och ta bort eventuell blekmedellösning kvar på toppen av röret. Upprepa sköljningen 4x.
- Lämna cirka 0,25 ml vatten i rören med fröna och förvara vid 4 ° C i 3 dagar i mörkret.
- Platta fröna som förberedelse för ympning.
- Bered en 1% agar MS-platta enligt följande: för 1 liter MS (0,5% sackaros) fast medium, blanda 4,4 g MS-salt, 5 g sackaros och 10 g agar i 800 ml vatten, justera pH till 5,7 med KOH och bringa sedan den totala volymen till 1 liter med ytterligare vatten. Autoklav i minst 20, min innan du häller ~ 25 ml i fyrkantiga petriskålar.
- Under sterila förhållanden, flytta lämpligt antal beredda frön till plattan med hjälp av en 20 μL pipettspets för att aspirera och överföra fröna.
- Placera en steril remsa på plattans yta för att styra fröpositionering, så att fröna är i linje med kanalerna på remsan. Ta bort remsan när fröna är pläterade.
OBS: En 100 mm x 100 mm fyrkantig platta rymmer två rader plantor (figur 1B). - När plattorna står upp, låt vätskan avdunsta ur det fasta mediet och samlas i botten av plattan. När fröna har placerats på plattan, lägg på plattans lock och försegla ena sidan av plattan som är parallell med de två raderna av frön (indikeras av det blå markerade området i figur 1B) med parafilm. Linda andningstejp ovanpå parafilmen och runt alla andra kanter på plattan.
- Stå försiktigt upp två plattor med den parafilmförseglade sidan nedåt. Separera de två plattorna längst ner genom att placera ett horisontellt 15 ml centrifugrör mellan dem och säkra med ett gummiband. Se till att plattans ytor bildar en vinkel på 100°-110° med bänkskivans yta (figur 1C).
- Förvara plattorna i denna riktning i 72 timmar i totalt mörker vid 21 °C, så att plantornas hypokotyler kan bli ~5 mm långa. Efter 72 timmar, ta bort plattorna från mörkret och växa under 16 h ljus (intensitet 100 μE m-2 sek-1) och 8 h mörka cykler i ytterligare 2-4 dagar vid samma temperatur före ympning.
- Ympa plantorna mellan 5 och 7 dagar efter att de har pläterats. Placera en ympremsa över plantorna och passa in deras hypokotyler i kanalerna. Placera plantan försiktigt så att rot-hypokotylkorsningen placeras längst ner på silikonremsan för att förbereda plantan för skärning (figur 1D).
3. Ympning
- Förbered en steril arbetsmiljö genom att desinficera ett dissektionsomfång med 70% etanol och autoklavera två par pincett med fin spets och ett skalpellhandtag. Utför alla ympningsprocedurer i en steril huva och med hjälp av ett dissektionsomfång efter behov. Utför det mesta av ympningen med en förstoring på 10,5x.
- Förbered scionsna. Använd ett nytt skalpellblad för att skära hypokotylen vinkelrätt för att skapa ett rakt rent snitt. Tryck bladet framåt istället för att trycka ner i växten för att förhindra att plantan skjuts in i agar (Video 1).
- Ta bort skottet. Var noga med att hålla den skurna delen av skottet hydratiserad genom att säkerställa kontakt med medieytan. Alternativt kan du flytta skottet till ett särskilt förvaringsområde, t.ex. toppen av en petriskål fylld med sterilt dH2O, tills det är klart att användas.
- Förbered grundstammarna. Dra försiktigt roten genom att fånga roten i utrymmet kvar mellan de stängda pincetterna och vrid dem och lämna den skurna delen av grundstammarna i mitten av remsan (Video 2).
OBS: Den ömtåliga roten kommer att skadas om den krossas direkt mellan de slutna pincetterna, vilket kräver kilning av roten i pincettändarnas skarpa vinkel för att manipulera vävnaden. - Ta försiktigt upp önskad fotografering med hjälp av de fina spetspincetterna och sätt in i toppen av kanalen.
OBS: Det är viktigt att visuellt bekräfta kontakten mellan scions och grundstammar för att få ett framgångsrikt transplantat (Video 3). - När alla transplantat har gjorts, linda in plattorna med parafilm och andningstejp och sätt upp plattorna på samma sätt som tidigare, utan att störa plantorna eller silikonremsorna. Flytta försiktigt plattorna till en tillväxtkammare inställd på 26 °C med 16 timmars ljusa/8 timmars mörka cykler.
- Utvärdera de ympade plantorna under sterila förhållanden efter 7-10 dagar. Ta försiktigt bort silikonremsan med pincett genom att skala upp ena sidan, så att kanalerna kan frigöra plantorna. Ta bort eventuella oavsiktliga rötter som växer från scion genom att skära dem från scion med ett nytt skalpellblad eller krossa dem med fina spetspincett. Visuellt utvärdera om grundstammen har blivit fast fäst vid scion för att bilda ett framgångsrikt transplantat (figur 2).
- Flytta framgångsrika transplantat till plantförökningsjord för att växa så länge som krävs. Täck jorden med transparent plast i några dagar när plantorna etableras. Efter överföring av växterna till jorden, växa under de tidigare nämnda ljusa och mörka cyklerna vid 21 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Olika aspekter av ympremsans design testades för att identifiera de optimala ympförhållandena som krävde minst teknisk skicklighet (tabell 1). Alla ympningsförsök slutfördes på 0,5% sackaros MS-medium, vilket tidigare har rapporterats vara ett idealiskt ympmedium11,12.
Optimal planttillväxt kan inte uppnås med spiring på remsan
I den första iterationen av silikonremsan gjordes inneslutna kanaler genom att lämna det tunna lagret av silikon som finns kvar på baksidan av remskanalerna efter att trådarna har tagits bort från silikonarken. Istället för att gro plantorna direkt på plattan och senare placera ympremsan över plantornas hypokotyler, groddes fröna direkt på remsan efter att fröna satts in i kanalen fylld med en liten mängd MS-medium. Med hjälp av denna teknik fastnade hälften av plantorna i kanalerna under spiring och misslyckades med att förlängas. Inklusive de icke-grodda och de icke-långsträckta plantorna uppnåddes framgångsrika ympningshastigheter på 25% (n = 16) (tabell 1). För att ta itu med det observerade töjningsfelet orienterades frön så att embryots kotyledoner och radikaler pekade nedåt under spiring. Med hjälp av denna metod grodde 75% av fröna och förlängdes framgångsrikt, vilket resulterade i en liten ökning av ympningseffektiviteten (33% framgång, n = 12) (tabell 1). För att öka framgångsrik plantutveckling avlägsnades det tunna lagret av silikon som stängde kanalen från ympremsans mediumsida för att möjliggöra kontakt mellan fröet och tillväxtmediet (figur 1A). Med hjälp av denna metod grodde och avled 85% av plantorna framgångsrikt och 31% (n = 16) ympades framgångsrikt (tabell 1). Trots att man avsevärt ökar hastigheten för korrekt fröutveckling på remsan, kan förlust av även ett litet antal plantor väsentligt påverka den experimentella populationsstorleken när man utför ömsesidiga transplantat mellan olika experimentgrupper. Av denna anledning bestämdes groddplantor direkt på medelytan att vara idealiska.
Upprätthålla plantornas överlevnadsgrad och minimera bearbetningstid och ansträngningar
Fröplantor odlades först för ympning på MS-plattor (1% sackaros), överfördes till en fast yta (såsom locket på en petriskål fylld med vatten) för skärning och monterades sedan på en tallrik med remsan för ympning. Med hjälp av denna teknik observerades en framgångsgrad på 50% (n = 8) (tabell 1). Medan denna metod uppnådde den högsta framgångsgraden var den tidskrävande och arbetskrävande och krävde 2,5 minuter för varje transplantat, vilket begränsade antalet transplantat som kunde monteras samtidigt. För att sänka den tid och ansträngning som krävdes odlades plantor vertikalt på ympplattan (0,5% sackaros) och sattes sedan in i remsan direkt före ympning, enligt beskrivningen i detta protokoll. För att ytterligare testa denna metod genomfördes tre försök av varierande storlek. De två första försöken hade båda en framgångsgrad på 48 % (n = 25 och 64) och den tredje studien hade en framgångsgrad på 25 % (n = 16) (tabell 1). Tillsammans indikerar dessa studier en framgångsgrad på 45% (n = 105). Denna framgångsgrad är jämförbar med den mer tidskrävande metoden och kräver cirka 1 min per transplantat för att placera ympremsan över plantorna och för att slutföra ympningen (protokollsteg 3.2-3.5).
Graden av ympningsframgång är starkt beroende av kvaliteten på ympremskonstruktionen. Medan de två första försöken har en framgångsgrad på 48%, har den tredje prövningen en lägre framgångsgrad. Den handgjorda kvaliteten på ympremsan resulterar i sig i liten variation mellan ympningsplatser. Om ledningarna som används för bandkonstruktion inte är helt raka, kommer kanalerna i remsorna inte att spola med formens botten och kommer att resultera i kanaler med något varierande djup. Totalt görs 25 remsor i varje bandgjutning, vilket resulterar i 100 unika ympningsplatser (tabell 2). Medan effekten av liten variation i ympningsställena balanseras i de två större försöken, i den mindre studien med lägre framgångshastigheter, verkar det som att ympningsplatser med mer variation på grund av svagt böjda trådar kan påverka ympbildningen negativt. För att minimera denna typ av variation beskrivs en trådrätningsteknik i protokollsteg 1.2.
Figur 1: Illustration av stegen för ympning . (A) Modell av silikonremsformens design. Denna panel visar den fyrkantiga plåtformen som används för gjutning av silikonremsorna. Fyra sektioner av 29 G-trådar av samma längd läggs längst ner på plattan och silikonelastomerblandning hälls ovanpå dem (ovan). Efter att silikonet har härdat helt avlägsnas silikonkvadraten från plattan och trådarna avlägsnas för att skapa ympkanalerna. Ett tunt lager silikon kvarstår på botten av kanalerna efter att ledningarna har tagits bort (indikeras av *). Detta lager ska tas bort för att lämna kanalerna öppna på botten (nedan). Kvadraten skärs sedan vinkelrätt mot trådkanalerna i 3 mm remsor, vilket visas av de prickade linjerna (ovan). B) Fröplacering på ympplattan. Med hjälp av en steril remsa placeras två rader frön på plattan i linje med remskanalerna. Efter placering av fröna bör denna remsa avlägsnas för att förhindra spridningshinder. För att förbereda MS-plattor för vertikal tillväxt bör parafilm lindas längs plattans nedre (rotsida), markerad här med blå markering. c) Vertikal plattplacering för frögroning. Efter plätering groddar fröna vertikalt på vinklade plattor. Ett 15 ml koniskt rör placeras vid basen av två plattor för att skapa en något trubbig vinkel mellan plattans yta och bänkskivan. Den parafilmade kanten (markerad med blått) på plattan är orienterad mot bänkytan. Ett gummiband lindas runt toppen av de två plattorna för att hålla dem på plats. d) Placering av plantor i remsan direkt före ympning. Sterila ympremsor placeras ovanpå plantorna med hypokotyler inuti remskanalerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bild tagen på ett dissektionsomfång som visar en läkt ympningsplats. Den svarta pilen indikerar transplantatkorsningsplatsen och de röda pilarna indikerar oavsiktliga rötter som togs bort under transplantatutvärderingsprocessen. Skalstång = 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: Demonstration av aktiv ympning med levande växtavbildning. Skalpellbladets placering och rörelse för att skapa ett rent snitt. Plantans hypokotyl skärs direkt ovanför ympremsan genom att trycka skalpellbladet framåt. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Placera den skurna grundstammen hypokotyl för ympning inom remsan. Grundstammen dras försiktigt med hjälp av pincett för att placera transplantatkorsningsplatsen i mitten av remsan. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Placera scion och slutföra transplantatet. Scionen byts ut och skjuts in i remsan tills den ansluter till grundstammen. Korrekt inriktning och kontakt utvärderas genom att se hypokotylen svara när scion trycks lätt. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Tabell 1: Variabler för ympningsförsök och framgångsfrekvens. Denna tabell sammanfattar resultaten av ympningsförsöken som används för att bestämma det optimala ympningsprotokollet för högsta framgång. De variabler som undersöktes i dessa försök inkluderar groningsförhållanden för plantor, silikonremskonstruktion och när plantor sattes in i silikonbandkanalerna under ympning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Antalet ympningsplatser som kan genereras från en 250 ml flaska silikonelastomer. Priset för varje produktionsenhet visas också här (vid tidpunkten för offentliggörandet) och kan enkelt justeras vid fluktuationer i marknadsvärdet för silikonelastomerreagenserna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammanfattning och betydelse
Bildandet av en ympförening är avgörande för framgångsrik ympning, vilket kräver direkt och ostörd kontakt mellan grundstammen och scion. Miniatyrstorleken och bräckligheten hos plantor av små växter som Arabidopsis gör det tekniskt utmanande att uppfylla detta krav. En teknik som utvecklades i tidiga Arabidopsis-plantympningsmetoder var att sätta in både scion och grundstammen i en kort silikonslangkrage för att stödja transplantatkorsningen10. Även om denna metod är mycket effektiv för att skydda de två transplantatdelarna från separation, är det inte en lätt uppgift att sätta in den ömtåliga scion och grundstammen i ett smalborrat rör. Dessutom gör förtjockningen vid korsningen från tillväxt det ofta svårt att ta bort de smalborrade silikonrören utan att skada de ympade plantorna. Andra metoder använde alternativa tekniker för att undvika användning av en ympkrage samtidigt som plantor hindrades från att röra sig under tillväxten, inklusive avlägsnande av båda kotyledonerna från scions och odling av ympade plantor på en sned yta 9,11. Även om dessa metoder kräver få resurser för att slutföra, resulterade dessa metoder i höga nivåer av scion migration bort från grundstammen, vilket resulterade i lägre ympningsframgång än rapporterat (80% i genomsnitt för de rekommenderade förhållandena i båda studierna) med hjälp av dessa tekniker. Dessutom kräver de båda att användaren justerar gränssnittet mellan transplantatplantans delar utan hjälpmedel, en uppgift som kräver hög skicklighet. Ett mikrotransplantationschip utformat speciellt för ympning av Arabidopsis-plantor har nyligen rapporterats12. Varje chip innehåller fyra mikrokammare för att tillåta fyra plantor att växa, med den speciella utformningen av kammarutrymmet som gör det möjligt för hypokotylen att växa inuti en mikrokanal. Grundstammarna genereras på plats på chipet och scions sätts in i mikrokanalerna. Detta eliminerar behovet av att hantera både grundstammar och scions för ympning, och mikrokanalen begränsar ympningen på plats utan att offra det enkla att ta bort plantor när transplantatföreningen bildas. Medan denna nya metod kraftigt minskar den tekniska barriären för ympning av plantor, kräver tillverkningen av mikrotransplantationschipet Micro-Electro Mechanical Systems (MEMS), en teknik som inte är lättillgänglig för de flesta biologiska laboratorier. Dimensionerna av mikrokammaren på mikrotransplanteringschipet optimerades för Arabidopsis Col-012. Detta förhindrar användning av chipsen för andra arter eller olika Arabidopsis-accessioner/mutanter som har hypokotyler som varierar i höjd eller tjocklek15,16,17.
Den billiga, flexibla och enkla att följa metoden som beskrivs här inspirerades av tidigare mikrotransplantationschiparbete för att underlätta ympning av unga plantor. I denna metod är manipuleringen av känsliga plantor minimal, vilket underlättar användningen för nya användare. Kanalerna i remsorna hjälper nya användare att rikta in de ympade plantorna och hålla roten och skottet i god kontakt under bildandet av transplantatplatsen, samtidigt som de säkerställer enkel borttagning efter att transplantatet har bildats. På grund av den höga genomströmningsproduktionen av silikonremsorna och relativt låga kostnader för utgångsmaterialen kan ympning av ett stort antal plantor uppnås till en bråkdel av kostnaden för mikroympningsflisen. Denna hemlagade enhet beräknas kosta $ 0,12 per ympningsplats, vilket gör detta till ett ekonomiskt alternativ för laboratorier som arbetar med en mängd olika växtarter eller plantorfenotyper (tabell 2). Medan den handgjorda aspekten av ympremsorna minskar kostnaderna för denna metod, introducerar den också chansen för variation mellan olika remsor. Som tidigare betonats är kvaliteten på ympremsorna nyckeln till framgången med denna metod. Ökningen av användningen av ympning av plantor i tidigt stadium inom molekylär genetik har gett växtgenetikområdet ett kraftfullt verktyg för att studera långdistanssignalering i växter. Denna enkla, billiga och lättillgängliga metod kommer att ge ett annat verktyg för att underlätta framgångsrikt antagande av plantympningstekniken av laboratorier med minimal tidigare utbildning och erfarenhet.
Kritiska överväganden
Processer som att initiera ett sårreparationssvar, upprätta cell-till-cell-kommunikation mellan scion och grundstammen och slutligen vaskulaturbildning är nödvändiga för bildandet av ett framgångsrikt transplantat9. Under ympningsprocessen är det viktigt att hålla plantorna hydratiserade och oskadade bortom nödvändigheten. Med hjälp av denna metod måste de skurna ändarna på rötterna och scions vara rena och vinkelräta för att säkerställa en spolförbindelse mellan scion och grundstammen. Om ympningsplatsen skadas under skärningen, eller om ympbitarna inte skärs i samma vinkel, är framgångsrik ympning osannolikt på grund av brist på nära kontakt mellan cellskikt över ympningskorsningen. Om någon av ympdelarna av växten får torka eller skadas, kommer de tidigare nämnda processerna att hämmas och ympningen kommer inte att lyckas. Unga plantor är bräckliga och krossas lätt av pincett. Om användarna finner det nödvändigt kan pincetten användas för att hålla fast vid en av de två kotyledonerna för att manövrera scion. Jämfört med den tidigare rapporterade ympchipmetoden ökar chansen att skada grundstammen medan man drar ner hypokotylen i silikonremsan. Hanteringstekniker för att minimera denna risk beskrivs i protokollsteg 3.4.
Totalt fyra ympningsplatser per remsa är det rekommenderade antalet positioner för att säkerställa att plantorna inte vidrör varandra under bildningsstadiet för transplantatkorsning. För att skala upp det totala antalet transplantat som utförs samtidigt rekommenderas att användarna ökar antalet plattor som används, snarare än att minska mängden utrymme som används per transplantat.
Modifiering av protokollet är möjligt att rymma divergerande hypokotyltillväxt eller icke-Arabidopsis-arter
Vissa mutanter etiolera i olika takt till vildtypsväxter. Fytohormoner som gibberelliner, brassinosteroider, eten och auxin spelar en omfattande roll i tillväxtreglering av plantor18,19,20. Muterade linjer defekta i dessa hormonvägar kan uppleva atypiska etioleringshastigheter16,17. Den användarkontrollerade utformningen av ympremsan möjliggör boende av dessa fenotypiska skillnader, men tillräcklig testning krävs i dessa fall. Om en genetisk linje används som upplever etiolering i signifikant olika hastigheter från den vilda typen, bör användarna avgöra om den 3-dagars etioleringsperiod som beskrivs här är lämplig för deras linjer innan de börjar. Otillräckligt etiolerade plantor kommer att resultera i svår ympning på grund av en förkortad eller alltför förlängd (och tunnare) hypokotyl. Användare som är intresserade av ympning av plantor av andra arter än Arabidopsis kan anpassa detta protokoll för att passa deras behov genom att ändra ympkanalens diameter. Tomat- och tobaksplantor odlade till lämplig ympningsålder verkar kräva 0,8 respektive 0,4 mm diameter ympkanaler9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några intressekonflikter.
Acknowledgments
Tack till Javier Brumos för inledande utbildning och vägledning i ympning av Arabidopsis-plantor .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E.
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y.
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
