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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Técnica quirúrgica para la ganglionectomía cervical superior en un modelo murino

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64527
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 1,3
1Department of Surgery, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, 3David M. Rubenstein Center for Pancreatic Cancer Research, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

El presente protocolo describe un modelo murino de ablación de inervación adrenérgica mediante la identificación y resección del ganglio cervical superior.

Abstract

Cada vez hay más pruebas que sugieren que el sistema nervioso simpático desempeña un papel importante en la progresión del cáncer. La inervación adrenólica regula la secreción de las glándulas salivales, el ritmo circadiano, la degeneración macular, la función inmunitaria y la fisiología cardíaca. La simpatectomía quirúrgica murina es un método para estudiar los efectos de la inervación adrenérgica al permitir una ablación adrenérgica completa y unilateral, evitando la necesidad de una intervención farmacológica repetida y los efectos secundarios asociados. Sin embargo, la simpatectomía quirúrgica en ratones es técnicamente desafiante debido al pequeño tamaño del ganglio cervical superior. En este estudio se describe una técnica quirúrgica para identificar y resecar de forma fiable el ganglio cervical superior para extirpar el sistema nervioso simpático. La identificación y extirpación exitosas del ganglio se validan mediante la obtención de imágenes de los ganglios simpáticos fluorescentes utilizando un ratón transgénico, la identificación del síndrome de Horner posterior a la resección, la tinción de marcadores adrenérgicos en los ganglios resecados y la observación de una inmunofluorescencia adrenenérgica disminuida en los órganos diana después de la simpatectomía. Este modelo permite futuros estudios de la progresión del cáncer, así como de otros procesos fisiológicos regulados por el sistema nervioso simpático.

Introduction

Múltiples estudios han reportado que los nervios en el microambiente tumoral desempeñan un papel activo en el apoyo a la progresión tumoral. Se ha demostrado que la ablación de los nervios simpáticos adrenérgicos perjudica el desarrollo y la diseminación tumoral en el cáncer de próstata y gástrico in vivo 1,2,3, mientras que el bloqueo farmacológico de los receptores adrenérgicos inhibe el crecimiento tumoral en el cáncer de cabeza y cuello4. También se ha descrito afectación neural simpática en la progresión del carcinoma de páncreas, cuello uterino y basocelular 5,6,7.

Dentro del sistema nervioso simpático, el ganglio cervical superior (SCG) es el único ganglio del tronco simpático que inerva la cabeza. El SCG regula diversas funciones fisiológicas, como la secreción salival y el ritmo circadiano, e inerva directamente los ganglios linfáticos cervicales 8,9,10. El SCG también ha sido implicado en procesos patológicos como la degeneración macular11 y la progresión de la disección aórtica12. Además, se ha descrito que la resección del SCG agrava la lesión renal aguda inducida por la isquemiareperfusión 13 y también altera la microbiota intestinal en ratas14.

La ablación completa de la SCG en un modelo de ratón representaría una técnica experimental valiosa para permitir la investigación del cáncer y del sistema nervioso autónomo. Si bien muchos estudios han utilizado el bloqueo farmacológico del receptor adrenérgico como ablación adrenérgica 15,16,17,18,19,20, la resección quirúrgica permite una ablación adrenenérgica completa y unilateral, evitando la necesidad de una intervención farmacológica repetida y los efectos secundarios asociados 21,22,23.

La resección quirúrgica de la SCG se ha descrito en ratas24, y la mayoría de los informes que estudian el efecto de la ganglionectomía cervical superior (SCGx) han empleado el modelo de rata. En comparación con el modelo de rata, SCGx es técnicamente más desafiante en ratones debido al pequeño tamaño de la SCG. Sin embargo, los ratones son comparativamente más fáciles de manejar, más rentables y más susceptibles a la manipulación genética. García et al. fueron uno de los primeros en reportar SCGx en ratones, y se encontró que afectaba la liberación de insulina25. Más recientemente, Ziegler et al. describieron SCGx en ratones basándose en la técnica publicada descrita para ratas24,26. Este y otros artículos describen un método en el que primero se identifica y disecciona la arteria carótida común (ACC), y posteriormente se retira el SCG de la bifurcación de la CCA21,22,27,28. En este artículo, se describe una técnica menos invasiva y más segura en ratones que evita la disección de la ACC, minimizando así la complicación más grave de este procedimiento: el sangrado por una lesión en la CCA.

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Protocol

Los procedimientos con animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Aquí se utilizaron ratones NSG machos y hembras de ocho semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Los instrumentos se esterilizan, se desinfecta la superficie de trabajo quirúrgico, se desinfecta la superficie de la piel del animal y el cirujano usa guantes estériles durante todo el procedimiento.

1. Preparación de los ratones y configuración preoperatoria

  1. El día antes de la cirugía, anestesiar al ratón con isoflurano al 2% en una cámara de inducción (3,75 de ancho x 9 de profundidad x 3,75 de alto, ver Tabla de Materiales).
    NOTA: Un plano quirúrgico de anestesia generalmente se logra en 3-5 minutos, dependiendo de cada animal. Evaluar la idoneidad de la anestesia mediante el pellizco del dedo del pie y aumentar el porcentaje de isoflurano según corresponda.
    1. Afeitar la cara ventral del cuello o utilizar un agente químico de depilación de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).
  2. El día de la cirugía, anestesiar al ratón con isoflurano al 2% en una cámara de inducción. Evaluar la idoneidad de la anestesia mediante el pellizco del dedo del pie y aumentar el porcentaje de isoflurano según corresponda.
  3. Administrar 2 mg/kg de meloxicam por vía subcutánea para analgesia sistémica preventiva. Aplique ungüento oftálmico tópico (ver Tabla de materiales) para prevenir lesiones oculares y sequedad bajo anestesia.
  4. Coloque al ratón bajo un microscopio de disección en su lado dorsal y proporciónele soporte térmico. Mantenga la anestesia inhalatoria con isoflurano al 2%-2.5% usando un vaporizador de precisión y un cono nasal. Asegure suavemente ambas extremidades anteriores con cinta hipoalergénica (consulte la Tabla de materiales).
  5. Limpie la cara ventral afeitada del cuello con povidona yodada y luego limpie con alcohol al 70%. Repite este proceso dos veces más. Asegúrese de que el sitio quirúrgico esté libre de cabello suelto.
    NOTA: También se puede usar un par de pinzas cortas curvas. Asegúrese de usar un par de pinzas finas u oftálmicas para trabajar adecuadamente en este espacio confinado. Se puede incluir una configuración preoperatoria adicional según las pautas institucionales.

2. Disección

  1. Realice una incisión de 1,5 cm en la línea media de la piel en la cara ventral del cuello con unas tijeras pequeñas desde aproximadamente 2 mm por debajo de la barbilla hasta 2 mm por encima de la muesca esternal.
  2. Retraiga los bordes de la piel lateralmente con pinzas para exponer la fascia subyacente y las glándulas salivales submandibulares. Separe la piel de la fascia subyacente insertando unas tijeras puntiagudas debajo de la piel a cada lado y extendiéndola. Tire hacia abajo de las glándulas submandibulares caudalmente con fórceps para revelar los músculos subyacentes.
  3. Localice la unión del vientre posterior del músculo digástrico y el músculo omohioideo (Figura 1A, círculo negro). La vena yugular anterior se ve corriendo longitudinal y lateral al músculo omohioideo.
    NOTA: El músculo omohioideo cubre la tráquea longitudinalmente, mientras que el músculo digástrico se encuentra transversalmente en la cara craneal de la tráquea (Figura 1C).
    1. Inserte la punta de las pinzas en ángulo de 45° en esta unión, lateral a la vena yugular anterior, para perforar y extender una abertura en la fascia cervical profunda suprayacente.
  4. Mantenga abierta esta ventana creada en el paso 2.3.1 con las pinzas en ángulo de 45°. Amplíe esta abertura realizando maniobras de extensión con un par de pinzas curvas en la otra mano.

3. Identificación y resección del ganglio

  1. Localice el ganglio cervical superior (SCG) en la pared lateral del espacio revelado. Aparece como un tejido redondo y nacarado.
    NOTA: Si no se identifica el SCG, los tejidos de este espacio deben examinarse más lateral y superiormente. El SCG puede confundirse fácilmente con la grasa, que a menudo está presente en esta región. La grasa tiene un tinte ligeramente amarillo, mientras que, por el contrario, el SCG aparece de color blanco perla.
  2. Mientras mantiene la abertura con fórceps con la otra mano, sujete suavemente el SCG con pinzas y sáquelo de la abertura para que se vea mejor.
  3. Una vez que el SCG esté a la vista, agarre la base lateral del SCG, donde todavía está unido a los tejidos circundantes. Con la otra mano, retraiga lenta y suavemente el SCG en dirección ventral y caudal.
    1. Retraiga el SCG varias veces para avulpar gradualmente el ganglio poco a poco. Mantenga el ganglio intacto durante esta maniobra para asegurarse de que no queden restos de ganglios residuales.
      NOTA: Tire del ganglio suavemente, ya que puede producirse sangrado durante este paso. Si se produce una hemorragia leve, use celulosa regenerada oxidada o una pequeña tira de gasa estéril para mantener la presión sobre la abertura durante 30 s a 1 min. Luego, levante lentamente la gasa y vuelva a evaluar. Repita el proceso de mantener la presión sobre la abertura según sea necesario hasta que el sangrado se haya detenido.
  4. Suelte lentamente las otras pinzas que sujetan la base del ganglio. Compruebe si hay sangrado buscando sangre acumulada.
    NOTA: Es normal que haya una ligera supuración en este momento. Controle y asegúrese de que no haya sangrado persistente o significativo antes de cerrar y finalizar el procedimiento. Si esto ocurre, mantenga la presión sobre la abertura, como se describe en el paso 3.3.1.
  5. Mueva las glándulas salivales a sus posiciones anatómicas normales. Aproximar y cerrar la piel con suturas simples de nylon 5-0 interrumpidas (ver Tabla de Materiales).
  6. Coloque al ratón en una jaula limpia por sí mismo para permitir una recuperación completa de la anestesia.
    NOTA: El ratón puede tardar entre 5 y 15 minutos en despertarse completamente de la anestesia. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. No coloque al ratón en una jaula con otros ratones hasta que se haya recuperado por completo. Evaluar la recuperación postquirúrgica del ratón al menos una vez cada 24 h durante 72 h.

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Representative Results

Este protocolo describe la extirpación quirúrgica de la SCG en un modelo de ratón. La figura 2 ilustra los puntos de referencia anatómicos, incluyendo el CCA, la vena yugular anterior y el SCG. Con la disección (Figura 2A), se puede ver la vena yugular anterior derecha discurriendo a lo largo del borde lateral de la tráquea. Como se encuentra más profundo que la vena yugular anterior, la CCA izquierda y su bifurcación en la arteria carótida interna (ACI) y la arteria carótida externa (ECA) solo se ven débilmente laterales a la vena. Al examinar esto en NSG. Ratón transgénico B6-P0TdTomato (un ratón P0-Cre TdTomato donde las células de Schwann son de color rojo fluorescente, trabajo no publicado) con neuronas fluorescentes rojas bajo un microscopio fluorescente, se puede ver el nervio vago fluorescente corriendo lateralmente a la CCA, y la SCG fluorescente se puede ver en la bifurcación de la CCA, lateral a la vena yugular anterior (Figura 2B).

Después de la resección de la SCG en un ratón normal y un ratón transgénico, el tejido resecado se confirmó por su fluorescencia roja en comparación con el control de SCG no fluorescente (Figura 3A) y la tinción inmunofluorescente para tirosina hidroxilasa (TH), un marcador de los nervios adrenérgicos 13,29 (Figura 3B).

Si el procedimiento se realiza correctamente, el ratón desarrolla el síndrome de Horner ipsilateral inmediatamente después de la cirugía al recuperar la conciencia plena24. Se observó ptosis, la caída del párpado, que es un signo del síndrome de Horner (Figura 4B).

La glándula salival submandibular es uno de los tejidos inervados por la SCG. Para validar el éxito de la SCGx, se realizó una tinción de inmunofluorescencia para la TH en la glándula salival submandibular derecha después de la SCGx derecha y se confirmó la ablación exitosa de la señalización adrenérgica con ausencia de tinción del nervio TH (lado derecho de la línea punteada, Figura 5A). Por el contrario, la glándula submandibular de control izquierda (sin SCGx) mantuvo su entrada adrenérgica y la tinción intacta del nervio TH (lado izquierdo de la línea punteada, Figura 5A). Estos hallazgos fueron confirmados por cuantificación (Figura 5B). La cuantificación ELISA de norepinefrina 13,30,31 en estos tejidos confirmó además una reducción significativa en la expresión de norepinefrina en la glándula submandibular en el lado de SCGx en contraste con el lado de la cirugía simulada de control (Figura 6). La cuantificación de ambos se analizó mediante una prueba t de Student no apareada de dos colas.

Figure 1
Figura 1: La vena yugular anterior izquierda sirve como punto de referencia anatómico. (A) La vena yugular anterior izquierda (flecha azul) se puede ver corriendo longitudinalmente y a lo largo del borde lateral del músculo omohioideo. Al perforar la fascia cervical profunda entre el ángulo del vientre posterior de los músculos digástrico y omohioideo, el piercing también debe ser lateral a la vena yugular anterior (círculo negro). (B) Cuando la fascia cervical profunda está ligeramente estirada, también se puede ver el nervio vago (flecha blanca) y la arteria carótida común con su bifurcación (flecha roja). (C) Ilustración estilizada de (B). Barra de escala = 100 μm. Abreviatura: M = músculo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: El SCG y su relación con los puntos de referencia anatómicos en un ratón transgénico con neuronas fluorescentes. (A) Disección en un ratón transgénico con neuronas fluorescentes rojas, que ilustra la arteria carótida común derecha (flecha roja que apunta a su bifurcación) y la vena yugular anterior. La arteria carótida común se bifurca en la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida interna (ACI). La flecha amarilla apunta al nervio vago que corre lateralmente a la arteria carótida común. La distancia entre la arteria carótida común y el nervio vago parece más amplia aquí, ya que la cabeza del ratón se gira para capturar todas las estructuras de esta imagen. (B) La misma disección examinada con imágenes fluorescentes. El nervio vago (flecha amarilla) tiene fluorescencia roja y se ve de nuevo corriendo lateralmente a la arteria carótida común (flecha roja que apunta a su bifurcación). El SCG fluorescente se localiza en la bifurcación de la arteria carótida (punta de flecha amarilla). La vena yugular anterior (flecha azul) corre medial a la arteria carótida común. La fascia cervical profunda que recubre estas estructuras se puede ver con su reflejo brillante. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imágenes microscópicas del ganglio resecado . (A) Ganglios cervicales superiores resecados bajo microscopía fluorescente. A la izquierda se muestra el SCG resecado de un ratón normal, que sirve como control no fluorescente. A la derecha se muestra un SCG fluorescente resecado a partir de un ratón transgénico con neuronas fluorescentes rojas. Barra de escala = 500 μm. (B) Tinción inmunofluorescente para tirosina hidroxilasa (TH), un marcador de nervios adrenérgicos, en el ganglio rojo fluorescente resecado (P0). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Desarrollo del síndrome de Horner después de SCGx. (A) Un ratón normal antes de SCGx. (B) El desarrollo de ptosis (flecha negra), la caída del párpado, después de SCGx ipsilateral, que es un signo del síndrome de Horner. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Inmunofluorescencia y tinción H&E correspondiente para el marcador adrenérgico en el tejido diana después de la cirugía SCGx versus cirugía simulada. (A) Izquierda, tinción de inmunofluorescencia para tirosina hidroxilasa (TH) en la glándula salival submandibular después de SCGx o cirugía simulada. Derecha, la correspondiente tinción H&E del mismo tejido. Barra de escala = 200 μm. (B) Cuantificación de la tinción de TH. Los datos representan la media ± SEM. Análisis estadístico mediante prueba t de Student no apareada de dos colas, p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Cuantificación ELISA de norepinefrina en la glándula salival después de SCGx versus cirugía simulada. Los datos representan la media ± SEM. Análisis estadístico mediante prueba t de Student no pareada de dos colas, p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe un modelo murino para la ablación quirúrgica unilateral de la entrada de SCG. Esta técnica permite estudiar los efectos de la inervación adrenérgica en diversos entornos. Además, el ganglio simpático resecado también puede cultivarse en cultivo de matrigel 3D para experimentos in vitro 30.

Los estudios que involucran SCGx se han realizado principalmente en ratas, ya que su anatomía más grande permite una visualización y disección anatómica más fácil. Si bien la SCGx en ratones ha sido descrita anteriormente por Ziegler et al.26 y reportada brevemente en otros estudios21,22,27,28, la técnica se basó en la utilizada en ratas, en la que el CCA es expuesto y diseccionado antes de la resección del SCG. A diferencia del modelo de rata, el CCA en ratones es más pequeño y delgado, lo que dificulta la disección y, por lo tanto, es más propenso a la complicación grave de una hemorragia mayor por el CCA. Además, la exposición del CCA requiere una manipulación más extensa, incluyendo el desplazamiento del músculo esternocleidomastoideo, así como la disección y rotación lateral de la glándula salival26. Por el contrario, el presente método utiliza la vena yugular anterior en lugar de la ACC como punto de referencia anatómico. En comparación con la ACC, la vena yugular anterior se localiza más superficialmente y se extiende más cranealmente (Figura 2A). Esto ofrece algunas ventajas. En primer lugar, este punto de referencia se ve más fácilmente sin la disección y el desplazamiento de la glándula salival y el músculo esternocleidomastoideo, lo que hace que la cirugía sea menos invasiva; Este protocolo, por lo tanto, solo requiere que el salival se tire ligeramente hacia abajo (Paso 2.2). La disección mínima también acorta el tiempo de cirugía y la duración de la anestesia para el animal. Además, al evitar una disección extensa de la CCA, se minimizan las posibilidades de lesionar la CCA, lo que puede provocar una hemorragia importante y mortal en casos graves. La manipulación de la CCA es inevitable, ya que el SCG se encuentra en la bifurcación de la CCA, pero al acercarse a esta región posteromedialmente a través de un piercing junto a la vena yugular anterior en lugar de abrir la fascia directamente sobre la CCA, este protocolo minimiza el contacto y, por lo tanto, el riesgo de lesión de esta arteria principal.

A la hora de realizar esta cirugía se enfrentan dos grandes retos. El primero es la identificación exitosa del SCG, especialmente dado el tamaño muy pequeño de los puntos de referencia anatómicos y el propio ganglio en modelos de ratón. Por lo tanto, la disección cuidadosa y la identificación de los puntos de referencia son esenciales. En el paso 2.3, se deben insertar pinzas en ángulo para perforar la fascia cervical profunda en el ángulo del vientre posterior de los músculos digástrico y omohioideo. Durante este paso, la vena yugular anterior generalmente se ve corriendo a lo largo del borde lateral del músculo omohioideo y debe mantenerse medial al punto de inserción (Figura 1); este es un punto de referencia importante y ayudará a entrar en el espacio correcto para encontrar el SCG. Si el SCG no se ve en la región lateral de este espacio, los tejidos deben explorarse más lateral y superiormente. Durante esta disección, la vaina carotídea se visualiza lateral al campo de visión para evitar el sangrado de los tejidos circundantes y para ayudar a identificar el SCG medial a esta estructura.

El segundo gran reto de este procedimiento es controlar el riesgo de hemorragia. Existen múltiples estructuras vasculares críticas adyacentes al SCG, incluyendo la CCA, la arteria carótida externa y la vena yugular interna. En nuestra experiencia, si se produce una hemorragia, se produce en el intraoperatorio y no en el postoperatorio. Es posible que se produzca sangrado durante el paso de desenganchar las pinzas en el paso 3.4. Es más probable que se produzcan lesiones en los vasos cuando se intenta pelar y avulsionar suavemente el ganglio de los vasos y tejidos circundantes. Es posible que el sangrado activo no se vea de inmediato porque se pinza un par de fórceps cerca de los vasos de esa región. Por lo tanto, el sangrado puede identificarse una vez que se sueltan los fórceps, y es importante inspeccionar el área cuidadosamente después de que se extirpa el ganglio. En el raro caso de exanguinación debido a un desgarro en un vaso sanguíneo principal, mantener la presión sobre el área es inútil debido a la rápida tasa de sangrado. En esta situación, la cirugía debe terminarse y el ratón debe ser sacrificado.

Dados los desafíos de la identificación del SCG y las posibles complicaciones hemorrágicas, se recomienda practicar primero la disección y extracción del SCG en ratones cadavéricos para familiarizarse con la anatomía antes de realizar la cirugía experimental de supervivencia.

Este método también puede verse afectado por la destreza del cirujano. El procedimiento es más fácil de realizar en el mismo lado que la mano dominante del cirujano. Por ejemplo, al realizar SCGx en el lado derecho del ratón, la mano izquierda del cirujano se usaría para agarrar la base del ganglio y la mano derecha se usaría para despegar el ganglio, lo que significa que la cirugía requeriría más delicadeza con la mano derecha. Si se va a realizar una SCGx bilateral, puede llevar más tiempo y requerir más entrenamiento para realizarla en el lado no dominante del cirujano.

Esta técnica quirúrgica de SCGx en un modelo murino permite futuros estudios experimentales que examinen los efectos del sistema nervioso simpático tanto en entornos oncológicos como fisiológicos. El modelo de ratón tiene múltiples ventajas sobre otros modelos in vivo , incluyendo el bajo coste, la facilidad de manejo y la facilidad de manipulación genética, lo que permite crear modelos experimentales más potentes.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Q. W. recibió el apoyo de NIH T32CA009685. R. J. W. recibió el apoyo de NIH R01CA219534. Las instalaciones centrales del Memorial Sloan Kettering Cancer Center contaron con el apoyo de los NIH P30CA008748.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody EMD Millipore AB152
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment Akorn 59399-162-35
Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile Covidien 1806
Derf Needle Holder Thomas Scientific 1177K00
Dissecting Microscope
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
Dumont #7b Forceps Fine Science Tools 11270-20
ETHILON Nylon Suture Ethicon 698H
Fine Scissors - ToughCut Fine Science Tools 14058-09
Hypoallergenic Surgical Tape 3M Blenderm 70200419342
Induction Chamber, 2 Liter VetEquip 941444
Isoflurane Baxter 1001936060
Nair Church & Dwight Co., Inc 40002957 chemical hair removing agent
NORADRENALINE RESEARCH ELISA Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics) BA E-5200
NSG Mouse Jackson Laboratory JAX:005557
Povidone-Iodine Swabstick PDI S41350
Webcol Alcohol Preps Covidien 5110

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Wang, Q., Chen, C. H., Xu, H.,… More

Wang, Q., Chen, C. H., Xu, H., Deborde, S., Wong, R. J. Surgical Technique for Superior Cervical Ganglionectomy in a Murine Model. J. Vis. Exp. (190), e64527, doi:10.3791/64527 (2022).

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