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Neuroscience

एक न्यूनतम इनवेसिव तकनीक के आधार पर एक माउस कॉन्ट्यूशन रीढ़ की हड्डी की चोट मॉडल की स्थापना

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64538
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Orthopaedics, Qilu Hospital of Shandong University, 2Department of Orthopaedics, Tianjin Medical University General Hospital

Summary

न्यूनतम इनवेसिव तकनीक और एक सरल प्रयोगशाला उपकरण प्रयोगात्मक जानवरों को ऑपरेटिव क्षति को कम करके और शारीरिक आकृति विज्ञान रखरखाव की अनुमति देकर रीढ़ की हड्डी की चोट मॉडल की प्रजनन क्षमता में सुधार करते हैं। विधि सार्थक है क्योंकि विश्वसनीय परिणाम और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रक्रिया रोग क्षतिपूर्ति के तंत्र की जांच की सुविधा प्रदान करती है।

Abstract

रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) को मॉडल करने के लिए न्यूनतम इनवेसिव तरीकों का उपयोग प्रयोगात्मक जानवरों के बीच व्यवहार और हिस्टोलॉजिकल अंतर को कम कर सकता है, जिससे प्रयोगों की प्रजनन क्षमता में सुधार हो सकता है।

इन विधियों को पूरा करने के लिए दो आवश्यकताओं की आवश्यकता होती है: सर्जिकल शारीरिक मार्ग की स्पष्टता और प्रयोगशाला उपकरण की सादगी और सुविधा। ऑपरेटर के लिए महत्वपूर्ण रूप से, एक स्पष्ट शारीरिक मार्ग न्यूनतम इनवेसिव एक्सपोजर प्रदान करता है, जो सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौरान प्रयोगात्मक जानवर को अतिरिक्त नुकसान से बचाता है और जानवर को प्रयोग के दौरान एक सुसंगत और स्थिर शारीरिक आकृति विज्ञान बनाए रखने की अनुमति देता है।

इस अध्ययन में, छोटे जानवरों में रीढ़ की हड्डी की चोट के लिए एससीआई समाक्षीय मंच नामक एक नए एकीकृत मंच का उपयोग न्यूनतम इनवेसिव तरीके से टी 9 स्तर की रीढ़ की हड्डी को उजागर करने और कशेरुक स्टेबलाइजर का उपयोग करके चूहों के कशेरुक को स्थिर और स्थिर करने के लिए किया जाता है, और अंत में, टी 9 रीढ़ की हड्डी की चोट के विभिन्न डिग्री तक पहुंचने के लिए चूहों की रीढ़ की हड्डी को दूषित करने के लिए एक समाक्षीय गुरुत्वाकर्षण प्रभावक का उपयोग किया जाता है। अंत में, हिस्टोलॉजिकल परिणाम पाठकों के लिए एक संदर्भ के रूप में प्रदान किए जाते हैं।

Introduction

दर्दनाक रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) आसानी से व्यक्ति को गंभीर परिणामों के लिए प्रेरित करती है1; फिर भी, वर्तमान में कोई प्रभावी उपचार नहीं है 1,2. पशु संदूषण मॉडल एससीआई 3,4 का अध्ययन करने के प्रमुख तरीकों में से एक है।

2004 से 2014तक, चूहों को 407 अध्ययनों (71%) में से 289 में मॉडल जीवों के रूप में और 69 (16.9%) में चूहों में इस्तेमाल किया गया था। दरअसल, चूहों के साथ प्रयोगों का अनुपात धीरे-धीरे अन्य मॉडलों पर उनके फायदे के कारण वर्षों से बढ़ गया है, विशेष रूप से जीन विनियमन अध्ययन 3,4,5 के लिए महान क्षमता। इसलिए, मॉडल स्थिरता6 से जुड़े महान महत्व के कारण एक मॉडल के रूप में माउस का उपयोग करके अधिक अध्ययन करने के लिए अधिक संगत उपकरणों की आवश्यकता होती है। पिछले अध्ययनों में रिपोर्ट किए गए सामान्य उपकरण मूल रूप से एलन के रीढ़ की हड्डी के प्रभाव सिद्धांत पर आधारित हैं, उदाहरण के लिए, मूल वजन ड्रॉप इंपैक्टर 7,8, न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय (एनवाईयू)/ बहु-आयामी पशु रीढ़ की हड्डी की चोट अध्ययन (एमएएससीआईएस) इंपैक्टर 1,9, और अनंत क्षितिज (आईएच) इंपैक्टर10,11 . वजन घटाने वाले इम्पैक्टर और एनवाईयू / एमएएससीआईएस इम्पैक्टर लक्षित रीढ़ की हड्डी को लक्षित करने और अलग-अलग चोट ों को अलग करने के लिए अलग-अलग ऊंचाइयों से एक निश्चित वजन गिराने के एक ही सिद्धांत को साझा करते हैं। आईएच इम्पैक्टर विभिन्न बलों के अनुसार रीढ़ की हड्डी की चोट बनाता है।

एससीआई अध्ययनों में माउस मॉडल का उपयोग करने में सुविधा के लिए और प्रभावी उपचार विधियों के लिए आधार स्थापित करने के लिए, एक एकीकृत माउस रीढ़ की हड्डी प्रभाव चोट मंच, जिसे रीढ़ की हड्डी की चोट समाक्षीय मंच (एससीआईसीपी) कहा जाता है, विकसित किया गया है। मंच में चार मुख्य घटक होते हैं: (1) संचालित चूहों के लिए उपयुक्त स्थिति के लिए डिज़ाइन की गई एक पशु ऑपरेटिंग टेबल, जो बहुत कॉम्पैक्ट है और स्थिति प्रतिबंध के बिना सुविधा प्रदान करती है; (2) ऑपरेशन के दौरान पैरावर्टेब्रल मांसपेशियों को पकड़ने के लिए दोनों तरफ एक माइक्रो-रिट्रैक्टर; (3) एससीआई की प्रक्रिया से पहले कशेरुका को पकड़ने के लिए एक कशेरुका स्टेबिलिज़ेटर (चूहों जैसे बड़े जानवरों पर ऑपरेशन के लिए दो कशेरुक स्टेबिलाइज़ेटर उपलब्ध हैं); (4) एक आस्तीन, एक इंपैक्टर टिप, वजन और एक पुल पिन। तीन भागों को एक हटाने योग्य एक्स-वाई-जेड हाथ में इकट्ठा किया जाना चाहिए। सटीक लक्ष्यीकरण के लिए, रीढ़ की हड्डी की सतह पर एक इंपैक्टर टिप रखी जाती है, और एक्स-वाई-जेड आर्म को धीरे-धीरे इम्पैक्टर टिप और आस्तीन के बीच निशान की सहायता से अपेक्षित ऊंचाई तक उतारा जाता है। इम्पैक्टर टिप 0.12 ग्राम एल्यूमीनियम मिश्र धातु से बना है ताकि प्रक्रिया से पहले बड़े वजन संपीड़न के कारण रीढ़ की हड्डी को नुकसान से बचाया जा सके। खिंचाव पिन वजन में गिरावट तैयार करने के लिए आस्तीन के शीर्ष पर वजन रखने के लिए है (चित्रा 1)।

पिछले अध्ययनों में, प्रभाव बल विभाजन को आईएच डिवाइस के प्रभाव बल डेटा के अनुसार परिभाषित किया गया था, जो क्रमशः 30 केडिन, 50 केडिन और 70 केडिन 6,10 हैं। अनुसंधान प्रक्रिया के दौरान, एससीआईसीपी के आधार पर एससीआई मॉडल की सीरियल डिग्री स्थापित की गई, जिसका उपयोग विभिन्न अध्ययनों में किया जा सकता है। इसलिए, आधिकारिक तौर पर प्रयोग शुरू करने से पहले, विभिन्न द्रव्यमानों के विभिन्न भारों द्वारा उत्पन्न प्रभाव बलों का परीक्षण एक चरम दबाव परीक्षण उपकरण का उपयोग करके किया गया था। नतीजतन, तीन मानकीकृत प्रतिनिधि एससीआई माउस मॉडल को चोट के तीन अलग-अलग डिग्री के रूप में चुना गया था, जिसमें क्रमशः 6,10 वर्गीकृत हल्के, मध्यम और गंभीर समूह शामिल थे, और वजन को एक ही ऊंचाई पर जारी किया गया था, जिसमें हल्के के लिए 1.3 ग्राम वजन, मध्यम के लिए 2.0 ग्राम और गंभीर क्षति के लिए 2.7 ग्राम था।

संचालन और सटीकता की गारंटी देने के एक अन्य साधन के रूप में, एक नया और न्यूनतम इनवेसिव ऑपरेटिव दृष्टिकोण बताया गया है। सामान्य चूहों की शारीरिक रचना पर शोध के माध्यम से, टी 12-टी 13 के इंटरस्पिनस स्पेस का पता लगाने के लिए एक नई विधि पाई गई है। ऑपरेशन चरणों में कशेरुक का पता लगाने की विधि मास्टर और सटीक है, जो न्यूनतम इनवेसिव ऑपरेशन के लिए सटीक पता लगाना सुनिश्चित करती है।

उम्मीद है, दूषित चोट की यह तकनीक रीढ़ की हड्डी की चोट के अनुसंधान और समझ में सहायता कर सकती है, जिसमें पैथोफिज़ियोलॉजी समझ, प्रबंधन मूल्यांकन आदि शामिल हैं।

Protocol

नोट: सभी प्रयोगों को शेडोंग विश्वविद्यालय चीलू कॉलेज ऑफ मेडिसिन (अनुमोदन संख्या: 21 एल 60) की प्रयोगशाला पशु नैतिक और कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच प्रकाशन संख्या 85-23, संशोधित 1996) द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार किया गया था।

1. रीढ़ की हड्डी की चोट समाक्षीय मंच और यांत्रिक परीक्षणों का तंत्र

  1. प्लेटफॉर्म को एक सर्जिकल ऑपरेटिंग टेबल, एक कशेरुक स्टेबिलाइज़ेटर और एक इंपैक्टर टिप (चित्रा 1) के साथ इकट्ठा करें।
    नोट: वजन में गिरावट और निकास स्लॉट रखें, जो वजन को हवा की धाराओं का सामना करने से रोकते हैं, साफ रखें, क्योंकि वजन में गिरावट या आस्तीन पर कोई भी गंदगी प्लेटफॉर्म की सटीकता को प्रभावित कर सकती है।
  2. टिप, जो सटीक रीढ़ की हड्डी का पता लगाने की अनुमति देता है, को आस्तीन में रखें।
  3. प्रयोग के लिए वजन की बूंदों के उचित द्रव्यमान का चयन करें, जो क्रमशः हल्के, मध्यम और गंभीर समूहों के लिए 1.3 ग्राम, 2.0 ग्राम और 2.7 ग्राम हैं।
  4. वजन गिरने के छेद में पुल पिन प्लग करें।
  5. एक्स-वाई-जेड बांह पर नाली में फिट किए गए पुल पिन के साथ आस्तीन के शीर्ष पर वजन की गिरावट को इकट्ठा करें ताकि, एक बार पता लगाने के पूरा होने के बाद, वजन इम्पैक्टर टिप पर प्रहार करने के लिए जारी किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप रीढ़ की हड्डी दूषित हो जाती है, और माइक्रोस्कोप के नीचे रीढ़ की हड्डी में परिवर्तन देखा जाता है।
  6. पर्याप्त कार्य स्थान प्रदान करने के लिए ऑपरेटर की सुविधा के लिए हटाने योग्य 0.1 मिमी परिशुद्धता एक्स-वाई-जेड हाथ समायोजित करें (चित्रा 1 डी, ई)।
    नोट: अध्ययन के परिणामों की स्थिरता की पुष्टि करने के लिए, प्रयोग शुरू होने से पहले, पीक प्रेशर डिटेक्शन डिवाइस का उपयोग करके आस्तीन के अंदर वजन गिराने पर उत्पन्न बल को मापें। भविष्य के अध्ययनों के लिए पुष्टि की पुनरावृत्ति आवश्यक नहीं है।
  7. डिवाइस चालू करें, धातु दबाव रिसेप्टर को टिप के नीचे रखें, एडाप्टर को शून्य करें, पुल पिन जारी करें, और वास्तविक प्रभाव बल रिकॉर्ड करें।

2. 9वें वक्ष कशेरुक (टी 9) का पता लगाना और लैमिनेक्टॉमी

नोट: 9-10 सप्ताह पुराने मादा C57BL / 6J चूहों को जिनान पेंग्यु एक्सपेरिमेंटल एनिमल कंपनी (जिनान, चीन) से खरीदा गया था।

  1. प्रयोग के लिए सर्जिकल उपकरणों का एक सूट ऑटोक्लेव करें और सर्जरी से पहले 75% अल्कोहल के साथ ऑपरेटिंग टेबल को निष्फल करें।
  2. चोट के ऑपरेशन के लिए संज्ञाहरण से 30 मिनट पहले एनाल्जेसिया (0.05-2.0 मिलीग्राम / किग्रा, एसक्यू) के लिए ब्यूप्रेनोर्फिन इंजेक्ट करें। फिर, आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें (प्रेरण: ~ 3% -5%, रखरखाव: ~ 1.5% -2%)। जांचें कि क्या जानवर पूंछ या पैर की अंगुली की सजगता से पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है। एक बार संज्ञाहरण प्रभावी होने के बाद, माउस को ऑपरेटिंग टेबल के एक निर्दिष्ट हिस्से में एक प्रवण स्थिति में रखें और कॉर्निया को नेत्र मरहम के साथ कोट करें (सर्जरी के दौरान आंखों को सूखने से बचाने के लिए कॉर्निया पर नेत्र मरहम लागू करें)।
    1. थोराकोलंबर रीढ़ के ऊपर एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ पुच्छल से रोस्ट्रल तक बालों को शेव करें। 30 सेकंड के लिए आयोडोफोर के साथ एक गोलाकार गति में त्वचा को कई बार निष्फल करें और इसके बाद 75% अल्कोहल। एक बाँझ सर्जिकल ड्रेप लागू करें और स्केलपेल और ब्लेड के साथ लगभग टी 6 से टी 13 तक त्वचा पर लगभग 1.5 सेमी का अनुदैर्ध्य चीरा लगाएं।
      नोट: मध्य रेखा के लिए कॉस्टल मार्जिन के साथ पालपेट, जहां टी 12-टी 13 इंटरस्पिनस स्पेस स्थित है। रोस्ट्रल को 1.5 सेमी का चीरा लगाएं, और चीरा लगभग टी 6-टी 13 कशेरुकाओं के साथ फ्लश होता है।
  3. ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत बोनी हिस्से से एक तरफ 13 वीं पसली का अन्वेषण करें। टी 12-टी 13 के इंटरस्पिनस स्पेस का पता लगाने के लिए कोस्टोवर्टेब्रल कोण के क्षेत्र को हल्के से छूकर और फिर रोस्ट्रल की ओर मुड़कर मध्य रेखा में घुमावदार प्रक्रिया का पता लगाएं। टी 12-टी 13 के स्थान से रोस्ट्रल साइड तक टी 9-टी 10 के इंटरस्पिनस स्पेस का अन्वेषण करें। (चित्र 2A, 3A)
  4. टी 9 की स्पिनस प्रक्रिया के साथ पैरास्पाइनल मांसपेशियों को सूक्ष्म कैंची के साथ दोनों पक्षों के पूर्ववर्ती और पीछे के पहलू जोड़ों में विच्छेदित करें (चित्रा 3 बी)। पैरास्पाइनल मांसपेशियों को माइक्रो-रिट्रैक्टर्स के साथ वापस लें और लैमिना पर नरम ऊतक को साफ करें और माइक्रो कैंची के साथ टी 8-टी 9 और टी 9-टी 10 के इंटरस्पिनस स्पेस में।
  5. टी 9 लैमिनेक्टॉमी करें, टी 9 की स्पिनस प्रक्रिया को माइक्रोसर्जरी फोर्सप्स के साथ दबाएं, इसे थोड़ा ऊपर उठाएं, लैमिना के दाहिने डोरसोलेटरल साइड के साथ समानांतर रूप से माइक्रो कैंची डालें, रीढ़ की हड्डी को नुकसान से बचाएं, और माइक्रो कैंची से लैमिना को काट दें। बाईं ओर दोहराएं, और रीढ़ की हड्डी को उजागर किया जा सकता है (चित्रा 2 बी, 3 सी)।
  6. कशेरुका को ठीक करने से पहले, सार्वभौमिक बांह को ढीला करें, और धीरे-धीरे कशेरुक के दोनों किनारों पर 9 वें से 10 वें पहलू जोड़ों को कशेरुक स्टेबिलिज़ेटर के सूक्ष्म मच्छर बल के साथ दबाएं। सूक्ष्म मच्छर बल पर शिकंजा कसें, और कशेरुक इस प्रकार स्थिर हो जाता है। रीढ़ की हड्डी को क्षैतिज तल पर समायोजित करें, सार्वभौमिक हाथ को कसें, और कशेरुक तय किया गया है (चित्रा 3 डी)।

3. टी 9 चोट

  1. एक बार जब टी 9 स्तर की रीढ़ की हड्डी उजागर हो जाती है और कशेरुका तय हो जाती है, तो ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 ई) के तहत आस्तीन के अंदर नोक द्वारा रीढ़ की हड्डी को लक्षित करें।
  2. जांचें कि क्या टिप की सतह रीढ़ की हड्डी के पीछे और पार्श्व पहलुओं से रीढ़ की हड्डी के समानांतर है, क्योंकि माइक्रोस्कोप के नीचे रीढ़ की हड्डी और नोक के बीच संबंधों का निरीक्षण करना आसान है, और ऑपरेटिंग टेबल को आसानी से चालू किया जा सकता है।
  3. जांचें कि क्या टिप की सतह लैमिनेक्टॉमी के बाद रीढ़ की हड्डी के संपर्क में आने से पहले बची हुई लैमिना की द्विपक्षीय सीमाओं के समानांतर है क्योंकि यह रीढ़ की हड्डी के समानांतर एक प्राकृतिक संदर्भ विमान है।
  4. टी 12-टी 13 के इंटरस्पिनस स्पेस का पता लगाने के बाद, इंपैक्टर के अंत तक आस्तीन को कम करें जो अवलोकन विंडो पर निशान के अनुरूप हो और 22 मिमी की निर्दिष्ट ऊंचाई तक पहुंच जाए। वजन जारी करने के लिए पुल पिन खींचें (समूह के अनुसार 1.3 ग्राम, 2.0 ग्राम, या 2.7 ग्राम, जिसमें प्रत्येक समूह में 3 चूहे शामिल हैं और प्रत्येक समूह में प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक माउस है)।
    नोट: रीढ़ की हड्डी जमीन के समानांतर और नोक के लंबवत होनी चाहिए; सूक्ष्म दृश्य क्षेत्र सुनिश्चित करने के लिए ऑपरेटिंग टेबल को स्थानांतरित करें, क्योंकि तालिका बहुत कॉम्पैक्ट है।
  5. जब संदूषण हो जाता है तो इंपैक्टर को हटा दें और ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत एससीआई की डिग्री का निरीक्षण करें। हल्के समूह में, एक हल्के लाल रंग में परिवर्तन देखा जा सकता है, जबकि मध्यम समूह में, चोट स्थल 3-4 सेकंड में गहरे लाल रंग का प्रदर्शन करता है, और, संभवतः, प्रतिष्ठा देखी जा सकती है। गंभीर समूह में, गहरे लाल अभिव्यक्तियाँ तुरंत दिखाई दे सकती हैं, और ड्यूरा में स्पष्ट प्रतिष्ठा प्रकट होती है, लेकिन ड्यूरा अभी भी एक सुसंगत आकार में है (चित्रा 3 एफ)।
  6. सतही प्रावरणी और सीवन के साथ त्वचा को सीवन (पॉलीप्रोपाइलीन नॉनएब्जॉर्बेबल सीवन, आकार: 6-0)।
  7. सीवन को पूरा करने के बाद, सर्जिकल क्षेत्र को निष्फल करें, माउस को तापमान-नियंत्रित पैड पर रखें जब तक कि पूर्ण चेतना बहाल न हो जाए, और फिर माउस को माउस पिंजरों में डाल दें।

4. पशु देखभाल

  1. ठीक होने के लिए जानवर को हीटिंग पैड पर रखें और दोनों पिछले अंगों की गति का निरीक्षण करें।
    नोट: सर्जरी से गुजरने वाले जानवरों को पूरी तरह से ठीक होने तक अन्य जानवरों की कंपनी में वापस नहीं किया जाना चाहिए।
  2. पिंजरे के फर्श पर उच्च पानी का आहार डालें ताकि जानवर आसानी से भोजन तक पहुंच सकें। वैकल्पिक रूप से, कम फीडिंग टेबल के साथ पिंजरे का उपयोग करें।
  3. ऑपरेशन के बाद दिन में दो बार चूहों के मूत्राशय को खाली करें क्योंकि मध्यम और गंभीर चोट समूहों के लिए मूत्राशय समारोह को ठीक करना मुश्किल है। एनाल्जेसिया (0.05-2.0 मिलीग्राम / किग्रा, एसक्यू) के लिए ब्यूप्रेनोर्फिन इंजेक्ट करें।

5. ट्रांसकार्डियल छिड़काव, धुंधलापन और इम्यूनोस्टेनिंग

  1. चोट लगने के बाद 1, 28 वें और 56 वें दिन, छिड़काव द्वारा क्रमशः प्रत्येक समूह के एक माउस का बलिदान करें।
    1. अत्यधिक संज्ञाहरण (4% -6% आइसोफ्लुरेन) के बाद चूहों को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 60 एमएल और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 20 एमएल के साथ संक्रमित करें।
    2. रीढ़ की हड्डी को सूक्ष्म कैंची के साथ इकट्ठा करें, घाव केंद्र से क्रमशः रोस्ट्रैली और पुच्छल रूप से 1 सेमी तक विस्तारित करें।
    3. अतिरिक्त मांसपेशियों को निकालें, चरण 5.1.4 में पकड़ने के लिए उपकरणों के लिए आंशिक पसलियों के साथ बरकरार रीढ़ के खंडों को आरक्षित करें और इसे 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में भिगो दें।
    4. निर्धारण के लिए हेमोस्टैटिक फोर्स के साथ पसलियों को दबाएं और रीढ़ की हड्डी के घाव केंद्र में कटे हुए लैमिना और रंग परिवर्तन के अनुसार माइक्रोस्कोप के तहत घाव केंद्र को परिभाषित करें।
    5. पुच्छल से सूक्ष्म कैंची के साथ सभी लैमिना और आर्टिकुलर प्रक्रियाओं को हटा दें।
    6. सूक्ष्म कैंची से तंत्रिका जड़ों को काट लें और रीढ़ की हड्डी को बाहर निकालें।
    7. सूक्ष्म कैंची के साथ घाव केंद्र से क्रमशः पुच्छल और रोस्टरैली तक फैली रीढ़ की हड्डी के 0.5 सेमी एकत्र करें।
    8. रीढ़ की हड्डी को 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% सुक्रोज में रखें।
  2. हिस्टोलॉजिकल परीक्षा प्रकार के अनुसार ठंड के बाद ऊतकों को 6 μm मोटे वर्गों में काटें।
  3. हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला करें।
    1. अनुभागों को कमरे के तापमान पर पुनः गर्म करें और लगभग 15 मिनट के लिए 4% फॉर्मलाडेहाइड में 6 μm मोटी खंडों को भिगोदें, इसके बाद अवशिष्ट OCT को हटाने के लिए 1x PBS में चार बार भिगोएं।
    2. 90 सेकंड के लिए हेमेटॉक्सिलिन के साथ वर्गों को दाग दें, और डबल-डिस्टिल्ड पानी से कुल्ला करें।
    3. फिर, 3 मिनट के लिए बहते पानी के साथ अनुभागों को धो लें।
    4. 4 मिनट के लिए ईओसिन के साथ दाग लगाएं और अतिरिक्त ईओसिन को कुल्ला करने के लिए 30 सेकंड के लिए 95% अल्कोहल में दो बार भिगोएं।
    5. अंत में, ग्रेडिएंट अल्कोहल (95% अल्कोहल और 50% अल्कोहल एक बार, क्रमिक रूप से) के साथ निर्जलित करें और 2 मिनट के लिए पारदर्शिता के लिए जाइलीन में भिगोएं। फिर, रेजिन जेल के साथ नमूनों को सील करें (कोरोनल प्लेन सेक्शन: चित्रा 4; धनु विमान अनुभाग: चित्रा 5)।
  4. इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन करें।
    1. अनुभागों को कमरे के तापमान पर फिर से गर्म करें और लगभग 2 मिनट के लिए 4% फॉर्मलाडेहाइड में 6 μm मोटी खंडों को भिगोदें।
    2. टीबीएसटी में अनुभागों को 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
    3. ब्लॉकिंग समाधान (पीबीएस में 10% बकरी सामान्य सीरम) के साथ अनुभागों को इनक्यूबेट करें और इम्युनोग्लोबुलिन के गैर-विशिष्ट बंधन को अवरुद्ध करने के लिए 1 घंटे के लिए ब्लॉक करें।
    4. माउस एंटी-ग्लिया फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी, प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स के लिए एक मार्कर), पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (1: 600), और खरगोश एंटी-एनएफ 200 एंटीबॉडी (1: 2000) दोनों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रीढ़ की हड्डी के वर्गों को इनक्यूबेट करें, जो ब्लॉकिंग समाधान के 0.4 एमएल में न्यूरोफिलामेंट के लिए एक मार्कर है।
    5. पीबीएस के साथ अनुभागों को धोएं और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा 594-संयुग्मित आईजीजी (1: 1,000) और बकरी एंटी-माउस एलेक्सा 488-संयुग्मित आईजीजी (1: 1,000) द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ ब्लॉकिंग समाधान के 0.4 एमएल जोड़ें।
    6. क्रमशः 594 एनएम और 488 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर स्वचालित पैनोरमिक स्कैनिंग द्वारा 10x पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ छवियां लें (चित्रा 6)।
      1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप चालू करें, माइक्रोस्कोप चरण पर स्लाइड डालें, प्रतिदीप्ति चैनल पर स्विच करें, ऊतक पर तीन से चार बिंदुओं को रखने के लिए पोजिशनिंग कुंजी का उपयोग करें, और शूटिंग को पूरा करने पर ध्यान केंद्रित करें। शूटिंग खत्म करने के बाद, विभिन्न चैनलों की छवियों को वांछित प्रारूप में सहेजें, और फिर मर्ज की गई छवि को सहेजें।

Representative Results

डिवाइस की सटीकता का परीक्षण करने के लिए, एक ही ऊंचाई से बनाए गए वजन के तीन अलग-अलग द्रव्यमानों को पीक प्रेशर टेस्टिंग डिवाइस का उपयोग करके मापा गया था। वजन के अलग-अलग समूहों के साथ चौबीस परीक्षण किए गए, जिसके परिणामस्वरूप (एसडी ± औसत) 0.323 एन ± 1.3 ग्राम वजन के लिए 0.02 एन, 2.0 ग्राम वजन के लिए 0.543 एन ± 0.15 एन और 2.7 ग्राम वजन के लिए 0.723 एन ± 0.26 एन (चित्रा 7)। पिछले अध्ययनों ने संदूषण तीव्रता को मापने के लिए इकाइयों के रूप में डायन (डायन) या किलोडाइन (केडिन) को अपनाया। पिछले अध्ययनों के साथ बेहतर तुलना के लिए, न्यूटन (एन) और डायन / किलोडाइन के बीच रूपांतरण सूचीबद्ध हैं (1 एन = 1 किलोग्राम × 1 मीटर /एस2 = 1 × 103 जी × 1 × 100 सेमी / एस2 = 1 × 105 डायन; 0.323 एन = 32.3 केडिन; 0.543 एन = 54.3 केडिन; 0.723 एन = 72.3 केडिन)।

तालिका 1 और चित्रा 4 कोरोनल वर्गों पर हल्के, मध्यम और गंभीर समूहों के घावों का डेटा दिखाते हैं। चित्रा 4 से देखते हुए, चोट के बाद 28 वें दिन, हल्के, मध्यम और गंभीर समूहों में अलग-अलग ग्रे और सफेद पदार्थ सीमाओं की निरंतरता क्रमिक रूप से कम हो गई, निशान ऊतक का क्षेत्र बड़ा हो गया और घाव केंद्र के क्रॉस-सेक्शन पर बढ़ता अनुपात था। सामान्य समूह की तुलना में सभी प्रयोगात्मक समूहों में स्पष्ट रूपात्मक अंतर थे। इसने प्रयोगात्मक समूहों में चोट की डिग्री के विभाजन की तर्कसंगतता साबित की।

तालिका 2 और चित्र 5 में रीढ़ की हड्डी की चोट का वर्णन किया गया है। यह देखा जा सकता है कि चोट के बाद पहले दिन घाव का क्षेत्र धीरे-धीरे हल्के से गंभीर समूहों में काफी बढ़ गया। इस बीच, रीढ़ की हड्डी के दोनों किनारों पर सफेद पदार्थ की निरंतरता हल्के समूह में बेहतर थी, जिसमें अवलोकन योग्य छोटे गोल रिक्तिकाएं थीं, जो अंतरालीय एडिमा की विशेषताएं हैं। मध्यम समूह में, सफेद पदार्थ ने खराब निरंतरता प्रदर्शित की, और वेंट्रल सफेद पदार्थ की संरचना का आदेश नहीं दिया गया था। गंभीर समूह में, उदर सफेद पदार्थ ने अधिक गंभीर व्यवधान का प्रदर्शन किया, और चोट के केंद्र में गुहा का एक बड़ा क्षेत्र दिखाई दिया। इसके अतिरिक्त, आसपास के ऊतक ने लाल रक्त कोशिकाओं का स्पष्ट भरना दिखाया, और केंद्रीय नहर के पास लाल रक्त कोशिकाएं स्ट्रिप्स में इकट्ठा हुईं। चोट के 56 वें दिन, तीन समूहों के चोट केंद्र में निशान गठन देखा गया था, जिसका क्षेत्र चोट की गंभीरता के अनुसार बढ़ गया था।

चोट के बाद 56 वें दिन रीढ़ की हड्डी न्यूरोफिलामेंट की अखंडता को इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग परिणामों (चित्रा 6) के विश्लेषण से भी प्राप्त किया जा सकता है। आंकड़े से यह भी पता चलता है कि अतिव्यापी निशान बनाने वाले एस्ट्रोसाइट्स चोटों के सभी तीन समूहों के केंद्र में दिखाई दे रहे थे, चोट की गंभीरता के साथ चोट क्षेत्र की लंबाई बढ़ रही थी, जबकि निशान व्यास कम हो गया था। यह निशान संकुचन की उपस्थिति का सुझाव देता है, जिससे रीढ़ की हड्डी के व्यास में कमी हो सकती है।

Figure 1
चित्र 1: रीढ़ की हड्डी की चोट समाक्षीय मंच की एक पूरी और भागों की प्रदर्शनी। (A) X-Y-Z हाथ और ऑपरेटिंग टेबल को अलग किया जा सकता है, जो ऑपरेशन प्रक्रिया के लिए पर्याप्त जगह छोड़ देता है जिसके दौरान एक छोटे जानवर की रीढ़ की हड्डी उजागर होती है। ऑपरेटिंग टेबल को ऑपरेशन के दौरान स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित किया जा सकता है, जिससे स्थिति सीमाओं के कारण संभावित ऑपरेटिंग कठिनाई कम हो जाती है। कशेरुक स्टेबिलाइज़ेटर के शरीर में दिशा सहायता के लिए तीन-संयुक्त सार्वभौमिक हाथ होता है, जो इसके लचीलेपन को बढ़ाता है। (बी) इंपैक्टर टिप को आस्तीन में डालें और बाद वाले को एक्स-वाई-जेड आर्म में इकट्ठा करें। वजन को गिरने से रोकने के लिए पुल पिन की नोक को वजन के छेद में डालें और वजन को आस्तीन में रखें। भागों को इकट्ठा करने के साथ, माइक्रोस्कोप के नीचे लक्षित चोट क्षेत्र का पता लगाएं। फिर, एक्स-वाई-जेड हाथ को तब तक कम करें जब तक कि इंपैक्टर टिप का अंत अवलोकन विंडो के निचले स्तर के अनुरूप न हो, जो इंगित करता है कि एक एकीकृत संदूषण ऊंचाई तक पहुंच गया है (गिरने की शुरुआत होने पर वजन और इम्पैक्टर टिप के बीच की ऊंचाई 22 मिमी है)। पुल पिन खींचें, और प्रभाव किया जाएगा। (सी) चोट क्षेत्र के उजागर होने के बाद, माउस की रीढ़ को दबाने और ठीक करने के लिए क्लिप का उपयोग करें और कशेरुक स्टेबिलाइज़ेटर को स्थिर करने के लिए कसने वाले बोल्ट का उपयोग करें। (डी) ऑपरेटिंग टेबल पर खांचे के लिए अनुशंसित कार्य। प्रयोगात्मक जानवर को मध्य नाली में रखा जाना चाहिए, जिसमें सिर ढलान पर पूर्ववर्ती, वक्ष भाग की ओर होता है। एक्स-वाई-जेड हाथ ऑपरेटिंग टेबल से अलग है। (ई) इकट्ठे एससीआईसीपी का प्रदर्शन। तीर भागों को इंगित करते हैं। लक्ष्य संदूषण क्षेत्र को लक्षित करने वाली नोक के साथ, संदूषण शुरू करने के लिए, पुल पिन को बाहर निकालें, और रीढ़ की हड्डी को दूषित करने के लिए वजन इम्पैक्टर टिप पर गिर जाएगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: T13 कॉस्टओवरटेब्रल कशेरुका पता लगाने की विधि का एक इमेजिंग ग्राफ। (A) 13 वीं पसली और T13 अपेक्षाकृत स्थिर शारीरिक संरचनाएं हैं। माइक्रोस्कोप के तहत टी 13 कॉस्टओवरटेब्रल कोण का आसानी से पता लगाया जा सकता है, जिससे ऑपरेटर स्पिनस प्रक्रिया की ओर जांच कर सकता है और टी 12-टी 13 इंटरस्पिनस स्पेस पा सकता है। फिर, लक्ष्य चोट कशेरुक (उदाहरण के लिए, टी 9) का पता लगाने के लिए क्रमिक रूप से रोस्ट्रल साइड की ओर जांच करें। (बी) एक न्यूनतम इनवेसिव 9 वें थोरैसिक लैमिनेक्टॉमी आसन्न कशेरुक निकायों के बीच पर्याप्त लैमिना और पहलू जोड़ों को संरक्षित कर सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: चूहों में T9 स्तर की रीढ़ की हड्डी का एक्सपोजर और संदूषण। (A) T13 कॉस्टओवरटेब्रल कोण की जांच करें। (बी) ऑपरेशन के लिए पर्याप्त जगह बनाने के लिए माइक्रो-रिट्रैक्टर्स द्वारा पैरास्पाइनल मांसपेशी को वापस लेने के साथ, टी 9 को उजागर करें। (सी) माइक्रो कैंची के साथ टी 9 लैमिनेक्टॉमी का संचालन करें। (डी) कशेरुक स्टेबिलाइज़ेटर की क्लिप के साथ कशेरुक को स्थिर करें। (ई) इम्पैक्टर टिप के साथ लक्ष्य क्षेत्र को लक्षित करें। (च) चोट के बाद चोट वाले क्षेत्र में एडिमा और भीड़ देखी जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: चूहों में एससीआई की विभिन्न डिग्री के बाद 28 वें दिन प्रतिनिधि खंड (कोरोनल अनुभाग)। (बी) हल्के समूह के लिए, रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय पहलू में मामूली चोट देखी जा सकती है, जबकि बचे हुए सफेद पदार्थ और भूरे पदार्थ की आकृति विज्ञान काफी हद तक संरक्षित है। (सी) मध्यम समूह के लिए, रीढ़ की हड्डी में स्पष्ट निशान ऊतक देखा जाता है (लाल तारांकन द्वारा इंगित)। सफेद पदार्थ और ग्रे पदार्थ के बीच विभेदक विशेषताओं को मुश्किल से अलग किया जा सकता है। (डी) तुलनात्मक रूप से, गंभीर समूह की रीढ़ की हड्डी ने लगभग अपनी मूल आकृति विज्ञान खो दिया है और लगभग निशान ऊतक द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है। हरे रंग की डैश्ड लाइन क्षति के क्षेत्र को इंगित करती है, और काली डैश्ड लाइन अवलोकन योग्य ग्रे पदार्थ की सीमा को इंगित करती है। जैसे-जैसे चोट की गंभीरता बढ़ी, माउस की रीढ़ की हड्डी में एक बड़ा घाव और कम बची हुई संरचना दिखाई दी, जिसमें ग्रे पदार्थ की सीमा मुश्किल से अलग थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: चूहों की रीढ़ की हड्डी में चोट लगने के बाद पहले और 56 वें दिन प्रतिनिधि खंड (ए) माउस की सामान्य वक्ष रीढ़ की हड्डी। (बी) बी 1-बी 3 क्रमशः हल्के, मध्यम और गंभीर समूहों में चोट के बाद पहले दिन रीढ़ की हड्डी का प्रतिनिधित्व करता है। यह देखा जा सकता है कि, जैसे-जैसे क्षति बढ़ी, घाव केंद्र में एक बड़ा क्षेत्र बाधित या द्रवित हो गया। उदर रीढ़ की हड्डी में सफेद पदार्थ की निरंतरता अलग-अलग चोट तीव्रता के कारण भिन्न होती है। बी 1 से पता चलता है कि उदर रीढ़ की हड्डी में सफेद पदार्थ में मामूली एडिमा के साथ बेहतर निरंतरता होती है। बी 2 उदर रीढ़ की हड्डी और गंभीर एडिमा में सफेद पदार्थ की खराब निरंतरता दिखाता है। बी 3 एससीआई के केंद्र में ऊतक ने लगभग सभी निरंतरता खो दी है, और चोट के केंद्र के बाहर के क्षेत्र में व्यापक एडिमा है। (C) C1-C3 क्रमशः हल्के, मध्यम और गंभीर समूहों में चोट के बाद 56 वें दिन रीढ़ की हड्डी का प्रतिनिधित्व करता है। निशान अनुबंध की विभिन्न डिग्री विभिन्न समूहों के बीच चोट केंद्र में प्रकट हुई, और चोट क्षेत्र के व्यास में महत्वपूर्ण अंतर था। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: चूहों में रीढ़ की हड्डी में चोट लगने के बाद 56 वें दिन प्रतिनिधि खंड (ए) हल्के समूह का प्रतिनिधि खंड। एनएफ 200 न्यूरोफिलामेंट को इंगित करता है, जबकि जीएफएपी एस्ट्रोसाइट्स को इंगित करता है। अतिव्यापी एस्ट्रोसाइट्स घाव उपरिकेंद्र में देखे जाते हैं, जबकि रीढ़ की हड्डी के उदर भाग में न्यूरोफिलामेंट अच्छी निरंतरता में है। (बी) मध्यम समूह का प्रतिनिधि अनुभाग। अतिव्यापी एस्ट्रोसाइट्स के अलावा दो निशान केंद्रों (लाल तारांकन द्वारा इंगित) को देखा जा सकता है, जबकि उदर पहलू में न्यूरोफिलामेंट में निरंतरता होती है। (सी) गंभीर समूह का प्रतिनिधि खंड, जिसमें एक बड़ी घाव सीमा और बड़े पैमाने पर निशान बनाने वाले एस्ट्रोसाइट्स हैं। कोई स्पष्ट निशान केंद्र नहीं देखा गया है, और न्यूरोफिलामेंट में खराब निरंतरता है। स्केल पट्टी = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: एक ही ऊंचाई से उत्पन्न बल लेकिन अलग-अलग वजन के साथ। प्रयोग से पहले, एक ही ऊंचाई से जारी भार के विभिन्न द्रव्यमानों द्वारा उत्पन्न बल का पता एक चरम दबाव का पता लगाने वाले उपकरण का उपयोग करके लगाया गया था। प्रत्येक समूह ने 24 डिटेक्शन पूरा करने के बाद, स्ट्राइकिंग फोर्स के संदर्भ के लिए अधिक विश्वसनीय गुरुत्वाकर्षण डेटा प्राप्त किया गया। सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर एसपीएसएस 19.0 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। डेटा को प्रत्येक समूह में एसडी, एन = 24 ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। अधिक समूहों के बीच तुलना मतभेदों का परीक्षण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विचरण (एनोवा) के एक-तरफ़ा विश्लेषण पर आधारित थी; पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

28 dpi
समूह GMR (%) WMR (%) डीआर (%)
सामान्य 35.44 64.57 0
हलका 11.59 64.88 23.53
मध्यम 0 41.14 58.86
गंभीर 0 0 100

तालिका 1: चोट के बाद 28 वें दिन सफेद पदार्थ, ग्रे पदार्थ और क्षति की दर। संक्षिप्तीकरण: डीपीआई = चोट के बाद के दिन, डीए = क्षतिग्रस्त क्षेत्र; जीएमआर = ग्रे पदार्थ दर; डब्ल्यूएमआर = सफेद पदार्थ दर; डीआर = क्षतिग्रस्त दर।

समूह 1dpi DA (μm2) 56dpi DA (μm2)
सामान्य 0 0
हलका 2391250 666091
मध्यम 4383381 1263191
गंभीर 5118833 1943962

तालिका 2: चोट के बाद पहले और 56 वें दिन घाव के बीच तुलना।

Discussion

मानकीकृत प्रक्रिया के माध्यम से, स्थिर डेटा प्राप्त किया जा सकता है, विशेष रूप से विवो प्रयोगों में छोटे जानवरों में , जो जानवरों के बीच व्यक्तिगत मतभेदों के कारण परिणामों के विचलन को कम कर सकता है। उपरोक्त शर्तों और सुविधाजनक अनुप्रयोग उपकरणों के आधार पर, मानकीकृत, न्यूनतम इनवेसिव, सटीक और दोहराने योग्य एससीआई मॉडल स्थापित किए जा सकते हैं।

इसकी व्यावहारिकता और सुविधा के कारण, पहले, वजन ड्रॉप इंपैक्टर का उपयोग ज्यादातर3 किया जाता था। इस अध्ययन में पेश किया गया इम्पैक्टर एलन के मॉडल12 के साथ एक ही सिद्धांत साझा करता है। सौभाग्य से, आधुनिक मशीनिंग तकनीक के सटीक विनिर्माण लाभों के कारण, अनुसंधान टीम ने संचालित करने में आसान, दृढ़ता से स्थिर और शायद ही कभी गलत होने के लाभों के साथ एक वजन ड्रॉप इम्पैक्टर तैयार किया। विभिन्न भारों के गुरुत्वाकर्षण को मापने के लिए एक चरम दबाव का पता लगाने वाले उपकरण का उपयोग किया गया था। अनंत क्षितिज प्रभावक के बारे में पिछले अध्ययन 6,10 ने बताया कि 30 Kdyn, 50 Kdyn और 70 Kdyn समूहों में इच्छित बल से विचलित बल की एक ±5 Kdyn रेंज को स्वीकार किया जाता है, जो समूह विभाजन और संदूषण डिग्री चयन के संदर्भ में वर्तमान अध्ययन के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है। वर्तमान शोध में, विभिन्न समूहों के संभावित बल को पहले से मापा गया था, और अधिक सटीक डेटा प्राप्त किया गया था।

पशु मॉडल प्रयोगों में डिवाइस की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण माउस शरीर रचना विज्ञान की समझ और उपयोग है। शरीर रचना विज्ञान का अच्छा उपयोग करने से प्रक्रियाओं को न्यूनतम इनवेसिव बनाया जा सकता है। मिनिमली इनवेसिव सर्जरी सीधे प्रयोगात्मक जानवर की कार्यात्मक स्थिति की स्थिरता और बाद में माउस रिकवरी की स्थिरता को प्रभावित करती है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एससीआई मॉडल की न्यूनतम इनवेसिव स्थापना कशेरुक संरचना की स्थिरता को बढ़ाती हैऔर चूहों में वसूली के दौरान रीढ़ की हड्डी की अस्थिरता के कारण होने वाली अतिरिक्त क्षति से बचती है। न्यूनतम इनवेसिव सर्जरी का आधार प्राकृतिक शारीरिक संरचनाओं का उचित उपयोग है। इसलिए, रीढ़ की हड्डी के खंडों का तेजी से और सटीक पता लगाना चूहों की शारीरिक संरचना के अनुसार किया जाना चाहिए। जैसा कि बताया गया है, कशेरुक13 को खोजने के लिए इमेजिंग विधि का उपयोग किया गया था। यद्यपि इसमें उच्च सटीकता है, वास्तविक प्रयोगात्मक संचालन प्रक्रिया में, पता लगाने के लिए इमेजिंग विधि में असुविधाजनक संचालन, लंबे ऑपरेशन समय, जटिल उपकरण अधिग्रहण और उच्च उपकरण सटीकता आवश्यकताओं के नुकसान हैं। मैकडोनो एट अल ने स्कैपुलस14 के अवर कोणों के माध्यम से टी 7 का पता लगाने का वर्णन किया, जबकि चूहे एक झूठ के साष्टांग में कार्य करते हैं, इसलिए उल्लिखित अवर कोणों को पीछे के कोण माना जाता है। इसके अलावा, टी 7 को खोजने के लिए निचले स्कैपुलर युक्तियों का उपयोग करना मानव शरीर रचनाविज्ञान 15 में एक विशिष्ट स्थिति के लिए एक पता लगाने की विधि है, जो चूहों के लिए उपयुक्त नहीं है। अंत में, माइक्रो-सीटी डेटा ने इस परिकल्पना को भी मान्य किया कि स्कैपुला के पीछे के कोण टी 7 के साथ फ्लश नहीं होते हैं, भले ही माउस उनकी प्राकृतिक या विशिष्ट शरीर की स्थिति में हो। मैकडोनो एट अल.14 ने माउस के धनुषाकार होने पर पीठ के उच्चतम बिंदु का पता लगाने और उच्चतम बिंदु को टी 12 के रूप में परिभाषित करने का भी उल्लेख किया। तुलनात्मक रूप से, वर्तमान शोध में, टी 9 टी 12-टी 13 इंटरस्पिनस स्पेस की सहायता से स्थित है, जो माउस की मुद्रा से न तो जुड़ा हुआ है और न ही प्रभावित है। इसके अलावा, इस विधि के साथ, लक्ष्य कशेरुक को आसानी से स्थित और संचालित किया जा सकता है। माइक्रोस्कोप के नीचे 13 वीं पसली की जांच करनी चाहिए, धीरे से कॉस्टओवरटेब्रल कोण के क्षेत्र को छूना चाहिए, स्पिनस प्रक्रिया की ओर एक रेखा खींचनी चाहिए, और फिर सिर की ओर टी 12-टी 13 की घुमावदार प्रक्रियाओं के बीच की जगह की जांच करनी चाहिए। शोध दल ने 12 चूहों में से टी 9 का पता लगाने के लिए टी 12-टी 13 इंटरस्पिनस स्पेस का उपयोग किया। अंत में, 12 महिला C57BL / 6J चूहों को T9 स्थान और लैमिनेक्टॉमी के बाद माइक्रो-सीटी स्कैन किया गया था। माइक्रो-सीटी स्कैन के परिणाम ने संकेत दिया कि सभी 12 चूहों में हटाए गए लैमिनेट टी 9 थे। माइक्रो-सीटी के परिणामों से पता चला कि सभी टी 9 सटीक रूप से स्थित थे, और सटीकता स्कैपुला लोकेटिंग विधि की तुलना में काफी अधिक थी। यह विधि हमें पता लगाने का एक तेज़ और सटीक तरीका प्रदान करती है, जो चोट मॉडल की स्थिरता में योगदान देती है।

वर्तमान प्रोटोकॉल की न्यूनतम आक्रामकता मुख्य रूप से तीन पहलुओं में स्पष्ट है। सबसे पहले, पता लगाने के बाद, टी 9 स्तर पर पैरास्पाइनल मांसपेशियों को केवल माइक्रो-रिट्रैक्टर्स द्वारा वापस ले लिया जाता है, टी 8 या टी 10 स्तरों पर मांसपेशियों को नुकसान पहुंचाए बिना। इसके अलावा, माइक्रो-रिट्रैक्टर्स द्वारा लैमिना का जोखिम दृश्य क्षेत्र में हस्तक्षेप नहीं करता है। दूसरा, रक्त की कमी, जो ज्यादातर लैमिनेक्टॉमी से होती है, जो कैंसेलस हड्डी से रक्त बहिर्वाह का कारण बन सकती है, ऑपरेशन प्रक्रिया में बहुत कम है, कपास के 2 मिमी x 2 मिमी x 3 मिमी त्रिकोणीय टुकड़े को दागने की मात्रा से अधिक नहीं है। तीसरा, लैमिनेक्टॉमी सबसे बड़ी सीमा तक आवश्यक क्षेत्र तक सीमित थी, जिससे लैमिना के पार्श्व भाग की निरंतरता बनी रही और कशेरुक अस्थिरता को बहुत कम किया गया। पिछले प्रोटोकॉल16,17 की तुलना में, वर्तमान प्रोटोकॉल बहुत अनावश्यक क्षति को कम करता है।

एससीआई की विभिन्न डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए, हिस्टोपैथोलॉजी में सभी समूहों के बीच परिणामों की तुलना पिछले अध्ययनों से पहले से ही 9,11,18 दिखाई गई है। ये परिणाम चोट की विभिन्न डिग्री और विभिन्न अवधियों में परिवर्तन के अवलोकन अध्ययन को पूरा करने के लिए पर्याप्त हैं। एचई और इम्यूनोफ्लोरेसेंस ने दिखाया कि, एससीआई की गंभीरता में वृद्धि के साथ, रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में अधिक असामान्य आकृति विज्ञान दिखाई दिया, और क्षति की डिग्री में वृद्धि से रीढ़ की हड्डी के संरचनात्मक विकार की डिग्री में भी वृद्धि हुई। ऊतक आकृति विज्ञान अवलोकन के परिप्रेक्ष्य से, इस अध्ययन में प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में ऊतक आकृति विज्ञान परिवर्तन की डिग्री और नियमितता पिछले अध्ययनों के साथ अत्यधिक सुसंगत है।

वर्तमान हिस्टोलॉजिकल परीक्षण परिणामों के अनुसार, दर्दनाक एससीआई के विभिन्न डिग्री के बाद विभिन्न संकेतकों में स्पष्ट परिवर्तन का संकेत दिया जाता है, जो इस अध्ययन में स्थापित मॉडल की विश्वसनीयता की पुष्टि करता है।

सटीक और प्रभावी हालांकि तकनीक है, विधियों के लिए संभावित सीमाएं मौजूद हो सकती हैं। लैमिनेक्टॉमी के बारे में, ऑपरेटर को माइक्रोस्कोप के तहत ऑपरेशन के साथ कुशल होना चाहिए ताकि रीढ़ की हड्डी को गलती से क्षतिग्रस्त होने से रोका जा सके। इसके अलावा, पूरे प्लेटफ़ॉर्म का सेटअप यांत्रिक संरचनाओं पर आधारित है, जो स्वचालित उपकरणों की तुलना में ऑपरेटर के लिए उच्च मांग निर्धारित करता है। दरअसल, ऑपरेशन के बार-बार प्रशिक्षण से सभी उल्लिखित समस्याओं में सुधार किया जा सकता है।

यह देखा जा सकता है कि न्यूनतम इनवेसिव और मानकीकृत मॉडलिंग परिणामों को अधिक समान, स्थिर और दोहराने योग्य बनाने, विभिन्न उपचार योजनाओं की प्रभावकारिता का सटीक मूल्यांकन करने और दर्दनाक एससीआई के लिए अनुसंधान योजना को अनुकूलित करने में फायदेमंद है।

Disclosures

प्रोफेसर शिकिंग फेंग के पास रीढ़ की हड्डी की चोट समाक्षीय मंच का स्वामित्व है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान (81930070) के राज्य कुंजी कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% fixative solution Solarbio P1110 4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody abcam ab8135 Dilution ratio (1: 2000)
Eosin Staining Solution (water soluble) biosharp BL727B
Ethanol Fuyu Reagent 64-17-5
Fluorescent microscope KEYENCE BZ-X800
Frozen Slicer leica CM3050 S
GFAP (GA5) Mouse mAb  Cell Signaling TECHNOLOGY #3670 Dilution ratio (1: 600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 ThermoFisher SCIENTIFIC A32723TR Dilution ratio (1: 1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 ThermoFisher SCIENTIFIC A32740 Dilution ratio (1: 1000)
Hematoxylin Staining Solution biosharp BL702A
Mice Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany  C57BL/6J 
Microsurgery apparatus  Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd All the surgey instruments are custom-made Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution) Zhong Shan Jin Qiao ZLI-9022 working solution
O.C.T. Compound SAKURA 4583
PBS (phosphate buffered solution) Solarbio P1020 pH 7.2-7.4
RWD Laboratory inhalation anesthetic station RWD Life Science Co., Ltd R550
Small animal in vivo microCT imaging system PerkinElmer  Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd Custom-made(Feng's standard) (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~
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a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto
Enter=1&share_cmpt=native_
wechat&is_silence_auth=1)
Surgery microscope  Zumax Medical Co., Ltd. zumax, OMS2355
TBST (Tris Buffered Saline+Tween) Solarbio T1082 Dilution ratio (1: 19)
Xylene Fuyu Reagent 1330-20-7

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न्यूरोसाइंस अंक 187 रीढ़ की हड्डी की चोट न्यूनतम इनवेसिव कशेरुक का पता लगाना
एक न्यूनतम इनवेसिव तकनीक के आधार पर एक माउस कॉन्ट्यूशन रीढ़ की हड्डी की चोट मॉडल की स्थापना
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