Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

मोलस्क से कच्चे और स्पष्ट अर्क के कथित एंटीक्रिप्टोकोकल गुणों का आकलन करना

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64540
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph, 2School of Environmental Sciences, University of Guelph

Summary

मानव कवक रोगज़नक़ क्रिप्टोकोकस नियोफोरमैन मेजबान के भीतर अपने अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए विभिन्न प्रकार के विषाणु कारकों (जैसे, पेप्टिडेस) का उत्पादन करता है। पर्यावरणीय niches नए प्राकृतिक पेप्टिडेस अवरोधकों के एक आशाजनक स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह प्रोटोकॉल मोलस्क से अर्क की तैयारी और फंगल विषाणु कारक उत्पादन पर उनके प्रभाव के आकलन को रेखांकित करता है।

Abstract

क्रिप्टोकोकस नियोफोरमैन एक वैश्विक वितरण के साथ एक एनकैप्सुलेटेड मानव फंगल रोगज़नक़ है जो मुख्य रूप से इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड व्यक्तियों को संक्रमित करता है। नैदानिक सेटिंग्स में एंटिफंगल के व्यापक उपयोग, कृषि में उनके उपयोग और तनाव संकरण ने प्रतिरोध के विकास में वृद्धि की है। एंटिफंगल के खिलाफ प्रतिरोध की यह बढ़ती दर दुनिया भर के चिकित्सकों और वैज्ञानिकों के बीच एक बढ़ती चिंता है, और नए एंटिफंगल उपचार विकसित करने की तात्कालिकता बढ़ गई है। उदाहरण के लिए, सी नियोफोरमैन कई विषाणु कारकों का उत्पादन करता है, जिसमें ऊतक क्षरण, सेलुलर विनियमन और पोषक तत्व अधिग्रहण में भूमिका के साथ इंट्रा-और एक्स्ट्रा-सेलुलर एंजाइम (जैसे, पेप्टिडेस) शामिल हैं। अवरोधकों द्वारा इस तरह की पेप्टिडेस गतिविधि का विघटन फंगल विकास और प्रसार को परेशान करता है, यह सुझाव देता है कि यह रोगज़नक़ का मुकाबला करने के लिए एक महत्वपूर्ण रणनीति हो सकती है। महत्वपूर्ण रूप से, मोलस्क जैसे अकशेरुकी बायोमेडिकल अनुप्रयोगों और एंटी-माइक्रोबियल गतिविधि के साथ पेप्टिडेस इनहिबिटर का उत्पादन करते हैं, लेकिन फंगल रोगजनकों के खिलाफ उनके उपयोग के संदर्भ में उन्हें कम किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, कच्चे और स्पष्ट अर्क में संभावित पेप्टिडेस इनहिबिटर को अलग करने के लिए मोलस्क से एक वैश्विक निष्कर्षण किया गया था, और शास्त्रीय क्रिप्टोकोकल विषाणु कारकों के खिलाफ उनके प्रभावों का आकलन किया गया था। यह विधि एंटिफंगल गुणों के साथ मोलस्क की प्राथमिकता का समर्थन करती है और मोलस्क में पाए जाने वाले प्राकृतिक अवरोधकों का उपयोग करके एंटी-विषाणु एजेंटों की खोज के अवसर प्रदान करती है।

Introduction

क्रिप्टोकोकस नियोफोरमैन एक मानव फंगल रोगज़नक़ है जो इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड मेजबानों में गंभीर बीमारी पैदा करता है, जैसे कि एचआईवी / एड्स1 के साथ रहने वाले व्यक्ति, और एड्स से संबंधित मौतों का लगभग 19% होताहै। कवक एंटिफंगल के कई वर्गों के लिए अतिसंवेदनशील है, जिसमें एज़ोल्स, पॉलीएन और फ्लुसाइटोसिन शामिल हैं, जो अलग-अलग तंत्र 3,4 का उपयोग करके कवकनाशी और कवकनाशी गतिविधि को बढ़ाते हैं। हालांकि, तनाव संकरण के साथ संयुक्त नैदानिक और कृषि सेटिंग्स में एंटिफंगल के व्यापक उपयोग ने सी नियोफोरमैन्स5 सहित कई फंगल प्रजातियों में प्रतिरोध के विकास को बढ़ाया है।

एंटिफंगल प्रतिरोध की चुनौतियों को दूर करने और वैश्विक स्तर पर फंगल संक्रमण के प्रसार को कम करने के लिए, एक आशाजनक दृष्टिकोण क्रिप्टोकोकस एसपीपी (जैसे, तापमान अनुकूलनशीलता, पॉलीसेकेराइड कैप्सूल, मेलेनिन और बाह्य एंजाइम) के विषाणु कारकों का उपयोग करना है। . इस दृष्टिकोण के कई फायदे हैं, क्योंकि इन विषाणु कारकों को साहित्य में अच्छी तरह से चित्रित किया गया है, और इन कारकों को लक्षित करने से सेल विकास को लक्षित करने के बजाय उग्रता को कम करने के माध्यम से कमजोर चयनात्मक दबाव लागू करके एंटिफंगल प्रतिरोध की दरों को कमकिया जा सकता है। इस संदर्भ में, कई अध्ययनों ने क्रिप्टोकोकस एसपीपी 7,8,9 की उग्रता को कम करने या रोकने के लिए बाह्य एंजाइमों (जैसे, प्रोटीज, पेप्टिडेस) को लक्षित करने की संभावना का आकलन किया है।

अकशेरुकी और पौधों जैसे जीवों में रोगजनकों से खुद को बचाने के लिए अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली नहीं होती है। हालांकि, वे सूक्ष्मजीवों और शिकारियों से निपटने के लिए रासायनिक यौगिकों की एक विशाल सरणी के साथ एक मजबूत जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली परभरोसा करते हैं। इन अणुओं में पेप्टिडेस इनहिबिटर शामिल हैं, जो कई जैविक प्रणालियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जिसमें अकशेरुकी प्रतिरक्षा की सेलुलर प्रक्रियाएं शामिल हैं, जैसे कि हेमोलिम्फ की जमावट, साइटोकिन्स और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स का संश्लेषण, और रोगजनकों के प्रोटीज को सीधे निष्क्रिय करके मेजबानों की सुरक्षा। इस प्रकार, मोलस्क जैसे अकशेरुकी जीवों से पेप्टिडेस इनहिबिटर में संभावित बायोमेडिकल अनुप्रयोग होते हैं, लेकिन कई 10,12,13 की विशेषता नहीं रखते हैं। इस संदर्भ में, ओंटारियो में स्थलीय मोलस्क की लगभग 34 प्रजातियां और कनाडा में 180 मीठे पानी के मोलस्कहैं। हालांकि, उनकी गहन प्रोफाइलिंग और लक्षण वर्णन अभीभी सीमित हैं। ये जीव संभावित एंटी-फंगल गतिविधि10 के साथ नए यौगिकों की पहचान के लिए एक अवसर प्रस्तुत करते हैं।

इस प्रोटोकॉल में, अकशेरुकी जीवों (जैसे, मोलस्क) (चित्रा 1) से अर्क को अलग करने और स्पष्ट करने के तरीकों का वर्णन किया गया है, जिसके बाद कथित पेप्टिडेस निरोधात्मक गतिविधि को मापा जाता है। इन अर्क के एंटिफंगल गुणों का मूल्यांकन तब फेनोटाइपिक परख (चित्रा 2) का उपयोग करके सी नियोफोरमैन्स विषाणु कारक उत्पादन पर उनके प्रभाव को मापकर किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कच्चे और स्पष्ट अर्क के बीच एंटिफंगल गुणों में अंतर मोलस्क के माइक्रोबियल कारकों (जैसे, द्वितीयक मेटाबोलाइट्स या मेजबान माइक्रोबायोम द्वारा उत्पादित विषाक्त पदार्थों) का संकेत हो सकता है, जो प्रयोगात्मक टिप्पणियों को प्रभावित कर सकता है। इस तरह के निष्कर्ष कार्रवाई के तरीकों को उजागर करने के लिए स्वतंत्र रूप से कच्चे और स्पष्ट अर्क दोनों का आकलन करने के लिए इस प्रोटोकॉल की आवश्यकता का समर्थन करते हैं। इसके अतिरिक्त, निष्कर्षण प्रक्रिया निष्पक्ष है और फंगल और बैक्टीरियल रोगजनकों के ढेरों के खिलाफ रोगाणुरोधी गुणों का पता लगाने में सक्षम हो सकती है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल सी नियोफोरमैन के खिलाफ एंटिफंगल गुणों के साथ मोलस्क प्रजातियों की प्राथमिकता के लिए एक दीक्षा बिंदु प्रदान करता है और कथित निरोधात्मक तंत्र के माध्यम से एंजाइमेटिक गतिविधि और विषाणु कारक उत्पादन के बीच संबंधों का मूल्यांकन करने का अवसर प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. मोलस्क से प्रोटीन निष्कर्षण

  1. एक निर्दिष्ट और अनुमोदित प्राकृतिक क्षेत्र (जैसे, स्पीड रिवर, गुएल्फ, ओंटारियो) से मोलस्क एकत्र करें। इस अध्ययन के लिए, संभावित एंटिफंगल प्रभावों की एक विस्तृत श्रृंखला का आकलन करने के लिए देशी और आक्रामक दोनों प्रजातियों का चयन किया गया था।
  2. मूसल और मोर्टार का उपयोग करके मोलस्क (जैसे, सेपिया नेमोरालिस, प्लानोरबेला पिल्सब्री , और सिपंगोपालुदिना चिनेंसिस) के खोल को धीरे से तोड़ें, और चिमटी की एक जोड़ी के साथ ठोस टुकड़ों को हटा दें। आम तौर पर, पूरे प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए 10 मोलस्क पूल किए जाते हैं।
  3. अंगों को इकट्ठा करें और तौलें। लगभग 15-20 ग्राम नमूना इष्टतम है। अंगों को आकार में लगभग 0.5-1 सेमी छोटे टुकड़ों में काटने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  4. तरल नाइट्रोजन के साथ विच्छेदित और कटे हुए अंग नमूनों को फ्लैश-फ्रीज करें। फिर, पेस्टल और मोर्टार का उपयोग करके अंग के नमूनों को एक महीन पाउडर में पीस लें।
  5. 1: 2 अनुपात (डब्ल्यू / वी) प्राप्त करने के लिए 30 एमएल ठंडे आसुत पानी (4 डिग्री सेल्सियस) में अंग नमूना पाउडर (लगभग 15 ग्राम) जोड़ें।
  6. उच्च प्रभाव वाले 2 एमएल ट्यूबों में नमूने के 2 एमएल डालें। प्रत्येक ट्यूब में 3 मिमी स्टेनलेस-स्टील मोती (लगभग 500 μg) का एक स्कूपपूर जोड़ें, और 1,200 आरपीएम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ब्लेंडर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके समरूप करें।
  7. सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम पर। गोली को त्यागते हुए, एक ताजा 50 एमएल ट्यूब में पिपेट के साथ सभी सतह पर तैरने वाले पदार्थों को इकट्ठा करें।
  8. 0.22 μm झिल्ली का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें। बर्फ पर नमूने स्टोर करें, और स्पष्टीकरण प्रोटोकॉल (धारा 2) पर आगे बढ़ें, जैसा कि लागू होता है।
    नोट: नमूने तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-जमे हुए हो सकते हैं और कच्चे अर्क के रूप में उपयोग करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।

2. मोलस्क अर्क का स्पष्टीकरण

  1. चरण 1.8 से सुपरनैटेंट नमूने को 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल स्नान में रखें। फिर, नमूनों को 20 मिनट के लिए बर्फ के साथ एक बाल्टी में स्थानांतरित करके जल्दी से ठंडा करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 15,000 × ग्राम पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें। एक ताजा 50 एमएल ट्यूब में सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें, और गोली को छोड़ दें। 0.22 μm झिल्ली फ़िल्टर का उपयोग करके नमूने को फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें, और फिर उन्हें बर्फ पर स्टोर करें।
  3. चरण 1.8 (यानी, कच्चे अर्क) और चरण 2.2 (यानी, स्पष्ट अर्क) से नमूनों में प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें, एक परिमाणीकरण परख (जैसे, बिसिंकोनिक एसिड परख17) का उपयोग करके। इष्टतम प्रोटीन एकाग्रता सीमा 4-8 मिलीग्राम / एमएल है।
  4. नमूनों को बर्फ पर 1 घंटे तक स्टोर करें या तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज करें, और उन्हें आवश्यकता होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. निरोधात्मक गतिविधि परख

  1. कच्चे तेल की निरोधात्मक गतिविधि को मापें और तकनीकी तीन प्रतियों में एंजाइमेटिक परख का उपयोग करके अर्क को स्पष्ट करें।
    नोट: प्रत्येक एंजाइमेटिक परख में एक एंजाइम होता है (उदाहरण के लिए, सब्टिलिसिन ए, जो फंगल विषाणु16,17,18 में शामिल होता है; आमतौर पर क्रोमोजेनिक-आधारित परख के लिए लगभग 1 x 10−9 मोल / एल), एक बफर और एक सब्सट्रेट। प्रतिक्रिया तब शुरू होती है जब सब्सट्रेट एंजाइम का सामना करता है। एंजाइमेटिक गतिविधि उत्पाद में सब्सट्रेट रूपांतरण की दर के समानुपाती है।
  2. एंजाइमेटिक गतिविधि (ईए) पर एंजाइम एकाग्रता (ईसी) के प्रभाव का आकलन करें जब तक कि दोनों मापदंडों के बीच रैखिक निर्भरता प्राप्त न हो। अगले चरणों के लिए, मापा रैखिक सीमा के भीतर एक एंजाइम एकाग्रता का उपयोग करें।
    नोट: पेप्टिडेस सब्टिलिसिन ए के लिए एंजाइमेटिक परख निम्नलिखित चरणों में विस्तृत है।
  3. कच्चे तेल (चरण 1.11) या स्पष्ट (चरण 2.5) मोलस्क प्रोटीन अर्क (उदाहरण के लिए, 4 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन युक्त 10 μL) को 10 μL सब्टिलिसिन ए (चरण 3.2 से निर्धारित एकाग्रता) के साथ इनक्यूबेट करें, और पीएच 8.6 पर 100 mM Tris-HCl का 220 μL (नियंत्रण के लिए, 230 μL ट्राइस बफर जोड़ें) 96-अच्छी तरह से सपाट प्लेट में 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ट्रिस बफर का 230 μL जोड़ें)।
  4. 250 μL की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा के लिए 1 Km (Michaelis-Menten स्थिरांक; सब्टिलिसिन A के साथ इस सब्सट्रेट के लिए 0.2 mM) की अंतिम सांद्रता पर 10 μL N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-नाइट्रोनिलाइड जोड़ें।
  5. 3 मिनट के लिए हर 15 सेकंड में 405 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को पढ़कर समय के साथ उत्पाद की उपस्थिति की निगरानी करके एंजाइमेटिक गतिविधि को मापें।
  6. मोलस्क अर्क की उपस्थिति में एंजाइमैटिक गतिविधि के अनुपात की गणना करके अवशिष्ट एंजाइमेटिक गतिविधि का निर्धारण करें।
  7. यदि निरोधात्मक गतिविधि देखी जाती है (यानी, अवशिष्ट गतिविधि 1 से नीचे), मानक विधियों19 का पालन करते हुए अर्क की सांद्रता की एक श्रृंखला का उपयोग करके निरोधात्मक एकाग्रता50 (आईसी 50) मान को मापें (उदाहरण के लिए, 200 μg / mL से 1 μg / mL तक दोहरी कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला)।

4. सी नियोफोरमैन्स विकास पर मोलस्क अर्क का प्रभाव

  1. 10 μL पिपेट टिप का उपयोग करके खमीर निकालने-पेप्टोन-डेक्सट्रोज (YPD) माध्यम (10 ग्राम / L खमीर निकालने, 20 ग्राम / L पेप्टोन, और 20 ग्राम / L डेक्सट्रोज, पीएच 6.5) के 5 एमएल में सी नियोफोरमैन्स वर ग्रुबी एच 99 वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) की एकल कॉलोनी पेश करने के लिए 10 μL पिपेट टिप का उपयोग करें, और 30 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर 16-18 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। जैविक तीन प्रतियों और तकनीकी डुप्लिकेट में प्रयोग करें।
  2. एक क्यूवेट में संस्कृति के 500 μL एकत्र करें, और 600 nm पर OD पढ़कर विकास को मापें। खमीर नाइट्रोजन बेस (वाईएनबी) माध्यम के साथ संस्कृति को0.02 के अंतिम ओडी 600 में पतला करें।
  3. विभिन्न सांद्रता (उदाहरण के लिए, 440 μg / mL से 15 μg / mL प्रोटीन तक तीन गुना कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला) अर्क (यानी, कच्चा और स्पष्ट) के साथ सह-संस्कृति C. Neoformans कोशिकाएं। ऐसा करने के लिए, 96-वेल प्लेट में पतला सी नियोफॉर्मन्स कल्चर (चरण 4.2) के 190 μL के साथ अर्क के 10 μL मिलाएं।
  4. 200 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए हर 15 मिनट से 1 घंटे में प्लेट रीडर का उपयोग करके ओडी600 को पढ़कर विकास को मापें।

5. सी नियोफोरमैन मेलेनिन उत्पादन पर मोलस्क अर्क का प्रभाव

  1. एल -3,4-डायहाइड्रॉक्सीफेनिलएलनिन (एल-डोपा) प्लेटें तैयार करें।
    1. 14 ग्राम / एल एगर के 230 एमएल को ऑटोक्लेव करें, और इसे 50-60 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने तक ठंडा होने दें।
    2. तरल आगर में 1 एम ग्लाइसिन का 3.25 एमएल, 1 एम केएच2पीओ4 का 7.35 एमएल, 1 एम एमजीएसओ4.7 एच 2 ओ का2.5एमएल, 40% ग्लूकोज का 0.6 एमएल, 10 एमएम थियामिन का 70 लीटर और 100 एमएम एल-डीओपीए (फिल्टर-स्टरलाइज्ड) का 2.5 एमएल जोड़ें।
    3. पेट्री प्लेटों में मिश्रण के 15 एमएल डालें, उन्हें अंधेरे में लगभग 1 घंटे तक सूखने दें, और 1 सप्ताह तक 2-4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सुनिश्चित करें कि आगर को ठीक से सूखने के लिए ढक्कन आंशिक रूप से उठाए गए हैं।
  2. चरण 4.1 से 50 μL C. Neoformans संस्कृति के साथ YNB माध्यम के 5 mL का टीकाकरण करें। 30 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर 16-18 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. कोशिकाओं को 1,000 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए घुमाएं। कोशिकाओं को पीएच 7.4 पर बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 2x धोएं।
  4. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  5. कच्चे और स्पष्ट मोलस्क अर्क की एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला (जैसे, दो गुना) तैयार करें। इसी तरह,96-वेल प्लेटों में बाँझ पीबीएस का उपयोग करके 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल से 1 x 10 1 कोशिकाओं / एमएल तक सी नियोफॉर्मन्स कोशिकाओं (चरण 5.4) की10 गुना कमजोर पड़ने की श्रृंखला तैयार करें।
  6. एक स्वैब का उपयोग करके एल-डोपा एगर युक्त पेट्री प्लेटों पर अर्क के 200 μL फैलाएं, और उन्हें 15 मिनट के लिए सूखने दें।
  7. प्रत्येक कुएं से एल-डोपा प्लेट पर 5 μL संस्कृति को स्पॉट करें, जिससे बूंदों के बीच 1 सेमी छोड़ दिया जाए। इसे 15 मिनट के लिए अंधेरे में सूखने दें।
  8. 3-5 दिनों के लिए एक स्थिर इनक्यूबेटर में 30 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें, कैमरे या प्लेट इमेजर (जैसे, स्कैनर) के साथ हर 24 घंटे में छवियों को कैप्चर करें।
    नोट: मोलस्क अर्क के विकास निरोधात्मक प्रभावों पर तापमान के प्रभाव का पता लगाने के लिए यहां दो तापमान स्थितियों का उपयोग किया जाता है, जिसमें 30 डिग्री सेल्सियस पर्यावरणीय और 37 डिग्री सेल्सियस मानव शारीरिक तापमान का प्रतिनिधित्व करता है।

6. सी नियोफोरमैन पॉलीसेकेराइड कैप्सूल उत्पादन पर मोलस्क अर्क का प्रभाव

  1. नीचे वर्णित के रूप में कम लोहे का माध्यम (एलआईएम) तैयार करें।
    1. अल्ट्राप्योर पानी के 60 एमएल में 5 ग्राम चेलटिंग राल ( सामग्री की तालिका देखें) को घोलें, और एक ग्लास कॉलम (2 सेमी व्यास x 25 सेमी लंबाई) में पैक करें। स्तंभ को 100 एमएल पानी से धोएं, और एकत्रित पानी को छोड़ दें।
    2. चेलेटिंग कॉलम के माध्यम से 2 एल बाँझ अल्ट्राप्योर पानी को पारित करके कम लोहे का पानी (एलआई-पानी) तैयार करें। एलआई-पानी को 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. 100 एमएल एलआई-पानी में 5 ग्राम ग्लूकोज घोलें। एक अलग बीकर में 200 एमएल एलआई-पानी में 5 ग्राम एल-शतावरी घोलें।
    4. निम्नलिखित को 500 एमएल एलआई-पानी के क्रम में जोड़ें: एचईपीईएस का 4.78 ग्राम, के2एचपीओ 4 का0.4 ग्राम, एमजीएसओ4.7 एच2ओ का 0.08 ग्राम, एनएएचसीओ3 का 1.85 ग्राम, और सीएसीएल2.2 एच 2 ओ का 0.25 ग्राम।
    5. चरण 6.1.3 और चरण 6.1.4 से समाधानों को संयोजित करें। 100 mM बाथोफेनथ्रोलिनिसल्फोनिक एसिड सोडियम नमक (BPS) का 1 mL 100 μM की अंतिम सांद्रता में जोड़ें।
    6. 1 एम एलआई-एमओपीएस के साथ पीएच को 7.2 में समायोजित करें। 1 लीटर की अंतिम मात्रा में एलआई-पानी जोड़ें, और इसे 0.22 μm झिल्ली के माध्यम से पारित करके माध्यम को फ़िल्टर करें- निष्फल करें। माध्यम में बाँझ थायमिन (4 मिलीग्राम / एमएल) के 100 μL जोड़ें।
  2. चरण 4.1 से 50 μL C. Neoformans संस्कृति के साथ YNB माध्यम के 5 mL का टीकाकरण करें। 30 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर 16-18 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इस संस्कृति का उपयोग 10 5 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए5 एमएल एलआईएम को टीका लगाने के लिए करें।
  3. वांछित सांद्रता तक पहुंचने के लिए मोलस्क अर्क के उचित वॉल्यूम जोड़ें (उदाहरण के लिए, एक दो गुना कमजोर पड़ने या पिछले विषाणु परख से निर्धारित मात्रा)। ढीली कैप के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर 72 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, 1 एमएल कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और 2x को बाँझ पीबीएस, पीएच 7.4 के साथ 1,500 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए धोएं।
  4. धीरे से पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कोशिकाओं को 1: 1 अनुपात (उदाहरण के लिए, 4 μL सेल सस्पेंशन के साथ भारत इंक का 4 μL) पर भारत स्याही के साथ मिलाएं। स्लाइड के शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखें।
  5. 63x तेल उद्देश्य के साथ एक अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नमूने की कल्पना करें (सामग्री की तालिका देखें)। कंट्रास्ट को स्वचालित पर सेट करें, और माइक्रोस्कोप डायल का उपयोग करके मैन्युअल रूप से ध्यान केंद्रित करें। सभी चित्रों का चयन करें, और उन्हें TIFF स्वरूप में निर्यात करें। कोई फ़िल्टर लागू करने की आवश्यकता नहीं है.
  6. ImageJ20 में शासक उपकरण का उपयोग करते हुए, सेल शरीर के आकार के लिए कुल सेल आकार (कैप्सूल सहित) के अनुपात को निर्धारित करें।

7. सी नियोफोरमैन बायोफिल्म उत्पादन पर मोलस्क अर्क का प्रभाव

  1. चरण 4.1 से 50 μL C. Neoformans संस्कृति के साथ YNB माध्यम के 5 mL का टीकाकरण करें। 30 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर 16-18 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. 5 एमएल संस्कृति से कोशिकाओं की कटाई करें। कोशिकाओं को बाँझ पीबीएस, पीएच 7.4, 1,500 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए धोएं।
  3. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम) के 3 एमएल में कोशिकाओं को 107 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता में पुन: निलंबित किया गया।
  4. सेल निलंबन के 300 μL को बाँझ, पॉलीस्टाइनिन, फ्लैट-बॉटम 24-वेल प्लेट के अलग-अलग कुओं में स्थानांतरित करें। मीडिया के साथ कुओं का उपयोग केवल एक नियंत्रण के रूप में करें।
  5. 10-20 μg / mL प्रोटीन की अंतिम सांद्रता तक पहुंचने के लिए मोलस्क अर्क की उचित मात्रा जोड़ें (उदाहरण के लिए, एक दो गुना कमजोर पड़ने या पिछले विषाणु परख से निर्धारित मात्रा)। सुनिश्चित करें कि अर्क की मात्रा कुल मात्रा के 10% से अधिक नहीं है।
  6. प्लेटों को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें (मीडिया वाष्पीकरण से बचने के लिए), और 30 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक स्थिर इनक्यूबेटर का उपयोग करके 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. एक बोतल या डिस्पेंसर का उपयोग करके कुओं को बाँझ पानी से 2 गुना धोएं, और उन्हें कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए हवा में सूखने दें। फिर, प्रत्येक कुएं (मध्यम-केवल नियंत्रण कुओं सहित) में 0.3% क्रिस्टल बैंगनी घोल का 100 μL जोड़ें, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  8. बाँझ पानी के साथ कुओं को अच्छी तरह से 3 गुना धोएं (धोने के दौरान बायोफिल्म बाधित नहीं होंगे)। 100% इथेनॉल का 200 μL जोड़ें, और RT पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. 75 μL को एक नई 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट में स्थानांतरित करें, औरOD 550 पढ़ें। बायोफिल्म गठन को इस प्रकार निर्धारित करें (ओडी550 एनएम नमूना - ओडी550 एनएम रिक्त)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहां वर्णित वर्कफ़्लो सी नियोफोरमैन के खिलाफ संभावित एंटी-विषाणु गुणों के साथ मोलस्क से प्रोटीन और पेप्टाइड्स के अलगाव को सक्षम बनाता है। इसी तरह, अर्क के विभिन्न रूपों (यानी, कच्चे और स्पष्ट) का आकलन करने से संभावित सक्रिय यौगिकों के अर्ध-शुद्धिकरण की अनुमति मिलती है और डाउनस्ट्रीम मूल्यांकन (जैसे, मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स) का समर्थन करता है। आमतौर पर, प्रोटीन निष्कर्षण वर्कफ़्लो 4-8 मिलीग्राम / एमएल की प्रोटीन सांद्रता के साथ समरूप समाधान पैदा करता है। यहां, प्रतिनिधि परिणाम सी चिनेंसिस अर्क के एंजाइमेटिक गतिविधि और एंटिफंगल गुणों के मूल्यांकन को प्रदर्शित करते हैं। कच्चे और स्पष्ट अर्क सब्टिलिसिन ए ( सी नियोफोरमैन्स में विषाणु से संबंधित) की प्रोटियोलिटिक गतिविधि को रोकने में सक्षम थे (चित्रा 3), क्रमशः 5.3 μg / mL और 4.53 μg / mL के आईसी50 मान के साथ। चिनेंसिस अर्क की गतिविधि को सी नियोफोरमैन्स विषाणु कारक उत्पादन से जुड़ी प्रक्रियाओं के खिलाफ आगे परीक्षण किया गया था, जिसमें फंगल विकास, कैप्सूल और मेलेनिन उत्पादन और बायोफिल्म का गठन शामिल था। कच्चे तेल (चित्रा 4 ए) की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर फंगल विकास में महत्वपूर्ण कमी आई थी और स्पष्ट किया गया (चित्रा 4 बी) सी चिनेंसिस अर्क। विशेष रूप से, कच्चे या स्पष्ट सी चिनेंसिस अर्क (चित्रा 4 सी, डी) की उपस्थिति में कैप्सूल या मेलेनिन उत्पादन में कोई बदलाव नहीं हुआ था। हालांकि, कच्चे तेल की उच्च सांद्रता (चित्रा 4 ई) पर बायोफिल्म निर्माण में 70% -80% की महत्वपूर्ण कमी देखी गई और अनुपचारित नियंत्रण के सापेक्ष स्पष्ट (चित्रा 4 एफ) अर्क को स्पष्ट किया गया।

Figure 1
चित्रा 1: मोलस्क से कुल प्रोटीन निष्कर्षण के लिए वर्कफ़्लो। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: क्रिप्टोकोकस नियोफोरमैन में प्रोटियोलिटिक गतिविधि, विकास और विषाणु कारक उत्पादन पर मोलस्क अर्क के प्रभावों का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली सामान्य रणनीति। डीआईसी = अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी। ऑप्टिकल घनत्व माप नैनोमीटर (एनएम) में तरंग दैर्ध्य के साथ इंगित किया गया है। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सब्टिलिसिन ए की प्रोटियोलिटिक गतिविधि पर मोलस्क प्रोटीन अर्क के प्रभावों के प्रतिनिधि परिणाम। (बी) चिनेंसिस ने अर्क को स्पष्ट किया। प्रत्येक बिंदु तीन प्रतिकृतियों के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। पट्टियाँ मानक विचलन का संकेत देती हैं. आईसी50 = आधा अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सी. नियोफोरमैन्स में विषाणु कारक उत्पादन पर सी. चिनेंसिस अर्क के प्रभावों के प्रतिनिधि परिणाम। (ए, बी) कच्चे और स्पष्ट सी चिनेंसिस अर्क की उपस्थिति में क्रमशः 37 डिग्री सेल्सियस पर सी नियोफॉर्मन्स की वृद्धि। (ग) सी नियोफोरमैन की डीआईसी माइक्रोस्कोपी छवियां कच्चे तेल (50 μg/mL) की उपस्थिति में कैप्सूल उत्पादन को दर्शाती हैं और स्पष्ट (40 μg/mL) अर्क को दर्शाती हैं। स्केल बार = 10 μm. (D) क्रूड (440 μg/mL) की उपस्थिति में C. Neoformans का मेलेनिन उत्पादन और 30 °C और 37 °C पर स्पष्ट (410 μg/mL) अर्क क्रमशः कच्चे और स्पष्ट अर्क की उपस्थिति में C. Neoformans का सापेक्ष बायोफिल्म निर्माण। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण और डंनेट का कई तुलना परीक्षण किया गया था। * पी < 0.05; ** पी < 0.01; और ****p < 0.0001. प्रत्येक मान कम से कम पांच जैविक प्रतिकृतियों और दो तकनीकी प्रतिकृतियों के औसत से मेल खाता है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. दिखाए गए मेलेनिन चित्र तीन जैविक प्रतिकृति और दो तकनीकी प्रतिकृतियों के प्रतिनिधि हैं। दिखाए गए कैप्सूल चित्र प्रति स्थिति 40-50 कोशिकाओं के प्रतिनिधि हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां वर्णित निष्कर्षण प्रोटोकॉल ओन्टारियो, कनाडा से एकत्र किए गए मोलस्क से यौगिकों के अलगाव को रेखांकित करता है, और मानव कवक रोगज़नक़, सी नियोफोरमैन के खिलाफ मोलस्क अर्क का उपयोग करने की एक नई जांच को प्रदर्शित करता है। यह प्रोटोकॉल अकशेरुकी जीवों से पेप्टिडेस अवरोधक गतिविधि की जांच करने वाले अनुसंधानके बढ़ते शरीर को जोड़ता है। निष्कर्षण के दौरान, कुछ अर्क नमूनों को फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करना मुश्किल था, संभवतः घुलनशील पॉलीसेकेराइड और / या पिगमेंट की उपस्थिति के कारण जो फ़िल्टर झिल्ली को बाधित करते थे। इस सीमा को दूर करने के लिए, बड़े यौगिकों (जैसे, बाधित कोशिका झिल्ली, जीनोम डीएनए) को बाहर करने के लिए पहले 5 μm झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करने की सिफारिश की जाती है, इस प्रकार प्रोटीन को फ़िल्टर से गुजरने की अनुमति मिलती है, और फिर 0.22 μm झिल्ली के माध्यम से फिर से फ़िल्टर करने की अनुमति मिलती है। ये कदम प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे रोगाणुओं की उपस्थिति को प्रतिबंधित करते हैं जो नमूनों को दूषित कर सकते हैं और डाउनस्ट्रीम प्रयोगों में हस्तक्षेप कर सकते हैं।

इस जांच के दौरान, सबटिलिसिन के एस 8 परिवार के लिए एक मॉडल एंजाइम सब्टिलिसिन ए के खिलाफ पेप्टिडेस इनहिबिटर का पता लगाया गया था। इस एंजाइम परिवार के सदस्यों को जीवों के बीच व्यापक रूप से वितरित किया जाता है और अलग-अलग भूमिकाएं होती हैं, जैसे कि प्रोटीन प्रसंस्करण, पोषण और विषाणु तंत्र21,22, जो इस अध्ययन में देखे गए फेनोटाइपिक प्रभावों का समर्थन करते हैं। उदाहरण के लिए, कच्चे और स्पष्ट अर्क दोनों की उपस्थिति में और अपेक्षाकृत उच्च और निम्न सांद्रता पर फंगल विकास में एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई, यह सुझाव देते हुए कि परीक्षण किए गए मॉडल में निरोधात्मक गतिविधि मजबूत थी। यह उल्लेखनीय है कि प्लेट रीडर के साथ ओडी को मापते समय, अर्क की उपस्थिति ने कुएं के तल पर फंगल कोशिकाओं के झुरमुट का कारण बना, विकास माप में हस्तक्षेप किया। इस सीमा को उच्च गति वाले हिलाने वाले इनक्यूबेटर (जैसे, 900 आरपीएम) का उपयोग करके दूर किया जा सकता है, जो सेल क्लंपिंग से बचेगा।

अन्य तकनीकी सीमाएं मौजूद हो सकती हैं जो प्रत्याशित फेनोटाइपिक टिप्पणियों को प्रभावित कर सकती हैं। उदाहरण के लिए, सबटिलिसिन जैसे पेप्टिडेस सी नियोफोरमैन में मेलेनिन संश्लेषण और कोरम सेंसिंग से जुड़े होते हैं, लेकिन किसी भी मोलस्क से कच्चे या स्पष्ट अर्क मेलेनिन उत्पादन 16,17,18 पर महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं दिखाते हैं। यह संभवतः बाहरी एजेंटों के खिलाफ मेलेनिन और कैप्सूल के प्राकृतिक सुरक्षात्मक प्रभाव के कारण है, जो मोलस्क अर्क को कवक के इंट्रासेल्युलर घटकों को प्रभावित करने से रोक सकता है। कार्बनिक सब्सट्रेट्स के साथ काम करते समय विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारकों में उन्हें डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में भंग करने की आवश्यकता शामिल है, जो आगर प्लेट के भीतर घुलनशीलता के मुद्दों को पेश कर सकता है (जैसा कि मेलेनिन परख में उपयोग किया जाता है)। इस समस्या को दूर करने के लिए, अर्क को आगर प्लेट की सतह के साथ फैलाया जा सकता है और प्लेट पर फंगल कोशिकाओं को देखने से पहले सूखने की अनुमति दी जा सकती है।

पिछले काम ने विट्रो में दो एंटिफंगल एजेंटों के लिए सी नियोफोरमैन बायोफिल्म की संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया, जिसमें एम्फोटेरिसिन बी और कैस्पोफुंगिन शामिल हैं; हालांकि, कवक फ्लुकोनाज़ोल और वोरिकोनाज़ोल23 के लिए प्रतिरोधी था। विषाणु और रोगाणुरोधी प्रतिरोध में फंगल बायोफिल्म के महत्व को देखते हुए, बायोफिल्म गठन में हस्तक्षेप करने या बाधित करने के लिए नई रणनीतियों को उजागर करना मूल्यवान होगा। वर्तमान अध्ययन में, सी चिनेंसिस से कच्चे और स्पष्ट अर्क ने स्पष्ट खुराक-प्रतिक्रिया व्यवहार के साथ क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के बायोफिल्म के गठन को बाधित किया। ये परिणाम दृष्टिकोण के प्रभाव और नवीनता का समर्थन करते हैं। विशेष रूप से, स्पष्ट अर्क की तुलना में कच्चे तेल के साथ उपचार पर बायोफिल्म गठन को अधिक हद तक रोक दिया गया था, जो स्पष्टीकरण प्रक्रिया के दौरान निरोधात्मक यौगिकों के नुकसान या परीक्षण की गई स्थितियों के तहत निरोधात्मक कार्य में कमी के कारण हो सकता है। यह संभव है कि इन निरोधात्मक प्रभावों के लिए जिम्मेदार प्रोटीन उच्च आणविक भार के हैं और स्पष्टीकरण प्रक्रिया के दौरान खो गए थे या थर्मल उपचार के दौरान गिरावट के लिए अतिसंवेदनशील थे। ये परिणाम निरोधात्मक कार्यों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए कच्चे और स्पष्ट अर्क दोनों का उपयोग करने के महत्व को उजागर करते हैं, क्योंकि अवरोधक स्रोत से संबंधित अंतर परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं।

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल मोलस्क से यौगिकों के निष्कर्षण और फंगल विषाणु में प्रदर्शित भूमिकाओं के साथ एक चयनित पेप्टिडेस के खिलाफ कथित निरोधात्मक गतिविधि के माप को सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में, अर्क की उच्च उपज और मजबूत पेप्टिडेस निरोधात्मक गतिविधि और सी नियोफोरमैन्स विकास और बायोफिल्म गठन के खिलाफ उनके प्रभाव का मूल्यांकन किया गया था। जबकि आगे के प्रयोगों की आवश्यकता है, ये परिणाम इस खतरनाक फंगल रोगज़नक़ के खिलाफ यौगिकों के कथित नए स्रोतों के रूप में मोलस्क के महत्व पर जोर देते हैं। इसके अलावा, जबकि यह प्रोटोकॉल मोलस्क से अवरोधकों के निष्कर्षण पर केंद्रित है, कार्यप्रणाली अन्य अकशेरुकी जीवों के लिए अनुकूलनीय है और इसका उपयोग कवक और बैक्टीरिया सहित विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मजीवों में विषाणु कारक उत्पादन पर विभिन्न अकशेरुकी जीवों से प्राप्त अवरोधकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। . अंततः, प्राकृतिक स्रोतों से यौगिकों का निष्कर्षण कथित उपन्यास रोगाणुरोधी एजेंटों के प्रदर्शनों की सूची में वृद्धि कर सकता है और इस प्रकार, संक्रामक रोगों का मुकाबला करने के लिए हमारी क्षमताओं में सुधार कर सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक इस जांच और उनकी पांडुलिपि प्रतिक्रिया के दौरान उनके मूल्यवान समर्थन के लिए गेडेस-मैकएलिस्टर लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। लेखक ओंटारियो ग्रेजुएट स्कॉलरशिप और इंटरनेशनल ग्रेजुएट रिसर्च अवार्ड - गुएल्फ विश्वविद्यालय से डीजी-जी और कैनेडियन फाउंडेशन ऑफ इनोवेशन (जेईएलएफ 38798) और ओंटारियो मिनिस्ट्री ऑफ कॉलेज एंड यूनिवर्सिटीज - जेजी-एम के लिए प्रारंभिक शोधकर्ता पुरस्कार से वित्त पोषण समर्थन को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm Filters VWR 28145-477 (North America)
1.5 mL Tubes (Safe-Lock) Eppendorf 0030120086
2 mL Tubes (Safe-Lock) Eppendorf 0030120094
3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) Sigma-Aldrich D9628-5G CAS #: 59-92-7
96-well plates Costar (Corning) 3370
Bullet Blender Storm 24 NEXT ADVANCE BBY24M
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428000010
Chelex 100 Resin BioRad 142-1253
CO2 Incubator (Static) SANYO Not available
Cryptococcus neoformans H99 ATCC 208821
DIC Microscope Olympus
DIC Microscope software Zeiss
DMEM Corning 10-013-CV
Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) BioShop GLU501 CAS #: 50-99-7
Glycine Fisher Chemical G46-1 CAS #: 56-40-6
GraphPad Prism 9 Dotmatics
Hemocytometer VWR 15170-208
HEPES Sigma Aldrich H3375
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) Honeywell M1880-500G CAS #: 10034-99-8 
Peptone BioShop PEP403
Phosohate buffer salt pH 7.4 BioShop PBS408 SKU: PBS408.500
Plate reader (Synergy-H1) BioTek (Agilent) Not available
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Chemical P285-500 CAS #: 7778-77-0
Subtilisin A Sigma-Aldrich P4860 CAS #: 9014-01-01
Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide Sigma-Aldrich 573462 CAS #: 70967-97-4
Thermal bath VWR 76308-834
Thiamine Hydrochloride Fisher-Bioreagents BP892-100 CAS #: 67-03-8
Yeast extract BioShop YEX401 CAS #: 8013-01-2
Yeast nitrogen base (with Amino Acids) Sigma-Aldrich Y1250-250G YNB 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
  2. Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
  3. Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
  4. Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
  5. Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
  6. Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
  7. Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
  8. Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
  9. Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
  10. Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
  11. Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
  12. Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
  13. González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
  14. Brown, D. S. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. Werger, M. J. A. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. 1153-1180 (1978).
  15. Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
  16. Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
  17. Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
  18. Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
  19. Copeland, R. A. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2013).
  20. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  21. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
  22. Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
  23. Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
  24. Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
  25. Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
  26. Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).

Tags

जीव विज्ञान अंक 190 एंटिफंगल प्रतिरोध एंटी-विषाणु फंगल रोगजनन पेप्टिडेस पेप्टिडेस इनहिबिटर मोलस्क
मोलस्क से कच्चे और स्पष्ट अर्क के कथित एंटीक्रिप्टोकोकल गुणों का आकलन करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gutierrez-Gongora, D.,… More

Gutierrez-Gongora, D., Raouf-Alkadhimi, F., Prosser, R. S., Geddes-McAlister, J. Assessing the Putative Anticryptococcal Properties of Crude and Clarified Extracts from Mollusks. J. Vis. Exp. (190), e64540, doi:10.3791/64540 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter