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Genetics

माइक्रो-सी-एक्सएल के साथ स्तनधारी 3 डी जीनोम इंटरैक्शन का मानचित्रण

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/64579
Automatic Translation
1, 1, 1
1Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, University of Copenhagen

Summary

जीनोम-वाइड क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर विधि माइक्रो-सी-एक्सएल का उपयोग करके न्यूक्लियोसोम रिज़ॉल्यूशन के साथ त्रि-आयामी जीनोम संगठन के मानचित्रण के लिए एक प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

तीन-आयामी (3 डी) गुणसूत्र संगठन जीनोम विनियमन और सेल-प्रकार विनिर्देश में एक प्रमुख कारक है। उदाहरण के लिए, सीआईएस-नियामक तत्व, जिन्हें एन्हांसर के रूप में जाना जाता है, को 3 डी स्पेस में बातचीत के माध्यम से डिस्टल प्रमोटरों की गतिविधि को विनियमित करने के लिए माना जाता है। जीनोम-वाइड क्रोमोसोम अनुरूपण कैप्चर (3 सी) -प्रौद्योगिकियों, जैसे कि हाई-सी, ने कोशिकाओं में जीनोम कैसे व्यवस्थित होते हैं, इसकी हमारी समझ को बदल दिया है। 3 डी जीनोम संगठन की वर्तमान समझ उस संकल्प से सीमित है जिसके साथ 3 डी अंतरिक्ष में गुणसूत्रों के टोपोलॉजिकल संगठन को हल किया जा सकता है। माइक्रो-सी-एक्सएल क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर प्रोटोकॉल के दौरान जीनोम को टुकड़े करने के लिए माइक्रोकोकल न्यूक्लियस (एमनेज) का उपयोग करके क्रोमैटिन की मूल इकाई न्यूक्लियोसोम के स्तर पर रिज़ॉल्यूशन के साथ क्रोमोसोम फोल्डिंग को मापता है। इसके परिणामस्वरूप माप में एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है, इस प्रकार अन्य जीनोम-वाइड 3 डी प्रौद्योगिकियों की तुलना में इन्सुलेशन साइटों और क्रोमोसोम लूप का बेहतर पता लगाने की सुविधा मिलती है। स्तनधारी कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता वाले माइक्रो-सी-एक्सएल नमूने तैयार करने के लिए एक नेत्रहीन समर्थित, विस्तृत, चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल इस लेख में प्रस्तुत किया गया है।

Introduction

माइक्रो-सी-एक्सएल न्यूक्लियोसोम रिज़ॉल्यूशन के साथ 3 डी जीनोम रचना को मापने के लिए एक जीनोम-वाइड तकनीक है। माइक्रो-सी-एक्सएल व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली निकटता बंधाव-आधारित हाई-सी तकनीक पर आधारित है, जिसने हमारी समझ को बदल दिया है कि 3 डी जीनोमकैसे व्यवस्थित किए जाते हैं। माइक्रो-सी-एक्सएल और इसकी पहली पुनरावृत्ति, माइक्रो-सी, शुरू में सैकरोमाइसेस सेरेविसिया2,3 में विकसित की गई थी और बाद में स्तनधारी सेल सिस्टम के लिए अनुकूलित की गई थी, जिसके लिए प्रोटोकॉल ने 3 डी जीनोम की छोटी दूरी की विशेषताओं का पता लगाने में अपनी पूरी क्षमता का प्रदर्शन किया है, जैसे कि क्रोमोसोम लूप और इन्सुलेशन साइटें। यह संस्करण हाल ही में स्तनधारी माइक्रो-सी-एक्सएल प्रकाशनों 4,5 पर आधारित है। चूंकि माइक्रो-सी-एक्सएल माइक्रो-सी की जगह लेता है, इसलिए माइक्रो-सी-एक्सएल को पांडुलिपि में माइक्रो-सी के रूप में संदर्भित किया जाता है।

माइक्रो-सी और हाई-सी6 के बीच प्रमुख अंतर इस प्रकार हैं: 1) प्रतिबंध एंजाइमों की तुलना में माइक्रोकोकल न्यूक्लियस (एमनेस) के साथ जीनोम विखंडन और 2) केवल फॉर्मलाडेहाइड की तुलना में प्रतिक्रियाशील समूहों के बीच बड़े परमाणु अंतर के साथ अतिरिक्त क्रॉसलिंकर। दोनों कदम पारंपरिक हाई-सी की तुलना में माइक्रो-सी के बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात में महत्वपूर्ण योगदान देते हैं। विखंडन आकार उस संकल्प को सीमित करता है जिसके लिए 3 डी जीनोम संगठन को निकटता बंधाव प्रोटोकॉल के दौरान हल किया जा सकता है। MNase एक न्यूक्लियस है जो अधिमानतः सुलभ डीएनए को पचाता है और न्यूक्लियोसोमल-संरक्षित डीएनए को बरकरार रखता है। MNase-अनुक्रमण का उपयोग करके न्यूक्लियोसोम पदचिह्न से पता चला है कि न्यूक्लियोसोम पूरी तरह से अधिकांश यूकेरियोटिक जीनोम7 को कवर करते हैं। चूंकि न्यूक्लियोसोम को प्रजातियों और सेल प्रकार के आधार पर 160-220 बीपी की औसत दूरी के साथ पूरे जीनोम में वितरित किया जाता है, इसलिए एमनेस जीनोम आर्किटेक्चर के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मैपिंग के लिए आदर्श एंजाइम है।

माइक्रो-सी विधि में फॉर्मलाडेहाइड (एफए) के साथ संयोजन में एक अतिरिक्त क्रॉसलिंकर का उपयोग सिग्नल-टू-शोर अनुपात 2,8 में भी सुधार करता है। प्रतिक्रियाशील समूहों के बीच लंबे परमाणु स्पेसर के साथ अमाइन-विशिष्ट क्रॉसलिंकर प्रोटीन-प्रोटीन क्रॉसलिंक की सुविधा प्रदान करते हैं। ये आमतौर पर क्रमशः 7.7 ° और 16.1 A स्पेसर के साथ डाइसुसिनिमिडिल ग्लूटारेट (DSG) या एथिलीन ग्लाइकॉल बिस-सक्सिनिमिडिल सक्सिनेट (ईजीएस) होते हैं। ईजीएस या डीएसजी के माध्यम से शोर की कमी विशेष रूप से उच्च विखंडन दर वाले प्रयोगों में स्पष्ट है, जैसे कि माइक्रो-सी, और संभवतः यादृच्छिक बंधावघटनाओं की दर में कमी के कारण होता है।

डीएसजी क्रॉसलिंकिंग और प्रतिबंध एंजाइमों के कई संयोजनों का उपयोग करने वाला हाल ही में विकसित हाई-सी 3.0 प्रोटोकॉल हाई-सी प्रयोगों में शोर को कम करता है और क्रोमोसोम लूप और इन्सुलेशन साइटों 8,9 का पता लगाने में काफी सुधार करता है। फिर भी, विभिन्न इंटरैक्शन डेटा सुविधाओं की साइट-दर-साइट तुलना में पाया गया कि माइक्रो-सी में हाई-सी 3.0 और पारंपरिक हाई-सी8 दोनों की तुलना में क्रोमोसोम लूप और इन्सुलेशन साइटों जैसी छोटी दूरी की विशेषताओं का बेहतर पता लगाया गया था। हालांकि, हाई-सी 3.0 छोटी दूरी की विशेषताओं का पता लगाने में सुधार करता है और पारंपरिक हाई-सी की तुलना में जीनोम कंपार्टमेंटलाइजेशन की मजबूत पहचान बनाए रखता है। सारांश में, क्रोमोसोम रचना कैप्चर विधि की पसंद उद्देश्य और जैविक प्रश्न द्वारा निर्धारित की जानी चाहिए।

यहां, हम सफल माइक्रो-सी प्रयोगों के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो 3 डी जीनोम संगठन को उजागर कर सकता है।

Protocol

1. सेल संस्कृति और क्रॉसलिंकिंग

  1. प्रयोगात्मक के अनुसार कल्चर कोशिकाओं को न्यूनतम 1 x 107 कोशिकाओं को प्राप्त करने की आवश्यकता होती है। यहां, कोशिकाओं को ई 14 माध्यम में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया था (पाइरूवेट और एल-ग्लूटामाइन के साथ डीएमईएम, 15% एफबीएस, 1 एक्स एलआईएफ, 1 एक्स एनईएए, 1% पेन-स्ट्रेप, 0.1 एमएम β-मर्कैप्टोइथेनॉल [ सामग्री की तालिका देखें]) और हर दूसरे दिन पारित किया गया।
    नोट: यह प्रोटोकॉल कई प्रजातियों के विभिन्न सेल प्रकारों पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है, जैसे कि होमो सेपियन्सऔर मस मस्कुलस। इस उदाहरण में, माउस भ्रूण स्टेम (ईएस) कोशिकाओं का उपयोग किया गया था।
  2. माध्यम को घुमाकर कोशिकाओं को 70% -80% स्थिरता पर काट लें। डीपीबीएस के 5 एमएल के साथ एक बार धो लें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट के लिए 3 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड 0.25% ट्रिप्सिन प्रति 10 सेमी डिश के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. प्रीवार्म्ड ई 14 माध्यम के 7 एमएल के साथ ट्रिप्सिन को बुझाएं और अलग कोशिकाओं को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली दें। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और माध्यम में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट प्रोटोकॉल सेल सांद्रता में कुछ भिन्नता के लिए मजबूत है, और सेल संख्याओं को निर्धारित करने के लिए विभिन्न सेल काउंटरों का उपयोग किया गया है; हालांकि, उपयोग किए गए सेल काउंटर की गतिशील सीमा से अवगत रहें। यह आमतौर पर 1 x 105-1 x 107 कोशिकाओं / एमएल के बीच होता है। जबकि इस सेल प्रकार के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन गति और अवधि का परीक्षण किया गया है, विभिन्न, छोटी कोशिकाओं को उच्च सेंट्रीफ्यूजेशन गति या लंबे समय तक स्पिन समय की आवश्यकता हो सकती है, और सेंट्रीफ्यूजेशन को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
  5. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर डीपीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। उदाहरण के लिए, यदि उपज 1 x 107 कोशिकाएं हैं, तो डीपीबीएस के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  6. पहले क्रॉसलिंकिंग चरण के लिए, सेल निलंबन में 1% की अंतिम एकाग्रता में 37% फॉर्मलाडेहाइड (एफए) जोड़ें, और रोटेशन (15-20 आरपीएम) के साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें; एक उदाहरण के रूप में, यदि उपज 1 x 107 कोशिकाएं हैं, तो 10 एमएल सेल निलंबन में एफए के 270 μL जोड़ें।
    नोट: एफए समाधान आमतौर पर खोलने के बाद 3 महीने तक आरटी पर स्थिर होता है।
  7. 0.25 मीटर की अंतिम एकाग्रता में 2.5 एम ग्लाइसिन जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाएं और रोटेशन (15-20 आरपीएम) के साथ आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। उदाहरण के लिए, यदि उपज 1 x 107 कोशिकाएं हैं, तो सेल निलंबन में 2.5 एम ग्लाइसिन के 1.027 एमएल जोड़ें।
  8. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और DPBS के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को एक बार दोहराएं और डीपीबीएस में पेलेट कोशिकाओं को 4 x 106 कोशिकाओं / एमएल में फिर से निलंबित करें। उदाहरण के लिए, यदि उपज 1 x 107 कोशिकाएं हैं, तो डीपीबीएस के 2.5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  9. दूसरे क्रॉसलिंकिंग चरण के लिए, डीएमएसओ में एथिलीन ग्लाइकॉल बिस-सक्सिनिमिडिल सक्सिनेट (ईजीएस) का 0.3 एम स्टॉक समाधान तैयार करें (डीएमएसओ के 100 μL में ईजीएस का 13.6 मिलीग्राम)। सेल निलंबन में 3 एमएम की अंतिम एकाग्रता पर ईजीएस जोड़ें, और रोटेशन (15-20 आरपीएम) के साथ 40 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। उदाहरण के लिए, यदि उपज 1 x 107 सेल है, तो सेल निलंबन के 2.5 एमएल में 0.3 एम ईजीएस स्टॉक समाधान के 25 μL जोड़ें।
    नोट: स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए वजन करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए ईजीएस को आरटी से मिलाएं।
  10. 0.4 एम की अंतिम एकाग्रता में 2.5 एम ग्लाइसिन जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाएं, और रोटेशन (15-20 आरपीएम) के साथ आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। उदाहरण के लिए, यदि उपज 1 x 107 कोशिकाएं हैं, तो सेल निलंबन में 2.5 एम ग्लाइसिन के 400 μL जोड़ें।
  11. आरटी पर 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और डीपीबीएस में पेलेट कोशिकाओं को 5 x 106 कोशिकाओं / एमएल में पुन: निलंबित करें। प्रीपैरेटिव लाइब्रेरी के लिए 5 x 10 6 सेल / ट्यूब और एमनेस पाचन के लिए अनुमापन के लिए 1 x 106 सेल / ट्यूब वितरित करें।
    नोट: प्रत्येक क्रॉस-लिंक्ड सेल बैच के लिए इष्टतम पाचन डिग्री को टाइट करने का सुझाव दिया जाता है। आदर्श रूप से, MNase अनुमापन प्रयोगों (चरण 2) के लिए 1 x 10 6 कोशिकाओं के दो से तीन एलिकोट और प्रारंभिक प्रयोगों (चरण 3) के लिए 5 x 106 कोशिकाओं के दो से चार एलिकोट एकत्र करें।
  12. आरटी पर 5 मिनट के लिए 1,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। तरल नाइट्रोजन में सेल छर्रों को स्नैप-फ्रीज करें, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: सफल माइक्रो-सी पुस्तकालय 3 महीने तक संग्रहीत नमूनों से तैयार किया जा सकता है।

2. एमनेस अनुमापन

नोट: डबल-क्रॉसलिंक्ड कोशिकाओं की प्रारंभिक लाइब्रेरी को संसाधित करने से पहले MNase की इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए MNase अनुमापन करना आवश्यक है।

  1. MNase अनुमापन करने के लिए, 10 मिनट के लिए बर्फ पर 1 x 106 कोशिकाओं की एक गोली पिघलाएं और DPBS के 500 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (यदि कोशिकाएं दीवार से चिपक जाती हैं तो 1x BSA जोड़ें)। 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें।
  2. आरटी पर 5 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। एमबी # 1 बफर के 500 μL में पेलेट कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2,0.2% NP-40, 1x प्रोटीज अवरोधक [सामग्री की तालिका देखें], pH 7.4)।
  3. 5 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। एमबी # 1 बफर के 200 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और नमूने को चार ट्यूबों में विभाजित करें।
  4. MNase (20 U/μL) की एक शीशी को पिघलाएं, और 1:2, 1:4, 1:4, और 1:4 की श्रृंखला में 10 mM Tris, pH 7.4 के साथ पतला करें ताकि क्रमशः 10 U/μL, 2.5 U/μL, 0.625 U/μL, और 0.1256 U/μL (प्रत्येक पाचन स्थिति के लिए एक) की सांद्रता प्राप्त की जा सके। उचित समय अंतराल (10-20 सेकंड) के साथ, चार नमूनों, भंवर में से एक में 1 μL MNase समाधान जोड़ें, और 10 मिनट (800 rpm झटकों) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोमिक्सर पर इनक्यूबेट करें। शेष सेल एलिकोट में शेष MNase तनुकरण से 1 μL जोड़ने के साथ जारी रखें।
  5. प्रत्येक ट्यूब में 200 μL ताजा तैयार STOP बफर (10 mM Tris का 150 μL, pH 7.4, 10% SDS का 25 μL, 20 mg/mL प्रोटीनेज K, 0.5 M EGTA का 2 μL) जोड़कर Mnase पाचन को रोकें। 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. प्रत्येक नमूने में फिनोल-क्लोरोफॉर्म-आइसोमाइल अल्कोहल (पीसीआई) के 500 μL जोड़ें, और भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। चरणों को अलग करने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए 19,800 x g पर सेंट्रीफ्यूज, और जलीय चरण को नए ट्यूबों (लगभग 200 μL / नमूना) में स्थानांतरित करें।
    चेतावनी: पीसीआई में कई जहरीले घटक होते हैं और इसे केवल रासायनिक सुरक्षा हुड में संभाला जाना चाहिए। अधिक जानकारी के लिए निर्माता से परामर्श करें।
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक डीएनए शुद्धिकरण किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें और नमूने को 12 μL क्षालन बफर में रखें।
    नोट: डीप्रोटीनाइजेशन चरण (चरण 2.5) से एसडीएस एकाग्रता कुछ डीएनए शुद्धिकरण किट के लिए निरोधात्मक है। यहां उपयोग की जाने वाली डीएनए शुद्धि करण किट इथेनॉल वर्षा की तुलना में प्रदर्शन करती है।
  8. लोडिंग डाई के 2-5 μL जोड़ें, और नमूने को 30-50 मिनट के लिए 120 V पर 1.5% Agarose जेल पर चलाएं (जब तक ठीक से अलग न हो जाए; चित्रा 1 ए)।
  9. प्रयोग के लिए पाचन की सबसे अच्छी डिग्री चुनें, और प्रारंभिक एमनेस पाचन के साथ जारी रखें। एक इष्टतम पाचन डिग्री बिना किसी सबन्यूक्लियोसोमल टुकड़े और 70% -90% मोनो- टू डाइ-न्यूक्लियोसोम अनुपात प्रदर्शित करती है।
    नोट: इस प्रयोग में, चित्रा 1 ए में लेन 4 की पाचन डिग्री को 2.5 x 10 5 कोशिकाओं के लिए 0.625-1.25 यू मेनेस के साथ प्राप्त इष्टतम पाचन के रूप में निर्धारित किया गया था (= 1 x 106 कोशिकाओं के लिए एमएनेज का 2.5-5 यू)। विस्तृत चर्चा के लिए, प्रतिनिधि परिणाम देखें.

3. प्रीपैरेटिव एमनेस पाचन

  1. MNase पाचन के माध्यम से क्रोमैटिन को मोनो-न्यूक्लियोसोम में विभाजित करने के लिए, पहले डबल क्रॉस-लिंक्ड 5 x 106 सेल एलिकोट को पिघलाएं, और डीपीबीएस के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें। 20 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें (यदि कोशिकाएं ट्यूब की दीवार से चिपक जाती हैं तो 1x बीएसए जोड़ें)।
  2. आरटी पर 5 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें। एमबी # 1 बफर के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को एक बार दोहराएं। एमबी # 1 बफर के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें, और 200 μL एलिकोट (1 x 106 सेल प्रति एलिकोट) बनाएं।
  3. MNase अनुमापन (चरण 2 में वर्णित) के आधार पर, प्रत्येक एलिकोट में MNase (आमतौर पर 2.5-10 U / μL प्रति 1 x 106 कोशिकाओं) की उचित मात्रा जोड़कर क्रोमैटिन को पचाएं। अच्छी तरह से मिलाएं (भंवर और जल्दी से स्पिन), और 800 आरपीएम झटकों के साथ 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोमिक्सर पर इनक्यूबेट करें।
  4. प्रत्येक एलिकोट में 0.5 एम ईजीटीए (अंतिम 4 एमएम) के 1.6 μL जोड़कर MNase पाचन को रोकें, और 800 आरपीएम झटकों के साथ 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोमिक्सर पर इनक्यूबेट करें।
  5. आरटी पर 5 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा नमूना एकत्र करें, और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें। सेल गोली को 1x NEBuffer 2.1 के 500 μL में पुन: निलंबित करें।
  6. आगे की प्रक्रिया के लिए 5 x 106 कोशिकाओं या उससे कम के इनपुट के बराबर पूल नमूने।
    नोट: यदि 5 x 10 6 कोशिकाओं से अधिक संसाधित किया जाना है, तो इन नमूनों को समानांतर में संसाधित करें, क्योंकि एंजाइमेटिक स्थितियों को 5 x 106 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है।
  7. निकटता बंधाव चरणों पर आगे बढ़ने से पहले, MNase पाचन स्तर को नियंत्रित करने के लिए इनपुट नियंत्रण के रूप में नमूने का 10% स्थानांतरित करें। इस नमूने में 10 mM Tris के 150 μL, pH 7.4, 10% SDS के 25 μL, और 20 mg/mL प्रोटीनेस K के 25 μL जोड़ें, और 65 °C पर रात भर इनक्यूबेट करें।

4. डीएनए एंड प्रोसेसिंग और प्रॉक्सिमिटी लिगेशन

  1. शेष नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र करें, और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें। ताजा तैयार माइक्रो-सी मास्टर मिक्स 1 (तालिका 1) के 90 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, और 800 आरपीएम झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए थर्मोमिक्सर पर इनक्यूबेट करें।
  2. 5 U/μL क्लेनो टुकड़े के 10 μL जोड़ें, और 800 आरपीएम झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए थर्मोमिक्सर पर इनक्यूबेट करें।
  3. ताजा तैयार माइक्रो-सी मास्टर मिक्स 2 (तालिका 2) के 100 μL जोड़ें, और 800 आरपीएम झटकों के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए थर्मोमिक्सर पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, 30 एमएम की अंतिम एकाग्रता में ईडीटीए जोड़कर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को बुझाएं। 800 आरपीएम झटकों के साथ 65 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए थर्मोमिक्सर पर इनक्यूबेट करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा नमूना एकत्र करें, और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें। ताजा तैयार माइक्रो-सी मास्टर मिक्स 3 (तालिका 3) के 500 μL में नमूने को फिर से निलंबित करें, और रोटेशन (15-20 आरपीएम) के साथ आरटी पर 2.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा नमूना एकत्र करें, और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें। ताजा तैयार माइक्रो-सी मास्टर मिक्स 4 (तालिका 4) के 200 μL में नमूने को फिर से निलंबित करें, और 800 आरपीएम झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए थर्मोमिक्सर पर इनक्यूबेट करें।
  6. रिवर्स क्रॉसलिंकिंग और डीप्रोटीनेशन के लिए, नमूने में 20 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन के 25 μL और 10% एसडीएस के 25 μL जोड़ें, और आंतरायिक मिश्रण के साथ रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

5. डि-न्यूक्लियोसोमल डीएनए शुद्धि और आकार चयन

  1. नमूने और इनपुट नियंत्रण में पीसीआई के 500 μL जोड़ें, और भंवर द्वारा मिलाएं। 5 मिनट के लिए 19,800 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा चरणों को अलग करें, और ऊपरी जलीय चरण को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. डीएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके या इथेनॉल वर्षा द्वारा डीएनए को केंद्रित करें। नमूने को 30 μL (चरण 5.3) और इनपुट नियंत्रण (चरण 3.11) में 15 μL में मिलाएं, और मोनो-न्यूक्लियोसोम और डाइ-न्यूक्लियोसोम (चित्रा 1 बी) को अलग करने के लिए 1.5% एगारोस जेल चलाएं।
    नोट: डीप्रोटीनाइजेशन चरण से एसडीएस एकाग्रता कुछ डीएनए शुद्धिकरण किट के लिए निरोधात्मक है। यहां उपयोग की जाने वाली डीएनए शुद्धिकरण किट ( सामग्री की तालिका देखें) इथेनॉल वर्षा की तुलना में प्रदर्शन करती है। उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या के आधार पर, इनपुट 100 एनजी से 10 μg तक हो सकता है। आमतौर पर, 5 x 106 कोशिकाओं से 1-5 μg DNA निकाला जाता है।
  3. डीएनए के टुकड़ों का उत्पादन करें जिनमें डाइ-न्यूक्लियोसोमल आकार (लगभग 300 बीपी) होता है। एगारोस जेल से डीएनए निकालने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए जेल क्षालन किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें, और 150 μL में इल्यूट करें।

6. स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों की तैयारी

  1. एक प्रतिक्रिया ट्यूब में प्रति नमूना स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों ( सामग्री की तालिका देखें) के 10 μL स्थानांतरित करें।
  2. इसे 1.5 एमएल ट्यूबों के लिए एक उपयुक्त चुंबक में रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। घोल साफ होने के बाद (1-2 मिनट), सतह पर तैरने वाला पदार्थ हटा दें, और प्रति नमूने 1x TBW (5 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% ट्वीन 20) के 300 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें। इस चरण को एक बार दोहराएं।
  3. चरण 7 में संसाधित प्रति नमूना 2x B&W बफर (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) के 150 μL में मोतियों को पुन: निलंबित करें।

7. स्ट्रेप्टाविडिन पुल-डाउन और ऑन-बीड लाइब्रेरी तैयारी

  1. नमूने के 150 μL (चरण 5.3) में पूर्व-तैयार मोतियों (चरण 6.3) के 150 μL जोड़ें। रोटेशन (15-20 आरपीएम) के साथ आरटी पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. ट्यूबों को एक उपयुक्त चुंबक में रखें, और समाधान के साफ होने तक प्रतीक्षा करें (1-2 मिनट)। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 1x TBW के 300 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें। इस चरण को दोहराएं।
  3. ट्यूबों को एक उपयुक्त चुंबक में रखें और समाधान के साफ होने तक प्रतीक्षा करें (1-2 मिनट)। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 0.1x TE (1 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) के 100 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  4. ट्यूबों को एक उपयुक्त चुंबक में रखें और समाधान के साफ होने तक प्रतीक्षा करें (1-2 मिनट)। सतह पर तैरने वाले को हटा दें, 0.1x TE के 50 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें, और उन्हें पीसीआर ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    नोट: उपयोग किए गए 0.1x TE की मात्रा (50 μL) इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले डीएनए अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी किट ( सामग्री की तालिका देखें) के इनपुट वॉल्यूम से मेल खाती है। यदि एक अलग किट या रणनीति का उपयोग किया जाता है, तो तदनुसार मात्रा समायोजित करें।
  5. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी किट के डीएनए हेरफेर चरणों का पालन करें। इन चरणों में आमतौर पर डीएनए ब्लंटिंग, ए-टेलिंग, एडाप्टर लिगेशन और यू एक्सिशन शामिल हैं। अंतिम चरण (यू एक्सिशन) इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली किट के लिए विशिष्ट है। यदि उस किट का उपयोग कर रहे हैं, तो गैर-पतला एडाप्टर का उपयोग करके किट प्रोटोकॉल में चरण 1 से चरण 2.6 तक निर्माता के निर्देशों का पालन करें, और चरण 2.6 के बाद -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण पर विचार न करें।
    नोट: अनुक्रमण किट द्वारा आवश्यक बफर परिवर्तनों को मोतियों को चुंबक और धोने (चरण 7.3 से 7.4) से बांधकर आदान-प्रदान किया जाना चाहिए, क्योंकि डीएनए अभी भी स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों से बंधा हुआ है। इसके अतिरिक्त, क्योंकि डीएनए चुंबकीय मोतियों से बंधा होता है, किट प्रोटोकॉल से एडाप्टर लिगेशन के बाद किसी भी शुद्धिकरण और आकार चयन चरणों को अनदेखा करें। चरण 7.6 (यह प्रोटोकॉल) जारी रखें।
  6. एडाप्टर बंधाव पूरा होने के बाद, चरण 7.2 में वर्णित के रूप में नमूना धो लें। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और 0.1x TE के 20 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें।

8. आवश्यक पीसीआर चक्रों का अनुमान

नोट: पुस्तकालय प्रवर्धन के लिए आवश्यक पीसीआर चक्रों का अनुमान लगाना उचित है। आमतौर पर, एक माइक्रो-सी लाइब्रेरी को पीसीआर के 8-15 चक्रों की आवश्यकता होती है। हालांकि यह कदम आवश्यक नहीं है, यह अति-प्रवर्धन से बचने में मदद करता है और पीसीआर डुप्लिकेट के जोखिम को कम करता है।

  1. आवश्यक पीसीआर चक्रों की न्यूनतम संख्या को परिभाषित करने के लिए, स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन-डीएनए नमूने (चरण 7.6) के 1 μL के साथ पीसीआर करें। ऐसा करने के लिए, नमूने में पीसीआर मास्टर मिश्रण (एच 2 ओ का3.2μL, i5 प्राइमर का 0.4 μL, i7 प्राइमर का 0.4 μL, और Q5 उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का 5 μL) जोड़ें। उपयोग की जाने वाली डीएनए लाइब्रेरी तैयारी किट के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार 16 चक्रों के साथ पीसीआर करें।
    नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों को एक अलग किट ( सामग्री की तालिका देखें) में खरीदा जाता है जिसे उपयोग की जाने वाली लाइब्रेरी तैयारी किट के साथ संगत होने की आवश्यकता होती है।
  2. पीसीआर के बाद, एक उपयुक्त चुंबक के साथ मोतियों को इकट्ठा करें, और एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए परिमाणीकरण उपकरण का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाले के 1 μL की डीएनए एकाग्रता को मापें (सामग्री की तालिका देखें)। कुल डीएनए एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, इस मान को 10 (पीसीआर प्रतिक्रिया की कुल मात्रा) से गुणा करें। प्रतिनिधि परिणामों में चर्चा के अनुसार पीसीआर चक्रों की आवश्यक संख्या का अनुमान लगाएं।
  3. पीसीआर मिश्रण के शेष 9 μL में 6x लोडिंग बफर के 2 μL जोड़ें। सफल एडाप्टर लिगेशन निर्धारित करने के लिए 1% एगारोस जेल पर पीसीआर प्रवर्धित लाइब्रेरी को हल करें, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 450 बीपी आकार (चित्रा 1 सी) है।
    नोट: जेल को लगभग 420 बीपी (माइक्रो-सी लाइब्रेरी प्लस एडेप्टर) का एक अलग बैंड दिखाना चाहिए। 120 बीपी के बैंड एडाप्टर डिमर का प्रतिनिधित्व करते हैं और कम जटिलता वाले पुस्तकालयों का संकेत देते हैं। कम आणविक भार के बैंड दिखाई दे सकते हैं (100 बीपी से कम), और ये पीसीआर प्रतिक्रिया से अप्रयुक्त प्राइमर हैं।

9. अनुक्रमण पुस्तकालय प्रवर्धन

  1. स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन-डीएनए नमूने के शेष 19 μL में पीसीआर मास्टर मिश्रण (एच2ओ का 65 μL, Q5 उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का 100 μL, i5 प्राइमर का 8 μL, i7 प्राइमर का 8 μL) जोड़ें। प्रतिक्रिया मिश्रण को 50-100 μL एलिकोट में विभाजित करें।
    नोट: पीसीआर के लिए इष्टतम मात्रा पीसीआर मशीन पर निर्भर करती है; आमतौर पर, 50 μL सामान्य पीसीआर मशीनों में सबसे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रवर्धन प्रदान करता है।
  2. चरण 8 में निर्धारित चक्रों की संख्या के साथ डीएनए लाइब्रेरी तैयारी किट के निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर करें। यदि चरण 8 को छोड़ दिया गया था, तो पीसीआर के लिए 14 चक्रों की सिफारिश की जाती है।
  3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 1: 0.9 के अनुपात में पैरामैग्नेटिक मोतियों ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ डीएनए को शुद्ध करें। 0.1% टीई के 20 μL में इल्यूट।
    नोट: यदि चरण 8.5 में एडाप्टर डिमर का पता चला है, तो समान अनुपात का उपयोग करके दो बार शुद्धिकरण करें।
  4. डीएनए एकाग्रता निर्धारित करें और नमूने को गुणवत्ता नियंत्रण प्रणाली पर चलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। एकल सटीक बैंड (चित्रा 1 डी) की उपस्थिति से माइक्रो-सी लाइब्रेरी की अच्छी गुणवत्ता सुनिश्चित करें।
    नोट: पीसीआर से पहले नमूना धोने के कारण ऑन-बीड लाइब्रेरी की तैयारी में एडाप्टर डिमर असामान्य हैं। इस प्रकार, एडाप्टर डिमर की उपस्थिति कम पुस्तकालय जटिलता को इंगित करती है। यदि एडाप्टर डिमर देखे जाते हैं, तो कम इनपुट अनुक्रमण के साथ नमूने को गुणवत्ता नियंत्रित करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।

10. डीएनए अनुक्रमण और डेटा प्रोसेसिंग

  1. अनुक्रमण प्रदाता की आवश्यकताओं के अनुसार युग्मित-अंत अनुक्रमण के साथ माइक्रो-सी लाइब्रेरी को अनुक्रमित करें।
    नोट: आदर्श रूप से, नमूने 50 बीपी प्रति रीड के साथ युग्मित-अंत मोड में एक मंच पर अनुक्रमित किए जाते हैं। पुराने प्लेटफ़ॉर्म जो कम पढ़ने की लंबाई प्रदान करते हैं, जैसे कि 2 x 35 बीपी, का भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, यदि दोहराए जाने वाले जीनोमिक क्षेत्रों का अध्ययन किया जाता है, तो लंबी पढ़ने की लंबाई के साथ अनुक्रम करना उचित हो सकता है।
  2. माइक्रो-सी लाइब्रेरी की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, प्रति नमूना 5 x 106 से 1 x 107 रीड के साथ कम इनपुट अनुक्रमण करें।
  3. डिस्टिलर10 के साथ अनुक्रमण फ़ाइलों (फास्टक्यू फाइलों) को संसाधित करें। उचित संदर्भ जीनोम के खिलाफ पढ़ने को मैप करें, यहां मिमी 10।
    नोट: अनुक्रमण फ़ाइलों को स्थानीय कंप्यूटर या कंप्यूटिंग क्लस्टर पर विभिन्न पाइपलाइनों का उपयोग करके संसाधित किया जा सकता है। कम अनुक्रमण गहराई वाले नमूनों के लिए, बड़े बिन आकार, जैसे 10,000 बीपी, 50,000 बीपी, 100,000 बीपी, और 500,000 बीपी, कंप्यूटिंग मांगों और फ़ाइल आकार को कम कर सकते हैं। डिस्टिलर (इस अध्ययन में उपयोग किया जाता है) माइक्रो-सी लाइब्रेरी की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए सभी आवश्यक फ़ाइल प्रकार उत्पन्न करता है। जेनरेट की गई *.stats फ़ाइल में मैप दर, सीआईएस-ट्रांस अनुपात और रीड ओरिएंटेशन पर जानकारी होती है जो पढ़े गए जोड़े के बीच की दूरी से स्तरीकृत होती है। इन मापदंडों को चित्रा 2 में देखा गया है, और प्रतिनिधि परिणामों में माइक्रो-सी लाइब्रेरी की गुणवत्ता के मूल्यांकन पर चर्चा की गई है। प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर एमकूल फाइलें भी उत्पन्न करता है जिन्हें इंटरैक्शन मैट्रिसेस9 उत्पन्न करने के लिए सीधे हाईग्लास (https://docs.higlass.io/) में लोड किया जा सकता है।

Representative Results

माइक्रो-सी पुस्तकालयों की सफल तैयारी का मूल्यांकन प्रोटोकॉल के कई चरणों में किया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण कदम एक उचित MNase पाचन डिग्री का विकल्प है। इसलिए, एमनेस एकाग्रता को हर नमूने के लिए डाइ-न्यूक्लियोसोम पर लगातार 70% -90% मोनो-न्यूक्लियोसोम उत्पन्न करने के लिए टाइट किया जाना चाहिए। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि क्रोमैटिन पाचन यूरोपीय संघ और हेटेरो-क्रोमैटिन के लिए अलग है, जिसमें एमनेस हेटेरोक्रोमैटिन को कम कुशलता से पचाता है। इस प्रकार, इष्टतम पाचन की डिग्री रुचि के क्रोमैटिन क्षेत्र और अध्ययन किए गए सेल प्रकार पर निर्भर करती है क्योंकि ईयू- और हेटेरो-क्रोमैटिन का सापेक्ष अनुपात सेल प्रकार-विशिष्ट है। इसलिए, यह सलाह दी जाती है कि आवश्यक MNase एकाग्रता को सावधानीपूर्वक संशोधित करें और पहले कम-इनपुट अनुक्रमण द्वारा माइक्रो-सी प्रयोग की सफलता का मूल्यांकन करें।

MNase की घटती मात्रा के साथ इलाज किए गए क्रोमैटिन का एक विशिष्ट MNase अनुमापन पैटर्न चित्रा 1 A में दिखाया गया है। यहां, प्रति प्रतिक्रिया 250,000 कोशिकाओं से क्रोमैटिन को MNase के चार गुना कमजोर पड़ने के साथ पचाया जाता है। उच्चतम सांद्रता (MNase, लेन 2 के 10 U) लगभग विशेष रूप से मोनो-न्यूक्लियोसोमल डीएनए (~ 150 बीपी) से युक्त अधिक पचने वाले क्रोमैटिन को दर्शाता है। विशेष रूप से, मोनो-न्यूक्लियोसोमल बैंड का केंद्र कम एमनेस सांद्रता वाले नमूनों में संबंधित बैंड की तुलना में एगारोस जेल में कम चलता है, जो न्यूक्लियोसोमल डीएनए के अति-पाचन का संकेत देता है। अति-पचने वाले न्यूक्लियोसोम को निकटता बंधाव प्रतिक्रिया में अकुशल रूप से लिगेट किया जाता है; इसलिए, लेन 2 में नमूना माइक्रो-सी प्रयोगों के लिए उप-मानक है। लेन 3 (MNase का 2.5 U) माइक्रो-सी प्रयोगों के लिए लगभग उपयुक्त पाचन डिग्री प्रदर्शित करता है। यहां, मोनो-न्यूक्लियोसोमल बैंड प्रमुख प्रजाति है, और सबन्यूक्लियोसोमल स्मीयर, जो अधिक पचने वाले न्यूक्लियोसोम का संकेत है, कम हो जाता है; हालाँकि, यह अभी भी मौजूद है। लेन 4 में पाचन की डिग्री (MNase का 0.635 U) इस अनुमापन उदाहरण में माइक्रो-सी प्रयोग के लिए एक आदर्श स्थिति है। उप-न्यूक्लियोसोमल डीएनए के बिना एक स्पष्ट मोनो-न्यूक्लियोसोमल बैंड मौजूद है। मोनो- और डाई-न्यूक्लियोसोम डीएनए के लिए बैंड तीव्रता लगभग बराबर है, जो 66% या उससे अधिक की मोनो-न्यूक्लियोसोम उपज का संकेत देती है। यह ध्यान देने योग्य है कि डि-न्यूक्लियोसोमल डीएनए मोनो-न्यूक्लियोसोमल डीएनए (~ 320 बीपी बनाम ~ 150 बीपी) के आकार का लगभग दोगुना है, इसलिए डीएनए के प्रति मोल इसकी बैंड तीव्रता अपने मोनो-न्यूक्लियोसोमल समकक्ष की तुलना में दोगुनी है। लेन 5 में पाचन की डिग्री (MNase का 0.156 U) लगभग कोई न्यूक्लियोसोमल डीएनए के साथ कम पचने वाले क्रोमैटिन को दर्शाता है, और इसलिए, यह एक उप-मानक नमूने का प्रतिनिधित्व करता है।

अंत में, इस उदाहरण में, 0.625 यू एमनेस के साथ 2.5 x 10 5 माउस ईएस कोशिकाओं का पाचन (200 μL में 1 x 106 कोशिकाओं के लिए MNase के2.5 U के अनुरूप) माइक्रो-सी प्रयोगों में प्रारंभिक पाचन के लिए सबसे आशाजनक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है। हालांकि, लेन 3 और लेन 4 में नमूनों के लिए उपयोग की जाने वाली स्थितियों के बीच एक मध्यवर्ती MNase एकाग्रता (200 μL में 1 x 106 कोशिकाओं के लिए MNase के 5 U के अनुरूप) पर भी विचार किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, MNase के साथ क्रोमैटिन पाचन को रैखिक रूप से स्केल नहीं किया जा सकता है, और यह 4x से अधिक प्रारंभिक पाचन को बढ़ाने की सिफारिश नहीं की जाती है। 1 x 10 6 कोशिकाओं से माइक्रो-सी पुस्तकालयों को तैयार करने के लिए, क्रोमैटिन को 1 x 106 कोशिकाओं के एलिकोट में पचाने और MNase निष्क्रियता के बाद उन्हें पूल करने की सलाह दी जाती है।

निकटता बंधाव प्रोटोकॉल की सफलता का आकलन करने के लिए, इनपुट नियंत्रण, जो MNase-पचा हुआ है और निकटता लिगेट (चरण 3.8) नहीं है, की तुलना 1.5% अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 1B) द्वारा निकटता-लिगेटेड नमूने (चरण 5.3) से की जानी चाहिए। निकटता-लिगेटेड मोनो-न्यूक्लियोसोम बैंड का अनुमानित आकार 300 बीपी है, जो डाई-न्यूक्लियोसोम के समान है। इसलिए, मोनो- से डाई-न्यूक्लियोसोमल बैंड सिग्नल अनुपात को मुख्य रूप से मोनो-न्यूक्लियोसोम (लेन 1) से डाय-न्यूक्लियोसोम (लेन 3 और लेन 4) की ओर स्थानांतरित करना चाहिए। चूंकि इस चरण में अगारोस जेल डाई-न्यूक्लियोसोमल डीएनए है जिसे उत्पाद और शुद्ध किया जाता है, इसलिए ओवरलोडिंग से बचने के लिए नमूनों को कई लेन में विभाजित करने की सलाह दी जाती है।

न्यूनतम पीसीआर द्वारा तैयार अनुक्रमण पुस्तकालय की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करने की सिफारिश की जाती है। यहां, 1 μL मोतियों (कुल नमूने का 1/20) से डीएनए को पीसीआर प्रतिक्रिया के 10 μL में 16 चक्रों के लिए प्रवर्धित किया जाता है। न्यूनतम पीसीआर लाइब्रेरी की कुल एकाग्रता आमतौर पर 16 पीसीआर चक्रों के बाद 50-500 एनजी तक होती है। सिद्धांत रूप में, यह शेष 19 μL नमूने से 1-10 μg लाइब्रेरी से मेल खाती है यदि इसे 16 चक्रों के लिए भी प्रवर्धित किया गया था। कुल डीएनए से लगभग 100 एनजी की लाइब्रेरी उत्पन्न करने के लिए आवश्यक पीसीआर चक्रों की न्यूनतम संख्या का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। पीसीआर में लघुगणकीय प्रवर्धन मानते हुए, 16 चक्रों में 19 μL इनपुट से प्राप्त डीएनए की सैद्धांतिक एकाग्रता को 100 ng लाइब्रेरी उत्पन्न करने के लिए आवश्यक पीसीआर चक्रों की संख्या की गणना करने के लिए क्रमिक रूप से दो से विभाजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 16 चक्रों के बाद 1 μL से 100 ng उपज 19 μL से प्रवर्धित 1,900 ng उपज से मेल खाती है। इस परिदृश्य में, 12 चक्रों को आदर्श रूप से कुल डीएनए (1,900 एनजी / [2 × 2 × 2 × 2] = 118 एनजी) से 118 एनजी अनुक्रमण पुस्तकालय उत्पन्न करना चाहिए। न्यूनतम पीसीआर से शेष 9 μL नमूना तब Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 1 C) द्वारा पुस्तकालय की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विज़ुअलाइज़ेशन को 420 बीपी पर एक अलग बैंड दिखाना चाहिए और एडाप्टर डिमर (120 बीपी) के लिए कोई बैंड नहीं दिखाना चाहिए। छोटे टुकड़े भी दिखाई दे सकते हैं, और ये अप्रयुक्त पीसीआर प्राइमरों के अनुरूप हैं।

इसके बाद, संसाधन-गहन गहन अनुक्रमण के लिए प्रतिबद्ध होने से पहले कम-इनपुट अनुक्रमण द्वारा सफल माइक्रो-सी नमूना तैयारी का विश्लेषण और पुष्टि करने की सिफारिश की जाती है। आमतौर पर, पुस्तकालयों को 5 x 106 से 1 x 107 की पढ़ने की गहराई तक अनुक्रमित किया जाता है और निम्नलिखित मानदंडों के आधार पर मूल्यांकन किया जाता है: अनुक्रमण पठन दोहराव दर, सीआईएस- बनाम ट्रांस-क्रोमोसोमल इंटरैक्शन दर, और अनुक्रमण पठन अभिविन्यास आवृत्ति। माइक्रो-सी पुस्तकालयों को डिस्टिलर, एक पूर्ण-सेवा पाइपलाइन के साथ संसाधित किया जाता है, जो कूलर, पेयरटूल्स और कूलटूल्स10,11,12 का उपयोग करके अनुक्रमण पठन फ़ाइलों (फास्टक्यू प्रारूप) से रीड-पेयर फाइलों (बेडपे प्रारूप) और स्केलेबल इंटरैक्शन मैट्रिसेस (कूल और एमकूल प्रारूपों) तक डेटा को संसाधित करता है। पाइपलाइन एक सारांश फ़ाइल भी उत्पन्न करती है जो माइक्रो-सी पुस्तकालयों10 (https://github.com/open2c/distiller-nf) की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए आदर्श है। पीसीआर दोहराव दर अनुक्रमण लाइब्रेरी जटिलता पर जानकारी प्रदान करती है और उत्पन्न *.stats फ़ाइल से निकाली जा सकती है। उच्च गुणवत्ता वाले माइक्रो-सी पुस्तकालयों में 5 मिलियन या अधिक कोशिकाओं से उत्पन्न होने पर 5% -10% पीसीआर दोहराव दर से कम होती है। विशेष रूप से, कुछ अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म अनुक्रमण लाइब्रेरी जटिलता से स्वतंत्र क्लस्टर गठन के दौरान पीसीआर डुप्लिकेट उत्पन्न करते हैं। चित्रा 2 ए दो प्रयोगों की सापेक्ष दोहराव दर दिखाता है: एक जिसे हम एक अच्छा नमूना और एक बुरा नमूना मानते हैं। इस उदाहरण में, दोनों नमूने स्वीकार्य मानचित्र दरों को प्रदर्शित करते हैं। माइक्रो-सी पुस्तकालयों की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए अगला मानदंड सीआईएस बनाम ट्रांस अनुपात और पठन अभिविन्यास आवृत्तियों है। नाभिक के भीतर, गुणसूत्र अलग-अलग गुणसूत्र क्षेत्रों में निवास करते हैं और इस प्रकार, शायद ही कभी अन्य गुणसूत्रों के साथ बातचीत करते हैं। पता लगाए गए ट्रांस-क्रोमोसोमल इंटरैक्शन की एक उच्च दर यादृच्छिक बंधाव की उच्च दर को इंगित करती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विश्लेषण के इस स्तर पर, खराब नमूने ने अच्छे नमूने (चित्रा 2 बी) की तुलना में ट्रांस-क्रोमोसोमल इंटरैक्शन की उच्च दर दिखाई। माइक्रो-सी के लिए, 70% या उच्च सीआईएस-क्रोमोसोमल इंटरैक्शन दर वांछनीय है।

एक माइक्रो-सी लाइब्रेरी में डाई-न्यूक्लियोसोमल डीएनए बैंड के समान एक टुकड़ा आकार होता है, जो निकटता लिगेटेड नमूने के साथ सह-शुद्ध कर सकता है और प्रयोग को दूषित कर सकता है। ये दूषित हमेशा सीआईएस-क्रोमोसोमल इंटरैक्शन होते हैं। इसलिए, पढ़ने के अभिविन्यास दरों का मूल्यांकन करना भी महत्वपूर्ण है। कम इनपुट अनुक्रमण द्वारा डाई-न्यूक्लियोसोमल संदूषण की दर का अनुमान लगाया जा सकता है। डि-न्यूक्लियोसोमल डीएनए दो पड़ोसी न्यूक्लियोसोम से उपजा है जिन्हें एमनेस द्वारा नहीं छोड़ा गया है। इस प्रकार, परिणामी अनुक्रमण हमेशा एक फॉरवर्ड-रिवर्स रीड ओरिएंटेशन (एफ और आर) प्रदर्शित करेगा, और पढ़ने वाले जोड़े के बीच की दूरी लगभग 320 बीपी होगी। इसकी तुलना में, निकटता-लिगेटेड टुकड़ों को चार झुकावों में विभाजित किया जा सकता है, जो एफ-आर, आर-आर, आर-एफ और एफ-एफ के साथ पठन-जोड़े उत्पन्न करते हैं, आदर्श रूप से समान प्रचुरता के साथ (चित्रा 2 सी)। इसके अलावा, वे दो पढ़ने वाले जोड़े के बीच विभिन्न दूरी प्रदर्शित करते हैं। डि-न्यूक्लियोसोमल दूषित पदार्थों की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए, पढ़ने के झुकाव की आवृत्ति की गणना डिस्टिलर (चित्रा 2 डी) द्वारा उत्पन्न * आँकड़े फाइलों से की जा सकती है। विशेष रूप से, इस काम में, अच्छे नमूने की तुलना में खराब नमूने में एफ-आर रीड्स (लाल) का अंश अधिक था, और यह तब अधिक स्पष्ट हो गया जब पढ़ने के झुकाव को दूरी से स्तरीकृत किया गया (चित्रा 2 ई)। एफ-आर अंश में माइक्रो-सी पुस्तकालयों की तुलना में डाई-न्यूक्लियोसोमल टुकड़ों का वर्चस्व होता है जब पढ़ने वाले जोड़े को <562 बीपी या ≥562 बीपी की दूरी के साथ पढ़ने में स्तरीकृत किया जाता है। यहां, दूरी <562 बीपी के साथ पढ़ने का अंश एफ-आर रीड पर हावी है, जबकि दूरी ≥562 बीपी वाला अंश चार संभावित झुकावों के बीच एक समान वितरण प्रदर्शित करता है, यह दर्शाता है कि एफ-आर रीड का वैश्विक अति-प्रतिनिधित्व डि-न्यूक्लियोसोमल संदूषकों से उपजा है। सबसेटिंग के लिए सीमा के रूप में 562 बीपी का विकल्प उत्पन्न * आँकड़े फ़ाइल में बिनिंग द्वारा परिभाषित किया गया है। हालांकि इस गुणवत्ता नियंत्रण के लिए आवश्यक नहीं है, * जोड़े फ़ाइल से दूरी निकालकर अधिक परिभाषित सबसेटिंग प्राप्त की जा सकती है, जो डिस्टिलर द्वारा भी उत्पन्न होती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि डि-न्यूक्लियोसोमल रीड माइक्रो-सी नमूने की गुणवत्ता को कम नहीं करते हैं क्योंकि उन्हें डेटा प्रोसेसिंग के दौरान पहचाना और अनदेखा किया जा सकता है। हालांकि, उनमें 3 डी इंटरैक्शन के बारे में मूल्यवान जानकारी नहीं है, और वे सूचनात्मक पढ़ने को पतला करते हैं।

इस प्रकार, कम इनपुट अनुक्रमण के साथ सावधानीपूर्वक MNase अनुमापन और पूरी तरह से गुणवत्ता नियंत्रण माइक्रो-सी प्रयोगों की गुणवत्ता को अनुकूलित करने के लिए सबसे अच्छे उपकरण हैं।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रो-सी प्रोटोकॉल के मध्यवर्ती चरण । (ए) क्रोमैटिन के अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन 2.5 x 105 माउस ईएस कोशिकाओं से अलग-अलग एमनेस सांद्रता के साथ पचता है। मोनो-, डि-और ट्राई-न्यूक्लियोसोमल बैंड को तीर द्वारा इंगित किया जाता है। एम: डीएनए सीढ़ी (लेन 1/6); प्रति 250,000 कोशिकाओं (लेन 2) में 10 यू एमनेस है; प्रति 250,000 कोशिकाओं में 2.5 यू एमनेस (लेन 3); प्रति 250,000 कोशिकाओं (लेन 4) में MNase के 0.625 U; प्रति 250,000 कोशिकाओं (लेन 2) में MNase के 0.156 U। (बी) माइक्रो-सी तैयार नमूनों (लेन 3 और लेन 4) और एमनेस डाइजेस्टेड इनपुट कंट्रोल (लेन 1) के 1.0% अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन लेन 1 और लेन 2 (एम: डीएनए सीढ़ी) को मोनो- टू डाइ-न्यूक्लियोसोमल टुकड़े की तीव्रता में सापेक्ष परिवर्तन पर जोर देने के लिए बढ़ाया गया है। मोनो- और डी-न्यूक्लियोसोमल बैंड तीर द्वारा इंगित किए जाते हैं। निकटता-लिगेटेड नमूने में डाई-न्यूक्लियोसोमल बैंड डाई-न्यूक्लियोसोमल और माइक्रो-सी लाइब्रेरी डीएनए को जोड़ता है। (सी) माइक्रो-सी अनुक्रमण पुस्तकालयों के 1.0% एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन को गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए 1 μL नमूने से प्रवर्धित किया गया। लेन 1 (एम): डीएनए सीढ़ी; लेन 2 (एस): मिर्को-सी लाइब्रेरी। (डी) अंतिम माइक्रो-सी लाइब्रेरी का टुकड़ा विश्लेषक ट्रेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक अच्छे नमूने और एक बुरे नमूने के कम-इनपुट अनुक्रमण के लिए नमूना आंकड़े । (ए) मैप किए गए प्रतिशत (हरे) और अनमैप (लाल) का बार ग्राफ पढ़ता है। (बी) सीआईएस और ट्रांस-क्रोमोसोमल इंटरैक्शन मैपिंग का सामान्यीकृत अंश। डेटा सेट को सीआईएस-मैपिंग रीड के लिए सामान्यीकृत किया गया था। सीआईएस-मैपिंग रीडिंग को युग्मित-अंत अनुक्रमित नमूनों के पहले और दूसरे रीडिंग के बीच की दूरी से स्तरीकृत किया गया था: ≤1 केबीपी (पीला), >1 केबीपी और ≤10 केबीपी (नारंगी), और >10 केबीपी (लाल)। (सी) डि-न्यूक्लियोसोमल आकार के साथ संभावित आणविक प्रजातियों का योजनाबद्ध। (डी) अच्छे नमूने और बुरे नमूने के सभी पठनों के पठन-जोड़ी उन्मुखता का प्रतिशत। (ई) पैनल (डी) के समान लेकिन दूरी (बाएं, <562 बीपी और दाएं, ≥562 बीपी) द्वारा स्तरीकृत है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

घटक 1x 4.4x
10x NEBuffer 2.1, 10 μL 44 μL
2 μL 100 mM एटीपी 2 μL 8.8 μL
100 mM DTT 5 μL 22 μL
H2O 68 μL 299.2 μL
10 U/μL T4 PNK 5 μL 22 μL
कुल 90 μL 396 μL

तालिका 1: माइक्रो-सी मास्टर मिक्स 1. अंतिम चबाने की प्रतिक्रिया के लिए मास्टर मिश्रण की संरचना।

घटक 1x 4.4x
1 mM Biotin-dATP 10 μL 44 μL
1 mM Biotin-dCTP 10 μL 44 μL
डीटीटीपी और डीजीटीपी का 10 एमएम मिश्रण 1 μL 4.4 μL
10x T4 डीएनए लिगेज बफर 5 μL 22 μL
200x BSA 0.25 μL 1.1 μL
H2O 23.75 μL 104.5 μL

तालिका 2: माइक्रो-सी मास्टर मिक्स 2। अंतिम लेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए मास्टर मिश्रण की संरचना।

घटक 1x 4.4x
10x NEB T4 लिगेज प्रतिक्रिया बफर 50 μL 220 μL
H2O 422,5 μL 1859 μL
टी 4 डीएनए लिगेस। 25 μL 110μL

तालिका 3: माइक्रो-सी मास्टर मिक्स 3. निकटता बंधाव प्रतिक्रिया के लिए मास्टर मिश्रण की संरचना।

घटक 1x 4.4x
10x NEBuffer 1.1 20 μL 88 μL
H2O 180 μL 792 μL
एक्सोIII न्यूक्लियस 10 μL 44 μL

तालिका 4: माइक्रो-सी मास्टर मिक्स 4. बायोटिन हटाने की प्रतिक्रिया के लिए मास्टर मिश्रण की संरचना।

Discussion

माइक्रो-सी प्रयोग की सफलता प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरणों पर निर्भर करती है जिन्हें सावधानीपूर्वक निष्पादित करने की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, अतिरिक्त क्रॉसलिंकर डीएसजी या ईजीएस के साथ क्रॉसलिंकिंग सेल प्रकार के आधार पर कोशिकाओं के एकत्रीकरण का कारण बन सकती है। क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया में 0.1% -0.5% बीएसए जोड़ने से क्रॉसलिंकिंग दक्षता को प्रभावित किए बिना एकत्रीकरण काफी कम हो जाता है। अक्षम क्रॉसलिंकिंग के परिणामस्वरूप ट्रांस-क्रोमोसोमल इंटरैक्शन की दर बढ़ सकती है जो यादृच्छिक बंधाव का संकेत है। इस प्रोटोकॉल में दूसरा, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण, कदम MNase के साथ क्रोमैटिन का पाचन है। सबऑप्टिमल क्रोमैटिन पाचन अक्षम निकटता बंधाव (अति-पाचन) या गैर-निकटता-लिगेटेड डि-न्यूक्लियोसोम (अंडर-पाचन) की बढ़ी हुई दरों की ओर जाता है। लिगेशन प्रतिक्रिया की दक्षता का मूल्यांकन एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 1 बी) द्वारा किया जा सकता है और कम इनपुट अनुक्रमण द्वारा भी इसका सबसे अच्छा अनुमान लगाया जाता है। यदि कम-इनपुट अनुक्रमण से या तो उच्च दोहराव दर (अक्षम बंधाव) या बढ़ी हुई डी-न्यूक्लियोसोम दरों का पता चलता है, तो MNase पाचन डिग्री का पुनर्मूल्यांकन किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल निष्पादित करते समय नमूने के नुकसान से लाइब्रेरी जटिलता कम हो सकती है। डीएनए शुद्धिकरण (चरण 5.3) या न्यूनतम पीसीआर (चरण 8) के बाद एक नमूने की एकाग्रता का सबसे अच्छा मूल्यांकन किया जाता है। डीएनए शुद्धिकरण के बाद 5 x 106 स्तनधारी कोशिकाओं से डीएनए की कुल उपज आमतौर पर >2 μg होती है। MNase पाचन, ExoIII पाचन और डीएनए शुद्धिकरण के बाद डीएनए एकाग्रता को नियंत्रित किया जाना चाहिए। अंतर्जात न्यूक्लियस, जिनमें से बहुतायत सेल प्रकार-विशिष्ट और प्रजाति-विशिष्ट है, डीएनए क्षरण का स्रोत हो सकता है। इसके अलावा, स्तंभ-आधारित डीएनए शुद्धिकरण से डीप्रोटीनेशन प्रतिक्रियाओं से एसडीएस के साथ असंगति के कारण नमूना हानि हो सकती है। इथेनॉल वर्षा पर विचार किया जा सकता है यदि इस चरण में डीएनए एकाग्रता कम है।

चूंकि माइक्रो-सी को नमूना-विशिष्ट एमनेस अनुमापन की आवश्यकता होती है, इसलिए माइक्रो-सी को छोटे सेल आबादी पर लागू करना चुनौतीपूर्ण है, जैसे कि विभिन्न मॉडल जीवों, भ्रूण और एकल कोशिकाओं, ऑर्गेनोइड्स या रोगी बायोप्सी के छोटे अंगों के साथ। यहां, हाई-सी 3.0 अनुक्रम-विशिष्ट प्रतिबंध एंडोन्यूक्लियस 8,9 द्वारा समापन बिंदु प्रतिक्रिया का उपयोग करके एक अच्छी तरह से स्थापित विकल्प प्रदान करता है।

माइक्रो-सी एक उच्च गतिशील सीमा और कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ एक व्यापक रूप से लागू उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रोमोसोम रचना तकनीक है, जो इसे क्रोमोसोम लूप जैसे छोटी दूरी के गुणसूत्र विशेषताओं 4,5,8 की जांच के लिए विशेष रूप से उपयुक्त बनाता है। माइक्रो-सी का रिज़ॉल्यूशन प्रमोटर-एन्हांसर लूप को कैप्चर करने की अनुमति देता है, जो हाई-सी की पहचान सीमा से परे हैं, कुशलतापूर्वक जीनोम संगठन और विनियमन13,14,15 के बीच संबंधों के अधिक विस्तृत विश्लेषण को सक्षम करते हैं। इसके अलावा, डीएनए कैप्चर रणनीतियों को हाल ही में माइक्रो-सी के साथ जोड़ा गया है ताकि लक्षित जीनोमिक लोकी के लोक-विशिष्ट रिज़ॉल्यूशन को अभूतपूर्व स्तर तक बढ़ाया जा सके, जिससे 3 डी जीनोम16,17,18 की अल्ट्रास्ट्रक्चर में नई अंतर्दृष्टि का पता चलता है। सारांश में, हम कल्पना करते हैं कि माइक्रो-सी और इसके डेरिवेट ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन में 3 डी जीनोम की भूमिका को विच्छेदित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक होगी और परिणामस्वरूप, सेल प्रकार भेदभाव और रखरखाव।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए क्रिस्टल गौबिट्ज़ और कैथलीन स्टीवर्ट-मॉर्गन को धन्यवाद देते हैं। हम अपनी प्रयोगशाला की स्थापना में उनके समर्थन के लिए अंजा ग्रोथ और ग्रोथ लैब को धन्यवाद देते हैं। हम समर्थन के लिए सीपीआर / रिन्यू जीनोमिक्स प्लेटफॉर्म के कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं: एच वोलमैन, एम मिचौट और ए कल्विसा। स्टेम सेल मेडिसिन के लिए नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन सेंटर (reNEW) नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन अनुदान संख्या NNF21CC0073729 द्वारा समर्थित है। नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन सेंटर फॉर प्रोटीन रिसर्च (सीपीआर) नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन अनुदान संख्या NNF14CC0001 द्वारा समर्थित है। हम माउस ईएस कोशिकाओं के लिए नोवो नॉर्डिस्क सेंटर फॉर स्टेम सेल मेडिसिन, रीन्यू कोपेनहेगन में ब्रिकमैन लैब को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mM Biotin dATP Jenna Bioscience  NU-835-Bio14-S
1 mM Biotin dCTP Jenna Bioscience NU-809-BioX-S
10 mM dGTP NEB N0442S
10 mM dTTP  NEB N0443S
10 U/ml T4 PNK NEB M0201L
100 U/L Exonuclease III NEB M0206L
10x NEBuffer 1.1 NEB B7001S
10x NEBuffer 2.1 NEB B7202S
10x T4 DNA Ligase buffer  NEB B0202A
1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ ThermoFisher  14190144
1x LIF
2_Mercaptoethanol 50 mM  Gibco 31350010 0.1 mM b-mercaptoethanol 
37% Formaldehyde  Sigma Aldrich 252549-500ML Caution. See manufactures MSDS
400 U/ml T4 DNA Ligase  NEB M0202L
5 U/ml Klenow Fragment NEB M0210L
Agarose BIO-RAD 1613102 Caution. See manufactures MSDS
BSA 20mg/ml NEB B9000S
CaCl2
cell counter
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D8418-100ML Caution. See manufactures MSDS
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65001
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes
DynaMag-PCR Magnet Invitrogen 492025 refered to as: magnet magnet for PCR tubes
EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 Invitrogen 15575-038
EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 BioWorld 40121266-1
Ethanol 96%  VWR Chemicals 20824365 quality control system 
Ethidium Bromide  Invitrogen 15585-011
Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) ThermoFisher 21565
Fetl Bovin Serum Sigma Aldrich F7524 15% FBS
Gel Loading dye purple (6X) NEB B7024S
Glycine  PanReac AppliChem A1067.0500
Halt Proteinase inhibitor (100x) ThermoFisher 78430 Caution. See manufactures MSDS
IGEPAL CA-630 (NP-40) Sigma Aldrich 18896-50ML
MgCl 1 M Invitrogen AM9530G
Micrococcal Nuclease (MNase) Worthington LS004798
mouse embryonic stem cells 
NaCl Sigma Aldrich S9888-1KG
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) NEB E7600S amplification primers for sequencing libraries
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina NEB E7645L sequencing library preparation kit 
NEBNext Ultra II Q5 Master mix  NEB M0544S Caution. See manufactures MSDS
Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050 1x NEAA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 1% Pen-Strep
Proteinase K (40 mg/ml) GoldBio P-480-1 Caution. See manufactures MSDS
QIAquick Gel extraction kit QIAgen 28706 refered to as: DNA gel elution kit 
QIAquick PCR purification kit QIAgen 28106 refered to as: commercial DNA purification kit 
Qubit dsDNA HS Assay kit Invitrogen Q32854 high sensitivity DNA quantification instrument 
Quick load purple 1kb plus DNA Ladder NEB N0550S
SPRIselect size selection beads Beckman Coulter B23319 paramagnetic beads 
ThermoMixer C Eppendorf  5382000015 refered to as: thermomixer
Tris Merck 10708976001
Trypsin
Tween20 Sigma Aldrich P7949-100ML
Ultrapure 10% SDS Invitrogen 15553-035
Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) Invitrogen 15593-031
Fragment Analyzer

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References

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Metelova, M., Jensen, R. R., Krietenstein, N. Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL. J. Vis. Exp. (201), e64579, doi:10.3791/64579 (2023).

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