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Neuroscience

Pupilometría para evaluar la sensación auditiva en cobayas

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64581
Automatic Translation
1,2, 1,2,4, 1,2,6, 1,2,3,4,5
1Department of Neurobiology, University of Pittsburgh, 2Center for Neuroscience, University of Pittsburgh, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 4Center for Neural Basis of Cognition, University of Pittsburgh, 5Department of Communication Science and Disorders, University of Pittsburgh, 6Department of Transfer and Innovation, USC University Hospital Complex (CHUS), University of Santiago de Compostela

Summary

La pupilometría, una técnica simple y no invasiva, se propone como un método para determinar los umbrales de audición en ruido en animales de audición normal y modelos animales de diversas patologías auditivas.

Abstract

La exposición al ruido es una de las principales causas de pérdida auditiva neurosensorial. Los modelos animales de pérdida auditiva inducida por ruido han generado una visión mecanicista de las patologías anatómicas y fisiológicas subyacentes de la pérdida auditiva. Sin embargo, la relación de los déficits de comportamiento observados en humanos con pérdida auditiva con los déficits de comportamiento en modelos animales sigue siendo un desafío. Aquí, la pupilometría se propone como un método que permitirá la comparación directa de datos de comportamiento animal y humano. El método se basa en un paradigma extraño modificado: habituar al sujeto a la presentación repetida de un estímulo y presentar intermitentemente un estímulo desviado que varía de alguna manera paramétrica del estímulo repetido. La premisa fundamental es que si el sujeto detecta el cambio entre el estímulo repetido y desviado, desencadenará una respuesta de dilatación de la pupila que es mayor que la provocada por el estímulo repetido. Este enfoque se demuestra utilizando una tarea de categorización de vocalización en conejillos de indias, un modelo animal ampliamente utilizado en la investigación auditiva, incluso en estudios de pérdida auditiva. Al presentar vocalizaciones de una categoría de vocalización como estímulos estándar y una segunda categoría como estímulos extraños incrustados en ruido en varias relaciones señal-ruido, se demuestra que la magnitud de la dilatación de la pupila en respuesta a la categoría extraña varía monótonamente con la relación señal-ruido. Los análisis de la curva de crecimiento se pueden utilizar para caracterizar el curso temporal y la significación estadística de estas respuestas de dilatación de la pupila. En este protocolo, se describen procedimientos detallados para aclimatar a los conejillos de indias a la configuración, realizar pupilometría y evaluar / analizar datos. Aunque esta técnica se demuestra en conejillos de indias de audición normal en este protocolo, el método se puede utilizar para evaluar los efectos sensoriales de diversas formas de pérdida auditiva dentro de cada sujeto. Estos efectos pueden correlacionarse con medidas electrofisiológicas concurrentes y observaciones anatómicas post-hoc.

Introduction

El diámetro de la pupila (DP) puede verse afectado por un gran número de factores y la medición de la DP que cambia con el tiempo se conoce como pupilometría. La EP está controlada por el músculo del esfínter del iris (involucrado en la constricción) y el músculo dilatador del iris (involucrado en la dilatación). El músculo de constricción está inervado por el sistema parasimpático e involucra proyecciones colinérgicas, mientras que el dilatador del iris está inervado por el sistema simpático que involucra proyecciones noradrenérgicas y colinérgicas 1,2,3. El estímulo más conocido para inducir cambios en la EP es la luminancia-constricción y las respuestas de dilatación de la pupila pueden ser producidas por variaciones en la intensidad de la luz ambiental2. La DP también cambia en función de la distancia focal2. Sin embargo, se sabe desde hace décadas que la EP también muestra fluctuaciones no relacionadas con la luminancia 4,5,6,7. Por ejemplo, los cambios en los estados mentales internos pueden provocar cambios transitorios en la EP. La pupila se dilata en respuesta a estímulos emocionalmente cargados o aumenta con la excitación 4,5,8,9. La dilatación de la pupila también podría estar relacionada con otros mecanismos cognitivos, como el aumento del esfuerzo mental o de la atención10,11,12,13. Debido a esta relación entre las variaciones del tamaño de la pupila y los estados mentales, los cambios en la EP se han explorado como un marcador de trastornos clínicos como la esquizofrenia 14,15, la ansiedad 16,17,18, la enfermedad de Parkinson 19,20 y la enfermedad de Alzheimer 21 entre otros. En animales, los cambios en la EP rastrean los estados internos de comportamiento y se correlacionan con los niveles de actividad neuronal en las áreas corticales22,23,24,25. El diámetro de la pupila también ha demostrado ser un indicador fiable del estado de sueño en ratones26. Estos cambios en la EP relacionados con la excitación y el estado interno generalmente ocurren en escalas de tiempo largas del orden de varias decenas de segundos.

En el ámbito de la investigación auditiva, tanto en la audición normal como en los sujetos con discapacidad auditiva, el esfuerzo auditivo y la percepción auditiva se han evaluado mediante pupilometría. Estos estudios suelen involucrar sujetos de investigación entrenados27,28,29,30 que realizan diversos tipos de tareas de detección o reconocimiento. Debido a la relación antes mencionada entre la excitación y la EP, se ha demostrado que el aumento de la participación en las tareas y el esfuerzo de escucha se correlacionan con el aumento de las respuestas de dilatación de la pupila 30,31,32,33,34,35. Por lo tanto, la pupilometría ha sido utilizada para demostrar que se gasta un mayor esfuerzo de escucha para reconocer el habla espectralmente degradada en oyentes de audición normal29,36. En los oyentes con discapacidad auditiva, como los seres humanos con pérdida auditiva relacionada con la edad 27,30,37,38,39,40,41 y los usuarios de implantes cocleares 42,43, las respuestas de los alumnos también aumentaron con la disminución de la inteligibilidad del habla; Sin embargo, los oyentes con discapacidad auditiva mostraron una mayor dilatación de la pupila en condiciones auditivas más fáciles en comparación con los sujetos con audición normal 27,30,37,38,39,40,41,42,43. Pero los experimentos que requieren que el oyente realice una tarea de reconocimiento no siempre son posibles, por ejemplo, en bebés o en algunos modelos animales. Así, las respuestas pupilares no relacionadas con la luminancia evocadas por estímulos acústicos podrían ser un método alternativo viable para evaluar la detección auditiva en estos casos44,45. Estudios anteriores demostraron una dilatación pupilar transitoria y ligada al estímulo como parte del reflejo orientador46. Estudios posteriores han demostrado el uso de dilataciones pupilares ligadas a estímulos para derivar curvas de sensibilidad de frecuencia en búhos47,48. Recientemente, estos métodos han sido adaptados para evaluar la sensibilidad de la respuesta de dilatación de la pupila en lactantes humanos48. La pupilometría ha demostrado ser un enfoque fiable y no invasivo para estimar los umbrales de detección auditiva y discriminación en cobayas (GP) de escucha pasiva mediante el uso de una amplia gama de estímulos simples (tonos) y complejos (vocalizaciones GP)49. Estos cambios en la EP relacionados con el estímulo generalmente ocurren en escalas de tiempo más rápidas del orden de varios segundos y están vinculados al momento del estímulo. Aquí, la pupilometría de los cambios de EP relacionados con el estímulo se propone como un método para estudiar los impactos conductuales de varios tipos de discapacidad auditiva en modelos animales. En particular, se describen los protocolos de pupilometría para su uso en médicos de cabecera, un modelo animal bien establecido de varios tipos de patologías auditivas 50,51,52,53,54,55,56 (ver también referencia 57 para una revisión exhaustiva).

Aunque esta técnica se demuestra en médicos de cabecera de audición normal, estos métodos se pueden adaptar fácilmente a otros modelos animales y modelos animales de diversas patologías auditivas. Es importante destacar que la pupilometría se puede combinar con otras mediciones no invasivas como el EEG, así como con registros electrofisiológicos invasivos para estudiar los mecanismos subyacentes a la posible detección de sonido y los déficits de percepción. Finalmente, este enfoque también se puede utilizar para establecer amplias similitudes entre los modelos humanos y animales.

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Protocol

Para todos los procedimientos experimentales, obtenga la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y adhiérase a las Pautas de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. En los Estados Unidos de América, los médicos generales también están sujetos a las regulaciones del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA). Todos los procedimientos de este protocolo fueron aprobados por la Universidad de Pittsburgh IACUC y se adhirieron a las Directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Para este experimento, se utilizaron tres médicos de cabecera pigmentados machos de tipo salvaje entre 4 y 10 meses de edad, con ~ 600-1,000 g de peso.

1. Procedimiento quirúrgico

  1. Realizar todos los experimentos de pupilometría en médicos de cabecera pigmentados despiertos, con la cabeza fija y con escucha pasiva. Verificar la audición normal en sujetos experimentales utilizando grabaciones de respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) de tono puro y de clic58.
    NOTA: Aunque la adquisición de datos de pupilometría no es invasiva en sí misma, en este protocolo se utiliza una cirugía invasiva posterior al implante de la cabeza para inmovilizar la cabeza del animal durante el procedimiento. Las alternativas se presentan en la sección Discusión.
  2. Primero, implante a todos los animales experimentales con un poste de cabeza de acero inoxidable para la fijación de la cabeza bajo anestesia con isoflurano. Utilizar técnicas quirúrgicas asépticas para anclar el poste de la cabeza al cráneo empleando una combinación de tornillos óseos y acrílico dental58.
  3. Proporcionar a los animales cuidados postquirúrgicos, incluida la administración de analgésicos sistémicos y tópicos. Después de un período de recuperación de 2 semanas, aclimate gradualmente a los animales a la configuración experimental.
    NOTA: El procedimiento quirúrgico se basa en métodos previamente publicados en GPs58, así como en otras especies59,60, y no es el foco de este protocolo.

2. Aclimatación del animal a la configuración experimental

NOTA: Los experimentos generalmente tienen lugar en una cámara o cabina con sonido atenuado (consulte la Tabla de materiales). El tiempo requerido para familiarizar a un animal con la configuración varía de un tema a otro. Los tiempos típicos de aclimatación se indican a continuación. Un animal bien aclimatado tolerará la fijación de la cabeza con un movimiento corporal mínimo y dará como resultado mejores mediciones del diámetro de la pupila.

  1. Después de un período de recuperación de 2 semanas, primero familiarice a los animales con el manejo y transporte (2-3 días). Esta aclimatación es esencial para reducir el estrés y la ansiedad. Para familiarizar al animal con el manejo, coloque al animal en su contenedor de transporte durante períodos de tiempo crecientes (10-30 min) y manipule al animal durante períodos de tiempo crecientes (10-30 min).
  2. A continuación, aclimate al animal a la configuración experimental (2-3 días) colocando al animal en un recinto durante 10-45 minutos (Figura 1A). El recinto debe permitir pequeños cambios posturales para la comodidad del animal durante el experimento. Permita pequeños cambios posturales para la comodidad del animal durante el experimento. Sin embargo, se sabe que la dilatación de la pupila precede al movimiento49. Por lo tanto, mida el movimiento del animal y tenga en cuenta este movimiento en el análisis de datos (Figura 1C).
  3. Como parte de esta aclimatación, manipule manualmente el poste de cabeza implantado, como si el animal fuera a ser fijado en la cabeza. Mantenga el poste principal durante períodos crecientes (10-60 s).
  4. Después de la aclimatación manual y dependiendo del comportamiento animal, intente fijar la cabeza del animal a un marco rígido utilizando el soporte del implante.
  5. Aumente lentamente la duración de la fijación de la cabeza (10-45 min) hasta que el animal esté tranquilo y relativamente quieto mientras está fijo (2-3 días).
  6. Acostumbre al animal a la presencia de la cámara, la fuente de luz IR y la fuente de luz blanca (1-2 días). Encienda la luz blanca, aumentando gradualmente la duración (10 min a 30 min).
  7. Acostumbrar al animal a la estimulación acústica tocando una variedad de sonidos (por ejemplo, tonos puros, clics, vocalizaciones) a diferentes niveles de sonido (1-2 días, concurrente con el paso 2.6). Para minimizar la habituación a los estímulos experimentales, use sonidos diferentes de los planeados para los experimentos de pupilometría en este paso.

3. Calibración de la cámara de la pupila

NOTA: La cámara utilizada para la pupilometría envía un vídeo a través de USB al paquete de software de pupilometría. A partir de este video, el diámetro de la pupila se extrae utilizando un ajuste de elipse y un valor de umbral ajustable por el usuario mediante el paquete de software de pupilometría (consulte la Tabla de materiales). Luego, el software interactúa con una tarjeta digital a analógica. La tarjeta emite un valor de voltaje analógico que es proporcional al diámetro de la pupila. La calibración es necesaria para convertir este valor de voltaje de nuevo al diámetro de la pupila en unidades de longitud.

  1. Coloque una hoja de papel que contenga imágenes de discos negros de diámetro conocido en el mismo lugar donde se ubicará el ojo del médico de cabecera durante la pupilometría. Para los médicos de cabecera, PD está en el rango de 4 mm. Por lo tanto, realice la calibración utilizando discos de 3 mm, 4 mm y 5 mm.
  2. Coloque la cámara de pupilometría (ver Tabla de materiales) a la misma distancia (25 cm) a la que se realizarán los experimentos. Ajuste la apertura y el enfoque de la cámara hasta obtener una imagen nítidamente enfocada de un disco de diámetro conocido.
  3. En el software de adquisición de pupilometría (consulte Tabla de materiales), ajuste el umbral para que el contorno de la elipse coincida estrechamente con el disco de imagen y anote el valor y la escala de voltaje de salida analógica.
  4. Repita este procedimiento para los discos de 3 mm, 4 mm y 5 mm. A continuación, tabule los valores de diámetro reales (en mm) correspondientes a los valores de voltaje de salida analógicos.

4. Adquisición de datos de pupilometría

  1. Realice todos los experimentos en una cabina o cámara con atenuación de sonido, con las paredes interiores cubiertas de espuma anecoica.
  2. Para la entrega de estímulos de campo libre, monte un altavoz calibrado en la pared de la cámara atenuada por sonido, a una altura igual a la posición donde se colocará el animal.
    NOTA: La elección del altavoz depende de la especie estudiada y de los estímulos previstos. Para vocalizaciones GP, use un altavoz de controlador de rango completo que tenga una respuesta de frecuencia relativamente plana (±3 dB) en el rango de frecuencia de vocalización de 0.5-3 kHz (Figura 1A).
  3. Coloque al animal en el recinto asegurándose de que no sean posibles movimientos corporales grandes (Figura 1A). Fije la cabeza del animal al marco rígido como se describe en el paso 2 (Figura 1A).
  4. Coloque un sensor piezoeléctrico debajo del recinto para detectar y registrar los movimientos de los animales (Figura 1A).
  5. Para configurar la bocanada de aire, use un soporte conectado a la mesa para colocar una punta de pipeta a ~ 15 cm frente al hocico del animal. Conecte un tubo de silicona (~3 mm de diámetro) a la punta de la pipeta y conecte el tubo a un cilindro de aire regulado.
  6. Mantenga la presión de aire del cilindro entre 20 y 25 psi. Pase el tubo a través de una válvula de pellizco para controlar el tiempo y la duración de la inhalación de aire utilizando un relé controlado por computadora.
  7. Ilumine el ojo con una matriz de LED infrarrojos colocada a ~ 10 cm de distancia. Utilice iluminación LED blanca a una intensidad de ~2.000 cd/m2 para iluminar el ojo fotografiado y llevar el PD de referencia a ~3,5 mm. Mantenga condiciones de iluminación constantes en la cámara experimental durante las sesiones experimentales.
    NOTA: En la iluminación normal del laboratorio (~ 500 cd / m2), la pupila GP está bastante dilatada y no permite la observación de una dilatación adicional relacionada con el estímulo. Mediante el uso de iluminación adicional, la pupila se lleva a un diámetro de referencia de ~ 3,5 mm, lo que permite un rango dinámico suficiente para observar la dilatación vinculada al estímulo. Esto también garantiza líneas de base consistentes en todas las sesiones y temas.
  8. Abra el software de adquisición de pupilas y adquiera el vídeo (a 90 fps) de la pupila utilizando una cámara con una lente de 16 mm (resolución espacial de 0,15° de ángulo visual) y un filtro infrarrojo (IR) colocado a una distancia de 25 cm del ojo fotografiado. Asegúrese de que el ojo esté centrado en el área de la imagen.
  9. Regula la apertura y el enfoque de la cámara, así como el nivel IR hasta que el contorno de la pupila fotografiada esté enfocado.
  10. En el software de adquisición de alumnos, defina el área de interés que contiene la pupila seleccionando un área rectangular con el ratón.
  11. Utilice el panel de controles del software de adquisición de alumnos para ajustar el brillo y el contraste del vídeo adquirido. Establezca la densidad de escaneo en 5 y ajuste el umbral de modo que el ajuste de la elipse coincida estrechamente con el contorno de la pupila en el vídeo.
  12. Usando el software del procesador de interfaz neuronal, adquiera y guarde la señal analógica de la traza PD, la traza de voltaje del sensor piezoeléctrico que registra el movimiento, los tiempos de entrega de estímulos y los tiempos de entrega de soplo de aire.

5. Detección de ruido de llamada y discriminación categórica utilizando un paradigma extraño modificado

NOTA: Los estímulos para los experimentos de pupilometría consistieron en vocalizaciones GP que fueron registradas en una colonia animal58. Las muestras de vocalización se pueden encontrar en el siguiente repositorio: https://github.com/vatsunlab/CaviaVOX. En particular, se utilizaron llamadas de silbidos y gemidos para obtener las respuestas de los alumnos mostradas en los resultados representativos. De cada categoría, elija vocalizaciones cuyas longitudes sean aproximadamente iguales. Para tener en cuenta las diferencias en la amplitud de grabación y las envolturas temporales de las vocalizaciones, normalice las vocalizaciones por sus amplitudes cuadráticas medias (r.m.s.), si es necesario.

  1. Presente los estímulos auditivos utilizando MATLAB a una frecuencia de muestreo adecuada. Para los médicos de cabecera, que son animales con audición de baja frecuencia, una frecuencia de muestreo de 100 kHz es suficiente.
  2. Seleccione ocho ejemplos diferentes de vocalizaciones GP de longitudes similares de dos categorías diferentes de vocalizaciones (por ejemplo, llamadas de silbido y llamadas de gemidos). Una categoría (ocho ejemplares) servirá como estímulos estándar, y la otra categoría (ocho ejemplares) servirá como estímulos extraños o desviados (Figura 2A).
  3. Para generar estímulos estándar y desviados de 1 s de largo incrustados en el ruido a diferentes niveles de relación señal-ruido (SNR), agregue ruido blanco de igual duración a las llamadas (ruido cerrado). El rango de SNR muestreadas en este experimento está entre -24 dB SNR y +40 dB SNR.
  4. Utilizando un diseño de bloque, en cada sesión experimental (~12 min de duración), adquiere los datos correspondientes a un único nivel SNR. En cada sesión, use ocho ejemplos de una categoría de vocalización en una SNR particular como estímulos estándar, y ocho ejemplos de la otra categoría de vocalización en ese mismo nivel de SNR como estímulos desviados.
    NOTA: Un bloque experimental típico dura ~ 12 minutos. Dependiendo del comportamiento del animal y la habituación de las respuestas de las pupilas, puede ser posible adquirir datos para 3-4 bloques cada día (~ 45 - 60 minutos). A lo largo de esta duración, monitoree al animal de cerca a través del video de la pupila, el rastreo de movimiento, así como directamente entre bloques.
  5. Para cada sesión, prepare una secuencia de presentación de estímulos pseudoaleatorios que contenga estímulos estándar >90% del tiempo. Asegúrese de que entre estímulos desviados, haya al menos 20 ensayos con estímulos estándar (Figura 2B).
    NOTA: Dependiendo del experimento, el orden de los estímulos desviados dentro de la secuencia de presentación del estímulo puede adoptar un diseño cuadrado latino para garantizar que cada estímulo desviado único ocupe una posición secuencial única en cada sesión. Por lo tanto, promediar todas las sesiones puede minimizar el efecto de la posición de estímulo desviado dentro de la secuencia de estímulo general.
  6. Utilice una intensidad de estímulo fija (por ejemplo, 85 dB SPL) para todas las presentaciones de estímulos.
    NOTA: Utilice un convertidor de digital a analógico adecuado para generar una señal de audio, atenuarla al nivel de sonido deseado mediante un atenuador programable, amplificar la señal y entregar la señal mediante un altavoz calibrado (por ejemplo, hardware, consulte Tabla de materiales).
  7. Presentar los estímulos con alta regularidad temporal (estímulo de 1 s seguido de 3 s de silencio como se muestra en los resultados representativos).
    NOTA: Las respuestas de dilatación de la pupila son lentas, por lo general alcanzan su punto máximo aproximadamente 1 s después del inicio del estímulo y tardan aproximadamente 5 s en volver a la línea de base49. La tasa de presentación del estímulo debe ser lo suficientemente baja como para tener en cuenta estas escalas de tiempo lentas. La regularidad temporal es importante porque es posible que la interrupción del patrón de tiempo pueda actuar como un estímulo desviado.
  8. Para mantener el compromiso del animal con los estímulos y minimizar la habituación, opcionalmente dar una breve bocanada de aire (100 ms) después del estímulo desviado. Asegúrese de que el inicio de la inhalación de aire esté suficientemente separado de la duración del estímulo (2,5 s desde el inicio del estímulo) para que las respuestas de dilatación de la pupila evocadas por estímulos alcancen un pico antes de que los artefactos de parpadeo inducidos por la inhalación de aire.
    NOTA: En el paradigma clásico de los bichos raros, no se utilizan refuerzos positivos o negativos. Dado que una bocanada de aire se utiliza aquí como un refuerzo ligeramente aversivo para mantener el compromiso del animal con los estímulos auditivos, el paradigma se conoce como un paradigma extraño modificado.

6. Análisis y estadísticas

NOTA: Todos los análisis se realizaron utilizando código personalizado escrito en MATLAB (disponible en https://github.com/vatsunlab/GP_Pupil). Se describen dos métodos principales de análisis, que abordan la fiabilidad y el curso temporal de las respuestas de los alumnos, respectivamente. La elección de uno o ambos métodos será dictada por el diseño experimental.

  1. Detección de movimiento y exclusión de prueba
    1. Usando el código pupil_avg_JOVE.m, realice la detección de movimiento y la exclusión de prueba para cada sesión. Para ello, ejecute el código y seleccione el archivo de datos de una sola sesión en el cuadro de diálogo emergente.
    2. Destendencia lineal de la traza PD y convierta las unidades de voltaje a micrómetros utilizando la tabla de calibración derivada anteriormente (consulte el paso 3). Además, detrend linealmente el rastro de movimiento durante toda la sesión de grabación (~ 12 min).
    3. Inspeccione los datos de la sesión trazando el trazado de la pupila (Figura 1B - fila superior) y el trazado de movimiento linealmente destendido (Figura 1B- fila inferior) durante la duración de la sesión (~ 12 min), superpuestos en los marcadores de prueba.
    4. Mida la desviación estándar (DE) de la traza de movimiento. Obtenga los tiempos de los picos de traza de movimiento utilizando la función findpeaks en MATLAB. Considere los picos que cruzaron un umbral de 5 SD y que están separados de otros picos por al menos 1 s como un evento de movimiento49 (Figura 1B - abajo).
    5. Descarte cualquier ensayo (tanto estándar como desviado) de dilatación de la pupila que ocurra dentro de los 7 s de un evento de movimiento. Si se descarta más de la mitad del número de ensayos desviados debido a la dilatación de la pupila relacionada con el movimiento, descarte toda la sesión y repítala.
  2. Preprocesamiento y visualización de datos
    1. Utilice el código pupil_avg_JOVE.m para eliminar los artefactos de parpadeo de los ojos, preprocesar los datos y obtener la dilatación media de la pupila para cada estímulo a lo largo de las sesiones. Para ello, ejecute el código y seleccione todos los archivos de datos que se analizarán en el cuadro de diálogo emergente.
    2. Detecte los parpadeos oculares (cambios en la DP superiores a 400 μm/ms) y elimínelos interpolando linealmente la traza de DP en una ventana de tiempo de 200 ms centrada en el tiempo de parpadeo detectado. Descarte los datos de la sesión si más de la mitad del número de ensayos desviados contienen un parpadeo entre el inicio del estímulo y el inicio de la inhalación de aire.
    3. Reduzca el muestreo de los datos de PD de la frecuencia de muestreo de adquisición de 1.000 Hz a 10 Hz.
    4. Extraiga las trazas de DP en una ventana que comienza 1 s antes del inicio del estímulo y dura 5 s después de la compensación del estímulo. Calcule la DP de referencia promedio para cada estímulo en una ventana de 500 ms justo antes del inicio del estímulo. Reste la DP basal de estas trazas para obtener el cambio evocado por el estímulo en la EP.
    5. Promedie los cambios de DP evocados por estímulos para cada condición de estímulo en todas las sesiones dentro de cada animal, y luego en todos los animales para generar la respuesta media de dilatación de la pupila a cada condición de estímulo (por ejemplo, Figura 3A).
  3. Análisis de la curva de crecimiento (ACG) para cuantificar el curso temporal de los cambios en la DP
    NOTA: Este método de análisis determina la magnitud y el curso temporal de las respuestas de dilatación de la pupila y se ha utilizado en estudios pupilométricos de sujetos humanos 27,36,40, así como en cobayas 49.
    1. Concatenar verticalmente todas las salidas de pupil_avg_JOVE.m para todas las sesiones, animales, SNR y atenuaciones para construir una matriz que contenga las siguientes columnas: animalID, SNR, nivel de sonido y valores de diámetro de pupila (1-50). Utilizando el código pupil_LME_JOVE.m, realice el análisis de la curva de crecimiento (GCA)27,36,40,49.
    2. Ajustar modelos lineales de efectos mixtos con intercepciones a nivel de sujeto como efectos aleatorios, y polinomios de tiempo ortogonales de hasta el orden dos como efectos fijos, con cada SNR desviado tratado como un grupo separado, a la fase ascendente de la traza del diámetro de la pupila (0,1 a 2,1 s después del inicio del estímulo).
    3. Modele la fase ascendente de la traza de la pupila utilizando la siguiente fórmula36,49:
      Pupildilatación = (Intercepción + Condición) + tiempo1 * (β tiempo1 + β tiempo1: Condición) + tiempo2* (β tiempo2+ β tiempo2: Condición) + r(subjectlevelintercept)
      Donde, tiempo1 y tiempo2 corresponden a polinomios de tiempo lineales y cuadráticos ortogonales, y βs corresponden a pesos.
    4. Estimar pesos medios (βs) y sus errores estándar utilizando la función fitlme en MATLAB. Estimar la significación estadística de las ponderaciones utilizando la función coeftest.
    5. Para cada SNR, trace los pesos correspondientes a los términos de intercepción, lineales y cuadráticos para visualizar los resultados (Figura 3B, C).
  4. Análisis de ensayos que muestran dilataciones de la pupila estadísticamente significativas
    NOTA: Este método de análisis determina la fracción de ensayos desviados en los que se observa una respuesta de dilatación de la pupila estadísticamente significativa y corresponde a la fiabilidad de las respuestas de dilatación de la pupila.
    1. Elija una ventana de análisis apropiada (0.5-1 s) centrada alrededor del pico de la respuesta de la pupila (generalmente ~ 1.5 s después del inicio del estímulo). Calcule la DP media en esta ventana de análisis para todos los ensayos estándar y desviados.
    2. Determinar si la DP media para cada uno de los ensayos desviados es mayor que 2,33 errores estándar de la distribución agrupada de los valores medios de DP para los ensayos estándar. Cuente los ensayos desviados que exceden este umbral como ensayos que muestran una dilatación significativa de la pupila.
    3. Divida el número de ensayos desviados que muestran una dilatación significativa de la pupila por el número total de ensayos desviados (para cada afección) para cuantificar la fracción de ensayos que muestran aumentos estadísticamente significativos en la DP en comparación con los ensayos de estímulo estándar.
    4. Coloque todo el porcentaje de ensayos con cambios significativos en la pupila en cada celda de una matriz celular, donde las células están dispuestas de menor a mayor SNR. Con el código pupil_threshold_estimate_JOVE.m, calcule el umbral de categorización de llamada en ruido.
    5. Trazar la fracción de ensayos que muestran un aumento estadísticamente significativo en la DP en función de la SNR (Figura 3D). Para estos datos, utilice la función fitnlm MATLAB (en la caja de herramientas de estadísticas) para ajustar las funciones psicométricas del formulario61:
      Ψ(x; α, β, λ) = (1 -λ) * F(x; α, β)
      Donde, F es la función de Weibull, definida como
      F(x; α, β) = Equation 1, α es el parámetro de desplazamiento, β es el parámetro de pendiente y λ es la tasa de lapso.

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Representative Results

La pupilometría se realizó en tres médicos de cabecera pigmentados masculinos, con un peso de ~ 600-1,000 g en el transcurso de los experimentos. Como se describe en este protocolo, para estimar los umbrales de categorización de llamada en ruido, se utilizó un paradigma extraño para la presentación de estímulos. En el paradigma extraño, las llamadas pertenecientes a una categoría (gemidos) incrustadas en ruido blanco en una SNR dada se emplearon como estímulos estándar (Figura 2A), y las llamadas de otra categoría (sibilancias) incrustadas en ruido blanco en la misma SNR (Figura 2A) como estímulos desviados. Los estímulos estándar y desviados se eligieron al azar, con remuestreo, de ocho ejemplares de cada categoría. En cada sesión experimental, los estímulos se presentaron con alta regularidad temporal (Figura 2B), con al menos 20 presentaciones de estímulos estándar entre estímulos desviados. Se adquirieron datos correspondientes a un nivel particular de SNR en cada sesión experimental. En todas las sesiones, se muestreó una amplia gama de SNR limpios y ruidosos (-24, -18, -12, -6, -3, 0, 3, 6, 12, 40 dB SNR).

Los cambios en la DP en los estímulos estándar no difirieron significativamente de la línea de base (línea azul en la Figura 3A). Los estímulos desviados evocaron cambios de DP robustos y significativamente mayores que los provocados por los estímulos estándar (líneas grises en la Figura 3A), lo que refleja la discriminación de categoría de llamada. La magnitud de la respuesta y el porcentaje de ensayos con respuestas de la pupila estadísticamente significativas fueron más altas en la SNR más limpia y disminuyeron gradualmente con la disminución de la SNR (Figura 3A, B). Usando GCA, se encontró que las respuestas de los alumnos a estímulos desviados eran estadísticamente significativas en SNR por encima de -18 dB (Figura 3C), que se tomó como el umbral de categorización de llamada en ruido (línea verde en la Figura 3A). El porcentaje de ensayos significativos en cada nivel de SNR probado se ajustó bien a una función psicométrica (Figura 3D). El nivel de SNR necesario para alcanzar el medio máximo de la curva psicométrica fue de aproximadamente -20 dB SNR (Figura 3D). Como anécdota, para este caso, las métricas basadas en la confiabilidad y en el curso del tiempo produjeron valores similares de umbrales de categorización de llamada en ruido.

Figure 1
Figura 1: Configuración de la pupilometría y cambios de DP evocados por estímulos y relacionados con el movimiento. (A) La configuración de pupilometría con imágenes de cuadro de video de dilatación de la pupila evocada por sonido (arriba). La DP basal se muestra mediante círculos verdes discontinuos. (B) Un rastro de PD ejemplar (arriba) y un rastreo de movimiento ejemplar (abajo) de una sola sesión experimental. Las líneas negras verticales corresponden a presentaciones de estímulos desviados en el tiempo de inicio. Los ticks rojos corresponden a eventos de movimiento detectados automáticamente. La línea discontinua horizontal gris corresponde al umbral de 5 DE. (C) Los cambios en la EP (ΔPD) evocados por estímulos desviados (arriba) y relacionados con eventos de movimiento (abajo) de una sesión experimental. El inicio del estímulo se muestra mediante una línea negra vertical; La detección del evento de movimiento se muestra mediante una línea roja vertical. Tenga en cuenta que el inicio de la dilatación de la pupila precede al inicio del movimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Espectrogramas de llamada y estructura del paradigma de categorización de ruido de llamada. (A) Espectrogramas representativos de un sibilante y sibilante de conejillo de indias, en condiciones limpias y a 0 y -18 dB SNR, respectivamente. Las llamadas ruidosas se obtuvieron agregando ruido blanco. (B) Estructura del paradigma extraño utilizado para estimar los umbrales de categorización de llamada en ruido. Las llamadas de gemido se eligieron al azar entre ocho ejemplares y se utilizaron como estímulos estándar. Las llamadas Wheek fueron elegidas al azar entre ocho ejemplares y utilizadas como desviados. En cada sesión experimental, el ruido se añadió a un nivel SNR diferente (-24, -18, -12, -6, -3, 0, 3, 6, 12 dB SNR). Las llamadas duran 1 s y el tiempo entre estímulos es de 3 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Estimaciones de la pupilometría de las detecciones de llamada en ruido y los umbrales de categorización . (A) Respuestas promedio de la pupila de tres animales. Las respuestas medias de la pupila a los estímulos de quejido estándar están representadas por la línea azul, y el sombreado corresponde a ±1 error estándar de la media (s.e.m.). Las líneas grises y el sombreado corresponden a la media y ±1 s.e.m. de las respuestas de los alumnos evocadas por estímulos desviados. La intensidad del sombreado de grises corresponde a SNR. La línea verde y el sombreado corresponden a la traza media de la pupila en el umbral SNR (aproximadamente -18 dB SNR). La línea vertical roja corresponde al inicio del estímulo; la línea vertical naranja corresponde al inicio de la bocanada de aire; Las líneas discontinuas verde azulado corresponden a la ventana GCA (PD cambia la fase ascendente). (B) GCA se ajusta a la fase ascendente de los cambios en la DP. Los puntos son el diámetro medio de la pupila en contenedores de tiempo de 100 ms, los bigotes corresponden a ±1 s.e.m. Las líneas sólidas corresponden a ajustes de modelos de efectos mixtos. Colores de línea como en A. (C) Estimaciones de peso GCA. Los pesos de la intersección están en azul, la pendiente está en rojo y la aceleración está en púrpura. Los bigotes corresponden a ±1 s.e.m. Los asteriscos muestran pesos de regresión estadísticamente significativos (prueba de hipótesis lineal sobre coeficientes del modelo de regresión lineal). (D) La función psicométrica se ajusta al porcentaje de ensayos con cambios significativos en la EP provocados por el estímulo desviado en función de la SNR. Los bigotes corresponden a ±1 s.e.m. Tenga en cuenta que el 50% del máximo se alcanza a aproximadamente -20 dB SNR (línea discontinua verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo demuestra el uso de la pupilometría como un método no invasivo y fiable para estimar los umbrales auditivos en animales que escuchan pasivamente. Siguiendo el protocolo descrito aquí, se estimaron los umbrales de categorización de llamada en ruido en médicos de cabecera de audición normal. Los umbrales estimados por pupilometría fueron consistentes con los obtenidos mediante entrenamiento operante62. Sin embargo, en comparación con el entrenamiento operante, el protocolo de pupilometría fue relativamente sencillo y rápido de configurar y adquirir datos. Cada sesión de adquisición de datos (por nivel de SNR) duró aproximadamente 12 min, lo que resultó en 1-2 h de sesiones experimentales (a través de los niveles de SNR) por animal por día49. La adquisición de datos podría completarse en unos 7-10 días (dependiendo del número de niveles SNR utilizados). Aunque el paradigma oddball fue utilizado para la estimación del umbral de categorización de llamada en ruido en este manuscrito, este protocolo de pupilometría puede ser adaptado a versiones más fáciles de paradigmas extraños, donde solo se usa un ejemplo de llamada, o a otros paradigmas de estímulo que utilizan una amplia gama de estímulos complejos o simples49.

El método no está exento de desventajas. En primer lugar, el protocolo actual requiere el implante de un poste de cabeza para fijar la cabeza durante estos experimentos. La cirugía y recuperación posterior al implante de la cabeza agregaría un mínimo de 2 semanas a la línea de tiempo del protocolo experimental. Es posible que este paso se pueda evitar mediante el uso de otros métodos de inmovilización no invasiva de animales despiertos durante los experimentos, por ejemplo, mediante el uso de cascos personalizados impresos en3D 63 o termoplásticos deformables64. Se necesitan más experimentos para explorar estas soluciones. En segundo lugar, los animales también podrían habituarse rápidamente a estímulos desviados, lo que resultaría en una disminución de las respuestas de dilatación de la pupila en el transcurso de una sesión experimental. Este efecto podría minimizarse restringiendo las sesiones experimentales a duraciones cortas (~ 12 min) y presentando solo un número limitado (8) de estímulos desviados. Además, una bocanada de aire administrada después de los estímulos desviados puede garantizar que los animales permanezcan comprometidos con los estímulos auditivos. En tercer lugar, debido a esta rápida habituación, es posible que se requieran varios días para completar la adquisición de datos. Al probar solo los valores SNR que muestrean densamente las partes más empinadas de la curva psicométrica, se puede minimizar el número total de días experimentales. Cuarto, los animales pueden no quedarse quietos durante los experimentos, o parpadear excesivamente o cerrar los ojos durante los experimentos. Estos factores son una función de la especie y la aclimatación y muestran un alto grado de variabilidad individual. Los médicos de cabecera son naturalmente dóciles, y al aclimatarlos bien a la configuración experimental, se pueden minimizar los artefactos de movimiento y parpadeo. Los parpadeos espontáneos y las sacadas son típicamente bastante raros en los conejillos de indias49, pero esto también podría ser una función de la especie. Finalmente, como se mencionó anteriormente, la dinámica de la pupila en humanos se ha asociado con una serie de trastornos neuropsiquiátricos. Si bien se supone que los animales experimentales utilizados aquí son neurotípicos, esta advertencia debe tenerse en cuenta al interpretar los resultados.

Si bien aquí se describe una implementación de hardware de pupilometría (utilizando un rastreador ocular disponible comercialmente y un sistema de adquisición de datos neuronales), el equipo requerido es costoso y no económico de escalar. Sin embargo, hay disponibles otras soluciones personalizadas basadas en el mismo principio subyacente de seguimiento ocular basado en infrarrojos que son más rentables. Por ejemplo, un estudio utilizó componentes personalizados y algoritmos de procesamiento de video personalizados para extraer el diámetro de la pupila del video grabado22,25. Los algoritmos de aprendizaje profundo desarrollados recientemente también pueden extraer el diámetro de la pupila a partir de datos videográficos65,66. Estas soluciones podrían reducir a más de la mitad el costo de los equipos de pupilometría. La compensación aquí es entre el gasto y el tiempo, mientras que las soluciones comerciales son más caras, son soluciones llave en mano que se pueden usar de inmediato. Por otro lado, las soluciones personalizadas son rentables y escalables, pero requieren experiencia para configurarlas y el tiempo necesario para desarrollar canalizaciones de análisis personalizadas.

Aunque el protocolo detallado aquí se realizó en médicos de cabecera de audición normal, la pupilometría podría ser relativamente fácil de usar en otros modelos animales de discapacidad auditiva con cambios apropiados en el tipo y los parámetros del estímulo. Esto permitiría caracterizar los efectos de la pérdida auditiva en una variedad de tipos de estímulos y especies, lo que podría producir observaciones novedosas. Dado que la pupilometría es una técnica no invasiva que también se ha utilizado ampliamente en humanos, mediante el uso de los mismos estímulos utilizados para sujetos animales, la pupilometría se puede utilizar para comparar los efectos de diversas patologías auditivas entre especies. Por ejemplo, un metaanálisis reciente en humanos mostró que los déficits de percepción del habla en el ruido derivados de la exposición moderada al ruido se observaron mejor cuando se utilizaron estímulos complejos y temporalmente variables67. La estimación de los umbrales de categorización de llamada en ruido mediante pupilometría demostrada aquí podría usarse como una de esas tareas utilizando estímulos complejos para evaluar los efectos de la exposición al ruido en los médicos de cabecera. La evaluación de la audición a nivel conductual utilizando estos métodos complementaría los métodos electrofisiológicos y anatómicos y podría ser parte del conjunto de herramientas estándar para evaluar varios trastornos auditivos conocidos.

En conclusión, los siguientes puntos son críticos para la adquisición exitosa de datos pupilométricos. En primer lugar, para garantizar un alto rendimiento de datos, es fundamental familiarizar bien a los animales con la configuración experimental. La falta de paciencia en este paso podría degradar la calidad de los datos que finalmente se obtienen o requerir la repetición de varias sesiones para compensar las sesiones perdidas. En segundo lugar, para evitar cambios de PD relacionados con la luminancia, es importante realizar experimentos en condiciones de iluminación constante, manteniendo estas condiciones entre sesiones y sujetos tanto como sea posible. En tercer lugar, para minimizar el número de sesiones experimentales necesarias, es importante realizar experimentos piloto para identificar rangos de parámetros críticos para el muestreo denso. En cuarto lugar, para minimizar la habituación de los animales a los estímulos, es importante realizar experimentos en sesiones cortas que contengan solo unas pocas presentaciones de estímulos desviados. Una bocanada de aire se puede utilizar adicionalmente para mantener un alto compromiso con los estímulos auditivos.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el NIH (R01DC017141), la Fundación de Investigación de la Audición de los Leones de Pensilvania y fondos de los Departamentos de Otorrinolaringología y Neurobiología de la Universidad de Pittsburgh.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analog output board Measurement Computing Corporation, Norton, MA PCI-DDA02/12
Anechoic foam Sonex One, Pinta Acoustic, Minneapolis, MN
Condenser microphone Behringer, Willich, Germany C-2
Free-field microphone Bruel & Kjaer, Denmark)  Type 4940 
Matlab Mathworks, Inc., Natick, MA 2018a version
Monocular remote camera and illuminator system Arrington Research, Scottsdale, AZ MCU902 Infrared LED array + camera with infrared filter
Multifunction I/O Device  National Instruments, Austin, TX PCI-6229
Neural interface processor Ripple Neuro, Salt Lake City, UT SCOUT
Piezoelectric motion sensor SparkFun Electronics, Niwot, CO SEN-10293
Pinch valve  Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, IL EW98302-02
Programmable attenuator Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL PA5
Silicon Tubing Cole-Parmer ~3 mm
Sound attenuating chamber IAC Acoustics
Speaker full-range driver Tang Band Speaker, Taipei, Taiwan W4-1879
Stereo Amplifier Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL SA1
Tabletop - CleanTop Optical TMC vibration control / Ametek, Peabody, MA
Viewpoint software ViewPoint, Arrington Research, Scottsdale, AZ

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Neurociencia Número 191
Pupilometría para evaluar la sensación auditiva en cobayas
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Pernia, M., Kar, M., Montes-Lourido, P., Sadagopan, S. Pupillometry to Assess Auditory Sensation in Guinea Pigs. J. Vis. Exp. (191), e64581, doi:10.3791/64581 (2023).

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