Summary
В этой статье подробно описываются методы диагностики врожденных пороков сердца у мышей (ИБС) с использованием эхокардиографии плода, некропсии и эпископического флуоресцентного изображения (EFIC) с использованием эпископической конфокальной микроскопии (ECM) с последующей трехмерной (3D) реконструкцией.
Abstract
Врожденные пороки сердца (ИБС) являются основными причинами младенческой смертности в Соединенных Штатах. В 1980-х годах и ранее большинство пациентов с умеренной или тяжелой ИБС умерли до совершеннолетия, с максимальной смертностью в течение первой недели жизни. Замечательные достижения в хирургических методах, диагностических подходах и медицинском управлении привели к заметному улучшению результатов. Для удовлетворения критических исследовательских потребностей в понимании врожденных пороков сердца мышиные модели обеспечили идеальную исследовательскую платформу, поскольку они имеют очень похожую анатомию сердца с людьми и короткие показатели беременности. Сочетание генной инженерии с высокопроизводительными инструментами фенотипирования позволило воспроизвести и диагностировать структурные пороки сердца для дальнейшего выяснения молекулярных путей, стоящих за ИБС. Использование неинвазивной эхокардиографии плода для скрининга сердечных фенотипов в мышиных моделях в сочетании с высокой точностью эпископического флуоресцентного захвата изображения (EFIC) с использованием эпископической конфокальной микроскопии (ECM) гистопатологии с трехмерными (3D) реконструкциями позволяет детально взглянуть на анатомию различных врожденных пороков сердца. Этот протокол описывает полный рабочий процесс этих методов для получения точного диагноза врожденных пороков сердца у мышей. Применение этого протокола фенотипирования к модельным организмам позволит проводить точную диагностику ИБС, давая представление о механизмах ИБС. Выявление основных механизмов ИБС предоставляет возможности для потенциальных методов лечения и вмешательств.
Introduction
Врожденные пороки сердца (ИБС) являются наиболее распространенным врожденным дефектом новорожденных 1,2, затрагивающим около 0,8-1,7% новорожденных и приводящим к значительной неонатальной смертности и заболеваемости3. Генетическая этиология сильно показана при ИБС 4,5. Генетически модифицированные мышиные модели широко использовались для понимания сложности ИБС и механизмов, которые их вызывают из-за того, что мыши имеют четырехкамерные сердца и сопоставимые последовательности ДНК развития сердца у мышей и человеческих плодов6. Идентификация фенотипа мышиных мутантов является фундаментальным первым шагом в характеристике функции гена-мишени. Мышиные модели, выражающие эффекты дозирования генов, в которых одна генетическая мутация может привести к спектру сердечных дефектов, имитирующих ИБС человека, важны для понимания сложности ИБС и механизмов, которые их вызывают.
В этой статье описывается конвейер для характеристики сердечных фенотипов в мышиных моделях. Применяемые методы используют эхокардиограмму плода7, за которой следуют некропсия и гистопатология ECM 7,8, которая может отображать подробную анатомию развивающихся мышиных сердечных фенотипов. Эхокардиограмма плода является неинвазивной модальностью, которая позволяет напрямую визуализировать несколько эмбрионов с разумным разрешением изображения. Кроме того, эхокардиограмма плода обеспечивает быстрое определение общего количества эмбрионов в помете, стадий их развития, а также относительной ориентации и расположения в роге матки. Используя спектральный допплеровский / цветовой поток, аномальные эмбрионы могут быть идентифицированы на основе структуры, гемодинамического нарушения, ограничения роста или развития водянки. Поскольку исследование эхокардиограммы плода является неинвазивным методом, его можно использовать для сканирования в течение нескольких дней и наблюдения за изменениями гемодинамики или морфологии сердца. Получение качественной визуализации эхокардиограмм плода требует практики и мастерства, так как специфические пороки сердца могут быть пропущены из-за отсутствия опыта и знаний. Из-за этого более точный анализ морфологии сердца может быть получен путем сочетания некропсии и гистопатологии ECM. Некропсия обеспечивает прямую визуализацию структуры дуги, относительных отношений аорты и легочной артерии, размера желудочков и предсердий, положения сердца относительно грудной клетки и бронхолегочных структур. Тем не менее, внутренние особенности, такие как сердечные клапаны и толщина стенки, могут быть трудно оценить только с помощью некропсии. Таким образом, Гистопатология ECM рекомендуется для окончательного диагноза. Гистопатология ECM - это метод визуализации с высоким разрешением, который позволяет как 2D, так и 3D-реконструкцию стека изображений9. Эти изображения получаются с помощью последовательной эпископической флуоресцентной визуализации образца, встроенного в парафин, поскольку он тонко секционируется через последовательный интервал автоматическим микротомом. В отличие от классической гистологии, изображения захватываются в виде сечения, прежде чем он будет вырезан из блока, так что все изображения захватываются в одной системе отсчета. Из-за этого стек 2D-изображений, созданный гистопатологией ECM, может быть легко и надежно реконструирован в трех измерениях. Это делается с помощью средства просмотра DICOM, которое позволяет 3D-визуализацию изображений в трех анатомических плоскостях: корональной, сагиттальной и поперечной. Из этих 3D-реконструкций с высоким разрешением может быть поставлен окончательный сердечный диагноз. Применение этих трех различных модальностей визуализации, по отдельности или в комбинации, может обеспечить точную характеристику структурных пороков сердца у эмбрионов мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование мышей для этих исследований необходимо, так как мыши имеют четырехкамерные сердца, которые могут имитировать человеческие ИБС. Мышам была оказана ветеринарная помощь и размещена в аккредитованном Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AAALAC). Соблюдались строгие протоколы, чтобы свести к минимуму дискомфорт, стресс, боль и травмы мышей. Мышей усыпляли с использованием газа CO2 , который приемлем для мелких грызунов в соответствии с Руководством Американской ветеринарной медицинской ассоциации по эвтаназии. Исследования на мышах в этой рукописи были проведены с утвержденным протоколом IACUC в Университете Питтсбурга.
1. Эхокардиограмма плода
ПРИМЕЧАНИЕ: Эхокардиограмма является мощным инструментом для выявления сердечно-сосудистых мальформаций и экстракардиальных дефектов у мышей. Из-за небольших размеров эмбрионов мыши (около 1-2 мм при среднем приеме, 3,5 мм при рождении) требуется ультравысокочастотное эхокардиографическое оборудование с ультразвуковой биомикроскопией (УБМ). UBM обеспечивает различные высокочастотные (30-50 МГц) зонды с небольшим окном визуализации (15 мм x 14 мм), которое обеспечивает разрешение (30 мкм осевой x 68 мкм боковой) для визуализации одного плода мыши за раз. Преобразователь 40 МГц обеспечивает изображения с высоким разрешением для идентификации сердечно-сосудистых фенотипов7.
- Включите аппарат эхокардиограммы и выберите программу Кардиология.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол может быть использован для любого фона мыши от эмбрионального дня (E)14,5 до 19,5. - Обезболить желаемую мышь в анестетической индукционной камере. Индуцируют анестезию с использованием концентрации 4% изофлурана и медицинского кислорода со скоростью потока 1 л/мин и уменьшают его до 2%-3% для поддержания.
- Быстро поместите мышь на платформу обработки изображений. Платформа визуализации имеет нагретую сталь, чтобы держать мышь в тепле во время процедуры. Поместите рот и нос мыши в анестезирующий носовой конус. Закрепите конечности скотчем, чтобы избежать движения. Контролируйте частоту сердечных сокращений, чтобы убедиться, что она остается между 400-450 ударами в минуту.
- Контролируйте температуру с помощью ректального термометра и убедитесь, что она находится при температуре 37 °C ± 0,5 °C. Следите за дыханием, чтобы избежать гипоксии. Держите мягкое усилие на зонде, чтобы предотвратить вред.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тепловая лампа может быть установлена над мышью, чтобы предотвратить переохлаждение, находясь под анестезией, и восстановиться после анестезии. Вазелиновую офтальмологическую мазь можно использовать в качестве смазки во избежание сухости глаз. - Удалите мех с грудной клетки и живота с помощью крема для депиляции. Нанесите крем и подождите 3 минуты перед удалением. Очистите участок 70% этанолом. Этанол работает лучше, чем вода, в качестве смазки для бритья.
- Разогрейте ультразвуковой гель до нормальной температуры тела. Обильно нанесите ультразвуковой гель и поместите датчик на живот, чтобы сориентировать его в горизонтальной плоскости и идентифицировать мочевой пузырь на экране. Как только мочевой пузырь идентифицирован, сканируйте краниально из мочевого пузыря и ищите плод. Измерьте длину коронки до крестца, чтобы определить гестационный возраст10 лет (рисунок 1 и таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение положения преобразователей для визуализации различных плоскостей, включая поперечную четырехкамерную, сагиттальную и фронтальную/корональную плоскостивизуализации 7 (фиг.1). - Используйте цветной допплер для анализа кровотока от сердца.
- Поместите мышь обратно в клетку, если эмбрионы не достигли намеченной стадии. В противном случае подготовьте мышь к сбору урожая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мышь уже проснулась и хорошо восстанавливается после анестезии, прежде чем помещать ее обратно в клетку. - Выключите изофлуран и кислород, очистите рабочую зону и выключите машину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить гель из датчика.
2. Некропсия
ПРИМЕЧАНИЕ: При подозрении на аномальные сердечные фенотипы с помощью эхокардиографии плода, плоды собирают и фиксируют путем погружения всего тела в фиксирующий раствор: либо 10% буферизованный формалинфосфат, либо 4% параформальдегид (PFA). Осмотрите внешнюю и внутреннюю морфологию образца, ища макроскопические анатомические аномалии или пороки развития.
- Подготовьте мышь.
- Если мышь является взрослой, усыпьте мышь, используя стандартный протокол CO2 . Используйте щипцы или рассекающие ножницы, чтобы сделать разрезы (около 3 см) в боковой грудной клетке и брюшной полости, чтобы обеспечить проникновение фиксатора во внутренние органы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец должен быть зафиксирован в течение не менее 24 ч до некропсии, если эмбрион старше E14.5.
- Если мышь является взрослой, усыпьте мышь, используя стандартный протокол CO2 . Используйте щипцы или рассекающие ножницы, чтобы сделать разрезы (около 3 см) в боковой грудной клетке и брюшной полости, чтобы обеспечить проникновение фиксатора во внутренние органы.
- Проанализируйте внешний вид кузова.
- Настройте программное обеспечение для сохранения изображений с именем, включая идентификацию образца, увеличение микроскопа и содержание изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение от 1,0x до 3,2x должно быть достаточным для визуализации большинства структур у мышей E14.5 или старше. - Поместите мышь на пластину под объектив стереомикроскопа. Заполните пластину фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), чтобы полностью покрыть образец, чтобы предотвратить обезвоживание и отражение на снимках. Отрегулируйте увеличение так, чтобы экран включал весь эмбрион, а затем сфотографируйте как левую, так и правую стороны эмбриона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нижняя часть пластины должна быть покрыта парафином, кремнием или другой подобной подложкой для облегчения закрепления. - Проткните образец через горло, лицом вверх, и сделайте еще один снимок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Направьте штифт немного вверх, чтобы убедиться, что важные структуры грудной полости не прокалываются.
- Настройте программное обеспечение для сохранения изображений с именем, включая идентификацию образца, увеличение микроскопа и содержание изображения.
- Проанализируйте грудную клетку.
- Поднимая кожу в середине шеи щипцами, срежьте ножницами кожу к обеим подмышкам, прежде чем разрезать кожу вдоль срединной оси к хвосту. Затем срежьте кожу от пупка до ног. Проткните образец через запястья и лодыжки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы разрезать только кожу. Рекомендуется держать лезвия ножниц горизонтально или под углом вверх. - Чтобы разорвать соединительную ткань, поднимите кожу одной парой щипцов, удерживая подлежащую ткань на месте с другой парой. Проткните образец через кожу, чтобы помочь обнажить грудь и живот (рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком большое растяжение при закреплении, разрезании или соскоблении может привести к повреждению тканей. - Сфотографируйте открытые мышцы, а затем аккуратно соскоблите мышцы, чтобы обнажить ребра.
- Сфотографируйте открытые ребра. Отделите ребра от диафрагмы и отрежьте ребра с обеих сторон как можно дальше по боковой оси к шее.
- Обнажите сердце, удалив разрезанные ребра. Сфотографируйте сердце.
- Удалите тимус, отшелушивая его одной парой щипцов. Используйте другую пару щипцов для стабилизации основания тимуса, чтобы избежать разрыва каких-либо нижележащих сосудов. Сфотографируйте сердце и сосуды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование штифтов для растяжения некоторых смежных структур может помочь получить лучшие изображения. Кроме того, сделайте отдельные фотографии, сфокусированные на больших артериях, сердце и других структурах, представляющих интерес, поскольку они могут не быть в фокусе вместе.
- Поднимая кожу в середине шеи щипцами, срежьте ножницами кожу к обеим подмышкам, прежде чем разрезать кожу вдоль срединной оси к хвосту. Затем срежьте кожу от пупка до ног. Проткните образец через запястья и лодыжки.
- Проанализируйте живот.
- Потяните диафрагму, чтобы удалить ее и обнажить печень. Сфотографируйтесь.
- Зажмите обратно печень, чтобы обнажить желудок и поджелудочную железу. Сфотографируйтесь.
- Разрезать пищевод. Удалите толстую кишку и кишечник, вытащив их щипцами. Отрежьте чуть выше печени и удалите ее, чтобы раскрыть почки и надпочечники. Сфотографируйтесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаленные органы следует держать в фиксаторном растворе.
- Изолируйте грудную клетку для анализа ECM.
- Разрезайте нижнюю часть грудной клетки по прямой линии между печенью и легкими. Отрежьте голову достаточно высоко, чтобы не перерезать ветвления сонных артерий.
- Аккуратно удалите боковые ребра, сохранив при этом спинные ребра и позвоночник. Очистите и соскоблите спинной жир.
- Отделите грудную клетку от остальной части тела и поместите ее в 10% буферный раствор формалинфосфата.
3. Встраивание
- Декантируйте фиксатор в соответствующую бутылку с опасными отходами. Промывайте образцы с 1x PBS в течение 15 минут три раза.
- Используйте увеличивающиеся концентрации этанола и ксилола для обезвоживания образцов. Продолжительность всех следующих этапов зависит от стадии эмбрионов. Подробную информацию можно найти в таблице 2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при смене растворов, чтобы избежать повреждения образцов. Оптимальные параметры обработки образцов могут быть скорректированы эмпирически. Ксилол растворяет определенные пластмассы; следует использовать стеклянные инструменты и контейнеры. - Замените ксилол парафином на нужную продолжительность. Оставьте флаконы в инкубаторе при температуре 65 °C на соответствующую продолжительность (таблица 2).
- Используйте свежий парафин, чтобы встроить образцы в нужное положение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется ориентировать образец в середину парафинового блока, причем его спинная сторона обращена к верхней, а задняя сторона обращена к передней части блока. При ориентации образца помните, что образец встроен в блок, обращенный вверх ногами.
4. Эпископическая конфокальная микроскопия (ECM)
ПРИМЕЧАНИЕ: После соответствующего встраивания эмбрионы проходят сбор изображений последовательно через ECM для гистопатологического анализа. Отдельные слайды могут быть извлечены из микротома для дальнейших исследований.
- Выньте парафиновый блок из морозильной камеры при температуре -20 °C и удалите металлические формы.
- Используйте лезвие бритвы, чтобы обрезать воск по краям и обратной стороне кассеты. Нарежьте воск, окружающий образец, пока он не будет заключен в небольшой квадрат воска, прикрепленный к кассете.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте крайнюю осторожность при обращении с лезвиями. - Используйте металлический рычаг для зажима парафинового блока против стадии нарезки микротома. Выберите функцию MAN (ручная) в режиме выполнения, поднимите поверхность парафина близко к лезвию и выполните несколько слайдов, чтобы убедиться, что лезвие контактирует с блоком парафина.
- Откройте приложение автофокусировки LAS и выберите MatrixScreener. Выберите Единая регулярная матрица и загрузите соответствующий ранее сохраненный шаблон. Нажмите кнопку Quick LUT , чтобы переключиться на белый и оранжевый омбр.
- Выберите «Настроить задания» и перетащите видимый лазер 405 нм до максимума. Сопоставьте левый край блока спектра с линией 405 нм и перетащите правый край на линию 800 нм. Отметьте параметр Pinhole и запустите интерактивный просмотр.
- Отрегулируйте положение лазерной проекции, чтобы центрировать образец на экране, и отрегулируйте ручку Zoom до ~20x. Чтобы оптимизировать разрешение, установите коэффициент усиления на 1 250 В и максимизируйте синюю область с помощью ручки фокусировки; затем сбросьте коэффициент усиления примерно до 750 В для получения изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные значения могут варьироваться в зависимости от состояния эмбриона. - Переключите метод резки на Автоматический, установите толщину около 50 мкм и запустите слайды. Прекратите резку, когда легкие и дыхательные пути находятся в поле зрения.
- Выберите толщину резки от 8 до 10 мкм и остановите интерактивный просмотр. Откройте Microtome Communicator , чтобы начать визуализацию. Перед сбором изображений убедитесь, что папка временного хранилища пуста.
- Прекратите резку, когда не визуализируется дополнительная структура сердца. Закройте приложение Microtome Communicator и экспортируйте временный файл в один .tiff серии изображений с помощью программного обеспечения для обработки изображений для последующей 3D-реконструкции.
5. Трехмерная (3D) реконструкция
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью 3D-реконструкции является обработка стека 2D-изображений из ECM-визуализации в 3D-видео в корональной, сагиттальной и поперечной ориентациях и использование 3D-видео для диагностики структурных и анатомических аномалий в образцах.
- Откройте стек изображений ECM в программном обеспечении для обработки изображений.
- Перетащите файлы изображений в программное обеспечение для обработки изображений. Переверните изображения ECM по горизонтали, выбрав в строке меню «Изображение > «Преобразовать > «Перевернуть по горизонтали ».
- Сохраните перевернутое изображение и закройте программное обеспечение для обработки изображений.
- Импортируйте стек изображений ECM в программное обеспечение для просмотра DICOM.
- Перетащите горизонтально перевернутые изображения ECM в программное обеспечение для просмотра DICOM. Убедитесь, что вокруг списка образцов есть светло-синяя рамка, иначе изображения могут быть добавлены в существующую папку примера.
- Выберите ссылки или файлы для копирования в базу данных при появлении всплывающего окна. Новый образец появится в списке образцов с тем же именем, что и файл, скопированный в программное обеспечение для просмотра DICOM.
- Нажмите на недавно добавленный файл, чтобы открыть его.
- Выполните 3D реконструкцию.
- Как только файл будет открыт, нажмите на меню Инструменты реконструкции 2D / 3D на панели инструментов и выберите 3D MPR.
- Для Pixel X Resolution и Pixel Y Resolution введите разрешение изображения, предоставив зум, используемый во время ECM-изображения. В поле Интервал среза введите толщину среза, используемую для вырезания во время визуализации ECM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение камеры изменяется в зависимости от зума камеры и может отличаться от камеры к камере.
- Используйте различные инструменты на вкладке Инструменты слева, чтобы настроить стеки изображений по своему усмотрению.
- Используйте инструмент WW/WL для настройки ширины окна и уровня окна. Щелкните и перетащите инструмент на изображении вверх, чтобы уменьшить яркость изображения, и вниз, чтобы увеличить его. Щелкните и перетащите инструмент на изображении вправо, чтобы уменьшить контрастность изображения, и влево, чтобы увеличить его.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные настройки WW/WL для одной структуры могут быть неоптимальными для другой. По этой причине рекомендуется создавать отдельные видео для просмотра разных структур. - Используйте инструмент « Панорама » для перетаскивания изображений в нужные позиции. Используйте инструмент «Масштаб» для увеличения или сжатия изображения по своему усмотрению, а инструмент «Поворот» — для поворота изображения по своему усмотрению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение изображений может привести к снижению качества изображения. Будьте осторожны при повороте изображений, так как это может привести к переворачиванию осей.
- Используйте инструмент WW/WL для настройки ширины окна и уровня окна. Щелкните и перетащите инструмент на изображении вверх, чтобы уменьшить яркость изображения, и вниз, чтобы увеличить его. Щелкните и перетащите инструмент на изображении вправо, чтобы уменьшить контрастность изображения, и влево, чтобы увеличить его.
- Щелкните и перетащите цветную ось первой панели. Обратите внимание, как поворот этой оси изменяет ориентацию двух других панелей. Поверните оси трех панелей до тех пор, пока три панели не представят корональный, сагиттальный и поперечный виды образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: При переориентации образцов поддерживайте правильную переднюю/заднюю ориентацию. - Создание видео.
- После того, как все три панели правильно расположены, ориентированы и освещены, нажмите на панель, представляющую корональный вид.
- Нажмите «Экспорт фильма» в правой части строки меню. Нажмите «Пакетная обработка» и перетащите ползунки «От» и «До», чтобы охватить всю интересующую область. В поле Интервал выберите параметр «То же, что и толщина». Сохраните видео с указанием ориентации представления.
- Просмотрите видео, чтобы увидеть, можно ли адекватно идентифицировать интересующие структуры. Если нет, используйте инструменты (шаг 5.4), чтобы перенастроить видео по мере необходимости и повторно сохранить видео.
- Повторите шаг 5.6 для поперечного и сагиттального видов. Диагностируйте образцы с помощью реконструированных видео.
ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно посмотрите видео в каждой ориентации, чтобы сделать полную оценку того, демонстрирует ли образец какие-либо анатомические аномалии или фенотипы заболевания (рисунок 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эмбрионы мышей со значительными гемодинамическими дефектами были отмечены как эмбриональные летальные. Широкий спектр ИБС может быть идентифицирован с помощью высокопроизводительной, неинвазивной эхокардиограммы плода с использованием различных видов (рисунок 1).
Дефекты перегородки: Наиболее распространенными ИБС являются дефекты перегородки, такие как дефект межжелудочковой перегородки (VSD), дефект атриовентрикулярной перегородки (AVSD) и дефект межпредсердной перегородки (ASD)1. VSD или AVSD можно легко визуализировать с помощью 2D-изображений и изображений цветового потока. Кровоток через желудочки или между предсердиями и желудочками может быть легко идентифицирован (рисунок 3). АСД трудно отличить при патентованном овальном отверстии у плода.
Аномалии оттока: Как показано на рисунке 3, поток в главной легочной артерии проходит через восходящий поток аорты у нормальных эмбрионов. У эмбрионов с двойным выходом из правого желудочка (DORV) можно увидеть обе крупные артерии, возникающие из правого желудочка. DORV также связан с VSD (рисунок 3D) и может быть идентифицирован с помощью цветового потока. Однако, учитывая небольшой размер эмбрионов, DORV иногда нельзя надежно отличить от преобладания аорты, атрезии легких или стойкого артериального обрезка (PTA). При ПТА на эхокардиограмме плода можно увидеть только один поток оттока тракта (рисунок 3Е). Детальную структуру дуги и главной легочной артерии можно наблюдать с помощью некропсии (рисунок 2E,F).
Некропсия может быстро диагностировать статус situs в груди и животе и положение сердца относительно грудной клетки (либо левокардия (рисунок 2C-E), либо декстрокардия). Структуры оттока и относительные размеры как предсердий, так и желудочков могут быть легко визуализированы (рисунок 2E, F).
Гистопатология ECM является золотым стандартом для оценки любой структурной сердечной аномалии 8,11,12. Он обеспечивает беспрецедентное разрешение и детализацию структур эмбрионов. Трехмерная реконструкция с использованием различных плоскостей и видов может легко определить связь между большими артериями и желудочками (рисунок 3) и дефект между желудочками и предсердиями.
Рисунок 1: Места измерения длины коронки-крестца на 2D-эхокардиограммных изображениях эмбрионов для определения гестационного возраста. 2D-эхокардиограммы изображений эмбрионов при (A) E11.5, (B) E12.5, (C,D) E13.5-E14.5. (D) Больной эмбрион меньше, чем его (C) брат или сестра, и, как отмечается, имеет «кашеобразный» вид с водянкой (стрелкой). (А-С) Живые эмбрионы демонстрируют различные органы. Репрезентативный VB-режим с цветными изображениями сердца E14.5 в корональном 4-камерном представлении, наклоненном спереди для изображения (E) оттоковых путей, демонстрирует неповрежденную желудочковую перегородку с нормальным соотношением магистральных артерий, что подтверждается ECM в (E') корональном представлении. (F) Репрезентативный сагиттальный вид сердца E14.5 демонстрирует левожелудочковый и правый желудочковые оттоковые пути с восходящей аортой (AO), направленной в крайнюю часть, и легочной артерией, направленной сзади (к позвоночнику), что подтверждается ECM в сагиттальном виде (F'). (G) Репрезентативный поперечный вид левого желудочка (LV) и правого желудочка (RV), который подтверждается ECM в поперечном представлении (G'). (H) Поперечный вид у основания сердца в ECM демонстрирует отчетливый и разделенный аортальный клапан (AV) и легочный клапан (PV). PV является передним к AV. (H') Репрезентативное ECM поперечное изображение стойкого артериального тронкуса (PTA) демонстрирует левую легочную артерию и правую легочную артерию, возникающую сзади из неразделенной стойкой рунковой артерии, причем левая сонная артерия возникает спереди и кранально из стойкой усеченной артерии. Сокращения: A: передний, AO: аорта, AV: аортальный клапан, Cd: каудальный, Cr: краниальный, DAO: нисходящая аорта, L: левый, LA: левое предсердие, LCA: левая сонная артерия, LPA: левая легочная артерия, LV: левый желудочек, P: задний, PA: легочная артерия, PTA: стойкий артериальный усок, R: правый, RA: правое предсердие, RPA: правая легочная артерия, RV: правый желудочек. Шкала: 0,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения некропсии для наблюдения за сердечно-сосудистыми аномалиями. (А) Эмбрион, прикрепленный к блюду для рассечения черного фона без явных фенотипов. На изображении показана грубая анатомия головы, пальцев, грудной полости и живота. (B) Дерма удаляется из щенка, обнажая подчелюстные железы, грудную клетку и брюшко. (C) Грудная клетка поднимается, выявляя грубую анатомию грудной полости, включая тимус, сердце, легкие и диафрагму. (D) Увеличенный вид грудной клетки со снятой грудной клеткой. (E) Тимус удаляется, обнажая большие сосуды и трахею. (F) Увеличенный вид больших судов. Сокращения: AAO: восходящая аорта, D: диафрагма, LA: левое предсердие, LCA: левая сонная артерия, LSVC: левая верхняя полая вена, LV: левый желудочек, P: перикард, RA: правое предсердие, Rb: ребра, RCA: правая сонная артерия, RL: правое легкое, RSVC: правая верхняя полая вена, RV: правый желудочек, S: грудина, SCA: правая подключичная артерия, SMG: подчелюстные железы, T: трахея, Th: тимус. Шкала: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативная эхокардиограмма плода (Echo) и изображения с эпископического конфокального микроскопа (ECM). (A) Echo демонстрирует интактную желудочковую перегородку без межжелудочкового шунта и нормальных связанных с ним крупных артерий в нормальном контроле, подтвержденную (A') ECM на стадии E14.5-15.5. (B) Ультразвуковое обнаружение дефекта атриовентрикулярной перегородки (AVSD). Эхо-визуализация в 4-камерном представлении демонстрирует связь между LA, RA, LV и RV, подтвержденную (B') ECM на стадии E14.5. (C) Ультразвуковая диагностика дефекта межжелудочковой перегородки (VSD) с цветовым потоком демонстрирует поток через LV и RV, подтвержденный (C') ECM на стадии E16.5. (D) Эхо и (D') ECM демонстрируют DORV с VSD между LV и RV с бок о бок большими артериями (аорта находится прямо к легочной артерии) на стадии E14.5. (E) Ультразвуковая диагностика стойкого артериального обрезка (PTA) демонстрирует связь между LV и RV с одним оттоковым трактом, перекрывающим оба желудочка (PTA). (Э') Данная патология подтверждается ECM на стадии E14.5. Шкала бар: 0,5 мм. АО: аорта, AVSD: дефект атриовентрикулярной перегородки, Cd: каудальный, Cr: черепной, L: левый, LA: левое предсердие, LV: левый желудочек, PA: легочная артерия, PTA: стойкий артериальный truncus, R: правый, RA: правое предсердие, RV: правый желудочек, VSD: дефект межжелудочковой перегородки. Шкала: 0,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Сцена | Длина от заводной головки до крестца (мм) | Площадь плода (мм2) | Область сердца (мм2) | Область сердца/Плода |
| Е12,5 | 7,9 ± 0,8 (n = 77) | 23.2 ± 5 (n = 77) | ||
| Е13,5 | 10.5 ± 0.9 (n = 92) | 40.9 ± 7 (n = 92) | ||
| Е14,5 | 12.5 ± 0.9 (n = 101) | 57.6 ± 8 (n = 101) | 2,9 ± 0,5 (n = 70) | 0,050 ± 0,004 (n = 70) |
| Е15,5 | 14.1 ± 0.5 (n = 134) | 71.4 ± 6 (n = 134) | 3,8 ± 0,4 (n = 87) | 0,053 ± 0,004 (n = 87) |
| Е16,5 | 15.4 ± 0.6 (n = 112) | 82.7 ± 6 (n = 112) | 4,9 ± 0,5 (n = 87) | 0,058 ± 0,007 (n = 87) |
| Е17,5 | 16.6 ± 0.4 (n = 211) | 96.9 ± 7 (n = 211) | 6,1 ± 0,6 (n = 146) | 0,063 ± 0,004 (n = 146) |
| Е18,5 | 17.7 ± 0.6 (n = 139) | 112.1 ± 8 (n = 139) | 7,1 ± 0,8 (n = 93) | 0,063 ± 0,005 (n = 93) |
| Е19,5 | 18.7 ± 0.7 (n = 57) | 126.7 ± 8 (n = 57) | 7,7 ± 0,7 (n = 36) | 0,062 ± 0,005 (n = 36) |
Таблица 1: Профиль развития роста плода.
| Е14,5 | Е16,5 | Е18,5 | Новорожденный | |
| 70% этанола | 1 ч | 1,5 ч | 3 ч | 4 ч |
| 95% этанол | 35 мин | 45 мин | 1 ч | 1 ч |
| 95% этанол | 35 мин | 45 мин | 1 ч | 1 ч |
| 100% этанол | 15 мин | 15 мин | 30 мин | 6 мин |
| Ксилол 1 | 20 мин | 30 мин | 40 мин | 30 мин |
| Ксилол 2 | 20 мин | 30 мин | 40 мин | 30 мин |
| Воск 1 | 20 мин | 20 мин | 20 мин | 30 мин |
| Воск 2 | 20 мин | 20 мин | 20 мин | 30 мин |
| Воск 3 | Вдруг | Вдруг | Вдруг | Вдруг |
Таблица 2: Протокол встраивания эмбриона на основе эмбриональных дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Генетически модифицированные мыши были использованы для понимания патомеханизмов врожденных пороков сердца. Протоколы, которые мы предоставляем в этом исследовании, направлены на оптимизацию и стандартизацию процесса оценки пороков сердца плода мышей. Тем не менее, есть критические шаги, которые следует отметить во время протокола. Эмбрионы мышей значительно растут в течение каждого дня беременности, и правильное время для сбора урожая мыши можно определить, выполнив эхокардиограмму плода точно. Эхокардиограмма плода может быть использована для скрининга сердечно-сосудистой патологии плода. 2D-изображение позволяет идентифицировать аномальную анатомию и сердечную функцию, с помощью цветной допплерографии исследовать кровоток и обнаруживать любые коммуникации между камерами сердца или аномальным оттоком и притоком путей. Для определения диагноза ИБС плод сканируют с эмбрионального дня Е14.5, когда завершается септация оттока тракта и формирование сердечной камеры. Сканирование на более ранних стадиях может отражать задержку развития.
Гистопатология является стандартом для характеристики ИБС8 с использованием микротома, за которым следует визуализация оптического микроскопа. Основным недостатком стандартного метода является отсутствие интуитивно понятного 3D-отображения сердечно-сосудистых структур для диагностики и ограничение в отсутствии предоставления различных видов образцов. Гистология ECM является наиболее эффективным по времени методом характеристики сердечных дефектов. Если ECM недоступен, микротом может быть использован для разрезания эмбриона и определения сердечных фенотипов. Другими вариантами получения визуализации сердца являются выполнение высокопроизводительной магнитно-резонансной томографии (МРТ) высокого разрешения или компьютерной томографии (КТ). Одним из ключевых аспектов МРТ или КТ является то, что несколько эмбрионов могут быть изображены одновременно; однако даже после ультразвука, КТ или фенотипирования МРТ для подтверждения любого диагноза ИБС требуется гистопатология.
Используя ECM-визуализацию для гистопатологии, эмбрион последовательно визуализируется после каждого разреза с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, установленного над автоматическим скользящим микротомом. Отдельные изображения, собранные из ECM, позволяют проводить последующие 3D-реконструкции и позволяют переделывать образцы в цифровом виде в любой плоскости визуализации без повторного получения изображений 8,11. Такая операция позволяет провести комплексную оценку анатомии сердца, которая может быть использована на разных стадиях развития. Кроме того, отдельные слайды могут быть извлечены из микротома при сборе данных с оборудования ECM. Хотя гистопатология ECM является золотым стандартом для оценки любой структурной сердечной аномалии, существуют ограничения с доступностью оборудования, программного обеспечения и времени работы на эмбрион. Продолжительность разреза эмбрионального сердца может варьироваться от 1 до 3 ч на образец, в зависимости от его размера. Из-за сложности оборудования исследователи должны регулярно проверять на компьютере, чтобы убедиться, что область интереса внутри поля записывается. Исследователи также должны проверить образец, чтобы убедиться, что парафиновая восковая стружка не препятствует образцу от лазерного сканера.
ECM и последующая 3D-реконструкция обеспечивают полную оценку с высоким разрешением любого структурного порока сердца независимо от плана встраивания образца. Эти протоколы помогли успешно диагностировать ряд ИБС и позволили понять сердечный эмбриогенез в мышиных моделях и патологии, связанные с генетическими мутациями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в данной рукописи.
Acknowledgments
Никакой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
