Summary
توضح هذه المقالة تفاصيل طرق تشخيص أمراض القلب الخلقية للفئران (CHD) باستخدام تخطيط صدى القلب الجنيني ، والتشريح ، والتقاط الصور الفلورية الأسقفية (EFIC) باستخدام المجهر الأسقفي متحد البؤر (ECM) متبوعا بإعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D).
Abstract
أمراض القلب الخلقية (CHDs) هي الأسباب الرئيسية لوفاة الرضع في الولايات المتحدة. في 1980s وما قبلها ، توفي معظم المرضى الذين يعانون من أمراض القلب التاجية المعتدلة أو الشديدة قبل سن الرشد ، مع الحد الأقصى للوفيات خلال الأسبوع الأول من الحياة. أدت التطورات الملحوظة في التقنيات الجراحية وأساليب التشخيص والإدارة الطبية إلى تحسينات ملحوظة في النتائج. لتلبية الاحتياجات البحثية الحرجة لفهم عيوب القلب الخلقية ، قدمت نماذج الفئران منصة بحث مثالية ، حيث أن لديها تشريح قلب مشابه جدا للبشر ومعدلات حمل قصيرة. سمح الجمع بين الهندسة الوراثية وأدوات التنميط الظاهري عالية الإنتاجية بتكرار وتشخيص عيوب القلب الهيكلية لزيادة توضيح المسارات الجزيئية وراء أمراض القلب التاجية. يتيح استخدام تخطيط صدى القلب الجنيني غير الباضع لفحص الأنماط الظاهرية للقلب في نماذج الفئران إلى جانب الدقة العالية لالتقاط الصور الفلورية الأسقفية (EFIC) باستخدام الفحص المجهري الأسقفي متحد البؤر (ECM) التشريح المرضي مع إعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D) عرض مفصل لتشريح عيوب القلب الخلقية المختلفة. يحدد هذا البروتوكول سير عمل كامل لهذه الطرق للحصول على تشخيص دقيق لعيوب القلب الخلقية للفئران. سيسمح تطبيق بروتوكول التنميط الظاهري هذا على الكائنات الحية النموذجية بالتشخيص الدقيق لأمراض الشرايين التاجية ، مما يؤدي إلى إلقاء نظرة ثاقبة على آليات أمراض الشرايين التاجية. يوفر تحديد الآليات الأساسية لأمراض القلب التاجية فرصا للعلاجات والتدخلات المحتملة.
Introduction
أمراض القلب الخلقية (CHDs) هي أكثر العيوب الخلقية الوليدية شيوعا 1,2 ، حيث تؤثر على حوالي 0.8٪ -1.7٪ من حديثي الولادة وتؤدي إلى وفيات ومراضة كبيرة لحديثي الولادة3. يشار بقوة إلى المسببات الوراثية مع CHDs 4,5. تم استخدام نماذج الفئران المعدلة وراثيا على نطاق واسع لفهم تعقيد أمراض الشرايين التاجية والآليات التي تسببها بسبب الفئران التي لديها قلوب من أربع غرف وتسلسل الحمض النووي التنموي القلبي المماثل في الفئران والأجنة البشرية6. يعد تحديد النمط الظاهري لمتحولات الفئران الخطوة الأولى الأساسية في توصيف وظيفة الجين المستهدف. تعد نماذج الفئران التي تعبر عن تأثيرات جرعة الجينات ، والتي يمكن أن تؤدي فيها طفرة جينية واحدة إلى مجموعة من العيوب القلبية التي تحاكي أمراض الشرايين التاجية البشرية ، مهمة لفهم تعقيد أمراض القلب التاجية والآليات التي تسببها.
توضح هذه المقالة خط أنابيب لتوصيف الأنماط الظاهرية القلبية في نماذج الفئران. تستخدم الطرق المطبقة مخطط صدى القلبالجنيني 7 ، يليه التشريح وعلم أمراض الأنسجةECM 7,8 ، والذي يمكن أن يعرض التشريح التفصيلي لتطوير الأنماط الظاهرية لقلب الفئران. مخطط صدى القلب الجنيني هو طريقة غير جراحية تسمح بالتصور المباشر لأجنة متعددة بدقة تصوير معقولة. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر مخطط صدى القلب الجنيني تحديدا سريعا للعدد الإجمالي للأجنة في القمامة ، ومراحل نموها ، والاتجاه النسبي والموقع في قرن الرحم. باستخدام تدفق دوبلر / اللون الطيفي ، يمكن تحديد الأجنة غير الطبيعية بناء على الهيكل أو اضطراب الدورة الدموية أو تقييد النمو أو تطور الهيدروبس. نظرا لأن دراسة مخطط صدى القلب للجنين هي تقنية غير جراحية ، فيمكن استخدامها للمسح في عدة أيام ومراقبة التغيرات في ديناميكا الدم أو مورفولوجيا القلب. يتطلب الحصول على تصوير عالي الجودة لتخطيط صدى القلب الجنيني ممارسة ومهارة ، حيث قد يتم تفويت عيوب معينة في القلب بسبب نقص الخبرة والمعرفة. لهذا السبب ، يمكن الحصول على تحليل أكثر تحديدا لمورفولوجيا القلب من خلال مزيج من التشريح وعلم أمراض الأنسجة ECM. يوفر التشريح تصورا مباشرا لبنية القوس ، والعلاقات النسبية للشريان الأورطي والشريان الرئوي ، وحجم البطينين والأذينين ، وموضع القلب بالنسبة للصدر ، والهياكل القصبية الرئوية. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تقييم الميزات الداخلية مثل صمامات القلب وسمك الجدار من خلال التشريح وحده. وبالتالي ، يوصى بعلم أمراض الأنسجة ECM لتشخيص قاطع. ECM التشريح المرضي هو تقنية تصور عالية الدقة تسمح بإعادة بناء كل من 2D و 3D لمكدس الصور9. يتم الحصول على هذه الصور من خلال التصوير الفلوري الأسقفي التسلسلي لعينة مدمجة بالبارافين حيث يتم تقسيمها بشكل رقيق في فاصل زمني ثابت بواسطة ميكروتوم تلقائي. على عكس الأنسجة الكلاسيكية ، يتم التقاط الصور كقسم قبل قطعها من الكتلة بحيث يتم التقاط جميع الصور داخل نفس الإطار المرجعي. لهذا السبب ، يمكن إعادة بناء مكدس الصور 2D الذي تنتجه ECM التشريح المرضي بسهولة وموثوقية في ثلاثة أبعاد. يتم ذلك باستخدام عارض DICOM ، والذي يسمح بتصور 3D للصور في المستويات التشريحية الثلاثة: الإكليلية والسهمية والمستعرضة. من عمليات إعادة البناء 3D عالية الدقة هذه ، يمكن إجراء تشخيص نهائي للقلب. يمكن أن يوفر تطبيق طرق التصور الثلاثة المختلفة هذه ، إما بشكل فردي أو مجتمعة ، توصيفات دقيقة لعيوب القلب الهيكلية في أجنة الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يعد استخدام الفئران في هذه الدراسات ضروريا لأن الفئران لديها قلوب من أربع غرف يمكنها تقليد أمراض الشرايين التاجية البشرية. تم توفير الرعاية البيطرية للفئران وإيوائها في مرفق رعاية الحيوانات المعتمد من جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر (AAALAC) التابعة للمؤسسة. تم اتباع بروتوكولات صارمة لتقليل انزعاج الفئران والإجهاد والألم والإصابة. تم القتل الرحيم للفئران باستخدام غاز CO2 ، وهو أمر مقبول للقوارض الصغيرة وفقا لإرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية بشأن القتل الرحيم. أجريت الدراسات على الفئران في هذه المخطوطة باستخدام بروتوكول IACUC معتمد في جامعة بيتسبرغ.
1. مخطط صدى القلب الجنيني
ملاحظة: مخطط صدى القلب هو أداة قوية لتحديد تشوه القلب والأوعية الدموية والعيوب خارج القلب في الفئران. نظرا لصغر حجم أجنة الفأر (حوالي 1-2 مم عند الحمل ، 3.5 مم عند الولادة) ، يلزم وجود معدات تخطيط صدى القلب فائقة التردد مع الفحص المجهري الحيوي بالموجات فوق الصوتية (UBM). يوفر UBM مجسات مختلفة عالية التردد (30-50 ميجاهرتز) مع نافذة تصوير صغيرة (15 مم × 14 مم) توفر الدقة (30 ميكرومتر محوري × 68 ميكرومتر جانبي) لتصور جنين فأر واحد في كل مرة. يوفر محول الطاقة 40 ميجاهرتز صورا عالية الدقة لتحديد الأنماط الظاهرية للقلب والأوعية الدموية7.
- قم بتشغيل جهاز تخطيط صدى القلب وحدد البرنامج أمراض القلب.
ملاحظة: يمكن استخدام البروتوكول التالي لأي خلفية ماوس من اليوم الجنيني (E) 14.5 إلى 19.5. - تخدير الفأر المطلوب في غرفة تحريض التخدير. تحفيز التخدير باستخدام تركيز 4٪ إيزوفلوران والأكسجين الطبي بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة وتقليله إلى 2٪ -3٪ للصيانة.
- ضع الماوس على منصة التصوير بسرعة. تحتوي منصة التصوير على فولاذ ساخن للحفاظ على دفء الماوس أثناء العملية. ضع فم وأنف الفأر في مخروط الأنف المخدر. تأمين الأطراف مع الشريط لتجنب الحركة. راقب معدل ضربات القلب للتأكد من بقائه بين 400-450 نبضة في الدقيقة.
- راقب درجة الحرارة باستخدام مسبار مقياس حرارة المستقيم وتأكد من أنه يستقر عند 37 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية. مراقبة التنفس لتجنب نقص الأكسجة. حافظ على قوة لطيفة على المسبار لمنع الضرر.
ملاحظة: يمكن وضع مصباح حراري فوق الماوس لمنع انخفاض حرارة الجسم أثناء التخدير وللتعافي منه. يمكن استخدام مرهم بترولاتوم للعيون كمواد تشحيم لتجنب جفاف العين. - إزالة الفراء من الصدر والبطن باستخدام كريم مزيل الشعر. ضعي الكريم وانتظري 3 دقائق قبل إزالته. تنظيف المنطقة مع 70 ٪ من الإيثانول. يعمل الإيثانول بشكل أفضل من الماء كمواد تشحيم للحلاقة.
- الاحماء هلام الموجات فوق الصوتية إلى درجة حرارة الجسم الطبيعية. ضع جل الموجات فوق الصوتية بسخاء وضع الترجام على البطن لتوجيهه في مستوى أفقي وتحديد المثانة على الشاشة. بمجرد تحديد المثانة ، امسح القحف من المثانة وابحث عن الجنين. قم بقياس طول التاج إلى الردف لتحديد عمر الحمل10 (الشكل 1 والجدول 1).
ملاحظة: قم بتغيير مواضع محول الطاقة لتصور مستويات مختلفة ، بما في ذلك طائرات التصوير المستعرضة المكونة من أربع غرف ، والسهمي ، والجبهي / الإكليلي7 (الشكل 1). - استخدم لون دوبلر لتحليل تدفق الدم من القلب.
- ضع الماوس مرة أخرى في القفص إذا لم تصل الأجنة إلى المرحلة المقصودة. خلاف ذلك ، تحضير الماوس للحصاد.
ملاحظة: تأكد من أن الفأر مستيقظ بالفعل ويتعافى جيدا من التخدير قبل إعادته إلى القفص. - قم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران والأكسجين ، وتنظيف منطقة العمل ، وإيقاف تشغيل الجهاز.
ملاحظة: من المهم إزالة الجل من محول الطاقة.
2. التشريح
ملاحظة: بمجرد الاشتباه في الأنماط الظاهرية القلبية غير الطبيعية باستخدام تخطيط صدى القلب للجنين ، يتم جمع الأجنة وتثبيتها عن طريق غمر الجسم بالكامل في المحلول المثبت: إما 10٪ فوسفات فورمالين مخزن أو 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). افحص التشكل الخارجي والداخلي للعينة ، بحثا عن تشوهات تشريحية عيانية أو تشوهات.
- تحضير الماوس.
- إذا كان الماوس بالغا ، فقم بالقتل الرحيم للماوس باستخدام بروتوكول CO2 القياسي. استخدم ملقط أو مقص تشريح لعمل شقوق (حوالي 3 سم) في الصدر الجانبي والبطن للسماح باختراق المثبت في الأعضاء الداخلية.
ملاحظة: يجب تثبيت العينة لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التشريح إذا كان الجنين أقدم من E14.5.
- إذا كان الماوس بالغا ، فقم بالقتل الرحيم للماوس باستخدام بروتوكول CO2 القياسي. استخدم ملقط أو مقص تشريح لعمل شقوق (حوالي 3 سم) في الصدر الجانبي والبطن للسماح باختراق المثبت في الأعضاء الداخلية.
- تحليل الجزء الخارجي من الجسم.
- قم بإعداد البرنامج لحفظ الصور باسم ، بما في ذلك تحديد العينة وتكبير المجهر ومحتوى الصورة.
ملاحظة: يجب أن يكون التكبير من 1.0x إلى 3.2x كافيا لتصوير معظم الهياكل في الفئران E14.5 أو أكبر. - ضع الماوس على اللوحة تحت عدسة المجهر المجسم. املأ اللوحة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لتغطية العينة بالكامل لمنع الجفاف والانعكاس في الصور. اضبط التكبير بحيث تتضمن الشاشة الجنين بأكمله ، ثم التقط صورة لكل من الجانبين الأيسر والأيمن من الجنين.
ملاحظة: يجب طلاء الجزء السفلي من اللوحة بالبارافين أو السيليكون أو أي ركيزة أخرى لتسهيل التثبيت. - ثبت العينة من خلال حلقها ، ووجهها لأعلى ، والتقط صورة أخرى.
ملاحظة: قم بتوجيه الدبوس لأعلى قليلا لضمان عدم ثقب أي هياكل مهمة للتجويف الصدري.
- قم بإعداد البرنامج لحفظ الصور باسم ، بما في ذلك تحديد العينة وتكبير المجهر ومحتوى الصورة.
- تحليل الصدر.
- أثناء رفع الجلد في منتصف الرقبة بالملقط ، قم بقص الجلد باتجاه كل من الإبطين بالمقص قبل قطع الجلد على طول المحور المتوسط باتجاه الذيل. ثم ، قطع الجلد من السرة إلى الساقين. ثبت العينة من خلال معصميها وكاحليها.
ملاحظة: احرص على قطع الجلد فقط. يوصى بإمساك شفرات المقص أفقيا أو بزاوية لأعلى. - لكسر النسيج الضام ، ارفع الجلد بزوج واحد من الملقط مع تثبيت الأنسجة الأساسية في مكانها مع الزوج الآخر. ثبت العينة على الجلد للمساعدة في كشف الصدر والبطن (الشكل 2).
ملاحظة: قد يؤدي التمدد المفرط أثناء التثبيت أو القطع أو الكشط إلى تلف الأنسجة. - التقط صورة للعضلات المكشوفة ، ثم اكشط العضلات برفق لكشف الضلوع.
- التقط صورة للأضلاع المكشوفة. افصل الأضلاع عن الحجاب الحاجز واقطع الأضلاع على كلا الجانبين قدر الإمكان على المحور الجانبي باتجاه الرقبة.
- فضح القلب عن طريق إزالة الضلوع المقطوعة. التقط صورة للقلب.
- قم بإزالة الغدة الصعترية عن طريق تقشيرها بزوج واحد من الملقط. استخدم الزوج الآخر من الملقط لتثبيت قاعدة الغدة الصعترية لتجنب تمزق أي أوعية كامنة. التقط صورا للقلب والأوعية العظيمة.
ملاحظة: قد يساعد استخدام المسامير لتمديد بعض الهياكل المجاورة في الحصول على عروض تصوير أفضل. بالإضافة إلى ذلك ، التقط صورا منفصلة تركز على الشرايين الكبيرة والقلب والهياكل الأخرى ذات الأهمية لأنها قد لا تكون في بؤرة التركيز معا.
- أثناء رفع الجلد في منتصف الرقبة بالملقط ، قم بقص الجلد باتجاه كل من الإبطين بالمقص قبل قطع الجلد على طول المحور المتوسط باتجاه الذيل. ثم ، قطع الجلد من السرة إلى الساقين. ثبت العينة من خلال معصميها وكاحليها.
- تحليل البطن.
- اسحب الحجاب الحاجز لإزالته وكشف الكبد. التقط صورة.
- دبوس الكبد لكشف المعدة والبنكرياس. التقط صورة.
- قطع المريء. إزالة القولون والأمعاء عن طريق سحبها بالملقط. قطع فوق الكبد مباشرة وإزالته للكشف عن الكلى والغدد الكظرية. التقط صورة.
ملاحظة: يجب الاحتفاظ بالأعضاء التي تمت إزالتها في المحلول المثبت.
- عزل الصدر لتحليل ECM.
- قطع الصدر السفلي على طول خط مستقيم بين الكبد والرئتين. قطع الرأس عالية بما فيه الكفاية لعدم قطع فروع الشرايين السباتية.
- قم بإزالة الأضلاع الجانبية برفق مع الحفاظ على الأضلاع الظهرية والعمود الفقري. قشر وكشط الدهون الظهرية بعيدا.
- افصل الصدر عن بقية الجسم وضعه في محلول فوسفات الفورمالين المخزن بنسبة 10٪.
3. التضمين
- صب المثبت في زجاجة نفايات خطرة مناسبة. اغسل العينات باستخدام 1x PBS لمدة 15 دقيقة ثلاث مرات.
- استخدم تركيزات متزايدة من الإيثانول والزيلين لتجفيف العينات. تعتمد مدة جميع الخطوات التالية على مرحلة الأجنة. يرجى الرجوع إلى الجدول 2 للحصول على التفاصيل.
ملاحظة: يجب توخي الحذر عند تغيير المحاليل لتجنب إتلاف العينات. يمكن تعديل المعلمات المثلى لمعالجة العينات تجريبيا. سوف يذوب الزيلين بعض المواد البلاستيكية ؛ يجب استخدام الأدوات الزجاجية والحاويات. - استبدل الزيلين بالبارافين للمدة المطلوبة. اترك الزجاجات في حاضنة 65 درجة مئوية للمدة المناسبة (الجدول 2).
- استخدم البارافين الطازج لتضمين العينات في الموضع المطلوب.
ملاحظة: يوصى بتوجيه العينة إلى منتصف كتلة البارافين ، بحيث يكون جانبها الظهري مواجها للأعلى والجانب الخلفي مواجها لمقدمة الكتلة. عند توجيه العينة ، تذكر أن العينة مضمنة بحيث تكون الكتلة مقلوبة رأسا على عقب.
4. المجهر الأسقفي متحد البؤر (ECM)
ملاحظة: بعد التضمين المناسب ، تخضع الأجنة لجمع الصور بشكل متسلسل عبر ECM لتحليل التشريح المرضي. يمكن استرداد الشرائح الفردية من الميكروتوم لمزيد من الدراسات.
- أخرج كتلة البارافين من الفريزر -20 درجة مئوية وقم بإزالة القوالب المعدنية.
- استخدم شفرة حلاقة لتقليم الشمع على حواف والجزء الخلفي من الكاسيت. قطع الشمع المحيط بالعينة حتى يتم تغليفها في مربع صغير من الشمع متصل بالكاسيت.
ملاحظة: توخ الحذر الشديد أثناء التعامل مع الشفرات. - استخدم الرافعة المعدنية لتثبيت كتلة البارافين على مرحلة تقطيع الميكروتوم. حدد وظيفة MAN (اليدوية) في وضع التشغيل ، وارفع سطح البارافين بالقرب من الشفرة ، وقم بتشغيل بعض الشرائح للتأكد من أن الشفرة تلامس كتلة البارافين.
- افتح تطبيق LAS AF وحدد MatrixScreener. حدد مصفوفة عادية واحدة وقم بتحميل القالب المناسب المحفوظ مسبقا. انقر فوق الزر Quick LUT للتبديل إلى أومبير أبيض وبرتقالي.
- حدد إعداد المهام واسحب الليزر المرئي 405 نانومتر إلى الحد الأقصى. قم بمطابقة الحافة اليسرى لكتلة الطيف مع خط 405 نانومتر واسحب الحافة اليمنى إلى خط 800 نانومتر. حدد خيار Pinhole وابدأ العرض المباشر .
- اضبط موضع إسقاط الليزر لتوسيط العينة على الشاشة واضبط مقبض التكبير / التصغير على ~ 20x. لتحسين الدقة ، اضبط الكسب على 1250 فولت وقم بتكبير المنطقة الزرقاء باستخدام مقبض التركيز ؛ بعد ذلك ، أعد ضبط الكسب إلى 750 فولت تقريبا للتصوير.
ملاحظة: قد تختلف القيم المحددة حسب حالة الجنين. - قم بتبديل طريقة القطع إلى تلقائي ، واضبط السماكة على حوالي 50 ميكرومتر ، وقم بتشغيل الشرائح. توقف عن القطع عندما تكون الرئتان ومجرى الهواء في الأفق.
- اختر سمك القطع بين 8-10 ميكرومتر وأوقف العرض المباشر . افتح جهاز الاتصال Microtome لبدء التصوير. تأكد من أن مجلد التخزين المؤقت فارغ قبل جمع الصور.
- توقف عن القطع عندما لا يتم تصور بنية قلب إضافية. أغلق تطبيق Microtome Communicator ، وقم بتصدير الملف المؤقت إلى سلسلة صور .tiff واحدة عبر برنامج معالجة الصور لإعادة بناء 3D لاحقا.
5. إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد (3D)
ملاحظة: الغرض من إعادة البناء ثلاثي الأبعاد هو معالجة مكدس صور 2D من تصوير ECM إلى مقاطع فيديو ثلاثية الأبعاد في الاتجاهات الإكليلية والسهمية والعرضية واستخدام مقاطع الفيديو ثلاثية الأبعاد لتشخيص التشوهات الهيكلية والتشريحية في العينات.
- افتح مكدس صور ECM في برنامج معالجة الصور.
- قم بسحب وإسقاط الملفات في برنامج معالجة الصور. اقلب صور ECM أفقيا عن طريق تحديد صورة > تحويل > انعكاس أفقي في شريط القائمة.
- احفظ الصورة المعكوسة وأغلق برنامج معالجة الصور.
- قم باستيراد مكدس صور ECM في برنامج عرض DICOM.
- قم بسحب وإسقاط صور ECM المعكوسة أفقيا في برنامج عرض DICOM. تأكد من وجود حد أزرق فاتح حول قائمة العينات، أو قد تتم إضافة صور إلى مجلد نموذج موجود.
- حدد الروابط أو الملفات المراد نسخها إلى قاعدة البيانات عند ظهور النافذة المنبثقة. ستظهر عينة جديدة في قائمة العينات بنفس اسم الملف المنسوخ في برنامج عرض DICOM.
- انقر فوق الملف المضاف حديثا لفتحه.
- أداء إعادة الإعمار 3D.
- بمجرد فتح الملف ، انقر فوق قائمة أدوات إعادة الإعمار 2D / 3D من شريط الأدوات وحدد 3D MPR.
- بالنسبة إلى دقة Pixel X ودقة Pixel Y، أدخل دقة الصورة عن طريق توفير التكبير/التصغير المستخدم أثناء تصوير ECM. بالنسبة إلى الفاصل الزمني للشريحة ، أدخل سمك الشريحة المستخدم للقطع أثناء تصوير ECM.
ملاحظة: تتغير دقة الكاميرا وفقا لتكبير/تصغير الكاميرا وقد تختلف من كاميرا إلى أخرى.
- استخدم الأدوات المختلفة من علامة التبويب أدوات على الجانب الأيسر لضبط مكدسات الصور حسب الرغبة.
- استخدم أداة WW/WL لضبط عرض النافذة ومستوى النافذة. انقر واسحب الأداة على الصورة لأعلى لتقليل سطوع الصورة ولأسفل لزيادتها. انقر واسحب الأداة على الصورة إلى اليمين لتقليل تباين الصورة وإلى اليسار لزيادتها.
ملاحظة: قد تكون إعدادات WW/WL المثلى لبنية واحدة دون المستوى الأمثل لبنية أخرى. لهذا السبب ، يوصى بإنشاء مقاطع فيديو منفصلة لعرض هياكل مختلفة. - استخدم أداة التحريك لسحب الصور إلى المواضع المطلوبة. استخدم أداة التكبير لتكبير أو تقليص الصورة حسب الرغبة وأداة التدوير لتدوير الصورة حسب الرغبة.
ملاحظة: قد يؤدي تكبير الصور إلى انخفاض جودة الصورة. كن حذرا عند تدوير الصور ، لأن القيام بذلك قد يتسبب في قلب المحاور.
- استخدم أداة WW/WL لضبط عرض النافذة ومستوى النافذة. انقر واسحب الأداة على الصورة لأعلى لتقليل سطوع الصورة ولأسفل لزيادتها. انقر واسحب الأداة على الصورة إلى اليمين لتقليل تباين الصورة وإلى اليسار لزيادتها.
- انقر واسحب المحور الملون للوحة الأولى. لاحظ كيف يؤدي تدوير هذا المحور إلى تغيير اتجاه اللوحتين الأخريين. قم بتدوير محاور الألواح الثلاثة حتى تمثل اللوحات الثلاث مناظر إكليلية وسهمية وعرضية للعينة.
ملاحظة: أثناء إعادة توجيه العينات، حافظ على الاتجاه الأمامي / الخلفي الصحيح. - إنشاء مقاطع فيديو.
- بمجرد وضع جميع اللوحات الثلاث وتوجيهها وإشراقها بشكل صحيح ، انقر فوق اللوحة التي تمثل العرض الإكليلي.
- انقر فوق تصدير الفيلم على الجانب الأيمن من شريط القوائم. انقر فوق Batch واسحب أشرطة التمرير من و إلى لتشمل منطقة الاهتمام بأكملها. بالنسبة للفاصل الزمني، حدد الخيار نفس السماكة . احفظ الفيديو الذي يشير إلى اتجاه العرض.
- راجع الفيديو لمعرفة ما إذا كان يمكن تحديد هياكل الاهتمام بشكل مناسب. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستخدم الأدوات (الخطوة 5.4) لإعادة ضبط مقاطع الفيديو حسب الحاجة وإعادة حفظ الفيديو.
- كرر الخطوة 5.6 للطرق العرضية والسهمية. تشخيص العينات باستخدام مقاطع الفيديو المعاد بناؤها.
ملاحظة: شاهد مقاطع الفيديو بعناية في كل اتجاه لإجراء تقييم كامل لما إذا كانت العينة تظهر أي تشوهات تشريحية أو أنماط ظاهرية للأمراض (الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لوحظ أن أجنة الفئران التي تعاني من عيوب الدورة الدموية الكبيرة قاتلة جنينية. يمكن التعرف على مجموعة متنوعة من أمراض القلب التاجية من خلال مخطط صدى القلب الجنيني عالي الإنتاج وغير الباضع باستخدام وجهات نظر مختلفة (الشكل 1).
عيوب الحاجز: أكثر أمراض الشرايين التاجية شيوعا هي عيوب الحاجز مثل عيب الحاجز البطيني (VSD) وعيب الحاجز الأذيني البطيني (AVSD) وعيب الحاجز الأذيني (ASD)1. يمكن تصور VSD أو AVSD بسهولة باستخدام صور 2D وصور تدفق الألوان. يمكن التعرف بسهولة على تدفق الدم عبر البطينين أو بين الأذينين والبطينين (الشكل 3). من الصعب التمييز بين ASD والثقبة البيضوية السالكة في الجنين.
الحالات الشاذة في مجرى التدفق: كما هو موضح في الشكل 3، يكون السريان في الشريان الرئوي الرئيسي عبر الشريان الأورطي الصاعد في الأجنة الطبيعية. في الأجنة ذات المخرج المزدوج للبطين الأيمن (DORV) ، يمكن رؤية كلا الشرايين الكبيرة الناشئة عن البطين الأيمن. يرتبط DORV أيضا ب VSD (الشكل 3D) ويمكن تحديده باستخدام تدفق اللون. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجم الأجنة ، لا يمكن أحيانا تمييز DORV بشكل موثوق عن تجاوز الشريان الأورطي أو رتق الرئة أو الجذع الشرياني المستمر (PTA). في منطقة التجارة التفضيلية ، يمكن رؤية تدفق مجرى تدفق واحد فقط في مخطط صدى القلب الجنيني (الشكل 3E). يمكن ملاحظة بنية القوس التفصيلية والشريان الرئوي الرئيسي باستخدام التشريح (الشكل 2E ، F).
يمكن للتشريح أن يشخص بسرعة حالة الموقع في الصدر والبطن والوضع القلبي بالنسبة للصدر (إما ليفوكارديا (الشكل 2C-E) أو ديكستروكارديا). يمكن تصور هياكل مجرى التدفق الخارجي والحجم النسبي لكل من الأذينين والبطينين بسهولة (الشكل 2E ، F).
ECM التشريح المرضي هو تقنية المعيار الذهبي لتقييم أي شذوذ هيكلي في القلب8،11،12. يوفر دقة وتفاصيل لا مثيل لها لهياكل الأجنة. يمكن لإعادة البناء ثلاثية الأبعاد باستخدام مستويات ومناظر مختلفة أن تحدد بسهولة العلاقة بين الشرايين الكبيرة والبطينين (الشكل 3) والعيب بين البطينين والأذينين.
الشكل 1: مواقع قياس طول ردف التاج في صور مخطط صدى القلب ثنائي الأبعاد للأجنة لتحديد عمر الحمل. صور مخطط صدى القلب ثنائية الأبعاد للأجنة عند (A) E11.5 ، (B) E12.5 ، (C ، D) E13.5-E14.5. (د) الجنين المصاب أصغر من شقيقه (ج) ويلاحظ أن مظهره «طري» مع وجود استسقاء (سهم). (أ - ج) تظهر الأجنة الحية أعضاء متميزة. وضع VB التمثيلي مع صور ملونة لقلب E14.5 في عرض إكليلي مكون من 4 غرف مائل إلى الأمام لتصوير (E) تظهر مسارات التدفق الخارجي الحاجز البطيني السليم مع العلاقة الطبيعية للشرايين الكبيرة ، وهو ما تم تأكيده مع ECM في المنظر الإكليلي (E'). (F) يوضح المنظر السهمي التمثيلي للقلب E14.5 مسارات تدفق البطين الأيسر والبطين الأيمن مع توجيه الشريان الأورطي الصاعد (AO) إلى الجمجمة والشريان الرئوي الموجه إلى الخلف (نحو العمود الفقري) ، وهو ما تم تأكيده باستخدام ECM في المنظر السهمي (F). (G) منظر عرضي تمثيلي للبطين الأيسر (LV) والبطين الأيمن (RV) ، وهو ما يتم تأكيده باستخدام ECM في المنظر العرضي (G'). (H) يوضح المنظر المستعرض لقاعدة القلب في ECM وجود صمام أبهري متميز ومنفصل (AV) وصمام رئوي (PV). PV هو الأمامي ل AV. (H') يوضح ممثل ECM صورة عرضية لالجذع الشرياني المستمر (PTA) الشريان الرئوي الأيسر والشريان الرئوي الأيمن الناشئ خلفيا من الشريان القطعي المستمر غير المقسم ، مع الشريان السباتي الأيسر الناشئ من الأمام والجمجمة من الشريان الجذعي المستمر. الاختصارات: A: الأمامي ، AO: الشريان الأورطي ، AV: الصمام الأبهري ، Cd: الذيلية ، Cr: الجمجمة ، DAO: الأبهر النازل ، L: اليسار ، LA: الأذين الأيسر ، LCA: الشريان السباتي الأيسر ، LPA: الشريان الرئوي الأيسر ، LV: البطين الأيسر ، P: الخلفي ، PA: الشريان الرئوي ، PTA: الجذع الشرياني المستمر ، R: اليمين ، RA: الأذين الأيمن ، RPA: الشريان الرئوي الأيمن ، RV: البطين الأيمن. شريط المقياس: 0.5 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: صور تمثيلية لعملية تشريح لمراقبة تشوهات القلب والأوعية الدموية . (أ) جنين مثبت في طبق تشريح أسود الخلفية بدون أنماط ظاهرية واضحة. تظهر الصورة التشريح الإجمالي للرأس والديجيتال وتجويف الصدر والبطن. (ب) تزال الأدمة من الجرو، وتكشف عن الغدد تحت الفك السفلي، والقفص الصدري، والبطن. (ج) رفع القفص الصدري، مما يكشف عن التشريح الكلي لتجويف الصدر، بما في ذلك الغدة الصعترية والقلب والرئتين والحجاب الحاجز. د: منظر مكبر للصدر مع إزالة القفص الصدري. ه: تزال الغدة التيموسية، وتكشف عن أوعية كبيرة وقصبة هوائية. (و) منظر مكبر للسفن الكبيرة. الاختصارات: AAO: الشريان الأورطي الصاعد ، D: الحجاب الحاجز ، LA: الأذين الأيسر ، LCA: الشريان السباتي الأيسر ، LSVC: الوريد الأجوف العلوي الأيسر ، LV: البطين الأيسر ، P: التامور ، RA: الأذين الأيمن ، Rb: الأضلاع ، RCA: الشريان السباتي الأيمن ، RL: الرئة اليمنى ، RSVC: الوريد الأجوف العلوي الأيمن ، RV: البطين الأيمن ، S: القص ، SCA: الشريان تحت الترقوة الأيمن ، SMG: الغدد تحت الفك السفلي ، T: القصبة الهوائية ، Th: الغدة الصعترية. شريط المقياس: 1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: مخطط صدى القلب الجنيني التمثيلي (Echo) وصور من المجهر الأسقفي متحد البؤر (ECM). (A) يظهر الصدى حاجزا بطينيا سليما بدون تحويلة بين البطينين والشرايين الكبيرة ذات الصلة الطبيعية في السيطرة الطبيعية ، والتي تؤكدها (A') ECM في مرحلة E14.5-15.5. (ب) الكشف بالموجات فوق الصوتية عن عيب الحاجز الأذيني البطيني (AVSD). يوضح التصوير بالصدى في العرض المكون من 4 غرف الاتصال بين LA و RA و LV و RV ، والذي أكده (B') ECM في مرحلة E14.5. (C) يوضح التشخيص بالموجات فوق الصوتية لعيب الحاجز البطيني (VSD) مع تدفق اللون التدفق عبر LV و RV ، والذي أكده (C') ECM في مرحلة E16.5. (D) يظهر Echo و (D') ECM DORV مع VSD بين LV و RV مع الشرايين الكبيرة جنبا إلى جنب (الشريان الأورطي هو الحق في الشريان الرئوي) في المرحلة E14.5. (ه) يوضح التشخيص بالموجات فوق الصوتية للجذع الشرياني المستمر (PTA) الاتصال بين LV و RV مع مجرى تدفق واحد يتجاوز كلا البطينين (PTA). (ه') يتم تأكيد هذا المرض من قبل ECM في مرحلة E14.5. شريط المقياس: 0.5 مم. AO: الشريان الأورطي ، AVSD: عيب الحاجز الأذيني البطيني ، Cd: الذيلية ، Cr: الجمجمة ، L: اليسار ، LA: الأذين الأيسر ، LV: البطين الأيسر ، PA: الشريان الرئوي ، PTA: الجذع الشرياني المستمر ، R: اليمين ، RA: الأذين الأيمن ، RV: البطين الأيمن ، VSD: عيب الحاجز البطيني. شريط المقياس: 0.5 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| مرحلة | طول التاج إلى الردف (مم) | منطقة الجنين (مم2) | منطقة القلب (مم2) | منطقة القلب / منطقة الجنين |
| ه١٢٫٥ | 7.9 ± 0.8 (ن = 77) | 23.2 ± 5 (ن = 77) | ||
| ه١٣٫٥ | 10.5 ± 0.9 (ن = 92) | 40.9 ± 7 (ن = 92) | ||
| ه١٤٫٥ | 12.5 ± 0.9 (ن = 101) | 57.6 ± 8 (ن = 101) | 2.9 ± 0.5 (ن = 70) | 0.050 ± 0.004 (ن = 70) |
| ه١٥٫٥ | 14.1 ± 0.5 (ن = 134) | 71.4 ± 6 (ن = 134) | 3.8 ± 0.4 (ن = 87) | 0.053 ± 0.004 (ن = 87) |
| ه١٦٫٥ | 15.4 ± 0.6 (ن = 112) | 82.7 ± 6 (ن = 112) | 4.9 ± 0.5 (ن = 87) | 0.058 ± 0.007 (ن = 87) |
| ه١٧٫٥ | 16.6 ± 0.4 (ن = 211) | 96.9 ± 7 (ن = 211) | 6.1 ± 0.6 (ن = 146) | 0.063 ± 0.004 (ن = 146) |
| ه١٨٫٥ | 17.7 ± 0.6 (ن = 139) | 112.1 ± 8 (ن = 139) | 7.1 ± 0.8 (ن = 93) | 0.063 ± 0.005 (ن = 93) |
| ه١٩٫٥ | 18.7 ± 0.7 (ن = 57) | 126.7 ± 8 (ن = 57) | 7.7 ± 0.7 (ن = 36) | 0.062 ± 0.005 (ن = 36) |
الجدول 1: الملف التنموي لنمو الجنين.
| ه١٤٫٥ | ه١٦٫٥ | ه١٨٫٥ | المولود الجديد | |
| 70٪ إيثانول | 1 ساعة | 1.5 ساعة | 3 ساعات | 4 ساعات |
| 95٪ إيثانول | 35 دقيقة | 45 دقيقة | 1 ساعة | 1 ساعة |
| 95٪ إيثانول | 35 دقيقة | 45 دقيقة | 1 ساعة | 1 ساعة |
| 100٪ إيثانول | 15 دقيقة | 15 دقيقة | 30 دقيقة | 6 دقائق |
| زيلين 1 | 20 دقيقة | 30 دقيقة | 40 دقيقة | 30 دقيقة |
| زيلين 2 | 20 دقيقة | 30 دقيقة | 40 دقيقة | 30 دقيقة |
| الشمع 1 | 20 دقيقة | 20 دقيقة | 20 دقيقة | 30 دقيقة |
| الشمع 2 | 20 دقيقة | 20 دقيقة | 20 دقيقة | 30 دقيقة |
| الشمع 3 | ضحاها | ضحاها | ضحاها | ضحاها |
الجدول 2: بروتوكول لتضمين الأجنة على أساس الأيام الجنينية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا لفهم الآليات المرضية لعيوب القلب الخلقية. تحاول البروتوكولات التي نقدمها في هذه الدراسة تبسيط وتوحيد عملية تقييم عيوب قلب الجنين الفئران. ومع ذلك ، هناك خطوات مهمة يجب ملاحظتها أثناء البروتوكول. تنمو أجنة الفئران بشكل ملحوظ خلال كل يوم من أيام الحمل ، ويمكن تحديد الوقت الصحيح لحصاد الفأر عن طريق إجراء مخطط صدى القلب للجنين بدقة. يمكن استخدام مخطط صدى القلب الجنيني لفحص أمراض القلب والأوعية الدموية للجنين. تسمح صورة 2D بتحديد التشريح غير الطبيعي ووظيفة القلب ، بمساعدة دوبلر الملون لفحص تدفق الدم والكشف عن أي اتصالات بين غرف القلب أو التدفق غير الطبيعي ومسارات التدفق. لتحديد تشخيص أمراض الشرايين التاجية ، يتم فحص الأجنة من اليوم الجنيني E14.5 عند اكتمال حاجز مجرى التدفق وتشكيل غرفة القلب. قد يعكس المسح في المراحل المبكرة تأخر النمو.
علم أمراض الأنسجة هو المعيار لتوصيف CHDs8 باستخدام ميكروتوم متبوعا بتصور المجهر البصري. العيب الرئيسي للطريقة القياسية هو عدم وجود عرض 3D بديهية من هياكل القلب والأوعية الدموية للتشخيص والحد من عدم تقديم وجهات نظر مختلفة من العينات. علم الأنسجة ECM هو الطريقة الأكثر فعالية من حيث الوقت لتوصيف عيوب القلب. في حالة عدم توفر ECM ، يمكن استخدام ميكروتوم لتقسيم الجنين وتحديد الأنماط الظاهرية للقلب. الخيارات الأخرى للحصول على تصوير القلب هي إجراء تصوير بالرنين المغناطيسي عالي الإنتاجية وعالي الدقة (MRI) أو التصوير المقطعي المحوسب (CT). أحد الجوانب الرئيسية للتصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي المحوسب هو أنه يمكن تصوير أجنة متعددة في وقت واحد. ومع ذلك ، حتى بعد التصوير الظاهري بالموجات فوق الصوتية أو التصوير المقطعي المحوسب أو التصوير بالرنين المغناطيسي ، يلزم وجود علم أمراض الأنسجة لتأكيد أي تشخيص لأمراض الشرايين التاجية.
باستخدام تصوير ECM لعلم الأنسجة ، يتم تصوير الجنين بشكل متسلسل بعد كل قطع باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مثبت فوق الميكروتوم المنزلق التلقائي. تسمح الصور الفردية التي تم جمعها من ECM بإعادة بناء 3D اللاحقة وتسمح بإعادة تقطيع العينات رقميا في أي مستوى تصوير دون إعادة التقاط الصور 8,11. تتيح هذه العملية إجراء تقييم شامل لتشريح القلب ، والذي يمكن استخدامه في مراحل النمو المختلفة. علاوة على ذلك ، يمكن استرداد الشرائح الفردية من الميكروتوم أثناء جمع البيانات من معدات ECM. على الرغم من أن ECM histopathology هو المعيار الذهبي لتقييم أي شذوذ هيكلي في القلب ، إلا أن هناك قيودا على توفر المعدات والبرامج ووقت التشغيل لكل جنين. يمكن أن يختلف وقت التشغيل لتقسيم القلب الجنيني من 1-3 ساعات لكل عينة ، اعتمادا على حجمه. نظرا لتعقيد المعدات ، يجب على الباحثين التحقق بانتظام من الكمبيوتر للتأكد من تسجيل منطقة الاهتمام داخل الحقل. يجب على الباحثين أيضا فحص العينة للتأكد من عدم وجود نشارة شمع البارافين تعيق العينة من الماسح الضوئي بالليزر.
توفر ECM وإعادة الإعمار 3D اللاحقة تقييما كاملا عالي الدقة لأي عيب هيكلي في القلب بغض النظر عن خطة تضمين العينة. ساعدت هذه البروتوكولات في تشخيص مجموعة من أمراض الشرايين التاجية بنجاح وسمحت لنا بفهم التطور الجنيني القلبي في نماذج الفئران والأمراض المتعلقة بالطفرات الجينية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح في هذه المخطوطة.
Acknowledgments
اي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
