Summary
Este artigo detalha os métodos diagnósticos de cardiopatia congênita murina (DCC) usando ecocardiografia fetal, necropsia e captura de imagem de fluorescência episcópica (EFIC) usando microscopia confocal episcópica (ECM) seguida de reconstrução tridimensional (3D).
Abstract
As cardiopatias congênitas (DCC) são as principais causas de morte infantil nos Estados Unidos. Na década de 1980 e anteriores, a maioria dos pacientes com DCC moderada ou grave morreu antes da idade adulta, com a mortalidade máxima durante a primeira semana de vida. Avanços notáveis em técnicas cirúrgicas, abordagens diagnósticas e manejo médico levaram a melhorias marcantes nos resultados. Para atender às necessidades críticas de pesquisa da compreensão de defeitos cardíacos congênitos, os modelos murinos forneceram uma plataforma de pesquisa ideal, pois têm anatomia cardíaca muito semelhante à dos seres humanos e taxas de gestação curtas. A combinação de engenharia genética com ferramentas de fenotipagem de alto rendimento permitiu a replicação e o diagnóstico de defeitos cardíacos estruturais para elucidar ainda mais as vias moleculares por trás das DCC. O uso da ecocardiografia fetal não invasiva para rastrear os fenótipos cardíacos em modelos de camundongos, juntamente com a alta fidelidade da captura de imagem de fluorescência episcópica (EFIC) usando a histopatologia da microscopia confocal episcopada (ECM) com reconstruções tridimensionais (3D), permite uma visão detalhada da anatomia de vários defeitos cardíacos congênitos. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho completo desses métodos para obter um diagnóstico preciso de defeitos cardíacos congênitos murinos. A aplicação deste protocolo de fenotipagem a organismos modelo permitirá um diagnóstico preciso de DCC, produzindo insights sobre os mecanismos da DCC. Identificar os mecanismos subjacentes da DCC oferece oportunidades para potenciais terapias e intervenções.
Introduction
As cardiopatias congênitas (DCC) são o defeito congênito neonatal mais comum 1,2, acometendo cerca de 0,8%-1,7% dos neonatos e resultando em mortalidade e morbidade neonatais significativas3. A etiologia genética é fortemente indicada com DCC 4,5. Modelos de camundongos geneticamente modificados têm sido amplamente utilizados para entender a complexidade das DCCs e os mecanismos que as causam devido aos camundongos terem corações de quatro câmaras e sequências de DNA de desenvolvimento cardíaco comparáveis em fetos de camundongos e humanos6. Identificar o fenótipo dos mutantes de camundongos é o primeiro passo fundamental para caracterizar a função do gene alvo. Modelos de camundongos que expressam efeitos de dosagem gênica, nos quais uma única mutação genética pode resultar em um espectro de defeitos cardíacos que imitam as DCCs humanas, são importantes para a compreensão da complexidade das DCCs e dos mecanismos que as causam.
Este artigo descreve um pipeline para caracterizar fenótipos cardíacos em modelos de camundongos. Os métodos aplicados utilizam o ecocardiograma fetal 7, seguido de necropsia e histopatologia da MEC7,8, que pode exibir a anatomia detalhada do desenvolvimento de fenótipos cardíacos murinos. O ecocardiograma fetal é uma modalidade não invasiva que permite a visualização direta de múltiplos embriões com resolução de imagem razoável. Além disso, um ecocardiograma fetal fornece uma determinação rápida do número total de embriões em uma ninhada, seus estágios de desenvolvimento e a orientação relativa e localização no corno uterino. Usando um Doppler/fluxo de cor espectral, embriões anormais podem ser identificados com base na estrutura, no distúrbio hemodinâmico, na restrição de crescimento ou no desenvolvimento de hidropisia hidropissexual. Como o estudo do ecocardiograma fetal é uma técnica não invasiva, ele pode ser usado para fazer a varredura em vários dias e observar as alterações na hemodinâmica ou morfologia cardíaca. A obtenção de imagens de alta qualidade de ecocardiogramas fetais requer prática e habilidade, pois defeitos cardíacos específicos podem ser perdidos devido à falta de experiência e conhecimento. Devido a isso, uma análise mais definitiva da morfologia cardíaca pode ser obtida através de uma combinação de necropsia e histopatologia da MEC. A necropsia fornece visualização direta da estrutura do arco, das relações relativas da aorta e da artéria pulmonar, do tamanho dos ventrículos e átrios, da posição do coração em relação ao tórax e das estruturas broncopulmonares. No entanto, características internas, como as válvulas cardíacas e a espessura da parede, podem ser difíceis de avaliar apenas através da necropsia. Assim, a histopatologia da ECM é recomendada para um diagnóstico conclusivo. A histopatologia da ECM é uma técnica de visualização de alta resolução que permite a reconstrução 2D e 3D da pilha de imagens9. Essas imagens são obtidas por meio de imagens fluorescentes episcoscópicas seriais de uma amostra embutida em parafina, pois é finamente seccionada em um intervalo consistente por um micrótomo automático. Ao contrário da histologia clássica, as imagens são capturadas como uma seção antes de serem cortadas do bloco, de modo que todas as imagens sejam capturadas dentro do mesmo quadro de referência. Devido a isso, a pilha de imagens 2D produzida pela histopatologia da ECM pode ser facilmente e de forma confiável reconstruída em três dimensões. Isso é feito usando um visualizador DICOM, que permite a visualização 3D das imagens nos três planos anatômicos: coronal, sagital e transversal. A partir dessas reconstruções 3D de alta resolução, um diagnóstico cardíaco definitivo pode ser feito. A aplicação dessas três diferentes modalidades de visualização, individualmente ou em combinação, pode fornecer caracterizações precisas de defeitos cardíacos estruturais em embriões de camundongos.
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Protocol
O uso de camundongos para esses estudos é necessário, pois os camundongos têm corações de quatro câmaras que podem imitar as DCCs humanas. Os camundongos receberam cuidados veterinários e foram alojados na instalação de cuidados com animais credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC) da instituição. Protocolos rigorosos foram seguidos para minimizar o desconforto, o estresse, a dor e a lesão dos camundongos. Os ratos foram sacrificados usando gás CO2 , o que é aceitável para pequenos roedores de acordo com as Diretrizes da Associação Médica Veterinária Americana sobre Eutanásia. Os estudos em camundongos neste manuscrito foram realizados com um protocolo IACUC aprovado na Universidade de Pittsburgh.
1. Ecocardiograma fetal
NOTA: Um ecocardiograma é uma ferramenta poderosa para identificar malformação cardiovascular e defeitos extracardíacos em camundongos. Devido ao pequeno tamanho dos embriões de camundongos (cerca de 1-2 mm no meio da gestação, 3,5 mm no nascimento), é necessário equipamento ecocardiográfico de ultra-alta frequência com biomicroscopia de ultrassom (UBM). O UBM fornece diferentes sondas de alta frequência (30-50 MHz) com uma pequena janela de imagem (15 mm x 14 mm) que fornece a resolução (30 μm axial x 68 μm lateral) para visualizar um feto de camundongo de cada vez. Um transdutor de 40 MHz fornece imagens de alta resolução para identificar fenótipos cardiovasculares7.
- Ligue a máquina de ecocardiograma e selecione o programa Cardiologia.
NOTA: O protocolo a seguir pode ser usado para qualquer fundo de rato do dia embrionário (E)14.5 a 19.5. - Anestesiar o rato desejado em uma câmara de indução anestésica. Induzir anestesia usando uma concentração de 4% de isoflurano e oxigênio medicinal a uma taxa de fluxo de 1 L / min e reduzi-lo para 2%-3% para manutenção.
- Coloque o mouse na plataforma de imagem rapidamente. A plataforma de imagem tem aço aquecido para manter o mouse aquecido durante o procedimento. Coloque a boca e o nariz do rato no cone anestésico do nariz. Prenda os membros com fita adesiva para evitar o movimento. Monitore a frequência cardíaca para garantir que ela permaneça entre 400-450 bpm.
- Monitore a temperatura usando uma sonda de termômetro retal e certifique-se de que ela descansa a 37 °C ± 0,5 °C. Monitore a respiração para evitar hipóxia. Mantenha uma força suave na sonda para evitar danos.
NOTA: Uma lâmpada de calor pode ser ajustada acima do mouse para evitar a hipotermia enquanto estiver sob e para se recuperar da anestesia. A pomada oftálmica Petrolatum pode ser usada como lubrificante para evitar olhos secos. - Remova a pele do tórax e do abdômen usando creme depilatório. Aplique o creme e aguarde 3 min antes de remover. Limpe a área com etanol a 70%. O etanol funciona melhor do que a água como lubrificante de barbear.
- Aqueça o gel de ultrassom a uma temperatura corporal normal. Aplique o gel de ultrassom generosamente e coloque o transdutor no abdômen para orientá-lo em um plano horizontal e identificar a bexiga na tela. Uma vez que a bexiga é identificada, varredura cranialmente da bexiga e procure o feto. Meça o comprimento coroa-garupa para determinar a idade gestacional10 (Figura 1 e Tabela 1).
NOTA: Altere as posições do transdutor para visualizar diferentes planos, incluindo os planos transversais de imagem de quatro câmaras, sagital e frontal/coronal7 (Figura 1). - Use o Doppler colorido para analisar o fluxo sanguíneo do coração.
- Coloque o rato de volta na gaiola se os embriões não tiverem atingido a fase pretendida. Caso contrário, prepare o mouse para a colheita.
NOTA: Certifique-se de que o rato já está acordado e a recuperar bem da anestesia antes de o colocar de volta na gaiola. - Desligue o isoflurano e o oxigênio, limpe a área de trabalho e desligue a máquina.
NOTA: É importante remover o gel do transdutor.
2. Necropsia
NOTA: Uma vez que os fenótipos cardíacos anormais são suspeitos usando ecocardiografia fetal, os fetos são coletados e fixados via submersão de corpo inteiro na solução fixadora: fosfato de formalina tamponada a 10% ou paraformaldeído (PFA) a 4%. Inspecione a morfologia externa e interna da amostra, procurando anormalidades anatômicas macroscópicas ou malformações.
- Prepare o mouse.
- Se o rato for um adulto, eutanasie o rato utilizando um protocolo CO2 padrão. Use fórceps ou tesoura dissecante para fazer incisões (cerca de 3 cm) no tórax lateral e abdômen para permitir a penetração do fixador nos órgãos internos.
NOTA: A amostra deve ser fixada durante, pelo menos, 24 horas antes da necropsia, se o embrião for superior a E14.5.
- Se o rato for um adulto, eutanasie o rato utilizando um protocolo CO2 padrão. Use fórceps ou tesoura dissecante para fazer incisões (cerca de 3 cm) no tórax lateral e abdômen para permitir a penetração do fixador nos órgãos internos.
- Analise o exterior do corpo.
- Configure o software para salvar as imagens com um nome, incluindo a identificação da amostra, a ampliação do microscópio e o conteúdo da imagem.
NOTA: A ampliação de 1,0x a 3,2x deve ser adequada para a imagem da maioria das estruturas em camundongos E14.5 ou mais. - Coloque o mouse na placa sob a lente do estereomicroscópio. Encha a placa com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para cobrir completamente a amostra para evitar a desidratação e reflexão nas imagens. Ajuste a ampliação para que a tela inclua todo o embrião e, em seguida, tire uma foto dos lados esquerdo e direito do embrião.
NOTA: O fundo da placa deve ser revestido em parafina, silício ou outro substrato para facilitar a fixação. - Prenda a amostra através de sua garganta, virada para cima, e tire outra foto.
NOTA: Oriente o pino ligeiramente para cima para garantir que nenhuma estrutura importante da cavidade torácica seja perfurada.
- Configure o software para salvar as imagens com um nome, incluindo a identificação da amostra, a ampliação do microscópio e o conteúdo da imagem.
- Analise o peito.
- Ao levantar a pele no meio do pescoço com fórceps, corte a pele em direção a ambas as axilas com a tesoura antes de cortar a pele ao longo do eixo mediano em direção à cauda. Em seguida, corte a pele do umbigo para as pernas. Prenda a amostra através de seus pulsos e tornozelos.
NOTA: Tenha cuidado para cortar apenas a pele. Recomenda-se segurar as lâminas da tesoura horizontalmente ou inclinadas para cima. - Para quebrar o tecido conjuntivo, levante a pele com um par de pinças enquanto mantém o tecido subjacente no lugar com o outro par. Fixe a amostra através da pele para ajudar a expor o tórax e o abdômen (Figura 2).
NOTA: Muito alongamento durante a fixação, corte ou raspagem pode resultar em danos nos tecidos. - Tire uma foto dos músculos expostos e, em seguida, raspe suavemente os músculos para expor as costelas.
- Tire uma foto das costelas expostas. Separe as costelas do diafragma e corte as costelas de ambos os lados, tanto quanto possível, no eixo lateral em direção ao pescoço.
- Exponha o coração removendo as costelas cortadas. Tire uma foto do coração.
- Remova o timo descascando-o com um par de fórceps. Use o outro par de fórceps para estabilizar a base do timo para evitar rasgar quaisquer vasos subjacentes. Tire fotos do coração e dos grandes vasos.
NOTA: O uso de pinos para esticar algumas estruturas adjacentes pode ajudar a obter melhores visualizações de imagem. Além disso, tire fotos separadas focadas nas grandes artérias, coração e outras estruturas de interesse, pois elas podem não estar em foco juntas.
- Ao levantar a pele no meio do pescoço com fórceps, corte a pele em direção a ambas as axilas com a tesoura antes de cortar a pele ao longo do eixo mediano em direção à cauda. Em seguida, corte a pele do umbigo para as pernas. Prenda a amostra através de seus pulsos e tornozelos.
- Analise o abdômen.
- Puxe o diafragma para removê-lo e expor o fígado. Tire uma foto.
- Prenda de volta o fígado para expor o estômago e o pâncreas. Tire uma foto.
- Corte o esôfago. Remova o cólon e os intestinos, puxando-os para fora com fórceps. Corte logo acima do fígado e remova-o para revelar os rins e as glândulas suprarrenais. Tire uma foto.
NOTA: Os órgãos removidos devem ser mantidos na solução fixadora.
- Isole o tórax para a análise da MEC.
- Corte o tórax inferior ao longo de uma linha reta entre o fígado e os pulmões. Corte a cabeça alto o suficiente para não cortar as ramificações das artérias carótidas.
- Remova suavemente as costelas laterais, mantendo as costelas dorsais e a coluna vertebral. Descasque e raspe a gordura dorsal.
- Separe o tórax do resto do corpo e coloque-o em uma solução de fosfato de formalina tamponada a 10%.
3. Incorporação
- Decantar o fixador em uma garrafa de resíduos perigosos apropriada. Lave as amostras com 1x PBS por 15 min três vezes.
- Use concentrações crescentes de etanol e xileno para desidratar as amostras. A duração de todas as etapas a seguir depende do estágio dos embriões. Consulte a Tabela 2 para obter detalhes.
NOTA: Deve-se ter cuidado ao mudar as soluções para evitar danificar as amostras. Os parâmetros ideais para o processamento de amostras podem ser ajustados empiricamente. O xileno irá dissolver certos plásticos; devem ser utilizados instrumentos e recipientes de vidro. - Substitua o xileno por parafina pela duração desejada. Deixar os frascos numa incubadora a 65 °C durante o período adequado (quadro 2).
- Use parafina fresca para incorporar as amostras na posição desejada.
NOTA: Recomenda-se orientar a amostra para o meio do bloco de parafina, com seu lado dorsal voltado para o topo e o lado posterior voltado para a frente do bloco. Ao orientar a amostra, lembre-se de que a amostra está embutida com o bloco virado de cabeça para baixo.
4. Microscopia confocal episcópica (MEC)
NOTA: Após a incorporação adequada, os embriões são submetidos à coleta de imagens em série via ECM para análise histopatológica. Lâminas individuais podem ser recuperadas do micrótomo para estudos adicionais.
- Retire o bloco de parafina do congelador a -20 °C e retire os moldes metálicos.
- Use uma lâmina de barbear para aparar a cera nas bordas e na parte de trás do. Corte a cera que rodeia a amostra até que esteja envolta num pequeno quadrado de cera preso à.
NOTA: Tenha extremo cuidado ao manusear lâminas. - Use a alavanca de metal para prender o bloco de parafina contra o estágio de corte do micrótomo. Selecione a função MAN (manual) no Modo de execução, levante a superfície da parafina perto da lâmina e execute alguns slides para garantir que a lâmina entre em contato com o bloco de parafina.
- Abra o aplicativo LAS AF e selecione MatrixScreener. Selecione Matriz Regular Única e carregue o modelo apropriado salvo anteriormente. Clique no botão Quick LUT para mudar para ombre branco e laranja.
- Selecione Configurar trabalhos e arraste o laser visível de 405 nm até o máximo. Combine a borda esquerda do bloco de espectro com a linha de 405 nm e arraste a borda direita para a linha de 800 nm. Marque a opção Pinhole e inicie a Visualização dinâmica.
- Ajuste a posição da projeção a laser para centralizar a amostra na tela e ajuste o botão Zoom para ~20x. Para otimizar a resolução, defina o ganho para 1.250 V e maximize a área azul usando o botão de foco; em seguida, redefina o ganho para aproximadamente 750 V para geração de imagens.
NOTA: Valores específicos podem variar dependendo da condição do embrião. - Alterne o método de corte para Auto, defina a espessura para cerca de 50 μm e execute os slides. Pare de cortar quando os pulmões e as vias aéreas estiverem à vista.
- Escolha uma espessura de corte entre 8-10 μm e pare a Visualização dinâmica. Abra o Microtome Communicator para iniciar a geração de imagens. Verifique se a pasta de armazenamento temporário está vazia antes de coletar imagens.
- Pare de cortar quando nenhuma estrutura cardíaca adicional for visualizada. Feche o aplicativo Microtome Communicator e exporte o arquivo temporário para uma série de imagens .tiff por meio do software de processamento de imagem para reconstruções 3D posteriores.
5. Reconstrução tridimensional (3D)
NOTA: O objetivo da reconstrução 3D é processar uma pilha de imagens 2D de imagens ECM em vídeos 3D nas orientações coronal, sagital e transversal e usar os vídeos 3D para o diagnóstico das anormalidades estruturais e anatômicas nas amostras.
- Abra a pilha de imagens ECM no software de processamento de imagens.
- Arraste e solte a imagem dos arquivos no software de processamento de imagem. Inverta as imagens ECM horizontalmente selecionando Imagem > Transformar > Inverter horizontalmente na barra de menus.
- Salve a imagem invertida e feche o software de processamento de imagem.
- Importe a pilha de imagens ECM no software de visualização DICOM.
- Arraste e solte as imagens ECM viradas horizontalmente no software de visualização DICOM. Verifique se há uma borda azul clara ao redor da lista de exemplo, ou imagens podem ser adicionadas a uma pasta de exemplo existente.
- Selecione os links ou os arquivos a serem copiados para o banco de dados quando a janela pop-up for exibida. Um novo exemplo aparecerá na lista de exemplos com o mesmo nome do arquivo copiado para o software de exibição DICOM.
- Clique no arquivo recém-adicionado para abri-lo.
- Realizar reconstrução 3D.
- Uma vez que o arquivo é aberto, clique no menu Ferramentas de reconstrução 2D / 3D na barra de ferramentas e selecione 3D MPR.
- Para Resolução de Pixel X e Resolução de Pixel Y, insira a resolução da imagem fornecendo o zoom usado durante a geração de imagens de ECM. Para o Intervalo de fatia, insira a espessura da fatia usada para cortar durante a imagem de ECM.
NOTA: A resolução da câmera muda dependendo do zoom da câmera e pode diferir de câmera para câmera.
- Use as diferentes ferramentas da guia Ferramentas no lado esquerdo para ajustar as pilhas de imagens conforme desejado.
- Use a ferramenta WW/WL para ajustar a largura da janela e o nível da janela. Clique e arraste a ferramenta na imagem para cima para diminuir o brilho da imagem e para baixo para aumentá-la. Clique e arraste a ferramenta na imagem para a direita para diminuir o contraste da imagem e para a esquerda para aumentá-la.
NOTA: As configurações ideais de WW/WL para uma estrutura podem estar abaixo do ideal para outra. Por esse motivo, recomenda-se a criação de vídeos separados para visualizar diferentes estruturas. - Use a ferramenta Panorâmica para arrastar as imagens para as posições desejadas. Use a ferramenta Zoom para ampliar ou reduzir a imagem conforme desejado e a ferramenta Girar para girar a imagem conforme desejado.
Observação : ampliar imagens pode causar diminuição da qualidade da imagem. Seja cauteloso ao girar imagens, pois isso pode fazer com que os eixos se invertam.
- Use a ferramenta WW/WL para ajustar a largura da janela e o nível da janela. Clique e arraste a ferramenta na imagem para cima para diminuir o brilho da imagem e para baixo para aumentá-la. Clique e arraste a ferramenta na imagem para a direita para diminuir o contraste da imagem e para a esquerda para aumentá-la.
- Clique e arraste o eixo colorido do primeiro painel. Observe como a rotação desse eixo altera a orientação dos outros dois painéis. Gire os eixos dos três painéis até que os três painéis representem vistas coronais, sagitais e transversais da amostra.
NOTA: Ao reorientar as amostras, mantenha a orientação anterior/posterior correta. - Gerar vídeos.
- Uma vez que todos os três painéis estejam devidamente posicionados, orientados e iluminados, clique no painel que representa a visão coronal.
- Clique em Exportação de filme no lado direito da barra de menus. Clique em Lote e arraste os controles deslizantes De e Para para abranger toda a região de interesse. Para Intervalo, selecione a opção Igual a Espessura . Salve o vídeo indicando a orientação da exibição.
- Revise o vídeo para ver se as estruturas de interesse podem ser adequadamente identificadas. Caso contrário, use as ferramentas (etapa 5.4) para reajustar os vídeos conforme necessário e salvá-lo novamente.
- Repita a etapa 5.6 para vistas transversais e sagitais. Diagnosticar as amostras usando vídeos reconstruídos.
NOTA: Assista atentamente aos vídeos em cada orientação para fazer uma avaliação completa se a amostra apresenta alguma anormalidade anatômica ou fenótipos de doença (Figura 3).
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Representative Results
Os embriões de camundongos com defeitos hemodinâmicos significativos foram observados como embrionários letais. Uma grande variedade de DCC pode ser identificada através do ecocardiograma fetal não invasivo de alto débito, utilizando diferentes pontos de vista (Figura 1).
Defeitos septais: As DCC mais comuns são defeitos septais, como um defeito do septo ventricular (CIV), um defeito do septo atrioventricular (DSAV) e um defeito do septo atrial (TEA)1. VSD ou AVSD pode ser facilmente visualizado usando imagens 2D e imagens de fluxo de cores. O fluxo sanguíneo através dos ventrículos ou entre os átrios e os ventrículos pode ser facilmente identificado (Figura 3). O TEA é difícil de distinguir com forame oval patente em um feto.
Anomalias da via de saída: Como mostra a Figura 3, o fluxo na artéria pulmonar principal é através do fluxo ascendente da aorta em embriões normais. Em embriões com uma dupla saída do ventrículo direito (DORV), ambas as grandes artérias podem ser vistas surgindo do ventrículo direito. O DORV também está associado ao VSD (Figura 3D) e pode ser identificado usando o fluxo de cores. No entanto, dado o pequeno tamanho dos embriões, o DORV às vezes não pode ser distinguido de forma confiável da sobreposição da aorta, atresia pulmonar ou truncus arteriosus persistente (PTA). Na ATP, apenas um fluxo da via de saída pode ser observado no ecocardiograma fetal (Figura 3E). A estrutura detalhada do arco e a artéria pulmonar principal podem ser observadas por meio de necropsia (Figura 2E,F).
A necropsia pode diagnosticar rapidamente o estado situs no tórax e abdômen e a posição cardíaca em relação ao tórax (levocardia (Figura 2C-E) ou dextrocardia). As estruturas das vias de saída e o tamanho relativo dos átrios e ventrículos podem ser facilmente visualizados (Figura 2E,F).
A histopatologia da MEC é a técnica padrão-ouro para avaliar qualquer anomalia cardíaca estrutural 8,11,12. Ele fornece uma resolução e detalhes incomparáveis para as estruturas dos embriões. A reconstrução tridimensional utilizando diferentes planos e vistas pode facilmente identificar a relação entre as grandes artérias e ventrículos (Figura 3) e o defeito entre os ventrículos e átrios.
Figura 1: Os locais para medir o comprimento coroa-garupa em imagens de ecocardiograma 2D de embriões para determinar a idade gestacional. Imagens de ecocardiograma 2D de embriões em (A) E11.5, (B) E12.5, (C,D) E13.5-E14.5. (D) O embrião doente é menor do que seu irmão (C) e nota-se que tem uma aparência "mole" com hidropisia (seta). (A-C) Embriões vivos demonstram órgãos distintos. O modo VB representativo com imagens coloridas do coração E14.5 em uma visão coronal de 4 câmaras inclinada anteriormente à imagem das vias de saída (E) demonstram septo ventricular intacto com a relação normal das grandes artérias, o que é confirmado com a ECM na visão coronal (E'). (F) A visão sagital representativa do coração E14.5 demonstra as vias de saída do ventrículo esquerdo e do ventrículo direito com a aorta ascendente (AO) apontada cranialmente e a artéria pulmonar apontada posteriormente (em direção à coluna vertebral), o que é confirmado com a MEC na visão sagital (F'). (G) Visão transversal representativa do ventrículo esquerdo (VE) e do ventrículo direito (VD), que é confirmada com MEC na visão transversal (G'). (H) Uma visão transversal na base do coração na MEC demonstra uma válvula aórtica (AV) e uma válvula pulmonar (PV) distintas e separadas. A imagem de visão transversal representativa da ECM de tronco arterial persistente (PTA) demonstra a artéria pulmonar esquerda e a artéria pulmonar direita surgindo posteriormente da artéria troncular persistente indivisa, com a artéria carótida esquerda surgindo anteriormente e cranialmente da artéria troncular persistente. Abreviaturas: A: anterior, AO: aorta, AV: valva aórtica, Cd: caudal, Cr: craniana, DAO: aorta descendente, L: esquerda, LA: átrio esquerdo, ACL: artéria carótida esquerda, LPA: artéria pulmonar esquerda, VE: ventrículo esquerdo, P: posterior, PA: artéria pulmonar, PTA: trégua arterial persistente, R: direita, AR: átrio direito, RPA: artéria pulmonar direita, VD: ventrículo direito. Barra de escala: 0,5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas de uma necropsia para observar anormalidades cardiovasculares . (A) Um embrião preso a um prato dissecante de fundo preto sem fenótipos óbvios. A imagem mostra a anatomia macroscópica da cabeça, digitais, cavidade torácica e abdômen. (B) A derme é removida do filhote, revelando glândulas submandibulares, caixa torácica e abdômen. (C) A caixa torácica é levantada, revelando a anatomia macroscópica da cavidade torácica, incluindo o timo, coração, pulmões e diafragma. (D) Uma visão ampliada do peito com a caixa torácica removida. (E) O timo é removido, revelando grandes vasos e traqueia. (F) Uma visão ampliada de grandes embarcações. Abreviaturas: AAO: aorta ascendente, D: diafragma, LA: átrio esquerdo, LCA: artéria carótida esquerda, LSVC: veia cava superior esquerda, VE: ventrículo esquerdo, P: pericárdio, AR: átrio direito, Rb: costelas, RCA: artéria carótida direita, RL: pulmão direito, CVRS: veia cava superior direita, VD: ventrículo direito, S: esterno, SCA: artéria subclávia direita, SMG: glândulas submandibulares, T: traqueia, Th: timo. Barra de escala: 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ecocardiograma fetal representativo (Eco) e imagens do microscópio confocal episcópico (ECM). (A) O ecocardiograma demonstra septo ventricular íntegro sem shunt interventricular e grandes artérias normais relacionadas no controle normal, confirmado por (A') ECM no estádio E14.5-15.5. (B) Detecção ultrassonográfica de um defeito do septo atrioventricular (DSAV). A ecoimagem na visão de 4 câmaras demonstra a comunicação entre LA, RA, LV e VD, confirmada pela MEC (B') no estágio E14.5. (C) O diagnóstico ultrassonográfico do defeito do septo ventricular (CIV) com fluxo colorido demonstra o fluxo através do VE e do VD, confirmado pela MEC (C') no estádio E16.5. (D) Eco e (D') ECM demonstram DORV com CIV entre VE e VD com grandes artérias lado a lado (a aorta está direita para a artéria pulmonar) no estágio E14.5. (E) O diagnóstico ultrassonográfico de truncus arteriosus persistente (PTA) demonstra comunicação entre VE e VD com uma única via de saída sobrepondo-se a ambos os ventrículos (PTA). (E') Esta patologia é confirmada pela ECM no estágio E14.5. Barra de escala: 0,5 mm. AO: aorta, DSAV: comunicação interventricular defeito, Cd: caudal, Cr: craniana, L: esquerda, AE: átrio esquerdo, VE: ventrículo esquerdo, PA: artéria pulmonar, PTA: tronco arterioso persistente, R: direita, AR: átrio direito, VD: ventrículo direito, CIV: comunicação interventricular. Barra de escala: 0,5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Palco | Comprimento da coroa-a-garupa (mm) | Área do feto (mm2) | Área do coração (mm2) | Área do coração/área do feto |
| E12,5 | 7,9 ± 0,8 (n = 77) | 23,2 ± 5 (n = 77) | ||
| E13,5 | 10,5 ± 0,9 (n = 92) | 40,9 ± 7 (n = 92) | ||
| E14,5 | 12,5 ± 0,9 (n = 101) | 57,6 ± 8 (n = 101) | 2,9 ± 0,5 (n = 70) | 0,050 ± 0,004 (n = 70) |
| E15,5 | 14,1 ± 0,5 (n = 134) | 71,4 ± 6 (n = 134) | 3,8 ± 0,4 (n = 87) | 0,053 ± 0,004 (n = 87) |
| E16,5 | 15,4 ± 0,6 (n = 112) | 82,7 ± 6 (n = 112) | 4,9 ± 0,5 (n = 87) | 0,058 ± 0,007 (n = 87) |
| E17,5 | 16,6 ± 0,4 (n = 211) | 96,9 ± 7 (n = 211) | 6,1 ± 0,6 (n = 146) | 0,063 ± 0,004 (n = 146) |
| E18,5 | 17,7 ± 0,6 (n = 139) | 112,1 ± 8 (n = 139) | 7,1 ± 0,8 (n = 93) | 0,063 ± 0,005 (n = 93) |
| E19,5 | 18,7 ± 0,7 (n = 57) | 126,7 ± 8 (n = 57) | 7,7 ± 0,7 (n = 36) | 0,062 ± 0,005 (n = 36) |
Tabela 1: Perfil do Desenvolvimento do Crescimento Fetal.
| E14,5 | E16,5 | E18,5 | Recém-nascido | |
| 70% Etanol | 1 h | 1,5 h | 5 . | 4 horas |
| 95% Etanol | 35 min | 45 min | 1 h | 1 h |
| 95% Etanol | 35 min | 45 min | 1 h | 1 h |
| 100% Etanol | 15 min | 15 min | 30 min | 6 min |
| Xileno 1 | 20 min | 30 min | 40 min | 30 min |
| Xileno 2 | 20 min | 30 min | 40 min | 30 min |
| Cera 1 | 20 min | 20 min | 20 min | 30 min |
| Cera 2 | 20 min | 20 min | 20 min | 30 min |
| Cera 3 | Durante a noite | Durante a noite | Durante a noite | Durante a noite |
Tabela 2: Protocolo para incorporação embrionária com base em dias embrionários.
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Discussion
Camundongos geneticamente modificados têm sido usados para entender os patomecanismos de defeitos cardíacos congênitos. Os protocolos que fornecemos neste estudo tentam agilizar e padronizar o processo de avaliação de defeitos cardíacos fetais murinos. No entanto, existem etapas críticas a serem observadas durante o protocolo. Os embriões de camundongos crescem significativamente durante cada dia de gestação, e o tempo correto para colher um camundongo pode ser determinado pela realização de um ecocardiograma fetal com precisão. O ecocardiograma fetal pode ser usado para rastrear a patologia cardiovascular fetal. Uma imagem 2D permite a identificação de anatomia anormal e função cardíaca, com a ajuda do Doppler colorido para examinar o fluxo sanguíneo e detectar quaisquer comunicações entre as câmaras do coração ou vias de saída e entrada anormais. Para determinar o diagnóstico de DCC, os fetos são escaneados a partir do dia embrionário E14.5, quando a septação da via de saída e a formação da câmara cardíaca são concluídas. A varredura em estágios anteriores pode refletir o atraso no desenvolvimento.
A histopatologia é o padrão para caracterizar as DCCs8 usando um micrótomo seguido de visualização em microscópio óptico. A principal desvantagem do método padrão é a falta de uma exibição 3D intuitiva das estruturas cardiovasculares para o diagnóstico e a limitação na falta de fornecer diferentes visões das amostras. Uma histologia de ECM é o método mais eficiente em termos de tempo para caracterizar defeitos cardíacos. Se a ECM não estiver disponível, um micrótomo pode ser usado para seccionar o embrião e determinar fenótipos cardíacos. Outras opções para a obtenção de imagens cardíacas são a realização de ressonância magnética (MRI) de alta resolução e alto rendimento ou tomografia computadorizada (TC). Um aspecto fundamental da ressonância magnética ou tomografia computadorizada é que vários embriões podem ser fotografados simultaneamente; no entanto, mesmo após uma ultrassonografia, tomografia computadorizada (TC) ou fenotipagem por ressonância nuclear magnética (RNM), a histopatologia é necessária para confirmar qualquer diagnóstico de DCC.
Usando imagens de ECM para histopatologia, o embrião é fotografado em série após cada corte usando um microscópio confocal de varredura a laser montado sobre o micrótomo deslizante automático. As imagens individuais coletadas da MEC permitem reconstruções 3D subsequentes e permitem que as amostras sejam recortadas digitalmente em qualquer plano de imagem sem refazer as imagens 8,11. Tal operação permite uma avaliação abrangente da anatomia cardíaca, que pode ser usada em diferentes estágios de desenvolvimento. Além disso, slides individuais podem ser recuperados do micrótomo durante a coleta de dados do equipamento ECM. Embora a histopatologia da MEC seja o padrão-ouro para avaliar qualquer anomalia cardíaca estrutural, existem limitações com a disponibilidade do equipamento, software e tempo de execução por embrião. O tempo de execução para seccionar um coração embrionário pode variar de 1-3 h por amostra, dependendo do seu tamanho. Devido à complexidade do equipamento, os pesquisadores devem verificar regularmente o computador para se certificar de que a região de interesse dentro do campo está sendo registrada. Os pesquisadores também devem verificar a amostra para garantir que nenhuma aparador de cera de parafina obstrua a amostra do scanner a laser.
A ECM e a reconstrução 3D subsequente fornecem uma avaliação completa de alta resolução de qualquer defeito cardíaco estrutural, independentemente do plano de incorporação da amostra. Esses protocolos ajudaram a diagnosticar com sucesso uma série de DCCs e nos permitiram entender a embriogênese cardíaca em modelos murinos e patologias relacionadas a mutações genéticas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste manuscrito.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
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