Summary
Il presente protocollo fornisce una procedura passo-passo per la generazione, il mantenimento e l'invecchiamento riproducibili di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC). Questo metodo consente di coltivare e maturare organoidi cerebrali per periodi prolungati, il che facilita la modellazione dei processi coinvolti nell'invecchiamento cerebrale e nella patogenesi legata all'età.
Abstract
I modelli animali e cellulari attualmente disponibili non riassumono completamente la complessità dei cambiamenti che avvengono nell'invecchiamento del cervello umano. Un recente sviluppo di procedure che descrivono la generazione di organoidi cerebrali umani, derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC), ha il potenziale per trasformare radicalmente la capacità di modellare e comprendere l'invecchiamento del cervello umano e i relativi processi patogeni. Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per la generazione, il mantenimento, l'invecchiamento e la caratterizzazione degli organoidi cerebrali umani derivati da iPSC. Questo protocollo può essere implementato per generare organoidi cerebrali in modo riproducibile e funge da guida passo-passo, incorporando le ultime tecniche che si traducono in una migliore maturazione degli organoidi e nell'invecchiamento in coltura. Vengono affrontate questioni specifiche relative alla maturazione degli organoidi, alla necrosi, alla variabilità e agli effetti dei lotti. Nel loro insieme, questi progressi tecnologici consentiranno la modellazione dell'invecchiamento cerebrale in organoidi derivati da una varietà di donatori umani giovani e anziani, nonché individui affetti da disturbi cerebrali legati all'età, consentendo l'identificazione dei meccanismi fisiologici e patogeni dell'invecchiamento cerebrale umano.
Introduction
I modelli di malattia che invecchiano sono diventati sempre più rilevanti man mano che l'aspettativa di vita umana continua ad aumentare. Studi genomici su larga scala hanno scoperto popolazioni anziane con disregolazione dei processi molecolari e cambiamenti genetici che influenzano la qualità della vita1. Il processo di invecchiamento è caratterizzato da una generale perdita di funzionalità dell'organismo, compresa la perdita della funzione cognitiva, un aumento del rischio di disturbi neurodegenerativi e una serie di malattie croniche2.
Le attuali tecniche di coltura cellulare non rappresentano adeguatamente la natura multifattoriale dell'invecchiamento, poiché queste disfunzioni non possono essere adeguatamente replicate utilizzando mutazioni, tossine o infezioni3. I modelli animali che esplorano il processo di invecchiamento sono spesso associati a lunghi tempi sperimentali e costi elevati, ma portano con sé anche considerazioni etiche. L'uso di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da pazienti può chiarire i meccanismi molecolari che sono alla base della progressione della malattia poiché le iPSC consentono lo sviluppo naturale delle cellule nel tessuto maturo3. Le iPSC sono diventate il cavallo di battaglia di molti laboratori che studiano le malattie neurodegenerative, poiché la riprogrammazione cellulare delle cellule raccolte non sembra cancellare la malattia o le impronte di invecchiamento dei donatori4. Queste impronte ricapitolano i fenotipi cellulari che sono stati dimostrati in modelli umani e animali, rendendo le iPSC adatte per esaminare il deterioramento cellulare individuale del tessuto cerebrale altamente denso 5,6. Gli organoidi derivati da IPSC sono diventati il modello preminente per la coltura tridimensionale dei tessuti, consentendo interazioni cellula-cellula più complesse e una migliore ricapitolazione dello sviluppo. Sebbene utilizzati principalmente per i dati sullo sviluppo, gli organoidi sono stati sempre più applicati alla modellizzazione delle malattie, in particolare ai modelli per l'infiammazione, la neurodegenerazione e l'invecchiamento7. Sulla base di precedenti studi iPSC, gli organoidi conservano fenotipi di malattia e fenotipi cellulari nel contesto fisiologico delle connessioni di rete tessuto-simili 8,9. Tuttavia, la coltura di tessuti tridimensionali di determinate dimensioni può essere difficile, soprattutto per lunghi periodi di tempo.
Questo lavoro presenta un metodo dettagliato per la generazione riproducibile di organoidi cerebrali che consente al tessuto di maturare sostanzialmente in dimensioni per periodi più lunghi. La creazione di organoidi cerebrali è rimasta relativamente standardizzata, adottando metodi da diversi protocolli importanti10,11. Tuttavia, sono state suggerite diverse modifiche per migliorare la differenziazione e la manutenzione. Questi metodi alternativi includono l'uso di fattori neurogeni per migliorare la differenziazione neurale12, scaffold aggiuntivi per migliorare lo scambio di nutrienti che promuove la longevità cellulare 13 e agitazione da stress a bassa purezza per una coltura e una crescita prolungate14. Questi miglioramenti sono stati incorporati in questo metodo per sviluppare organoidi maturi in grado di esprimere fenotipi neurodegenerativi e di invecchiamento.
Protocol
Gli studi sui pazienti sono stati approvati dall'Institutional Review Board. Tutti i partecipanti hanno firmato il consenso informato scritto e il consenso del repository per consentire il riutilizzo dei loro dati e del loro biospecimen. Le linee iPSC sono state generate seguendo le linee guida IRB e istituzionali. Nella Figura 1 viene illustrata una panoramica schematica del flusso di lavoro di questo protocollo.
1. Riprogrammazione e manutenzione iPSC
- Raccogliere 8 ml di sangue del soggetto (paziente anziano o malato; di età pari o superiore a 65 anni) in provette di preparazione cellulare (CPT) con citrato di sodio o in EDTA o tubi eparinizzati.
- Centrifugare a 1.800 x g per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) per raccogliere pellet contenente solo sangue periferico e nessun siero15.
- Utilizzare vettori di riprogrammazione specializzati secondo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali) per ottenere iPSC16.
- IPSC di coltura in piastre di coltura a membrana basale senza alimentatore, prive di lattosio deidrogenasi (LDEV) con matrice basale rivestita di matrice a 6 pozzetti in mezzi essenziali 8 (E8) (vedi tabella dei materiali) a 37 °C in atmosfera umidificata con CO2 al 5%.
- Mantenere le iPSC nei media E8 per 3-4 giorni al fine di evitare sovraffollamento o differenziazione spontanea.
- Convalidare la pluripotenza delle linee iPSC utilizzando marcatori immunofluorescenti (fase 2) e test per il micoplasma (fase 3).
2. Colorazione pluripotente
- Per conservare soluzioni e anticorpi, seminare le cellule su piastre di coltura rivestite (fase 1.4) a 24 pozzetti 3-4 giorni prima dell'analisi. Aspirare il mezzo con una pipetta e fissare le cellule con formaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) per 15-20 minuti a RT.
- Lavare le cellule 3 volte con 1x PBS e permeabilizzare con Triton-X 100 allo 0,1% in albumina sierica bovina all'1% (BSA) in PBS per almeno 15 minuti, ma non più di 1 ora a RT.
- Lavare 3x con 1x PBS e bloccare con BSA al 5% in PBS per 30 minuti a RT.
- Lavare nuovamente 3 volte con 1x PBS e aggiungere gli anticorpi Sox2 e Oct3/4 (diluizione 1:100; vedere Tabella dei materiali) e la colorazione nucleica DAPI in BSA all'1% (diluizione 1:4.000) per una notte a 4 °C . Avvolgere in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce.
- Lavare 3x con 1x PBS e lasciare le celle in PBS. Immagine con un microscopio a fluorescenza con un ingrandimento 10-20x. Assicurarsi che i marcatori di pluripotenza Sox2 e Oct3/4 siano localizzati nei nuclei delle cellule17,18.
3. Analisi del micoplasma
NOTA: fare riferimento al protocollo del kit di rilevamento (vedere la tabella dei materiali) per le fasi dettagliate di esecuzione e analisi del test. Il kit di rilevamento fornisce il reagente, il substrato e il tampone di analisi per il test del micoplasma.
- Prima di passare le cellule o il terreno di raffreddamento, raccogliere 2-3 ml di terreno di coltura cellulare in una provetta da centrifuga e pellettare eventuali cellule o detriti a 200 x g per 5 minuti a RT. Conservare il surnatante a 4 °C per ≤5 giorni. Incubare le cellule con il mezzo per almeno 24 ore per garantire un segnale rilevabile.
- Aggiungere 100 μL di surnatante cellulare in un tubo fresco o in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con pareti bianche (fondo opaco consigliato, vedere Tabella dei materiali). Ricostituire il reagente e il substrato nel tampone di analisi ed equilibrare per 15 minuti a RT.
- Aggiungere 100 μL del reagente al campione e incubare per 5 minuti a RT. Misurare la luminescenza con un luminometro (misura #1).
- Aggiungere 100 μL del substrato al campione e incubare per 10 minuti a RT. Misurare la luminescenza (misura #2).
- Determinare la contaminazione da micoplasma in base al rapporto tra la misurazione #2 e #1. Fare riferimento al manuale del kit per l'interpretazione dei risultati.
4. Preparazione dei microfilamenti
- Iniziare la preparazione dei microfilamenti poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA, vedi Tabella dei materiali) sfilacciando il filo di sutura con l'estremità smussata di un bisturi. Sterilizzare leggermente la fibra sfilacciata con etanolo al 70%.
- Al microscopio e usando un righello, iniziare a tagliare la fibra PLGA in frammenti di fili lunghi da 500 μm a 1 mm. Tagliare circa 25 mm della fibra in totale. Conservare i filamenti in un tubo da 15 ml con una soluzione antibiotico-antimicotica da 1 ml.
- Nel cappuccio, diluire la soluzione di fibre con 10 ml di DMEM/F-12 (Tabella 1). Vortice bene per mescolare la soluzione.
NOTA: Lavorare in una cappa a flusso di coltura cellulare in un ambiente sterile.
- Nel cappuccio, diluire la soluzione di fibre con 10 ml di DMEM/F-12 (Tabella 1). Vortice bene per mescolare la soluzione.
- Aggiungere 20 μL della soluzione di fibre a tre corpi embrioidi (EB) che formano pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Sotto microscopia a campo chiaro, contare e calcolare la media delle fibre per pozzetto. Diluire o concentrare in media 5-10 microfilamenti PLGA per pozzetto. Prepara ogni pozzo in questo modo.
- I pozzi sono ora pronti per essere seminati con le cellule. Conservare la piastra a temperatura ambiente fino al momento del bisogno o a 4 °C per il giorno successivo.
5. Formazione del corpo embrioide (EB)
NOTA: tutti i supporti e le soluzioni devono essere riscaldati su RT.
- Una volta che le iPSC hanno raggiunto il 70%-80% di confluenza (Figura 2A), sono pronte per essere fatte passare e utilizzate per la formazione di EB. Controllare le cellule con un microscopio con un ingrandimento 10x-20x. Assicurarsi che le colonie mostrino aree minime (<10%) di differenziazione spontanea.
- Aspirare il mezzo con una pipetta e lavare le celle una volta con DPBS. Dissociare le colonie aggiungendo 500 μL di soluzione di distacco cellulare (vedere Tabella dei materiali) o 0,5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare per 3-5 minuti a 37 °C.
NOTA: Lavorare in una cappa a flusso di coltura cellulare in un ambiente sterile. - Raccogliere le cellule rilasciate aggiungendo 1 mL di materiale E8 fresco a ciascun pozzetto e pipettare delicatamente fino a quando tutte le cellule non si sono staccate.
- Trasferire 1,5 ml di sospensione cellulare in un tubo da 15 ml e aggiungere un altro 1 ml di materiale E8 fresco per raggiungere un volume totale di 2,5 ml.
- Centrifugare a 290 x g per 3 minuti a RT.
- Aspirare il surnatante con una pipetta, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo Essential 6 (E6, vedere Tabella dei materiali) integrato con inibitore ROCK 50 μM e contare le cellule utilizzando un emocitometro19.
- Preparare una sospensione cellulare di 60.000-90.000 cellule/ml, a seconda della densità di semina desiderata, in terreni E6 integrati con 50 μM di inibitore ROCK (vedere Tabella dei materiali).
- Aggiungere 150 μL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra ULA a 96 pozzetti (o una piastra concava preparata20). Seme 9.000-11.000 cellule per pozzetto.
- Centrifugare la piastra per forzare l'aggregazione delle celle a 290 x g per 1 minuto a RT. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2.
6. Induzione neuroepiteliale
- Dopo 24 ore, aspirare con cura 120 μL del fluido con una pipetta. Assicurarsi di non aspirare l'EB abbassando troppo la punta della pipetta nel pozzetto.
- Aggiungere 150 μL di mezzo E6 (a RT) integrati con 2 μM di XAV939 e gli inibitori SMAD: 10 μM di SB431542 e 500 nM di LDN 193189 per pozzetto (vedere Tabella dei materiali).
- Cambiare il terreno ogni giorno con mezzi E6 appena preparati integrati con 2 μM di XAV939, 10 μM di SB431542 e 500 nM di LDN 193189.
NOTA: Entro il giorno 6 (DIV6), gli EB dovrebbero avere un diametro di 550-600 μm ed essere pronti per un'ulteriore differenziazione.
7. Differenziazione e maturazione degli organoidi
NOTA: tutti i supporti devono essere riscaldati a RT.
- A circa DIV7, verificare se tutti gli EB hanno raggiunto un diametro di 550-600 μm e mostrano un bordo liscio e chiaro (Figura 2B); in questa fase, sono pronti per essere incorporati in una matrice extracellulare (ECM).
NOTA: Lavorare in un ambiente sterile. - Preparare i fogli di incorporamento con fossette dal film sigillante termoplastico (vedi Tabella dei materiali) posizionando un foglio di pellicola (lungo circa 4) su una scatola P200 vuota. Utilizzando un tubo conico da 15 mL o un tubo da microcentrifuga da 500 μL, premere delicatamente il foglio di pellicola nei fori per ottenere 12 fossette. Spruzzare il foglio di pellicola con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare all'interno della cappa di flusso con la luce UV accesa per almeno 30 minuti.
- Scongelare una quantità sufficiente di matrice di membrana basale (Matrigel, vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio e posizionarla all'interno della cappa di flusso.
NOTA: Per EB, sono necessari circa 30 μL di matrice a membrana non diluita. Mantenere sempre la matrice della membrana al di sotto dei 4 °C per evitare che si gelifichi. Si consigliano anche le punte delle pipette pre-raffreddate poiché rallentano la matrice dalla polimerizzazione nella punta durante il pipettaggio, riducendo così la perdita di materiale. - Utilizzando una punta P200 a foro largo, trasferire un EB su ciascuna fossetta e rimuovere quanto più fluido possibile con una normale punta per pipetta. Fai attenzione a non lasciare asciugare gli EB. Utilizzando una punta P200 regolare, aggiungere ~ 30 μL di matrice di membrana non diluita a ciascun organoide, assicurandosi che l'EB sia al centro della goccia.
- Una volta che tutti gli EB sono incorporati nella matrice, posizionare il foglio di pellicola contenente gli EB in una capsula di Petri sterile.
NOTA: Opzionalmente, una piccola capsula di Petri riempita con acqua sterile può essere posizionata nella capsula di Petri più grande accanto al foglio di pellicola per evitare l'evaporazione.- Trasferire il piatto in un incubatore e incubare a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2 per circa 10 minuti per far solidificare la matrice della membrana.
- Per ogni set di 12 organoidi incorporati, preparare 5 ml di terreno di differenziazione con B27 senza vitamina A (Tabella 1) in un pozzetto di una piastra ULA a 6 pozzetti. Preriscaldare la piastra a 37 °C in un'incubatrice.
- Una volta terminato il tempo di incubazione, trasferire gli EB incorporati sulla piastra ULA a 6 pozzetti prendendo il foglio di pellicola e spingendo fuori le fossette dal retro del foglio. Se necessario, prelevare 1 mL dal pozzetto e pipettarlo sul foglio per aiutare le goccioline a staccarsi dal film.
NOTA: Importanti cambiamenti morfologici possono essere visti 1 giorno dopo l'incorporazione; Gli EB passano dall'avere bordi lisci a sporgenze sporgenti che formano gemme (Figura 2C). - Dopo 2 giorni (DIV9), eseguire una modifica del mezzo supporto. Fare attenzione a non aspirare o danneggiare le goccioline della matrice della membrana nel processo.
- Dopo altri 2 giorni (DIV11), eseguire una sostituzione completa del supporto, integrando il supporto con 3 μM di CHIR99021 (vedere Tabella dei materiali).
- A DIV14, cambiare il terreno in mezzo di differenziazione con B27 con vitamina A (Tabella 1) per un graduale aumento delle dimensioni degli organoidi.
- A DIV16, posizionare la piastra del pozzo su uno shaker orbitale a 90 giri / min all'interno di un incubatore. Cambia il supporto ogni 2 giorni.
- Ogni 40 DIV, diluire 500 μL della matrice di membrana per ogni 50 ml di terreno per ulteriori nutrienti nei mezzi.
Representative Results
L'integrazione di fibre PLGA, l'incorporazione di fossette e l'agitazione portano a una robusta generazione di organoidi cerebrali che consente di mantenere colture derivate da iPSC per lunghi periodi di tempo (Figura 1).
Figura 1: Illustrazione schematica del flusso di lavoro e della sequenza temporale di questo metodo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Il periodo iniziale di induzione neurale è paragonabile alle procedure pubblicate in precedenza11. I corpi embrioidi (EB) iniziano come aggregati circolari (Figura 2B) con bordi bianchi o trasparenti. Quando l'EB viene modificato da mezzo di induzione neurale a mezzo di manutenzione neurale a DIV7, sporgenze e gemmazioni emergono entro 24 ore dal tessuto circolare (Figura 2C). Inoltre, mentre l'organoide continua a crescere, la superficie della fibra PLGA aiuta l'organoide ad allungarsi (Figura 2D). Durante la maturazione, i bordi dell'organoide devono rimanere intatti, in quanto è un buon segno di cellule sane e di sviluppo; in caso contrario, devono essere forniti nutrienti aggiuntivi13 (Figura 2E). La crescita degli organoidi è ulteriormente facilitata dall'agitazione della coltura organoide, in quanto ciò migliora la perfusione con i nutrienti.
Figura 2: Differenziazione e maturazione degli organoidi cerebrali . (A) Immagine rappresentativa di una coltura iPSC al 70%-80% di confluenza. (B) Sono stati generati corpi embrioidi (EB) e la formazione neuroepiteliale è stata indotta fino a DIV7. Gli EB sono stati quindi incorporati nella matrice di membrana e ulteriormente differenziati verso organoidi cerebrali. (C) Organoidi a DIV10 che mostrano formazioni gemmose distinte. Gli organoidi possono essere ulteriormente maturati nella matrice di membrana utilizzando (D) fossetta o (E) incorporazione a sandwich, qui mostrata a DIV30. (F) La coltura a lungo termine mostra organoidi cerebrali che crescono fino a dimensioni significative (DIV70). Barra di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Le dimensioni e la morfologia esterna dell'organoide sono completate da una complessa architettura all'interno dell'organoide. Dopo aver fissato il tessuto a DIV7 dopo il primo stadio di differenziazione, le cellule dell'EB esprimono SOX2, un fattore di trascrizione HMG box che funge da marker per le cellule staminali neurali multipotenti21, così come la scatola proteica accoppiata Pax-6, che indica le cellule progenitrici neurali (Figura 3). I neuroni immaturi contrassegnati da TuJ1 (classe III β-tubulina)22 possono già essere visti sparsi in tutto il tessuto.
In questa fase, un esempio dell'auto-organizzazione che questi organoidi attraversano diventa evidente. L'organizzazione delle strutture radiali, chiamate rosette, è analoga al tubo neurale, con cellule SOX2+ nel centro della rosetta21 e PAX6 verso la periferia della rosetta. Queste rosette danno origine ai neuroni mentre migrano fuori. Queste cellule radianti sono inizialmente doppiamente positive per il marcatore di cellule staminali neurali / progenitrici Nestin23 e la proteina acida fibrillare gliale (GFAP), simile alla glia radiale che si trova nelle aree neurogeniche del cervello in vivo . Man mano che questi neuroni migratori maturano, i marcatori citoscheletrici riflettono questo cambiamento22. Il marcatore di differenziazione neurale in fase iniziale TuJ1 22 è visibile nel cerchio interno della rosetta e si sposta verso la proteina 2 associata ai microtubuli (MAP2 )24, un marcatore di maturazione specifico del neurone alla periferia.
Figura 3: I corpi embrioidi al DIV7 mostrano un'organizzazione strutturale e una caratterizzazione immatura. Immagine immunoistochimica a montaggio intero di un EB a DIV7. (A) Un'immagine composita dell'EB che mostra (B) rosette neurali SOX2+, (C) neuroni immaturi (TUJ1) sparsi in tutto l'EB, (D) cellule progenitrici neurali (PAX6) e (E) nuclei visualizzati da DAPI. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Man mano che gli organoidi invecchiano, l'organizzazione e i marcatori dei neuroni in via di sviluppo iniziano a replicare le condizioni fisiologiche. A DIV30, molte rosette che danno origine a regioni neurogeniche equivalenti al cervello in via di sviluppo possono essere osservate25. Con DIV60, queste regioni neurogeniche SOX2+ sono inesistenti e sono sostituite da MAP2 e NeuN26 maturi, un marcatore di differenziazione neuronale e neuroni positivi (Figura 4 e Figura 5).
Figura 4: Gli organoidi a DIV120 mostrano una caratterizzazione neuronale matura. Immagine immunoistochimica di una sezione organoide al DIV 120. (A) Un'immagine composita della sezione che mostra marcatori neuronali maturi di (B) MAP2 (viola) e (C) NeuN (verde). (D) I nuclei sono stati visualizzati da DAPI. Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: PCR digitale a goccia di organoidi DIV120. Grafici digitali della PCR a goccia che mostrano il valore assoluto di espressione di (A) MAP2 (in alto, blu) e (B) NeuN (in basso, verde). Le linee gialle tagliate separano diverse linee iPSC (A, B, C, ecc.) e gli organoidi sono stati raggruppati insieme. N = 5. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Questi marcatori citoscheletrici possono essere utilizzati in combinazione con altri marcatori post-mitotici (come la doppia cortina27 e la sinapsina28) per sondare la plasticità sinaptica e altri declini legati all'età (Figura 6), nonché tessuto cerebrale aggiuntivo come astrociti e glia (Figura 7).
Figura 6: Esempio di analisi del terminale sinaptico. Immagine immunoistochimica di una sezione dell'organoide a DIV 120. (A) Un'immagine composita della sezione colorata per (B) MAP2, (C) doublecortin (DCX) e (D) sinapsina I (SYN). (E) I nuclei sono stati visualizzati da DAPI. Barra di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Evidenza dello sviluppo gliale. Immagine immunoistochimica di una sezione dell'organoide a DIV 120. (A) Un'immagine composita della sezione colorata per (B) la molecola adattatore legante il calcio ionizzato 1 (Iba1) e (C) NeuN. (D) I nuclei sono stati visualizzati da DAPI. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Reagente | Concentrazione finale | Volume (50 mL totali) |
| DMEM-F12 | 50% | 25 ml |
| Mezzo neurobasale | 50% | 25 ml |
| Supplemento N2 (100x) | 1x | 0,25 ml |
| Supplemento B27 -/+ Vitamina A (50x) | 0,5x | 0,5 ml |
| Insulina | 0.25% | 12,5 μL |
| GlutaMAX (100x) | 1x | 0,5 ml |
| MEM-NEAA (100x) | 0,5x | 0,25 ml |
| HEPES (1 M) | 10 mM | 0,5 ml |
| Antibiotico/Antimicotico (100x) | 1x | 0,5 ml |
| 2-β-mercaptoetanolo | 50 μM | 17,5 μL |
| *NOTA: alcuni DMEM-F12 contengono già GlutaMAX, non è necessario aggiungerne altri. | ||
Tabella 1: Composizione dei mezzi di differenziazione utilizzati nel presente studio.
Discussion
La formazione standardizzata di EB è un passo fondamentale nella conversione riproducibile di cellule staminali pluripotenti in organoidi cerebrali. L'aggregazione forzata delle cellule staminali in singoli tessuti può variare a seconda della geometria dei pozzi concavi, della densità di semina e del trattamento dei pozzi. Sebbene il metodo attuale citi un intervallo di diametri di 500-600 μm dopo 6 giorni, questi diametri non escludono altri diametri di corretta formazione di organoidi, poiché molti altri diametri si sono dimostrati efficaci. Tuttavia, è stato dimostrato che diametri variabili influenzano i tassi di differenziazione e il successo29. Ai fini della riproducibilità, le variazioni di diametro inferiori a 50 μm sono altamente raccomandate20. Inoltre, il numero di giorni di induzione neurale può essere esteso da 6 a 10 giorni per consentire agli EB di crescere di diametro, poiché l'uso di inibitori SMAD ha dimostrato di produrre e mantenere in modo efficiente la formazione di neuroepiteli dopo soli 5 giorni di esposizione30. In assenza di inibitori SMAD, l'induzione neurale può produrre risultati incoerenti, richiedendo periodi di induzione più lunghi. Gli inibitori SMAD citati in questo lavoro sono i più efficaci, ma altre piccole molecole di dorsomorfina e TGF-β possono essere utilizzate alla loro concentrazione efficace.
La matrice della membrana basale fornisce un substrato eccellente per la crescita e può essere somministrata in modo diverso. I primi usi della matrice includevano la membrana basale come rivestimento del pozzo31. Tuttavia, l'uso della matrice per l'incorporazione del tessuto ha dimostrato di migliorare la differenziazione e la maturazione in questi tessuti32. Per gli organoidi, l'uso della matrice ha dimostrato di migliorare la differenziazione dell'EB in organoidi, promuovere la maturazione ed estendere i periodi di coltura33. Mentre gli organoidi possono ancora essere formati senza la matrice, poiché molti gruppi hanno cercato di realizzare una coltura tissutale priva di matrice34,35, gli studi hanno scoperto che gli organoidi incorporati nella matrice hanno una maggiore probabilità di tempi di coltura prolungati e richiedono meno manutenzione 36. Il metodo dimple di incorporazione fornisce una copertura uguale della superficie organoide, garantendo una diffusione simile, l'accesso ai nutrienti e la differenziazione riproducibile. In alternativa, l'incorporazione a cupola può essere impiegata per incapsulare completamente gli organoidi37.
Il trasferimento degli EB nelle fossette della matrice di membrana è un passaggio critico. Sebbene una punta per pipetta da 1 mL abbia un'apertura sufficientemente ampia per trasferire gli EB, è preferibile una punta da 200 μL per facilitare il trasferimento. Le punte da 200 μL devono essere tagliate per creare un'apertura abbastanza grande, garantendo un bordo liscio per ridurre lo sforzo di taglio durante il pipettaggio. In alternativa, esistono punte larghe da 200 μL per facilitare il trasferimento. Il pipettaggio deve essere fatto lentamente, poiché il pipettaggio veloce potrebbe disturbare la periferia organoide e ostacolare la corretta crescita. Particolare attenzione deve essere prestata per garantire che venga trasferito un mezzo sufficiente per fornire sostanze nutritive. Troppo poco mezzo corre il rischio di seccare l'organoide, causando necrosi. Il trasferimento dell'EB con troppi terreni di coltura può causare una matrice troppo diluita e non riuscire a incapsulare l'organoide in modo sicuro. Idealmente, la matrice non deve essere diluita di oltre il 50% per garantire la sua polimerizzazione e funzionare come ECM per gli EB. Se l'incorporamento non riesce, l'EB può essere recuperato e reincapsulato. Il ri-incapsulamento nella matrice fresca può essere fatto in qualsiasi momento per fornire all'organoide un supporto aggiuntivo.
Analogamente all'incorporazione a matrice per impalcature, le fibre PLGA forniscono un supporto aggiuntivo per la crescita tridimensionale. Originariamente incorporata per produrre organoidi allungati e aumentare la superficie38, l'incorporazione di fibre PLGA è stata progressivamente identificata come uno strumento aggiuntivo per migliorare la differenziazione e la maturazione degli organoidi39. Man mano che sempre più laboratori cercano di ridurre l'uso della matrice o di abolirla del tutto, le proprietà auto-organizzanti degli organoidi supportate dalle fibre incorporate forniscono un'impalcatura sufficiente per la creazione e la differenziazione tridimensionale del tessuto39. Qui, entrambi i metodi sono stati combinati per aumentare le possibilità di cultura a lungo termine38,39. L'incorporazione delle fibre durante l'aggregazione iniziale è fondamentale, in quanto potrebbero non essere introdotte in una fase successiva. Dopo la centrifugazione, controllando che un paio di fibre siano tra le celle aggregate assicurerà che una fibra sia incorporata nell'EB. In caso contrario, una delicata aspirazione del pozzo e la ricentrifugazione dovrebbero garantire la miscelazione.
Un altro passo critico nella manutenzione degli organoidi è l'introduzione di uno shaker orbitale per una migliore perfusione dei fluidi. Nelle prime iterazioni dei protocolli organoidi, un bioreattore rotante è stato utilizzato per creare agitazione11. Uno shaker orbitale a 90 rpm fornisce un'agitazione sufficiente senza distruggere la goccia della matrice o danneggiare la morfologia organoide. Alcuni gruppi si astengono dall'utilizzare l'impalcatura della matrice, ma mantengono l'agitazione dello shaker per fornire un ambiente adatto34. Come per tutti i protocolli, la velocità delle rotazioni deve essere regolata a seconda dell'agitatore per ridurre la quantità di sforzo di taglio. Se si scegliesse un incasso a cupola, potrebbe essere impiegato uno scuotitore inclinato per ridurre la quantità di sforzo di taglio11,34.
Nel loro insieme, l'integrazione di diverse tecniche selezionate fornisce un metodo robusto di formazione di organoidi derivati da iPSC. Esistono diversi modi per creare e mantenere gli organoidi, ma molti di essi si concentrano sulle traiettorie di differenziazione precoce. In questo lavoro, più tecniche diverse sono state combinate per coltivare organoidi per lunghi periodi di tempo, oltre la fase di differenziazione e in un periodo di maturazione in cui i fenotipi di invecchiamento possono iniziare a svilupparsi. L'incorporazione di queste tecniche consente una maturazione prolungata senza la necessità di fattori biologici esogeni per mantenere le colture, mantenendo l'auto-organizzazione e la progressione naturale dell'invecchiamento.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Netherlands Organ-on-Chip Initiative, un progetto NWO Gravitation (024.003.001) finanziato dal Ministero dell'Istruzione, della Cultura e della Scienza del governo dei Paesi Bassi. D.C.B. riconosce con gratitudine il sostegno finanziario del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) sotto forma di una borsa di studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
| 6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
| B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
| BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
| ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
| Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
| Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
| Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
| Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
| HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
| MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
| PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
| QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
| SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
| Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
| XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |
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