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Neuroscience

Evaluación de los cambios en la plasticidad sináptica utilizando un modelo de lesión cerebral traumática leve con vigilia

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64592
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Medical Sciences, University of Victoria, 2Island Medical Program, University of British Columbia

Summary

Aquí, se demuestra cómo se puede usar un modelo de lesión de cabeza cerrada despierta para examinar los efectos de la lesión cerebral traumática leve repetida (r-mTBI) en la plasticidad sináptica en el hipocampo. El modelo replica características importantes de r-mTBI en pacientes y se utiliza junto con la electrofisiología in vitro .

Abstract

Las lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBI) son un problema de salud frecuente en América del Norte. Existe una creciente presión para utilizar modelos ecológicamente válidos de mTBI de cabeza cerrada en el entorno preclínico para aumentar la traducibilidad a la población clínica. El modelo de lesión de cabeza cerrada despierta (ACHI) utiliza un impactador cortical controlado modificado para administrar una lesión de cabeza cerrada, induciendo déficits de comportamiento clínicamente relevantes sin la necesidad de una craneotomía o el uso de un anestésico.

Esta técnica normalmente no induce muertes, fracturas de cráneo o hemorragias cerebrales, y es más consistente con ser una lesión leve. De hecho, la naturaleza leve del procedimiento ACHI lo hace ideal para estudios que investigan mTBI repetitivo (r-mTBI). La creciente evidencia indica que la r-mTBI puede resultar en una lesión acumulativa que produce síntomas de comportamiento, cambios neuropatológicos y neurodegeneración. La r-mTBI es común en los jóvenes que practican deportes, y estas lesiones ocurren durante un período de reorganización sináptica robusta y mielinización, lo que hace que la población más joven sea particularmente vulnerable a las influencias a largo plazo de la r-mTBI.

Además, la r-mTBI ocurre en casos de violencia de pareja, una condición para la cual hay pocas medidas objetivas de detección. En estos experimentos, la función sináptica se evaluó en el hipocampo en ratas jóvenes que habían experimentado r-mTBI utilizando el modelo ACHI. Después de las lesiones, se utilizó una cortadora de tejido para hacer cortes del hipocampo para evaluar la plasticidad sináptica bidireccional en el hipocampo a los 1 o 7 días después de la r-mTBI. En general, el modelo ACHI proporciona a los investigadores un modelo ecológicamente válido para estudiar los cambios en la plasticidad sináptica después de mTBI y r-mTBI.

Introduction

La lesión cerebral traumática (TBI) es un problema de salud significativo, con ~ 2 millones de casos en Canadá y los Estados Unidos cada año 1,2. La LCT afecta a todos los grupos de edad y géneros y tiene una tasa de incidencia mayor que cualquier otra enfermedad, en particular el cáncer de mama, el SIDA, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis múltiple3. A pesar de la prevalencia de TBI, su fisiopatología sigue siendo poco conocida, y las opciones de tratamiento son limitadas. En parte, esto se debe a que el 85% de todas las LCT se clasifican como leves (mTBI), y anteriormente se pensaba que la LCTm producía solo cambios de comportamiento limitados y transitorios sin consecuencias neuropsiquiátricas a largo plazo 4,5. Ahora se reconoce que la recuperación de mTBI puede tomar semanas a años5,6, precipitar condiciones neurológicas más graves4, y que incluso los impactos repetidos "sub-conmocionales" afectan el cerebro7. Esto es alarmante ya que los atletas en deportes como el hockey / fútbol tienen >10 impactos subconmocionales en la cabeza por juego / sesión de práctica 7,8,9,10.

Los adolescentes tienen la mayor incidencia de mTBI, y en Canadá, aproximadamente uno de cada 10 adolescentes buscará atención médica para una conmoción cerebral relacionada con el deporte anualmente11,12. En realidad, cualquier impacto subconmocional en la cabeza o mTBI puede causar daño difuso al cerebro, y esto también podría crear un estado más vulnerable para lesiones posteriores y / o afecciones neurológicas más graves 13,14,15,16,17. En Canadá, se reconoce legalmente a través de la ley de Rowan que las lesiones previas pueden aumentar la vulnerabilidad del cerebro a lesiones adicionales18, pero la comprensión mecanicista de r-mTBI sigue siendo lamentablemente inadecuada. Sin embargo, está claro que el TCE-m individual y el r-mTBI pueden afectar la capacidad de aprendizaje durante los años escolares 19,20, tener resultados específicos por sexo 21,22,23,2 4 y afectar la capacidad cognitiva más adelante en la vida16,25,26. De hecho, los análisis de cohortes asocian fuertemente la r-mTBI temprana en la vida con la demencia más adelante27,28. r-mTBI también está potencialmente asociado con la encefalopatía traumática crónica (CTE), que se caracteriza por la acumulación de proteína tau hiperfosforilada y atrofia cortical progresiva y precipitada por inflamación significativa 27,29,30,31. Aunque los vínculos entre r-mTBI y CTE son actualmente controvertidos32, este modelo permitirá explorarlos con mayor detalle en un entorno preclínico.

Un mTBI a menudo se describe como una "lesión invisible", ya que ocurre dentro de un cráneo cerrado y es difícil de detectar incluso con técnicas modernas de imagen33,34. Un modelo experimental preciso de mTBI debe adherirse a dos principios. En primer lugar, debe recapitular las fuerzas biomecánicas normalmente observadas en la población clínica35. En segundo lugar, el modelo debe inducir resultados conductuales heterogéneos, algo que también es altamente prevalente en poblaciones clínicas36,37,38. Actualmente, la mayoría de los modelos preclínicos tienden a ser más severos, involucrando craneotomía, sujeción estereotáxica de la cabeza, anestesia e impactos corticales controlados (CCI) que producen daño estructural significativo y déficits de comportamiento más extensos que los observados normalmente clínicamente33. Otra preocupación con muchos modelos preclínicos de conmoción cerebral que involucran craneotomías es que este procedimiento en sí mismo crea inflamación en el cerebro, y esto puede exacerbar los síntomas de mTBI y la neuropatología de cualquier lesión posterior39,40. La anestesia también introduce varios factores de confusión complejos, incluyendo la reducción de la inflamación 41,42,43, la modulación de la función microglial 44, la liberación de glutamato45, la entrada de Ca2+ a través de los receptores NMDA 46, la presión intracraneal y el metabolismo cerebral 47. La anestesia introduce aún más factores de confusión al aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE), la hiperfosforilación tau y los niveles de corticosteroides, al tiempo que reduce la función cognitiva 48,49,50,51. Además, las lesiones difusas de cabeza cerrada representan la gran mayoría de las mTBI clínicas52. También permiten estudiar mejor la multitud de factores que pueden influir en los resultados conductuales, incluidos el sexo21, la edad 53, el intervalo entre lesiones15, la gravedad54 y el número de lesiones23.

La dirección de las fuerzas acelerativas / desaceleradoras (verticales u horizontales) también es una consideración importante para los resultados conductuales y moleculares. La investigación de Mychasiuk y sus colegas han comparado dos modelos de mTBI difuso de cabeza cerrada: caída de peso (fuerzas verticales) e impacto lateral (fuerzas horizontales)55. Tanto los análisis conductuales como moleculares revelaron resultados heterogéneos dependientes del modelo y del sexo después de la LCTm. Así, los modelos animales que ayudan a evitar procedimientos quirúrgicos, incorporando fuerzas lineales y rotacionales, son más representativos de las condiciones fisiológicas bajo las cuales esas lesiones ocurren normalmente33,56. El modelo ACHI fue creado en respuesta a esta necesidad, permitiendo la inducción rápida y reproducible de mTBI en ratas, evitando procedimientos (es decir, anestesia) que se sabe que sesgan las diferencias de sexo57.

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Protocol

La aprobación para todos los procedimientos con animales fue proporcionada por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Victoria de conformidad con los estándares del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC). Todas las ratas Long-Evans macho fueron criadas internamente o compradas (ver la Tabla de Materiales).

1. Alojamiento y condiciones de cría

  1. Permita que los animales se aclimaten a su entorno de alojamiento durante 1 semana antes del destete en el día postnatal (PND) 21.
  2. Mantener a las ratas en jaulas estándar a 22,5 °C ± 2,5 °C, con acceso ad libitum a alimentos y agua, en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
  3. Agrupe y aloje a los animales con dos o tres compañeros de camada emparejados por sexo y asígnelos aleatoriamente a condiciones falsas o r-mTBI.
  4. Realice todos los procedimientos entre las 7:30 a.m. y las 11:30 p.m.

2. Configuración del procedimiento de lesión en la cabeza cerrada despierta

  1. Posición a 2.75 in. Almohadilla de espuma de baja densidad (100 cm x 15 cm x 7 cm) debajo del impactador para permitir el movimiento de rotación de la cabeza.
    NOTA: La almohadilla de espuma tenía una constante de resorte de ~ 2,500 N / m, pero puede variar entre 3,100 y 5,600 N / m58. El nivel de firmeza (bajo, medio y alto) no ha demostrado ser predictivo del resultado de la lesión59. La almohadilla de espuma es un material no consumible. Normalmente se reemplaza anualmente o si está sucio o dañado.
  2. Encienda el dispositivo de impacto cortical modificado (Figura 1A) y ajuste la velocidad a 6 m/s.
    NOTA: Estas especificaciones están diseñadas para provocar un deterioro neurológico agudo en ratas juveniles y adolescentes que son análogas a las características de un mTBI, pero tales parámetros pueden no ser adecuados para animales más viejos u otras especies (por ejemplo, ratones o hurones). Para una revisión de los parámetros comunes de ACHI, consulte60.

3. Inducción de mTBI

  1. Cuando las ratas alcancen PND 24, muévalas a la sala de procedimientos donde se realizarán los procedimientos. Asegúrese de que esta habitación esté separada de su entorno de vivienda normal.
  2. Coloque suavemente a la rata en un cono de sujeción, asegurándose de que el hocico y las fosas nasales estén cerca de la pequeña abertura del cono para permitir una ventilación adecuada. Use una pinza plástica para el cabello para mantener el cono cerrado en el extremo caudal para evitar el movimiento una vez que la rata se coloca en el cono de sujeción.
    1. Use puntajes de restricción para registrar el cumplimiento o la tolerancia de los animales con el cono de restricción y el procedimiento ACHI.
      NOTA: La puntuación de restricción se puede utilizar como una evaluación del estrés en los animales. Por lo tanto, los criterios de exclusión se pueden desarrollar utilizando la puntuación de restricción para reducir la variabilidad entre los sujetos que surge debido a una respuesta de estrés excesiva.
      1. Dé una puntuación de 0 a 4 basada en la disposición del animal para entrar en el cono, sus movimientos y vocalizaciones. Dé una puntuación de 0 si no hay resistencia a la sujeción, mientras que una puntuación de 1 corresponde con el animal girando 1-2x y poca o ninguna vocalización o retorcerse. Dé una puntuación de 2 si el animal ha girado 2-3x y exhibe algo de vocalización o retorcerse. Dé una puntuación de restricción de 3 si el animal ha girado 5-10x y exhibe más vocalizaciones y retorcerse. Finalmente, dé una puntuación de 4 si el animal ha girado más de 10 veces con vocalizaciones frecuentes y retorcerse.
        NOTA: Esta información también figura en la propia hoja de puntuación (cuadro suplementario S1 y cuadro suplementario S2).
  3. Mientras la rata está sujeta, coloque manualmente el casco (Figura 1B) sobre la línea media, con el disco objetivo sobre el lóbulo parietal izquierdo (Figura 1C, D).
  4. Coloque la rata en la almohadilla de espuma y ajuste manualmente el impactador a la posición Extender. Baje manualmente la punta del impactador para que entre en contacto con el disco de orientación del casco. Ajuste manualmente el impactador a la posición Retraer para que el impactador se retire 10 mm por encima del casco.
  5. Utilice el dial del brazo estereotáxico para bajar la punta del impacto en 10 mm para que vuelva a tocar el disco de orientación del casco. Gire el interruptor de impacto para que la cabeza del animal se acelere rápidamente durante 10 mm a 6 m/s.
  6. Una vez activado el dispositivo, retirar inmediatamente al animal del cono de sujeción y proceder a realizar un protocolo de evaluación neurológica inmediata (NAP).
    NOTA: Para los experimentos actuales, este protocolo se repitió ocho veces en total a intervalos de 2 h.

4. Inducción de lesión simulada

  1. Siga todos los procedimientos experimentales descritos anteriormente en la sección 3, pero coloque la rata adyacente a la trayectoria del pistón de impacto, de modo que no se produzca ninguna lesión.

5. Protocolo de evaluación neurológica

NOTA: La NAP se puede utilizar para medir el nivel de conciencia, así como el funcionamiento cognitivo y sensoriomotor.

  1. Al inicio e inmediatamente después de la inducción de la lesión mTBI o lesión simulada, evaluar las ratas utilizando la NAP como se describe en56,61. Sobre una mesa, coloque la jaula de la casa de las ratas y una jaula de recuperación separada 100 cm. Centra uniformemente la viga de equilibrio en la parte superior de ambas jaulas. Además, coloque una toalla doblada o amortiguación adicional debajo de la barra de equilibrio.
  2. Si es necesario, evalúe el nivel de conciencia. Si los animales no responden después de la LCTm, evalúe la apnea (cese de la respiración) y cualquier retraso en el reflejo de enderezamiento utilizando un cronómetro para registrar el tiempo que tarda el animal en reanudar la respiración y / o enderezarse de un decúbito supino a la posición prona.
    NOTA: La pérdida del reflejo de enderezamiento y la apnea son raras con el modelo ACHI, pero ocasionalmente se pueden observar en animales juveniles.
  3. Evalúe la función cognitiva y sensoriomotora de la rata utilizando la siguiente secuencia de pruebas. Administrar estas pruebas rápidamente en sucesión después de la evaluación de la conciencia.
    NOTA: La suma de estas cuatro pruebas arroja una puntuación total de 12, si no hay déficits de comportamiento observados. Los déficits restan valor a esta puntuación.
    1. Respuesta de sobresalto
      1. Coloque la rata en la jaula de recuperación vacía y aplauda en voz alta (50 cm) sobre la jaula. Registre la respuesta del animal al ruido utilizando el siguiente sistema de puntuación:
        3 = reacción rápida de sobresalto al sonido (p. ej., movimiento/contracciones del oído, salto, todo el cuerpo se congela).
        2 = reacción lenta o reacción de congelación leve al sonido.
        1 = Sólo se observan movimientos del oído.
        0 = Sin reacción al sonido.
    2. Extensión de la extremidad
      1. Con la viga (100 cm de largo x 2 cm de ancho x 0,75 cm de grosor) colocada horizontalmente a través de la casa de la rata y las jaulas de recuperación, levante a la rata por la base de la cola y sosténgala cerca de la viga. Asegúrese de que la rata esté lo suficientemente cerca como para poder agarrarla fácilmente. Evalúe la capacidad de la rata para extender ambas extremidades hacia la viga con el siguiente sistema de puntuación:
        3 = Extensión completa de ambas extremidades anteriores y agarra la viga.
        2 = Sólo se extiende una extremidad.
        1 = extensión o retracción intermitente de las extremidades anteriores.
        0 = Las extremidades anteriores están flojas/sin extensión.
    3. Paseo de viga
      1. Coloque al animal en el centro de la viga horizontal en la marca de 50 cm frente a su jaula doméstica. Asegúrese de que el haz esté espaciado equitativamente entre la jaula doméstica de la rata y la jaula de recuperación (colocada a ~ 80 cm de distancia). Permita que la rata camine a través de la viga. Evalúe la capacidad de la rata para equilibrarse y caminar con el siguiente sistema de puntuación:
        3 = Camina con éxito a través de la viga con menos de dos pies deslizándose dentro de 10 s.
        2 = Camina con éxito la viga, pero se observan deslizamientos de más de dos pies.
        1 = Movimiento no locomotor, movimiento de "natación".
        0 = Incapaz de caminar a lo largo de la viga o incapaz de moverse dentro de 10 s.
    4. Haz giratorio
      1. Reposicione la rata en el centro de la viga, asegurándose de que la rata esté equilibrada. Levante la viga 80 cm por encima de una toalla o superficie acolchada y comience a girar manualmente la viga a una velocidad de una rotación por segundo durante 4 s (un total de cuatro rotaciones). Evalúe la capacidad de la rata para permanecer en la viga mientras gira con el siguiente sistema de puntuación:
        3 = La rata permanece en la viga durante las cuatro rotaciones.
        2 = La rata cae en la cuarta rotación.
        1 = La rata cae en la segunda o tercera rotación.
        0 = Caída de rata durante la primera rotación.
  4. Al finalizar la siesta, devuelva la mTBI y las ratas simuladas a sus jaulas domésticas. Repita según sea necesario para los procedimientos de r-mTBI. Supervise el bienestar de los animales después de las lesiones con la Lista de verificación de monitoreo del lado de la jaula (Archivo complementario 1). Si hay alguna indicación de anomalía (cualquier puntuación que no sea N) durante la monitorización del lado de la jaula, se debe tomar una puntuación completa del dolor con la Escala de dolor y la Lista de verificación de monitorización avanzada después del impacto en la cabeza (Archivo complementario 2).

6. Preparación de la rebanada

NOTA: En el estudio actual, la plasticidad sináptica se evaluó en animales después de r-mTBI a los 1 o 7 días después de mTBI. En estos días, los animales fueron llevados individualmente al laboratorio en jaulas cubiertas antes del sacrificio.

  1. Refrigere (-20 °C) durante la noche todas las herramientas quirúrgicas (Figura 2A) necesarias para hacer rodajas de hipocampo: tijeras estándar, tijeras de disección, fórceps, rongeurs, espátulas y bloque de enfriamiento.
    NOTA: El pegamento tisular y la cámara de incubación no deben refrigerarse.
  2. Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (LCR) que contenga 125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaHPO 4, 25 mM de NaHCO 3, 2 mM de CaCl 2,1,3 mM de MgCl 2 y 10 mM de dextrosa (300 ± 10 mOsm; pH 7,2-7,4).
    NOTA: La solución principal de aCSF debe ser burbujeada continuamente con carbógeno (95% O 2/5% CO2) durante la duración del protocolo.
  3. Antes de sacrificar al animal (paso 6.8), prepare 12,5 ml de agarosa. Disuelva 0,25 g de agarosa en 12,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) en el microondas en un tubo cónico de 50 ml en incrementos de 10 s.
  4. Mantener la agarosa caliente (42 °C) y agitar en una placa calefactora para evitar que se solidifique.
  5. Instale una estación de corte en hielo, que incluya una placa de Petri y un vaso de precipitados pequeño (50 ml) lleno de aCSF helado (4 °C) y una placa de Petri volcada con un trozo de papel de filtro humedecido en la parte superior (Figura 2A). Burbujee continuamente el aCSF en el vaso de precipitados pequeño con carbogen.
  6. Calentar el baño maría a 32 °C. Llene la cámara de recuperación con aCSF y burbujee continuamente con carbógeno (Figura 2B).
  7. Transporta al animal a la sala experimental.
  8. Anestesiar al animal usando isoflurano al 5% como inhalante (hasta la falta de un reflejo de abstinencia) y luego decapitarlo rápidamente usando una pequeña guillotina.
  9. Diseccionar el cerebro del cráneo en la placa de Petri llena de aCSF helada (4 °C), sosteniendo el cráneo sumergido en el aCSF para ayudar a enfriar rápidamente el tejido.
    NOTA: Este procedimiento normalmente requiere menos de 5 minutos, pero la velocidad de extracción del cerebro no es un factor crítico si el cerebro está sumergido en aCSF refrigerado.
  10. Coloque el cerebro en el vaso pequeño de aCSF refrigerado y carbogenado para limpiar y enfriar aún más la muestra.
  11. Mueva el cerebro a la placa de Petri invertida y colóquelo en el papel de filtro. Use un bisturí afilado para extirpar el cerebelo y la corteza prefrontal para "bloquear" el cerebro. Separe los dos hemisferios haciendo un corte en la línea media del cerebro.
    NOTA: El siguiente protocolo se realiza un hemisferio a la vez. Es imperativo que el hemisferio que no se está preparando actualmente permanezca sumergido en el vaso de precipitados de aCSF carbogenado helado (4 °C).
  12. Para crear cortes transversales del hipocampo, coloque el hemisferio en la superficie medial. Incline la hoja de un bisturí a ~ 30 ° hacia adentro y retire una rebanada delgada de la superficie dorsal del cerebro para proporcionar una superficie plana para que el cerebro se monte en el pistón utilizado por la cortadora. Voltea el cerebro sobre la superficie dorsal y aplica suavemente el tejido sobre papel de filtro seco para eliminar cualquier exceso de aCSF. Usando pegamento de cianoacrilato, fije la superficie dorsal del cerebro al pistón, dejando la superficie ventral en posición vertical.
    NOTA: Asegúrese de que el pegamento no corra sobre el borde del pistón, ya que esto hará que se adhiera al tubo de metal utilizado para contener la agarosa y evitar el movimiento del pistón.
  13. Extienda el tubo exterior del pistón sobre el cerebro y vierta la agarosa líquida en el tubo hasta que el cerebro esté completamente cubierto. Solidifique rápidamente la agarosa sujetando un bloque de enfriamiento sobre el tubo del pistón (Figura 2A).
  14. Coloque el pistón en la cámara de la cortadora y asegure la cámara con un tornillo. Asegure la cuchilla y agregue aCSF oxigenado y helado a la cámara de corte.
  15. En la segmentación de datos (Figura 2B), ajuste la velocidad de corte a 4, la oscilación a 6 y cambie el interruptor de corte continuo/simple a continuo. Arranque para comenzar a seccionar el cerebro a 400 μm.
  16. A medida que la cortadora secciona el cerebro, use una pipeta Pasteur de gran diámetro para transferir cada rebanada al baño de recuperación de aCSF oxigenado a medida que se secciona (Figura 2C).
    NOTA: A medida que se corta cada rebanada, se puede colocar secuencialmente en los diferentes pocillos del baño de recuperación. Este protocolo generalmente produce entre seis y ocho cortes, que contienen el hipocampo para cada hemisferio. Se puede usar un atlas62 de ratas para identificar la posición dorsal-ventral de cortes individuales en el cerebro de la rata.
  17. Deje que las rodajas se recuperen a 32 °C durante 30 min y luego déjelas recuperar durante 30 min adicionales a temperatura ambiente (23 °C).
  18. Repita estos pasos para crear sectores del segundo hemisferio.

7. Electrofisiología de campo

NOTA: Para adquirir grabaciones de campo extracelular del giro dentado (DG), realice los siguientes pasos. Después de la recuperación de 60 minutos, los cortes individuales del hipocampo están listos para las grabaciones de campo extracelular.

  1. Utilizando un extractor de micropipetas disponible comercialmente, extraiga electrodos de registro (1-2 MΩ) de capilares de vidrio de borosilicato de 10 cm con un diámetro exterior de 1,5 mm y un diámetro interior de 1,1 mm.
    NOTA: El electrodo de grabación debe tener una resistencia de ~1 MΩ y las puntas deben tener un tamaño de ~1 mm. La consistencia en los parámetros del electrodo es importante para una buena grabación.
  2. Encienda la computadora y el equipo que se utilizará para las grabaciones: el amplificador, el digitalizador, el estimulador, el micromanipulador, el regulador de temperatura, la luz del microscopio y la bomba de vacío.
  3. Llene un vaso de precipitados con aCSF y conéctelo a un sistema de perfusión controlado por gravedad. Abra la válvula aCSF en el sistema de perfusión para comenzar un flujo de aCSF a través de la cámara de perfusión. Mantenga un caudal de aproximadamente uno o dos goteos/s o 2 mL/min. Carbogenato continuo aCSF durante la duración de los registros electrofisiológicos.
    NOTA: Es imperativo mantener una tasa de goteo constante de aCSF carbogenado durante las grabaciones de campo. También es imperativo que el electrodo de referencia esté completamente sumergido en aCSF.
  4. Utilice una pipeta Pasteur para transferir una rodaja del hipocampo del baño de recuperación a la cámara de perfusión que se perfunde continuamente con aCSF carbogenado y se mantiene a 30 ± 0,5 °C. Oriente el corte cerebral de modo que el giro dentado y la capa de células granulares sean visibles en el campo de visión. Estabilice la rebanada con pesos de alambre doblados. Inicie el software de la computadora para la adquisición de datos.
    NOTA: Puede ser útil apagar la bomba de vacío durante este paso para permitir la manipulación libre del tejido. Esto debe hacerse rápidamente ya que demasiada manipulación puede dañar el tejido. Además, la cámara de perfusión puede desbordarse con aCSF si esto lleva demasiado tiempo. Una vez que el tejido esté orientado y estabilizado correctamente, encienda la bomba de vacío.
  5. Utilice un microscopio vertical para visualizar el DG con óptica oblicua. Coloque un electrodo estimulante bipolar concéntrico para activar las fibras de la ruta perforante medial (MPP) en el tercio medio de la capa molecular. Luego, coloque una micropipeta de vidrio, llena con aCSF en el MPP (Figura 3A, B). Comience con los electrodos más separados (es decir, el electrodo estimulante cerca de CA3 y el electrodo de grabación justo por encima del genu del DG), ya que tocar el tejido causará daño a las fibras.
    NOTA: Óptimamente, todas las grabaciones deben tener los electrodos colocados equidistantes de la capa celular, aproximadamente a 200 μm de distancia.
  6. Una vez que los electrodos de estimulación y grabación estén colocados, visualice las respuestas de campo evocadas utilizando un amplificador, un digitalizador y un software de grabación.
  7. Para encontrar un potencial postsináptico excitatorio de campo adecuado (fEPSP), estimule el tejido con pulsos de corriente de 0,12 ms a 0,2 Hz (cada 5 s) cuando el usuario sea competente para encontrar respuestas, o a 0,067 Hz (cada 15 s) para usuarios menos competentes para evitar la sobreestimulación. Asegúrese de que el fEPSP tenga una amplitud mínima de 0,7 mV con una descarga de fibra transparente que sea más pequeña que la fEPSP.
    NOTA: Es fundamental colocar ambos electrodos equidistantes de la capa celular para obtener respuestas de campo máximas y lo suficientemente separados (es decir, ~ 200 μm) para generar una pequeña descarga de fibra. Pequeños ajustes en la posición del electrodo pueden ayudar a mejorar la amplitud de la respuesta, aunque estos deben mantenerse al mínimo para evitar daños tisulares.
  8. Determine la amplitud máxima de fEPSP aumentando la intensidad de estimulación y luego establezca la intensidad de simulación para que la fEPSP esté en el 70% de la amplitud máxima.
    NOTA: La amplitud máxima se establece en 70% para estudios de depresión a largo plazo (LTD) y en 50% para estudios de potenciación a largo plazo (LTP). La amplitud máxima se determina ajustando la fuerza de estimulación hasta que el fEPSP ya no aumenta en amplitud. Para una fEPSP con una amplitud máxima de 2 mV, el tamaño de respuesta se ajustaría a 1,4 mV para estudios LTD y 1,0 mV para estudios LTP, para dejar espacio para que la fEPSP se deprima o potencie (respectivamente).
  9. Establezca una línea base de preacondicionamiento estable durante 20 min con pulsos de 0,12 ms entregados a 0,067 Hz. Para que los cortes se consideren estables, busque una variabilidad del <10% en la pendiente inicial del fEPSP y que la pendiente de la línea de mejor ajuste a través de las pendientes fEPSP trazadas sea de <0.5. Continúe con los siguientes pasos de la grabación cuando se verifique que los EPSP son estables durante 20 minutos.
    NOTA: Se pueden agregar varios antagonistas de receptores al aCSF para bloquear o mejorar LTD y LTP. Si es necesario, asegúrese de que los cortes estén expuestos a estos agentes farmacológicos durante este período de referencia y que se cumplan los requisitos para registros estables. Para ver ejemplos, véanse63,64,65.
  10. Primero, determinar los cambios en las propiedades sinápticas básicas mediante el uso de estímulos de pulso pareado y mediante la construcción de curvas de entrada-salida de estímulo-respuesta. Para la prueba de pulso pareado, aplique una serie de pulsos pareados con un intervalo interpulso de 50 ms a 0,033 Hz. Para las curvas de entrada-salida, aplique una serie (10) de intensidades de estímulo crecientes (0,0-0,24 ms) a 0,033 Hz para trazar el cambio de tamaño de la respuesta fEPSP.
  11. Para estudiar LTD que depende principalmente de la activación de los receptores CB164,66, emplee un protocolo de 10 Hz (6.000 pulsos a 10 Hz). Este protocolo tarda 10 minutos en administrarse.
  12. Para grabaciones posteriores al acondicionamiento, reanude el uso de estimulación de pulso único (0,12 ms a una frecuencia de 0,067 Hz) durante 60 minutos adicionales.
  13. Después de la grabación posterior al acondicionamiento, administre nuevamente los estímulos de pulso pareado, seguidos de una curva de entrada-salida. Compare estos con los registros de referencia para observar alteraciones en las propiedades de liberación presináptica y ayudar a evaluar la salud del corte para registros a largo plazo.
  14. Durante el análisis, sea conservador y cumpla con los criterios de exclusión al determinar si los datos de los cortes individuales deben conservarse en el conjunto de datos de plasticidad sináptica. Excluya los cortes que muestran una pendiente grande en una línea de mejor ajuste de las pendientes fEPSP durante la línea de base de preacondicionamiento (pendiente >0.5), inestabilidad en la línea base de preacondicionamiento (>10% de cambio) o inestabilidad en el período de postacondicionamiento (pendiente >1.5 en 50-60 min de postacondicionamiento).

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Representative Results

El modelo de lesión de cabeza cerrada despierta es un método viable para inducir r-mTBI en ratas jóvenes. Las ratas expuestas a r-mTBI con el modelo ACHI no mostraron déficits de comportamiento manifiestos. Los sujetos en estos experimentos no exhibieron latencia a la derecha o apnea en ningún momento durante el procedimiento r-mTBI, lo que indica que este fue de hecho un procedimiento de TBI leve. Surgieron sutiles diferencias de comportamiento en el NAP; Como se describió anteriormente, las ratas fueron calificadas en cuatro tareas sensoriomotoras (respuesta de sobresalto, extensión de extremidades, caminata de haz y haz giratorio) en una escala de 0 a 3, donde 3 representa ningún deterioro con la tarea. Por lo tanto, cuanto más baja era la puntuación de la NAP, más deteriorado estaba el animal. Al inicio del estudio, no hubo diferencias en las puntuaciones NAP entre las ratas simuladas y r-mTBI. Después de todas las sesiones de ACHI, las ratas r-mTBI mostraron deficiencias significativas dentro de las tareas de NAP en comparación con las simulaciones (Figura 4). Sin embargo, como se informó anteriormente para los impactos entregados durante varios días (es decir, 2 o 4 días), la adición posterior de lesiones en el transcurso del día no agravó ni produjo déficits de comportamiento adicionales. Por lo tanto, el modelo ACHI de r-mTBI produce déficits de comportamiento sutiles, pero significativos, durante estos puntos de tiempo agudos posteriores a la lesión.

Siguiendo el protocolo de lesión, las respuestas de campo evocadas y la plasticidad sináptica se examinaron en la entrada MPP al DG del hipocampo en el día 1 posterior a la lesión (PID1) y PID7. La salud del corte se examinó utilizando fEPSP en respuesta a una serie ascendente de anchos de pulso en cada corte. Como se muestra en la Figura 3C, no hubo diferencia en las curvas de entrada-salida generadas en rodajas obtenidas de ratas simuladas y r-mTBI. Para examinar la liberación presináptica del transmisor, se administró una serie de pulsos pareados (intervalo interpulso de 50 ms) y se calculó la relación del tamaño del segundo fEPSP en relación con el primer fEPSP. Las relaciones de pulso pareado no difirieron entre ratas simuladas y r-mTBI (Figura 3D). Por lo tanto, estos datos indican que r-mTBI no alteró la fisiología sináptica básica en la entrada MPP al DG. Para examinar LTD, se administró un protocolo LTD de 10 Hz para inducir una LTD dependiente de endocannabinoides64. En PID1, hubo una disminución significativa en la capacidad de la entrada de MPP a la DG para sostener LTD (Figura 3E). Sin embargo, esta reducción en LTD fue transitoria, y para PID7, las rebanadas de animales simulados y r-mTBI mostraron LTD equivalente (Figura 3F), aunque hubo una indicación de una ligera tendencia a que las rebanadas de animales r-mTBI exhibieran un aumento en LTD.

Figure 1
Figura 1: La configuración del procedimiento ACHI utilizada para modelar r-mTBI . (A) Se utilizó un impactador cortical controlado modificado para desplazar rápidamente la cabeza del animal 10 mm a una velocidad de 6,0 m/s. (B,C) Casco impreso en 3D personalizado con un sitio objetivo de la corteza parietal izquierda. (D) Los sujetos fueron colocados en una bolsa de sujeción de plástico en una plataforma de espuma, con el casco colocado alrededor del cono de sujeción y colocado de manera que el sitio objetivo esté directamente debajo de la punta del impactador. Abreviaturas: ACHI = lesión cerrada en la cabeza despierta; r-mTBI = lesión cerebral traumática leve repetida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Materiales y configuración necesarios para la preparación de la rebanada. (A) Herramientas utilizadas para la extracción, montaje, corte e incubación del cerebro: (a) plato de cultivo con papel de filtro; (b) diversas herramientas de disección, incluyendo tijeras estándar, tijeras de disección, fórceps, un rongeur y espátulas; c) adhesivo tisular; d) Pistón de compresión y tubo de muestra; e) hoja de pluma y soporte de cuchilla; f) bloque de refrigeración; g) cámara de incubación de rodajas. (B) Cortadora de tejido de comprimito. (C) Rebanadas que se incuban en un baño que contiene líquido cefalorraquídeo artificial que se oxigena continuamente con 95% O2/5% deCO2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Alteraciones agudas en la plasticidad sináptica en ratas macho jóvenes debido a r-mTBI utilizando el modelo ACHI . (A) Las principales vías del hipocampo. La vía perforante medial está compuesta por la entrada de la corteza entorrinal en el giro dentado (azul). La trayectoria perforante medial introduce sinapsis en las células granulares en el giro dentado (púrpura). (B) Microfotografía de campo claro de un corte cerebral del hipocampo (aumento 4x), que muestra la colocación real de un electrodo estimulante bipolar (izquierda) y una pipeta de electrodo de registro de vidrio (derecha) en la trayectoria de rendimiento medial del giro dentado. (C) Gráfica de entrada-salida (pendiente fEPSP) para diferentes intensidades de simulación (10-300 μs) en PID1 y PID7 para ratas simuladas y r-mTBI. (D) Relación de pulso pareado para ratas simuladas y r-mTBI (intervalo interpulso de 50 ms). (E) Evolución temporal de los cambios de fEPSP antes y después de la administración de un paradigma de inducción LTD en cortes del hipocampo obtenidos de ratas simuladas y r-mTBI en PID1. (F) Evolución temporal de los cambios de fEPSP antes y después de la administración de un paradigma de inducción LTD en cortes del hipocampo obtenidos de ratas simuladas y r-mTBI en PID7. Abreviaturas: ACHI = lesión cerrada en la cabeza despierta; r-mTBI = lesión cerebral traumática leve repetida; PID = día posterior a la lesión; fEPSP = potencial postsináptico excitatorio de campo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Deterioro neurológico agudo en ratas macho jóvenes debido a r-mTBI utilizando el modelo ACHI. Las ratas se sometieron a ocho procedimientos de ACHI a intervalos de 2 h durante 1 día, con un protocolo de evaluación neurológica realizado al inicio y después de cada lesión. El NAP consistió en cuatro tareas: respuesta de sobresalto, extensión de extremidades, caminata de haz y haz giratorio. Cada tarea se puntuó sobre 3, dando una puntuación total posible de 12 para cada sesión. Los datos presentados como media ± SEM. (*) indican p < 0,05. Abreviaturas: ACHI = lesión cerrada en la cabeza despierta; r-mTBI = lesión cerebral traumática leve repetida; NAP = protocolo de evaluación neurológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria S1: Información sobre animales e impactos del procedimiento ACHI. Abreviatura: ACHI = lesión en la cabeza cerrada despierta. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S2: Puntuación de restricción para mTBI despierto. Abreviatura: mTBI = lesión cerebral traumática leve. "Dar la vuelta con restricción" se refiere al investigador que coloca al animal en la sujeción, antes de cerrar la bolsa alrededor de la cola. Después de cerrar la bolsa, el animal no debería poder darse la vuelta. La vocalización y el retorcimiento deben marcarse después de cerrar la bolsa. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Lista de verificación de monitoreo del lado de la jaula. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Escala de dolor y lista de verificación de monitoreo avanzado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La mayoría de las investigaciones preclínicas han utilizado modelos de mTBI que no recapitulan las fuerzas biomecánicas observadas en la población clínica. Aquí, se muestra cómo se puede usar el modelo ACHI para inducir r-mTBI en ratas jóvenes. Este modelo cerrado de r-mTBI tiene ventajas significativas sobre los procedimientos más invasivos. En primer lugar, el ACHI normalmente no causa fracturas de cráneo, hemorragias cerebrales o muertes, todo lo cual sería contraindicación de una LCT "leve" en poblaciones clínicas61. En segundo lugar, el ACHI no requiere el uso de craneotomías, lo cual es significativo porque se sabe que causan respuestas inflamatorias que pueden exacerbar las sintomatologías y la neuropatología67. En tercer lugar, el ACHI no requiere el uso de anestesia. Esto también es significativo, ya que la anestesia puede tener propiedades neuroprotectoras y puede afectar la plasticidad sináptica, además del rendimiento del aprendizaje y la memoria 48,49,50,51,68. Finalmente, el ACHI puede producir cambios transitorios sutiles en la función neurológica que pueden evaluarse inmediatamente después de la lesión.

Como el ACHI normalmente no induce pérdida de conciencia o apnea, este modelo imita mTBI en una proporción significativa de la población clínica 69,70,71. A pesar de esto, el modelo ACHI produjo una reducción significativa en los puntajes del NAP. Esta reducción persistió con la administración repetida del procedimiento ACHI, pero no exacerbó las deficiencias sensoriomotoras dentro del grupo de r-mTBI. Esto indica que el modelo ACHI induce una lesión leve análoga a la observada después de impactos craneales conmocionantes o subconmocionales en poblaciones clínicas72,73. Una ventaja primaria del NAP es la detección de déficits conductuales sutiles observados en el período de tiempo agudo después de r-mTBI. Este examen rápido puede permitir a los investigadores categorizar a las ratas en función de sus respuestas conductuales. Sin embargo, el uso de pruebas conductuales más robustas en puntos de tiempo subagudos y crónicos puede ser necesario para detectar sintomatologías motoras, cognitivas y afectivas74,75,76. Es importante señalar que, si bien no hubo diferencias en los puntajes de NAP sobre las ocho lesiones, el comportamiento de los roedores puede ser influenciado por cambios en el entorno y la familiaridad con el experimentador77,78. Se debe permitir que las ratas se aclimaten a la sala de procedimientos antes de administrar r-mTBI o lesiones simuladas. Además, es importante que una persona sea responsable de administrar los impactos para ayudar a garantizar la coherencia.

A pesar de los beneficios mencionados anteriormente del modelo ACHI, no está exento de limitaciones. Primero, el paradigma fue diseñado para imitar la acumulación de impactos en una sola sesión y no lesiones repetitivas después de un período de recuperación. Después de la lesión, el cerebro reside en una ventana de vulnerabilidad cerebral que se extiende de 1 a 5 días después de la lesión en roedores 15,79,80. Recibir ocho lesiones en un día singular no permite que se desarrollen cascadas de lesiones agudas y subagudas. Por lo tanto, dependiendo de la pregunta de investigación de interés, puede ser necesario ajustar el paradigma del daño dentro de la ventana de vulnerabilidad. En segundo lugar, si bien es beneficioso limitar el uso de anestésicos, una consecuencia no deseada del modelo ACHI es someter a las ratas a un estrés de contención. Se ha demostrado que la exposición a factores estresantes agudos y crónicos puede iniciar una respuesta inflamatoria, influir en una variedad de comportamientos y alterar la plasticidad sináptica en el hipocampo81,82,83.

El protocolo descrito anteriormente proporciona un método claro para producir cortes transversales del hipocampo de alta calidad a partir de animales administrados con r-mTBI con el modelo ACHI. Además, el protocolo permite registros electrofisiológicos estables y muestra que el hipocampo todavía es capaz de exhibir plasticidad sináptica después de r-mTBI, aunque puede haber interrupciones transitorias. Con cualquier registro electrofisiológico, la salud de la rebanada es primordial para la capacidad de registrar fEPSP adecuados. Para preservar el tejido cerebral, antes de cortar, es imperativo que el cerebro permanezca helado en el aCSF carbogenado. La extracción y el corte del cerebro deben hacerse rápidamente, pero no si esto se produce a expensas de la atención. Este protocolo en animales juveniles utiliza aCSF como solución de corte, pero dependiendo de la edad del animal, se pueden requerir soluciones de corte protectoras (como soluciones a base de colina, sacarosa, NMDG o glicerol) 84,85,86.

Las grabaciones electrofisiológicas de campo permiten a los investigadores medir la plasticidad sináptica del hipocampo. Sin embargo, hay una serie de limitaciones a la técnica. El proceso de cortar el cerebro ha demostrado causar cambios en el número de la columna vertebral87, lo que podría afectar la plasticidad sináptica. El uso de grabaciones in vivo preservaría las vías y permitiría medir la plasticidad sináptica en animales anestesiados o vivos88. Además, el uso de grabaciones de campo sondea las propiedades de grupos de neuronas, pero no informa sobre los cambios en las neuronas individuales. El uso de registros de patch-clamp de células enteras puede dar información temporalmente detallada sobre las propiedades neuronales en respuesta a manipulaciones farmacológicas u optogenéticas89. Además, la combinación de registros electrofisiológicos con técnicas complementarias, como imágenes de calcio, Western blotting, inmunohistoquímica o microscopía electrónica, permitiría a los investigadores obtener información sobre los mecanismos de acción.

Los déficits cognitivos se informan comúnmente después de r-mTBI, y el protocolo actual puede ayudar a investigar algunos de los procesos fisiológicos subyacentes asociados con estos déficits. En particular, la naturaleza leve del procedimiento ACHI abre la posibilidad de examinar los cambios en la fisiología sináptica a lo largo de la vida de los animales que han incurrido en r-mTBI. El modelo ACHI parece ser un modelo ecológicamente válido de mTBI que se puede utilizar para estudiar r-mTBI. Estudios preliminares que utilizan el modelo ACHI han mostrado deterioro neurológico agudo sin daño estructural manifiesto, administrando uno, cuatro y ocho paradigmas de lesión repetida61,90. Los estudios futuros examinarán cómo la mTBI puede afectar la plasticidad sináptica durante los períodos de desarrollo y en el envejecimiento del cerebro. Al comprender mejor la fisiopatología de mTBI y r-mTBI para la función sináptica, la esperanza es dirigir mejor las posibles intervenciones terapéuticas para ayudar a reducir la función cognitiva.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio Christie de la Universidad de Victoria, pasados y presentes, por sus contribuciones al desarrollo de este protocolo. Este proyecto fue apoyado con fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR: FRN 175042) y NSERC (RGPIN-06104-2019). El gráfico del cráneo de la Figura 1 se creó con BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printed helment  Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) 
Agarose  Fisher Scientific (BioReagents) BP160500
Anesthesia chamber Home Made N/A Plexiglass Container
Automatic Heater Controller Warner Electric TC-324B
Axon Digidata Molecular Devices 1440A Low-noise Data Acquisition System
Balance beam  Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride Bio Basic Canada Inc.  CD0050 For aCSF
Camera Dage MTI NC-70
Carbogen tank Praxair MM OXCD5C-K Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software Molecular Devices Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome Precisionary VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode FHC Inc. CBAPC75
Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific (Chemical) D16-3 aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier   Getting Instruments, Inc.  Model 4D
Disodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S373-500 PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade Electron Microscopy Sciences 72002-10
Filter Paper Whatman 1 1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000
Hair Claw Clip Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator Quest Scientific  726300
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath Fisher Scientific  15-462-15
Leica Impact One CCI unit Leica Biosystems Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad 3" polyurethane foam sheet 
Magnesium Chloride Fisher Scientific (Chemical) M33-500 aCSF
Male Long Evans Rats Charles River Laboratories Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier Molecular Devices Model 700B
pH Test Strips VWR Chemicals BDH BDH83931.601
Potassium Chloride Fisher Scientific (Chemical) P217-500 aCSF, PBS
Potassium Phosphate Sigma P9791-500G PBS
Push Button Controller Siskiyou Corporation  MC1000e Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs ELITechGroup SS-033 For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific (Chemical) S233-500 aCSF
Sodium Chloride Fisher Scientific (Chemical) S271-3 For aCSF, PBS
Sodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S369-500 aCSF
Soft Plastic Restraint Cones Braintree Scientific model DC-200
Stopwatch Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges  For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament) Sutter Instrument BF150-110-10 Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope Olympus Olympus BX5OWI 5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer Vapro Model 5600 aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table Kinetic Systems 9101-01-45

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Neurociencia Número 191
Evaluación de los cambios en la plasticidad sináptica utilizando un modelo de lesión cerebral traumática leve con vigilia
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Christie, B. R., Gross, A.,… More

Christie, B. R., Gross, A., Willoughby, A., Grafe, E., Brand, J., Bosdachin, E., Reid, H. M. O., Acosta, C., Eyolfson, E. Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (191), e64592, doi:10.3791/64592 (2023).

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