Summary
Cet article décrit un protocole d’immunopanoramique pour les ganglions de la racine dorsale de souris adultes. En adhérant des anticorps aux plaques de culture, nous pouvons sélectionner négativement et éliminer les cellules non neuronales. Nous montrons que les cultures sont enrichies pour les neurones en utilisant ce protocole, permettant une étude approfondie des réponses neuronales à la manipulation.
Abstract
Les ganglions radiculaires dorsaux (DRG) sont des structures périphériques adjacentes à la corne dorsale de la moelle épinière, qui abritent les corps cellulaires des neurones sensoriels ainsi que divers autres types de cellules. Les protocoles de culture publiés se réfèrent souvent à des cultures DRG dissociées entières comme étant neuronales, malgré la présence de fibroblastes, de cellules de Schwann, de macrophages et de lymphocytes. Bien que ces cultures DRG entières soient suffisantes pour les applications d’imagerie où les neurones peuvent être discernés en fonction de la morphologie ou de la coloration, les homogénats de protéines ou d’ARN collectés à partir de ces cultures ne sont pas principalement d’origine neuronale. Ici, nous décrivons une séquence d’immunopanoramique pour les DRG de souris en culture. Le but de cette méthode est d’enrichir les cultures DRG pour les neurones en supprimant d’autres types de cellules. L’immunopanning fait référence à une méthode d’élimination des types de cellules en adhérant des anticorps aux boîtes de culture cellulaire. En utilisant ces plats, nous pouvons sélectionner négativement et réduire le nombre de fibroblastes, de cellules immunitaires et de cellules de Schwann en culture. Cette méthode nous permet d’augmenter le pourcentage de neurones dans les cultures.
Introduction
Les ganglions radiculaires dorsaux (DRG) abritent les corps cellulaires des neurones sensoriels qui innervent les tissus périphériques. L’étude de ces neurones nous permet de comprendre les fondements mécanistes de la douleur et des conditions sensorielles. Cependant, les DRG ne sont pas composés uniquement de neurones, mais contiennent également des fibroblastes, des cellules de Schwann, des macrophages et d’autres cellules immunitaires1. Malgré la présence de ces différents types de cellules, les cultures DRG entières sont souvent appelées neuronales 2,3 dans la littérature. Ces cultures sont toujours utiles pour l’investigation neuronale par imagerie ou cytométrie en flux, ce qui permettrait une identification neuronale par coloration, taille cellulaire et/ou morphologie. Cependant, pour des tests tels que la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) ou le Western blotting, où les cultures sont homogénéisées pour la collecte d’ARN ou de protéines, la présence de types de cellules non neuronales peut interférer avec les résultats. Par conséquent, il est nécessaire d’augmenter la proportion de cellules neuronales dans les cultures DRG.
L’immunopanning est une technique utilisée pour purifier une variété de types de cellules, y compris les neurones corticaux, les astrocytes, les cellules précurseurs d’oligodendrocytes et la microglie. En termes simples, il s’agit d’adhérer un anticorps contre un marqueur de surface cellulaire à une boîte de Pétri, destiné à lier certaines cellules (Figure 1), et il peut être utilisé pour sélectionner soit pour ou contre des types de cellules d’intérêt 4,5,6. L’immunopanning de DRG embryonnaires de rat à sélectionner contre les cellules non neuronales a été décrit précédemment par Zuchero7. Cependant, nous n’avons pas été en mesure de trouver un protocole d’immunopanoramique spécifique aux DRG de souris. Dans ce protocole, nous nous appuyons sur les tenants de base du protocole Zuchero, mais nous adaptons plutôt la séquence d’immunopanoramique pour enrichir les cultures DRG de souris adultes (Figure 2). Il s’agit d’un outil puissant pour étudier les neurones sensoriels établis en culture. Il est avantageux car il permet l’utilisation de souris adultes à partir de modèles génétiques, de maladies et de blessures, de sorte que leurs neurones sensoriels peuvent être étudiés avec plus de spécificité.
Ce protocole est avantageux pour les lecteurs qui cherchent à augmenter la proportion de neurones dans les cultures DRG de souris adultes. Cependant, les étapes d’immunopanoramique peuvent également être omises, et ce protocole peut également être utilisé pour des cultures DRG entières.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées avec l’approbation du Comité de protection et d’utilisation des animaux des sciences de la santé de l’Université de l’Alberta (protocole 0000274).
1. Préparation du réactif
- Pour le jour 1, préparez les réactifs suivants: eau de qualité culture cellulaire; poly-D-lysine-préparer un bouillon en reconstituant la bouteille entière dans 50 mL d’eau de culture jusqu’à une concentration de 100 μg/mL, entreposer à 4 °C et diluer le stock 1:10 dans de l’eau de culture jusqu’à une concentration finale de 10 μg/mL; tris-HCl-préparer une souche en dissolvant le chlorhydrate de tris en poudre dans de l’eau de culture jusqu’à une concentration de 500 mM (3,94 g dans 50 mL), pH 9,5, stériliser par filtre (0,22 μm), entreposer à 4 °C et diluer le stock 1:10 dans de l’eau de culture jusqu’à une concentration finale de 50 mM; anticorps secondaires (chèvre anti-rat, -lapin et -souris).
- Pour le jour 2, préparez les réactifs suivants.
- Préparer la solution saline équilibrée de Hank de grade de culture cellulaire Ca 2+, Mg2+ (HBSS; HBSS-/-), et une solution saline tamponnée au phosphate D (PBS) de qualité de culture cellulaire avec Ca 2+ et Mg2+. Préparer une partie aliquote de la souche de laminine et conserver à -80 °C dès sa réception; diluer le stock dans du HBSS-/- stérile jusqu’à une concentration finale de 10 μg/mL pour le matériel de travail.
- Préparer 4 % d’albumine sérique bovine (BSA) en dissolvant 400 mg de BSA dans 7,5 mL de D-PBS (pH 7,4), porter le volume à 10 mL, filtrer stériliser (0,22 μm), aliquote, et conserver à -20 °C. Préparer 0,2% BSA en diluant 750 μL de BSA à 4% dans 14,25 mL de D-PBS.
- Préparer le stock de DNAse à 0,4 % en ajoutant 1 mL de solution saline équilibrée (EBSS) d’Earle par 12 500 unités d’ADNase, stériliser par filtre (0,22 μm), aliquote et conserver à -20 °C. Préparer un tampon panoramique (0,02 % de BSA) en ajoutant 3 mL de BSA à 0,2 % et 100 μL de DNAse à 0,4 % dans 27 mL de D-PBS. Préparer les anticorps primaires (CD45, PDGRFβ, O4).
REMARQUE : Ce protocole utilise un hybridome O48,9, mais 10 μg d’anticorps O4 disponibles dans le commerce seraient également appropriés. - Préparer le stock de collagénase combinée en dissolvant un flacon de collagénase combinée (50 mg) dans 5 mL de HBSS-/-, aliquote, et conserver à -20 °C. Préparer un stock de travail pour deux souris en ajoutant 500 μL de collagénase combinée chauffée et 50 μL de DNase chauffée à 0,4% à 4,5 mL de HBSS-/-.
- Préparer un faible ovomucoïde en ajoutant 3 g de BSA à 150 mL de D-PBS, puis ajouter 3 g d’inhibiteur de la trypsine et mélanger pour dissoudre. Ajustez le pH à 7,4 et portez le volume à 200 mL avec le D-PBS. Filtrer stériliser, préparer des aliquotes de 1 mL et conserver à -20 °C. Le jour de la dissection, combiner 1 mL d’ovomucoïde faible dans 9 mL de D-PBS pour obtenir la solution de travail.
- Préparer 15 % de BSA en dissolvant 7,5 g de BSA dans 50 mL de HBSS-/- (placer sur un agitateur pour dissoudre complètement), stériliser par filtre et conserver à 4 °C.
- Préparer 50 mL de milieux neuronaux en ajoutant 23,2 mL de DMEM, 23,2 mL de milieu neurobasal, 500 μL de glutamax, 500 μL de pyruvate de sodium, 500 μL de pénicilline/streptomycine (aliquote immédiatement à l’arrivée et conserver à -20 °C), 500 μL d’insuline (5 μg/mL final), 500 μL de SATO, 50 μL de N-acétyl-L-cystéine (NAC; 5 μg/mL final), et 1 000 μL de B27+ (immédiatement aliquote et conserver à -20 °C à la réception).
- Préparer le stock d’insuline en le dissolvant dans de l’eau de culture à une concentration de 0,5 mg/mL (50 mg dans 100 mL), ajuster le pH à 7,4, stériliser le filtre (0,22 μm), préparer des aliquotes de 500 μL et conserver à -20 °C.
- Préparer le stock SATO en combinant 20 μL de progestérone (2,5 mg dans 100 μL d’éthanol), 800 μL de sélénite de sodium (4 mg dans 10 mL de milieu neurobasal + 10 μL de 1 N NaOH), 800 mg de BSA, 800 mg de transferrine, 128 mg de dichlorhydrate de putrescine et 80 mL de neurobasal. Filtrer stériliser (0,22 μm), préparer des aliquotes de 500 μL et conserver à -20 °C. Il est essentiel de faire des solutions fraîches de progestérone et de sélénite de sodium.
- Préparer 50 μL de souche de N-acétyl-L-cystéine (NAC) en les dissolvant dans un milieu neurobasal à une concentration stocke de 5 mg/mL (50 mg dans 10 mL), stériliser par filtre (0,22 μm), aliquote et conserver à -20 °C.
- Pour les jours 4 et 5, préparez les réactifs suivants.
- Préparer 0,2 M tampon phosphate (PB) en dissolvant 21,8 g de phosphate dibasique de sodium (Na2HPO4) et 8,34 g de phosphate de sodium monobasique dihydraté (NaH2PO4) dans 1 000 mL d’eau. Ajustez le pH à 7,4 et conservez à température ambiante.
- Préparer 8 % de paraformaldéhyde (PFA) comme suit : dans une hotte, chauffer 50 mL d’eau à 55 °C, éteindre le feu et ajouter 8 g de granulés de PFA en remuant constamment. Ajouter 1 N NaOH goutte à goutte jusqu’à ce que la solution commence à disparaître, puis ajouter 40 mL de 0,2 M PB et continuer à agiter jusqu’à consistance claire. Refroidir la solution à température ambiante, ajuster le pH à 7,4 et porter le volume à 100 mL avec 0,2 M PB. Filtrer et conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Préparer D-PBS + Triton X-100 (PBSTX) en ajoutant 0,2% de Triton X-100 dans le grade de culture D-PBS (1 mL de Triton + 500 mL de D-PBS). Conserver à 4 °C. Préparer la solution bloquante, qui est 1% de sérum d’âne normal (NDS) dans PBSTX. À l’avance, 1 mL de NDS + 9 mL de PBSTX peut être préparé et conservé à -20 °C dans 10 mL d’aliquotes.
- Préparer une solution d’anticorps contenant 0,2 % de NDS/0,2 % de BSA dans du PBS TX : 200 μL de NDS + 200 mg de BSA + 9,6 mL de PBSTX ; peuvent être préparés à l’avance et conservés à -20 °C dans des aliquotes de 10 mL.
2. Configuration de l’équipement
- Installez l’équipement suivant : armoire de biosécurité pour culture cellulaire stérile, jeu de micropipettes, pipettes sérologiques et pistolet à pipettes, boîtes de Petri de 10 cm, boîtes de culture cellulaire souhaitées pour le placage (ici, des plaques à fond de verre noir à 24 puits ont été utilisées pour l’imagerie), tubes coniques de 15 ml et 50 ml, outils de dissection (à savoir: ciseaux à ressort fins pour laminectomie et parage nerveux, pinces fines, et une lame de rasoir), bain-marie réglé à 37 °C, crépine cellulaire de 70 μm, centrifugeuse (10 min à 300 x g) avec adaptateurs pour tubes coniques de 15 mL, bleu de trypan et hémocytomètre, hotte et plaque chauffante magnétique.
3. Méthode expérimentale
- Jour 1 : préparation des plats
- Dans une armoire de biosécurité, enduire la surface de culture souhaitée avec suffisamment de poly-D-lysine pour couvrir le fond du puits. Conserver toute la nuit à 4 °C. Ici, des plaques à fond de verre à 24 puits ont été utilisées pour l’imagerie, et donc 300 μL de poly-D-lysine ont été utilisés.
- Dans une enceinte de biosécurité, préparer les plats de panoramique : pour la boîte CD45, ajouter 10 ml de solution de tris-HCl de travail et 30 μL d’IgG anti-rats de chèvre dans une boîte de Pétri de 10 cm ; pour la boîte PDGFRβ, ajouter 10 mL de solution de tris-HCl de travail et 30 μL d’IgG anti-lapin de chèvre dans une boîte de Petri de 10 cm; pour la boîte d’hybridome O4, ajouter 10 mL de solution de tris-HCl et 30 μL d’IgG anti-souris de chèvre dans une boîte de Petri de 10 cm. Assurez-vous que la solution couvre toute la surface du plat et laissez à 4 °C pendant la nuit.
- Jour 2 : dissection, trituration et immunopanoramique
- Aspirez la poly-D-lysine, lavez les plaques trois fois avec de l’eau de culture tissulaire, ouvrez le couvercle et laissez la surface sécher complètement dans une armoire de biosécurité. Appliquer suffisamment de laminine sur les plaques pour recouvrir le fond de chaque puits et placer dans un incubateur à 37 °C. Pour les plaques à 24 puits, 200 μL suffisent.
- Terminer la préparation des plats panoramiques. Laver chaque plat avec du D-PBS et incuber avec 10 μg d’anticorps primaires. Laisser reposer à température ambiante pendant au moins 2 h.
- Pour la boîte CD45, ajouter 5 mL de BSA à 0,2 % et 20 μL de CD45 primaire; pour la boîte PDGFRβ, ajouter 5 mL de BSA à 0,2 % et 15,4 μL de PDGFRβ; pour la boîte d’O4, ajouter 3 mL de BSA à 0,2 %, 2 mL d’hybridome O4 et 100 μL supplémentaires de BSA à 4 % (pour s’assurer que la concentration finale de BSA demeure à 0,2 %).
- Euthanasier une à quatre souris en utilisant 0,1 mL/kg de pentobarbitol sodique (par boîte d’immunopanoramique de 10 cm). Nous avons utilisé des souris C57BL/6 âgées de 8 à 10 semaines. Les deux sexes étaient utilisés et cultivés séparément l’un de l’autre. Perfuser l’animal avec 30 mL de solution saline froide à 0,9 %.
- Épinglez les pattes avant et postérieures à une scène en polystyrène et utilisez une lame de rasoir propre pour exposer la colonne vertébrale par l’arrière. Effectuez une laminectomie en faisant des coupures à peu près à mi-hauteur de chaque côté de la colonne vertébrale dorsale, en enlevant la moitié dorsale de la colonne, pour exposer la moelle épinière. Soit couper doucement les nerfs et retirer la moelle épinière, soit pousser doucement la moelle sur le côté, en maintenant l’intégrité nerveuse.
- Utilisez les racines nerveuses spinales (sectionnées ou attachées à la moelle épinière) pour trouver et enlever tous les DRG de chaque côté de la colonne vertébrale. Coupez les débris nerveux de chaque DRG au fur et à mesure qu’il est enlevé (plus de débris nerveux dans la culture peut entraîner une mauvaise survie de la culture). Recueillir les DRG dans 15 mL de HBSS-/- dans un tube conique de 15 mL sur de la glace.
NOTE: Notez que le tissu est disséqué à l’air libre, mais une fois que les DRG sont ajoutés au tube, ils doivent être traités comme stériles et manipulés uniquement dans une enceinte de biosécurité. - Placer les bouillons congelés de stemxyme 1 et de 0,4% d’ADN dans un bain-marie, environ 30 minutes avant la fin des dissections (environ au démarrage de la dernière souris). Laissez-les s’installer au fond du tube conique, puis poursuivez le protocole dans une enceinte de biosécurité.
- Aspirer la plupart des HBSS-/- des DRG. Utilisez une pipette plutôt que d’aspirer pour obtenir <1 mL de liquide, et laissez ~100 μL de liquide afin de ne pas risquer de perdre du tissu.
- Laver trois fois avec 1 mL de HBSS-/-. Ajouter 5 mL de solution de stemxyme fonctionnel au tissu. Couvrir le couvercle d’un film transparent et faire flotter le tube sur le côté dans un bain-marie réglé à 37 °C pendant 1 h.
- Après incubation dans l’enzyme, ajouter 1 mL de solution inhibitrice à faible teneur en ovo dans le tube. Triturez doucement les cellules avec une pipette p1000 10-15 fois. Laissez les morceaux de tissu se déposer.
- Transvaser les 2-3 mL supérieurs de solution (contenant des cellules dissociées) dans une solution fraîche à faible teneur en ovomucoïde. Répétez jusqu’à ce que le tissu soit complètement dissocié et qu’il ne reste plus aucun morceau visible.
- Centrifuger pendant 10 min à 300 x g à température ambiante. Siphonner à nouveau le surnageant, à l’aide d’une pipette plutôt que d’aspirer pendant le dernier 1 mL, en laissant ~100 μL, et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de tampon panoramique.
- Pipeter doucement pour mélanger. Prémouiller une crépine cellulaire de 70 μm avec 1 mL de tampon panoramique sur un tube conique de 50 mL. Filtrer la solution cellulaire à travers la passoire cellulaire.
- Laver le tube avec 1 mL de tampon panoramique, puis passer à travers la passoire (3 mL de filtrat). Déposer doucement la suspension cellulaire (1 mL à la fois) sur 2 mL d’un coussin BSA à 15 % pour enlever les débris de myéline. Un coussin de 2 mL est efficace pour deux souris, et 3 mL est efficace pour quatre souris.
- Pour la superposition, placer les 2 ml de BSA dans le tube, fermer et enduire doucement les côtés du tube de BSA. Ensuite, superposez délicatement la suspension cellulaire du dessus, en pipetant contre le côté du tube.
- Centrifuger à température ambiante à 300 x g pendant 10 min (accélération et décélération lentes). Utilisez une pipette P1000 pour retirer le liquide clair sur le dessus, la phase de myéline entre les deux, et le BSA, 1 mL à la fois (en changeant les embouts entre chaque mL). Laisser ~100 μL de BSA pour ne pas déranger la pastille.
- Ajouter 5 ml de tampon panoramique et incuber le tube dans un incubateur à 37 °C, 10 % de CO2 pendant 30 à 45 min. Cela permet la récupération de l’antigène. Assurez-vous de desserrer le bouchon pour permettre l’échange de gaz.
- Lavez le plat CD45 trois fois avec D-PBS. Versez le rinçage final. Décanter la suspension cellulaire dans le plat CD45.
- Incuber les cellules sur la boîte CD45 pendant un total de 20 minutes à température ambiante, en remuant doucement au point de 10 minutes pour permettre aux cellules un accès égal à l’anticorps.
- Rincez le plat PDGFRβ trois fois avec du D-PBS et versez le rinçage final. Transférer les cellules non liées de la boîte CD45 vers la boîte PDGFRβ.
- Secouez doucement le plat CD45 et soutenez-le en biais. Pipeter doucement 1 mL de la suspension cellulaire sur la capsule pour recueillir les cellules non liées. Décanter dans la capsule et la pipette PDGFRβ pour transférer la suspension cellulaire restante sur la plaque PDGFRβ.
- Incuber la plaque PDGFRβ pendant un total de 20 minutes à température ambiante, en remuant doucement au point de 10 minutes pour permettre aux cellules un accès égal à l’anticorps.
- Rincez le plat O4 trois fois avec du D-PBS et versez le rinçage final. Transférer les cellules non liées de la boîte PDGFRβ vers la boîte O4 en utilisant la même méthode qu’à l’étape 3.2.19. Incuber la plaque O4 pendant un total de 20 minutes à température ambiante, en remuant doucement au point de 10 minutes pour permettre aux cellules un accès égal à l’anticorps.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et centrifuger pendant 10 min à 300 x g. Remettez les cellules en suspension dans le volume souhaité et diluez 1:1 avec du bleu trypan pour la viabilité cellulaire. Comptez les cellules moyennes à grandes avec un hémocytomètre (cela permettra la meilleure représentation du nombre de neurones dans la culture).
- Retirez la laminine et plaquez les cellules à la densité désirée. Ne laissez pas la plaque sécher entre l’enlèvement de la laminine et le placage, et ajoutez les cellules immédiatement.
- Culture des cellules quantifiées pour l’enrichissement neuronal (Figure 3) avec 500 neurones dans 25 μL de milieu de culture (décrit en 1.2.7) par puits dans des plaques de 24 puits et incuber à 37 °C pendant 30 min. Inonder les puits jusqu’à un volume final de 500 μL.
- Jour 4 : fixation immunocytochimique (ICC), blocage et primaire
- Après 48 h de croissance, ajouter 500 μL/puits (ou volume équivalent au milieu dans le puits) de PFA à 8 % pendant 15 min à température ambiante pour fixer les cellules. Si une analyse des médias est souhaitée, on peut fixer directement avec 4% de PFA. Cependant, nous n’avons pas testé cela.
- Lavez les cellules avec D-PBS trois fois. Notez que nous avons gardé ces cellules en culture sans changement de milieu pendant un maximum de 72 heures, mais nous émettons l’hypothèse qu’elles pourraient survivre plus longtemps, en particulier si le milieu est à moitié changé.
- Retirez le lavage final et ajoutez suffisamment de solution de blocage par puits pour couvrir complètement les cellules. Bloquer pendant 30 min à température ambiante. Retirer la solution bloquante et ajouter l’anticorps primaire dans la solution d’anticorps : β3-tubuline à une dilution de 1:1 000. Sceller la plaque avec un film transparent et incuber pendant la nuit à 4 °C.
NOTE: On pourrait envisager une coloration avec PDGFRβ pour l’absence de fibroblastes, CD45 pour l’absence de cellules immunitaires, P0 ou PMP22 pour l’absence de myéline, ou fabp7 pour la glie satellite.
- Jour 5 : ICC secondaire
- Lavez les cellules avec D-PBS trois fois. Retirer le lavage final et ajouter les anticorps secondaires dans la solution d’anticorps : anti-lapin 488 à une dilution de 1:500 et DAPI à une dilution de 1:2 000. Incuber pendant 30 min à température ambiante, à l’abri de la lumière.
- Laver avec D-PBS trois fois. Ajoutez suffisamment de D-PBS pour couvrir le fond du puits, et l’image. La plaque peut être scellée avec un film transparent, protégée de la lumière et conservée à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
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Representative Results
Les cellules fixes colorées avec DAPI et β3-tubuline ont ensuite été imagées avec un système de criblage confocale à haut contenu. Les images ont été analysées à l’aide d’un logiciel commercial approprié pour déterminer le pourcentage de cellules DAPI positives qui ont comarqué avec la β3-tubuline (Figure 3). Il a été déterminé que les cultures de DRG entières présentaient une coloration de 42,36 % ± de 6,4 % de β3-tubuline, et les cultures de DRG immunopanisées présentaient une coloration de 71,44 % ±7,43 % de β3-tubuline. Cela révèle une augmentation significative de l’enrichissement neuronal avec l’immunopanoramique (p < 0,0001, test t non apparié).
Figure 1 : Principes de base de l’immunopanning. Un anticorps secondaire adhère à une boîte de culture pendant la nuit, et des anticorps primaires sont ensuite introduits. Cela permet aux cellules d’intérêt d’être attachées à la plaque par un antigène de surface. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Immunopannage des neurones DRG de souris adultes par sélection négative. Les DRG sont récoltés, dissociés et filtrés en une solution unicellulaire. Les débris de myéline sont éliminés par centrifugation à travers un coussin BSA. La suspension cellulaire est ensuite passée à travers trois antennes paraboliques (CD45, PDGFRβ et O4) pour obtenir une culture enrichie pour les neurones. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Enrichissement neuronal en culture DRG par immunopanning. Les cultures fixes ont été colorées avec de la β3-tubuline pour les neurones et du DAPI pour tous les noyaux. (A) Image représentative d’une culture entière (non immunopanée). (B) Image représentative d’une culture immunopanée. (C) Quantification des cellules β3-tubuline positives en pourcentage du total des cellules DAPI positives. Les barres indiquent la moyenne ± la moyenne d’erreur type (MEB). = p < 0,0001, test t non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole d’immunopanoramique augmente la proportion de cellules neuronales dans les cultures primaires DRG. Pour de meilleurs résultats, les dissections doivent être effectuées en temps opportun et les DRG doivent être débarrassés de l’excès de nerfs. L’étape de dissociation doit être surveillée attentivement et ne doit pas dépasser 1 h pour éviter que les cellules ne subissent un stress inutile. En ce qui concerne l’immunopanoramique en particulier, chaque plaque doit être doucement tourbillonnée à mi-chemin pour permettre aux cellules d’avoir accès aux anticorps enrobés. Les plaques doivent également être vues au microscope de culture après la collecte de la suspension de cellules neuronales pour s’assurer que les cellules non neuronales se sont liées.
Une limitation dans l’utilisation de souris adultes est la nature établie des DRG. Une incapacité à éliminer tous les types de cellules non neuronales laisse environ 30% de la culture comme non neuronale (Figure 3). Bien que nous puissions dissocier et réduire la population de cellules immunitaires, de fibroblastes et de cellules de Schwann à partir des cultures, la glie satellite peut être extrêmement difficile à dissocier des neurones. Nous émettons également l’hypothèse que ces neurones pourraient avoir une faible survie sans le soutien métabolique fourni par la glie satellite10. Bien que notre tentative de coloration pour ces cellules à l’aide de GFAP ait échoué en raison d’une faible spécificité des anticorps, une orientation future pourrait être de colorer ces cellules en utilisant fabp7. Nous avons tenté de supprimer les cellules non neuronales CD9 positives telles que la glie satellite lors du dépannage de ce protocole. Cependant, dans la plaque CD9, il a été constaté que de nombreux neurones étaient attachés à la plaque. Nous émettons l’hypothèse que les neurones de souris peuvent avoir une certaine expression de CD9. En fait, la littérature sur les vésicules extracellulaires provenant de cellules de type neurone de souris utilise CD9 comme marqueur11. Si un anticorps panoramique plus approprié pouvait être trouvé pour réduire la proportion de glies satellites, on pourrait envisager une supplémentation supplémentaire avec des facteurs de croissance tels que NGF, BDNF ou NT3 pour contrer la perte de ces cellules de soutien.
Ce protocole d’immunopanoramique peut améliorer la précision des lectures neuronales à partir d’échantillons de culture DRG homogènes en augmentant la proportion de cellules neuronales en culture. Il fournit également un moyen de cultiver des neurones DRG de souris adultes, permettant une étude approfondie des phénotypes neuronaux dans des modèles de souris génétiques, de maladies et de blessures.
L’immunopanning est également un outil hautement personnalisable. Par exemple, le marqueur de surface cellulaire isolectine-B4 pourrait être utilisé pour sélectionner spécifiquement les nocicepteurs de souris non peptidergiques. L’immunopanoramique peut également être utilisé pour enrichir d’autres cultures primaires, y compris les neurones corticaux, la microglie, les astrocytes et les cellules précurseurs d’oligodendrocytes. C’est un outil puissant qui peut élargir les applications des cultures cellulaires primaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été financés par une subvention Projet des Instituts de recherche en santé du Canada (FRN-162434) et une subvention à la découverte de la Société canadienne de la SP (EGID-3761). Les auteurs tiennent à remercier le Dr Sun et le Cross Cancer Institute pour la formation et l’utilisation du système ImageXpress.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
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- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
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