Summary
Caenorhabditis elegans er en kraftig modell for å undersøke molekylære determinanter som driver vertsmikrobiom-interaksjoner. Vi presenterer en rørledning med høy gjennomstrømning som profilerer enkeltdyrnivåene av tarmmikrobiomkolonisering sammen med viktige aspekter ved C. elegans-fysiologien.
Abstract
Sammensetningen av tarmmikrobiomet kan ha en dramatisk innvirkning på vertsfysiologien gjennom utviklingen og dyrets liv. Måling av sammensetningsendringer i mikrobiomet er avgjørende for å identifisere de funksjonelle forholdene mellom disse fysiologiske endringene. Caenorhabditis elegans har dukket opp som et kraftig vertssystem for å undersøke molekylære drivere av vertsmikrobiominteraksjoner. Med sin gjennomsiktige kroppsplan og fluorescerende merkede naturlige mikrober, kan de relative nivåene av mikrober i tarmmikrobiomet til et individuelt C. elegans-dyr enkelt kvantifiseres ved hjelp av en stor partikkelsortering. Her beskriver vi prosedyrene for eksperimentelt oppsett av et mikrobiom, innsamling og analyse av C. elegans-populasjoner i ønsket livsstadium, drift og vedlikehold av sortereren, og statistiske analyser av de resulterende datasettene. Vi diskuterer også hensyn for optimalisering av sorteringsinnstillinger basert på mikrober av interesse, utvikling av effektive gatingstrategier for C. elegans livsstadier, og hvordan man kan utnytte sorteringsevner for å berike dyrepopulasjoner basert på tarmmikrobiomsammensetning. Eksempler på potensielle applikasjoner vil bli presentert som en del av protokollen, inkludert potensialet for skalerbarhet til applikasjoner med høy gjennomstrømning.
Introduction
Dyrs evolusjon er under konstant mikrobiell påvirkning1. Fra ulike mikrober i miljøet får dyreverter spesifikke partnere2 som utvider vertens evner og driver dens fysiologi og følsomhet for sykdom3. For eksempel avdekket metagenomiske analyser av tarmmikrobiomet berikede metabolske klasser av mikrobielle gener som kan gi større energihøsting og lagring hos overvektige mus4, hvorav mange også finnes i det humane tarmmikrobiomet5. Det er fortsatt et stort behov for å etablere årsakssammenhenger og finne molekylære determinanter for mikrobiompåvirkningen, selv om fremgangen har blitt hindret av mikrobiometkompleksiteten og trekkbarheten til vertssystemer til storskala screening.
Modellorganismen C. elegans gir en plattform for å fremme molekylær forståelse av koblinger mellom mikrobiom og vertsfysiologi. C. elegans har 20 tarmceller med et slimhinnelag og villi-strukturer. Disse cellene er utstyrt med rikelig kjemoreceptorgener som sanser mikrobielle produkter og produserer antimikrobielle molekyler som potensielt regulerer tarmkolonisatorene 6,7. Denne konserverte biologien til C. elegans har ført til et enormt antall funn i vertssignalering som regulerer tarmmikrober, inkludert insulinsignalering, TGF-beta og MAP Kinase 8,9,10.
C. elegans bruker mikrober som både deres diett for vekst under utvikling og mikrobiom som voksne. Med alderdommen kan noen mikrober overakkumuleres i tarmlumen, og vertsmikrobeforholdet skifter fra symbiose til patogenese11. I sine naturlige habitater møter C. elegans et bredt spekter av bakteriearter12,13. Sekvensering av 16S rDNA fra representative prøver samlet inn i naturlige habitater (råtne frukter, plantestamme og dyrevektorer) avslørte at det naturlige mikrobiomet til C. elegans domineres av fire bakterielle phyla: Proteobakterier, Bacteroidetes, Firmicutes og Actinobacteria. Innenfor disse divisjonene ligger stor variasjon i bakteriens mangfold og rikdom basert på habitatet12,13,14,15. Flere definerte samfunn har blitt etablert, inkludert samlingene med 63 medlemmer (BIGbiome)16 og 12-medlemmer (CeMbio) som representerer de beste mikrobiomslektene opprettet for C. elegans forskningssamfunn17. Både mikrobiomer og komponentstammer kan ha en variert innvirkning på fysiologien til C. elegans som kroppsstørrelse, vekstrater og stressresponser 9,16,17. Disse studiene gir ressurser og eksempler for å etablere C. elegans som en modell for mikrobiomforskning.
Her presenteres en stor partikkelsorterer (LPS) basert arbeidsflyt (figur 1) som bruker C. elegans-systemet til samtidig å måle mikrobiomsammensetning og grunnleggende mål på vertsfysiologi på populasjonsskalaen. Fra den mikrobielle siden kan arbeidsflyten tilpasses for å sette sammen et definert mikrobiom eller enkeltmikrober for å teste robustheten og plastisiteten i samfunnet med økende mikrobielle interaksjoner. Fra vertssiden muliggjør arbeidsflyten høye gjennomstrømningsanalyser for å måle koloniseringsnivåer av fluorescerende mikrober i mikrobiomet og vertsfysiologisk avlesning når det gjelder utvikling, kroppsstørrelse og reproduksjon. Samlet sett muliggjør C. elegans mikrobiommodell skjermer med høy gjennomstrømning for å finne de metabolske og genetiske determinantene som modulerer vertsfysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av mikrobiomblanding
- Stemple eller streke ut bakterier fra en glyserolfrysestokk på en lysogen buljongplate (LB), eller passende vekstmedium, og vokse over natten ved en optimal temperatur basert på bakteriestammer av interesse (vanligvis 25 ° C for C. elegans naturlige mikrober).
- Fra LB-platen bruker du en enkelt koloni fra hvert bakterieisolat (f.eks. 12 bakterier fra CeMbio-samlingen) for å inokulere 800 μL LB-medium i separate brønner på en 1 ml dypbrønnsplate. Inkuber over natten ved optimal temperatur med risting ved 250 o / min.
MERK: Denne protokollen er optimalisert for bruk med definerte naturlige mikrobiomer (f.eks. CeMbio), men kan enkelt justeres for individuelle mikrober ved vekst under passende forhold eller andre dyrkningsbeholdere (rør). - Vurdere veksten av hver mikrobe ved spektrofotometri. Overfør en 20 μL alikot til 80 μL LB og tilsett løsningen til en klar, flat bunn 96-brønnsplate. Mål OD600 på en plateleser.
- Etter vekst over natten, sentrifuger den dype brønnkulturplaten ved 4000 x g i 10 minutter for å pelletsbakterier og fjern supernatanten ved aspirasjon ved hjelp av en 96-brønns aspirasjonsmanifold eller flerkanals pipette.
- Bruk OD 600-verdier, normaliser konsentrasjonen av hver mikrobe til en endelig OD600 på 1,0 ved bruk av sterilt M9-medium.
- Hvis du kombinerer mikrober, bestem mengden bakteriekultur som trengs for eksperimentet og lag en mikrobiommasterblanding ved å kombinere like volumer av hver bakteriestamme i et rør av tilstrekkelig størrelse (f.eks. 5 ml eller 15 ml rør).
- Spot 30-50 μL av mikrober med en endelig OD600 på 1,0 på midten av hver nematode vekstmedium (NGM) agarholdig plate eller brønn18. La det sådde mikrobiomet vokse over natten ved en optimal temperatur (25 °C her).
MERK: Klargjør NGM-agarplater på forhånd i henhold til instruksjonene i Wormbook eller ved bruk av ferdigblandet NGM-pulver18. For eksempel tilsettes 3 ml NGM for 12-brønnsplater, og 1,5 ml tilsettes for 24-brønnsplater.
2. Fremstilling av synkroniserte C. elegans for vekst på mikrobiomet
- Dyrk ca 100 ormer på NGM-plater (6 cm diameter) frøet med Escherichia coli OP50, til ormer når gravid voksen alder. I denne protokollen ble C. elegans N2-stammen brukt, selv om protokollen lett kan tilpasses andre nematodestammer.
- Tilsett 6 ml M9-buffer (pluss 0,01% triton X-100; M9-TX) til platen, pipettering opp og ned for å vaske av ca. 100 drektige voksne ormer i et 15 ml konisk rør.
- Forbered nylaget blekemiddelløsning ved å blande to deler blekemiddel med en del 5 M NaOH.
- Sentrifuge ormene ved 3000 x g i 30 s for å pelletere ormene. Aspirer for å få volumet ned til 4 ml, og tilsett deretter 2 ml blekemiddeloppløsning.
- Lukk lokket tett og rist røret. Overvåk de voksne ormene i løsningen under et stereomikroskop ved 10x forstørrelse. Når voksne kropper begynner å bryte fra hverandre, vanligvis etter 3,5 min, må du slutte å riste og sentrifugere ved 3000 x g i 30 s.
- Aspirer til et minimalt volum med en pipette. Resuspendere, sentrifugere og aspirere fire ganger i M9-TX for å vaske ut blekemiddelet.
- Resuspender i 4-6 ml M9-TX og plasser røret på en rotator over natten, slik at eggene klekkes og synkroniseres på L1-trinnet.
- Neste dag, ta 10 μL L1 ormer i M9-TX fra røret og slipp dem på en ren petriskål. Tell antall levende L1-ormer under et stereomikroskop ved 20x total forstørrelse.
- Basert på L1-tettheten, pipetter riktig volum for å slippe ~50 synkroniserte L1-larver på kanten av mikrobiomfrøede NGM-plater og inkubere ved 20 °C. La ormer vokse til ønsket alder (dag 2 eller dag 3 i voksen alder).
3. Innsamling av ormpopulasjon for tarmmikrobiomanalyser
- Vask ormene av bakterieplenen med 1-2 ml M9-TX til en sterilisert 2 ml 96-brønns dyp plate.
MERK: For mikrobielle stammer som skaper betydelige biofilmer, rist platen med væske i 5 minutter for å bryte opp mikrobielt rusk. - Sentrifuge dypbrønnplaten ved 300 x g i 1 min for å pelletere ormene, og fjern deretter væsken ved hjelp av en aspirasjonsmanifold.
MERK: Brukere kan bruke en flerkanals pipette for å fjerne væsken manuelt hvis en aspirasjonsmanifold ikke er tilgjengelig. Pass på at pipettespissene ikke berører bunnen av brønnene for å unngå tap av ormeprøver. - Tilsett 1,8 ml M9-TX til hver brønn på dypbrønnplaten ved hjelp av en 1,2 ml flerkanalspipettte. Bland ved å pipettere opp og ned et par ganger, og sentrifuger ved 300 x g i 1 min. Gjenta dette trinnet fire ganger for å fjerne bakterier i væsken.
- Etter den endelige vasken, bring volumet i hver brønn til 100 μL ved hjelp av aspirasjonsmanifolden.
MERK: For å skille voksne fra larver ved hjelp av tyngdekraften, la platen stå på benken i 30-60 s, slik at voksne ormer kan synke til bunnen av brønnen. Deretter aspirerer du platen for å fjerne larver fra suspensjonen. - Tilsett 100 μL 10 mM levamisol i M9-TX til hver brønn og la ormene lamme i 5 minutter. Etter levamisolbehandling, tilsett 4% av blekemiddeloppløsningen beskrevet i trinn 2.3 til hver brønn i 2 minutter for å redusere bakterieklumper, om nødvendig. Vask med M9-TX to ganger etter blekemiddelbehandlingen og aspirer til et endelig volum på 100 μL etter den andre vasken.
- Overfør ormer til en flatbunns 96-brønnplate inneholdende 150 μL 10 mM levamisol i M9-TX. Hold ormetettheten på 50-100 per brønn og del ormene i flere brønner hvis bestanden er for overfylt.
4. Oppsett av stor partikkelsorterer og automatisk prøvetaker
- Slå på luftkompressoren, datamaskinen og LPS-instrumentet. Sjekk og tøm avfallstanken. Tilsett deretter 500 ml blekemiddel i den tomme avfallstanken. Kontroller og fyll på kappe og vanntanker hvis volumet er lavt. Sørg for at 250 μm fluidisk og optisk kjerneenhet (FOCA) er på plass.
- Kjør kontrollpartiklene for kvalitetskontroll. Åpne programvaren for LPS-instrumentet. I programvarevinduet merker du av for Aktiver lasere for å slå på laserne 488 nm og 561 nm.
MERK: Det er mulig å hoppe over trinn 4.2-4.5 hvis kontrollpartiklene har blitt kjørt i løpet av de siste 2 ukene og FOCA ikke har blitt endret i løpet av den tiden. - Velg Konfigurer > kontrollpartikler. Velg Nei i ledeteksten for å gå til standardinnstillingene. Virvel kontrollpartiklene (10 ml dH2O og 10 ml kontrollpartikler i et 50 ml konisk rør) før hver bruk og legg dem på prøveporten.
- Når du er klar, klikker du på Oppkjøp for å registrere 500 hendelser. Sørg for at arrangementsfrekvensen leser mellom 15–30 hendelser.
MERK: Hvis hendelsesfrekvensen ikke er 15–30 hendelser, bør en tekniker kontaktes for å justere maskininnstillingene. - Undersøk variasjonskoeffisient (CV) for alle parametere. Hvis CV < 15%, er kvalitetskontrollen bestått og LPS-programvaren kan lukkes. Hvis CV > 15%, kjør igjen og juster mikrometer med nylagde kontrollpartikler for å justere laseren med strømningscellen.
- Koble til og slå på den automatiske prøvetakeren. Åpne programvaren for automatisk prøvetakerinstrument. Dette åpner den automatiske prøvetakeren og LPS-programvaren. I LPS-programvarevinduet går du til Fil > nytt eksperiment og deretter Fil > ny prøve. Merk av for Aktiver lasere for å slå på lasere på 488 nm og 561 nm hvis det ikke allerede er gjort.
- Opprett maler for innsamlingspunktplott ved hjelp av flytid (TOF), utryddelse (EXT) og fluorescerende kanaler i LPS-programvarevinduet. Et godt startmaksimumstall for å fange alle ormene er 8,000 for TOF og EXT. Fluorescensskalaer vil variere basert på hver mikrobe. Inkluder kontrollormprøver dyrket på ikke-fluorescerende mikrobe (f.eks. OP50) og hver fluorescerende mikrobe alene (hvis du blander mikrober) som kontroller med hvert eksperiment.
- Høyreklikk i brødteksten i en graf for å endre skaleringen. Bruk kontrolldyr som dag 1 voksne eller synkroniserte L1s (eller populasjon av interesse) for å hjelpe til med TOF og EXT gating utvalg.
- I det automatiske prøvetakervinduet velger du Prime. Gå til File > Open Script for å velge riktig innebygd skript, og klikk deretter på OK.
- Bare for analyse velger du skriptet med Hent. For sortering, velg skriptet med Dispense. For anskaffelse fra 96-brønnsplater, velg skriptet med 96 brønner; For oppkjøp fra 384-brønnplater, velg skriptet med 384 brønn. For prøvevolum (40 eller 100 μL), velg skriptet med tilsvarende volum.
- Gå til Platemal på menyen for automatisk prøvetakerprogramvare for å velge de ønskede brønnene for analyse. Last inn kontrolleksemplene. Etter at platen er lastet på det automatiske prøvetakertrinnet og sikret, trykker du på Run Plate i det automatiske prøvetakervinduet. Lagre filen når du blir bedt om det.
MERK: Kontrollprøver og innstillinger kan gjøres med et 50 ml konisk rør på LPS-prøveporten før du fester LP-prøvetakeren. - Når oppkjøpet er fullført, klikker du på Lagre data-knappen på det øverste båndet i LPS-programvarevinduet og lagrer dataene igjen.
5. Analyse av C. elegans egenskaper og tarmmikrobiomnivåer per dyr
- Rådata lagres i tre filtyper: .lmd, .bxr3 .txt. Last inn tekstfilen merket .txt filen i R-programmet for analyse. Fullfør trinnene nedenfor i R19.
- Bruk pakken tidyverse20 som rammeverk for analysen.
- Bruk ggplot-funksjonen (inkludert i tidyverse) til å plotte LPS-dataene ved hjelp av TOF-verdiene som x-akse- og EXT-verdier som y-akse. Et normalt plott vil vise to skyer av prikker. Sørg for at man er nær opprinnelsen og x-aksen, noe som indikerer mindre partikler som larver og små rusk, og den andre gruppen av partikler er øverst til høyre i plottet og representerer voksne nematoder.
- Bruk denne grupperingen som en veiledning, og velg tilstrekkelige TOF- og EXT-grenseverdier. Gating kan variere etter C. elegans-stammer på forskjellige mikrober basert på endringer i fysiologi (f.eks. mørke vs. klare dyr eller endringer i eggvogn kan endre EXT-koeffisienter).
- Bruk funksjonsundergruppen til å skille voksne og larver ved TOF og EXT gating. I eksemplet her bruker du TOF > 1,200 og EXT > 1,000-innstillinger for å gate for voksne dyr.
- Analysere de resulterende datasettene for statistiske forskjeller; bruk t-test-funksjonen i R for dette eksperimentet.
- For å bestemme virkningen av mikrobiom på størrelsen og den optiske tettheten til C. elegans, sammenlign henholdsvis TOF- og EXT-verdiene mellom forhold. TOF er en proxy for ormstørrelse og kan indikere endringer i veksthastigheten til dyrene på bestemte tidspunkter. EXT-endringer er størst mellom slutten av utviklingen og voksen alder på grunn av lyset spredt av egg og kan brukes til å vurdere endringer i tidspunktet for den overgangen og fecundity. Vurder andelen og fordelingen av avkommet hvis de ble beholdt under analysene.
- For å bestemme endringer i tarmmikrobiomkoloniseringsnivåer, normaliser først fluorescensverdier (f.eks. Røde eller grønne kolonner) ved å dele med individuelle TOF-verdier for hvert dyr. Etter hvert som ormer vokser i størrelse og blir voksne, blir volumet av tarmen også større. Normalisering bidrar til å redusere artefakter fra forskjeller i fordeling av dyrestørrelse. Bruk normaliserte dyr for å vurdere endringer i tarmmikrobiomkolonisering på tvers av forhold.
MERK: Et rådataeksempel og tilsvarende R-skript finnes i tilleggsfil 1 JOVE_worm_microbiome.txt og tilleggsfil 2 JOVE_worm_microbiome.r. Se figur 2 og figur 3 for et representativt eksempel på disse analysene av verten og mikrobiomet ved bruk av to fluorescerende bakterier.
6. Sortering av C. elegans dyr etter tarmmikrobiom funksjoner
- Samle en C. elegans-populasjon dyrket på fluorescerende merkede mikrober (f.eks. RFP) som beskrevet i trinn 3. Ormer bør plasseres i 50 ml koniske rør med minimum 5 ml prøve. Sikt på ca 2000 ormer / ml inkludert alle voksne og avkom.
MERK: Dette kan også gjøres i en flat bunn 96-brønns plate ved hjelp av LP-sampleren. Hold ormetettheten på 50–100 per brønn.- Hvis LP sampler har blitt brukt, slå av og koble fra LP sampler. Koble prøve- og renselinjene til LPS-en på nytt før sortering.
- Åpne LPS-programvaren, gå til File > New Experiment og deretter File > New Sample. Lag et punktdiagram med TOF på x-aksen og Extinction på y-aksen. Opprett et nytt punktdiagram med TOF på x-aksen og rødt på y-aksen. Bruk samme akseskala og laserinnstillinger som tidligere brukt. Merk av for Aktiver lasere for å slå på lasere på 488 nm og 561 nm
MERK: Hvis disse plottene er opprettet tidligere, går du til File > Open Experiment og File > Open Sample for å laste inn grafer.- Plasser kontrollprøverøret på prøveporten. I dialogboksen Hent/dispenser klikker du Hent. Lagre filen når du blir bedt om det. Når nok ormer er målt til å skille populasjoner, klikker du Avbryt.
MERK: Strømningshastigheter bør være omtrent 15–30 hendelser/s. Hvis ikke, juster ormekonsentrasjoner for å sikre at individuelle dyr analyseres eller sorteres per dråpe. I LPS passerer ormer gjennom laserens bane i forskjellige posisjoner (rett mot krøllet eller bøyd). De kan ta en annen tid å passere laseren og detektoren, avhengig av deres posisjoner. - I TOF vs Extinction dot plot tegner du en port rundt den voksne befolkningen. I TOF vs Red dot-plottet tegner portene rundt områdene med høye og lave røde verdier som områder av interesse for voksne ormer med forskjellige nivåer av mikrobiomkolonisering. Gå til Vis > Gating Hierarki, og kontroller at fluorescerende porter er oppført under den voksne befolkningsporten. Når innstillingene er optimalisert, går du til Fil > Lagre eksperiment og Fil > Lagre eksempel.
MERK: I eksemplet her, velg dyr basert på TOF / EXT-porter for voksne og sorter i bassenger som viser enten høy eller lav kolonisering med røde fluorescerende proteinuttrykkende bakterier. Imidlertid kan enhver kombinasjon av parametere målt av LPS brukes til å identifisere populasjonen(e) av interesse.
- Plasser kontrollprøverøret på prøveporten. I dialogboksen Hent/dispenser klikker du Hent. Lagre filen når du blir bedt om det. Når nok ormer er målt til å skille populasjoner, klikker du Avbryt.
- Før sortering, sørg for at riktig oppsamlingsapparat er lastet. For å laste 96-brønnsplaten på oppsamlingsapparatet, velg Lastplate A > Flytt under Flytt fase-delen i dialogboksen Hent / dispenser for å la oppsamlingstrinnet bevege seg i en posisjon som er primet for lasting av en 96-brønnsplate.
- For massesortering, velg riktig rørstørrelse og klikk Flytt for å laste enten et 15 ml eller 50 ml konisk rør. I Sortering-delen i dialogboksen Hent/dispenser velger du sorteringsporten fra rullegardinlisten over områdene som er opprettet. Skriv inn antall objekter fra det definerte området som skal dispenseres til et oppsamlingsrør rett under flytcelledysen. Klikk på Bulk Sort-knappen under dialogboksen Hent/dispenser.
- For dispensering til en 96-brønnsplate, gå til Setup > Plates > Calibrated Plates > 96-well Plate. Gå deretter til Vis > platemal, velg brønnene som ormene skal sorteres til, skriv inn antall objekter som skal sorteres i hver brønn, og velg de inngjerdede områdene av interesse. Hvis mer enn ett inngjerdet område skal sorteres i samme plate, merker du av i boksen Gate hver brønn. Klikk OK for å lagre endringene.
- Etter at sorteringsnumre og steder er tildelt, klikker du på Fyllplate-knappene fra dialogboksen Hent / dispenser for å starte dispensering til en 96-brønnsplate.
- Før du fyller hele 96-brønnplaten, utfør testsortering av en delmengde av dyr eller kontroller i en 96-brønnsplate og analyser ved hjelp av et stereomikroskop for å sikre at passende tall og ønskede dyrepopulasjoner er sortert. Når nøyaktig sortering er bekreftet, gjenta trinn 6.3-6.6 for eksperimentelle prøver. Klikk på Lagre data-knappen på det øverste båndet i LPS-programvarevinduet for å lagre data igjen.
MERK: Alle målingene (EXT, TOF, RFP, GFP, etc.) kan også samles inn for sorterte dyr og sammenlignes med de som ikke ble sortert. Dette kan gjøre det mulig å kjøre analyse- og sorteringsmoduser samtidig hvis ønskelig.
- Før du fyller hele 96-brønnplaten, utfør testsortering av en delmengde av dyr eller kontroller i en 96-brønnsplate og analyser ved hjelp av et stereomikroskop for å sikre at passende tall og ønskede dyrepopulasjoner er sortert. Når nøyaktig sortering er bekreftet, gjenta trinn 6.3-6.6 for eksperimentelle prøver. Klikk på Lagre data-knappen på det øverste båndet i LPS-programvarevinduet for å lagre data igjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Definere populasjonsporter for voksne og larver
Her ble synkroniserte C. elegans L1 dyrket på en NGM-plate sådd med E. coli OP50 (Eco), en standard laboratoriediett. C. elegans-populasjoner ble samlet for LPS-analyse etter 96 timer eller 120 timers vekst ved 20 °C (figur 2A). Et punktplott av utryddelse (EXT, en proxy for kroppstetthet) versus time-of-flight (TOF, en proxy av kroppslengde) skaper to visuelt separerte skyer av dyr. Hver prikk representerer et enkelt dyr der høyere EXT- og TOF-verdier er observert hos voksne sammenlignet med larver (figur 2B). Disse to parametrene er verdifulle slutninger for befolkningsvekst og fysiologi. For eksempel kan et tetthetsplott av larver TOF visualisere fordelingen av larvestadier. Progenier fra 2 dager gamle voksne ble dominert av L1- og L2-stadier med en TOF under 200, mens de fleste progenier fra 3-dagerige voksne nådde L3- og L4-stadier (figur 2C). I tillegg er 2D-tetthet og boks-whisker-plott nyttige for å visualisere endringer i voksen kroppsstørrelse og tetthet siden verdiene av TOF og EXT øker på dag 3 sammenlignet med dag 2 når de vokser på E. coli (figur 2D-F). Dette forholdet er vanligvis lineært i voksen alder, men noen endringer i fysiologi kan påvirke en funksjon mer enn en annen (f.eks. Voksne uten egg kan ha lavere EXT-verdier uten å påvirke TOF).
Profilering av tarmmikrobiomsammensetning ved bruk av fluorescerende merkede mikrober
For å illustrere ulike nivåer av kolonisering, sammenligner vi en dominerende kolonisator av det naturlige C. elegans mikrobiomet dTomat-merket Ochrobactrum BH3 (Och) og grønt fluorescerende protein (GFP)-merket E. coli OP50. Disse to ble sådd hver for seg og i en lik blanding basert på OD (1:1 mix) på NGM-platen. Synkroniserte C. elegans L1 ble dyrket på de tre forholdene og samlet ved 120 timer for å undersøke koloniseringsdynamikken hos 3 dager gamle voksne (figur 3A). 2D-tetthet og boks-whisker-plott viste at det er forskjeller i voksne TOF- og EXT-verdier når C. elegans dyrkes på Ochrobactrum BH3 og blandingskulturer (figur 3B-E). Tarmkolonisering av bakterier kan utledes av fluorescensnivået som oppdages i de enkelte nematodene. Box-whisker-plott av røde fluorescerende avlesninger viser økt Ochrobactrum BH3-kolonisering i blandingstilstand enn i Ochrobactrum BH3 alene. I motsetning til dette indikerer grønnfluorescerende verdier lavere OP50-kolonisering i blandingstilstanden enn i OP50 alene. Lignende trender observeres i TOF-normaliserte fluorescerende signaler, som fjerner effekten av kroppsstørrelse og reduserer variasjonen i befolkningen (figur 3F-I). For et definert mikrobiom med flere fluorescerende merkede mikrober, kan et punktplott illustrere koloniseringsmønstre for disse mikrober. For eksempel, i to-medlemsblandingsmikrobiomet, viser et punktplott av rødt fluorescerende protein (RFP) versus GFP-kanaler at ormer er sterkt skjevt mot y-aksen (RFP), noe som tyder på at OP50-kolonisering er lav i de fleste ormer mens nivåene av Ochrobactrum BH3-kolonisering er jevnt fordelt i befolkningen (figur 3J). På samme måte kan et punktplott av RFP versus EXT avsløre forholdet mellom Ochrobactrum BH3 koloniseringsnivåer og vertsutvikling som kroppstetthet (figur 3K). I tillegg kan forskjellene i reproduksjonsmønstre observeres ved å plotte tetthetsplottet til den respektive larvepopulasjonen på de tre forholdene (figur 3L).
Anrikning for målrettede populasjoner basert på mikrobiomkolonisering
De 3 dager gamle voksne som vokser på tomedlemmets blandingsmikrobiom, utviser et bredt spekter av RFP-intensitet, noe som indikerer individuelle variasjoner i Ochrobactrum BH3-kolonisering i gruppen (figur 4A). For ytterligere å skille disse undergruppene ble sorteringsporter for høy og lav RFP manuelt tegnet for å sortere 15 individer fra hver gate til en 96-brønnsplate, som vist ved RFP-bildet av hele brønnen (figur 4B). Under høyere forstørrelse bekrefter overleggsbilder av lyse felt og RFP-kanaler at sorteringsmetoden velger høy og lav Ochrobactrum BH3-koloniserte ormer, noe som muliggjør ytterligere karakterisering av fenotypiske konsekvenser og molekylære drivere (figur 4C).
Figur 1: Et flytskjema for strømningsvermimetribaserte metoder for å vurdere tarmmikrobiom og vertsfysiologi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Definere voksne og larvepopulasjoner. (A) En arbeidsflyt for å samle C. elegans populasjoner på dag 2 og dag 3 i voksen alder. (B) Prikkplott av time-of-flight (TOF) versus utryddelse (EXT) for C. elegans-populasjoner på dag 2 (grå) og dag 3 (rød) i voksen alder. (C) Tetthetsplott av larver TOF på dag 2 og dag 3 i voksen alder. (D-E) Dot og box-and-whisker tomter av TOF versus EXT for voksne på dag 2 og dag 3 i voksen alder. (F) Boks-og-whisker-plott om voksen utryddelse på dag 2 og dag 3 i voksen alder. P-verdier ble beregnet med studentens t-test (*** p < 0,001; Dag 2 n = 38; Dag 3 n = 88). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Profilering av tarmmikrobiomkolonisering ved bruk av fluorescerende merkede mikrober. (A) Samling av 3 dager gamle voksne populasjoner dyrket på Ochrobactrum BH3 (dTomat-uttrykkende; Och), E. coli OP50 (GFP-uttrykkende; Eco) eller en 1:1 blanding av de to bakteriene (mix). (B) Prikkplott av TOF versus EXT for dag 3 voksne dyrket på blandingen. (VG Nett) Dot og box-and-whisker tomter av TOF versus EXT for 3 dager gamle voksne vokst på Ochrobactrum BH3. Grå streklinjer angir middelverdien av populasjonen som vokser på OP50. (VG Nett) Box-and-whisker plot av rå og TOF-normalisert dTomato (RFP) verdier for 3 dager gamle voksne vokst på Mix og Ochrobactrum BH3 alene. (H-I) Box-and-whisker tomter av rå og TOF-normalisert GFP for 3 dager gamle voksne vokst på blanding og OP50. (J) Prikkplott av Ochrobactrum BH3 (RFP) versus E. coli OP50 (GFP) for 3 dager gamle voksne dyrket på blanding. (K) Prikkplott av RFP versus EXT for 3 dager gamle voksne vokst på blanding. (L) Tetthetsplott av larver fra 3 dager gamle voksne vokst på blanding, Ochrobactrum BH3 og OP50. Alle P-verdier ble generert fra studentens t-test (*** p < 0,001; ** p < 0,01; n.s., ikke signifikant; mix n = 230; Och n = 45). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Berike målrettede populasjoner basert på mikrobiomkolonisering . (A) Prikkplott av TOF versus RFP (Ochrobactrum BH3) for 3 dager gamle voksne. Høy (rød boks) og lav (svart boks) RFP-porter trekkes for å berike C. elegans med høy og lav Ochrobactrum BH3 kolonisering. (B) Representative RFP-bilder (4x) av brønnene som inneholder 15 sorterte ormer fra høye og lave RFP-porter (Bar = 1 mm). (C) Representative bilder (10x) av individuelle ormer fra høye og lave RFP-porter (Bar = 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Representativt datasett generert av stor partikkelsorterer for N2-populasjoner i dag 2 og dag 3 voksen alder dyrket på E. coli OP50 og Ochrobactrum BH3. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Skript som brukes i analysen og figurgenereringen av representative datasett i R-miljøet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flow vermimetry har blitt brukt til å karakterisere C. elegans gener og veier mot patogen kolonisering og toksisitet i flere studier21,22. Her presenteres en høy gjennomstrømnings mottagelig tilnærming som bruker C. elegans for å undersøke hvordan intestinale mikrobiomer modulerer vertsfysiologien. Sammenlignet med eksisterende metoder som bruker kolonidannende enheter (CFU) eller 16S rRNA-amplikonsekvensering 9,16,17,23,24, krever denne tilnærmingen ikke arbeidsintensiv telling eller introduserer potensiell PCR-skjevhet. I tillegg til å måle mikrobiomer i en hel befolkning, tillater denne tilnærmingen brukere å visualisere individuelle variasjoner i befolkningen. Denne tilnærmingen begrenses bare av tilgjengeligheten av fluorescerende proteinuttrykk eller farging av mikrober og antall deteksjonskanaler i LPS. Ytterligere hensyn for eksperimentell design diskuteres nedenfor, slik at brukerne kan lage en tilpasset arbeidsflyt basert på deres behov.
Betraktninger for å skape og sådd et definert mikrobiom
Først normaliseres hver bakteriekultur til en OD600-verdi på 1 før blanding av forskjellige stammer. Det er verdt å merke seg at, avhengig av samfunnets kompleksitet og relasjonene mellom arter, kan starttettheten ha forskjellige virkninger på den etablerte mikrobiomsammensetningen23. Mens OD enkelt kan måles med spektrofotometre, er en advarsel at forskjellige bakterier vil ha forskjellige konsentrasjoner (f.eks. Antall celler per ml) for samme OD-verdi og bør justeres tilsvarende. For det andre bør variasjon i mikrobiomsammensetningen i plener tas hensyn til. Når mikrobiomet er sådd på NGM-platen (eller andre medier), får mikrobiomet vokse over natten ved romtemperatur før det slipper synkroniserte L1 C. elegans-populasjoner på platene. På grunn av variasjoner i vekstrater og interaksjoner mellom arter mellom bakteriestammer, vil mikrobiomer dyrket på NGM-plater eller en hvilken som helst plate med substrater for vekst avvike i sammensetning fra den opprinnelige frøblandingen. Bruk av en peptonfri NGM-plate kan bevare det opprinnelige mikrobielle samfunnet13. På grunn av begrenset mikrobiomvekst på den peptonfrie platen, kan det imidlertid være nødvendig med en høyere såing OD eller et redusert antall synkroniserte L1s per plate. Dette forhindrer befolkningen i å sulte før den når ønsket alder for analyse. En annen tilnærming er å sekvensere eller på annen måte bestemme andelen mikrober i plenen.
Måling av mikrobiomkolonisering og C. elegans fysiologi
For det første kan tersklene for utryddelse (EXT) og time-of-flight (TOF) for voksne variere basert på alder, C. elegans stammebakgrunn og mikroberene de dyrkes på. Å ha en 1 dag gammel voksen populasjon i forsøket for hver orm / bakteriell tilstand kan være nyttig for å bestemme TOF og utryddelsesavskjæringer, samt å kontrollere variasjonen på grunn av vekstmedier og miljø. I tillegg til gating for voksne kan TOF og EXT brukes på gate for larver, og et tetthetsplott av avkommet kan estimere tidspunkt og utgang for reproduksjon på populasjonsnivå (figur 3L). For det andre må PMT-gevinster og spenning på LPS justeres for å maksimere signal-støy-forholdet og stille inn signalområdet for å unngå metning. Dette er avhengig av den fluorescerende intensiteten til bakteriestammene og deres koloniseringsnivåer. Standard PMT ved 350 fungerer bra for høye kolonisatorer som Ochrobactrum BH3, men brukere må kanskje øke PMT eller spenningsverdier for lave kolonisatorer som E. coli OP50. For det tredje, på grunn av forskjeller i egenskapene til fluoroforene og deres ekspresjonsnivåer i transgene bakteriestammer, reflekterer fluorescerende verdier ikke det absolutte antall bakterier som er tilstede i mikrobiomet. Derfor kan GFP- og RFP-verdier ikke brukes til å sammenligne kolonisering mellom to forskjellige fluorescerende mikrober direkte. Forstyrrelse og plating av dyr for å identifisere levende bakterietall kan bidra til å bedre løse disse forholdene24.
Potensielle anvendelser for berikelsesbaserte strategier
Denne metoden gir en akseptabel plattform med høy gjennomstrømning for å undersøke virkningen av mikrobiomendringer på vertsfysiologi på populasjonsnivå. På den mikrobielle siden vil den økende tilgjengeligheten av verktøy og ressurser for å redigere bakteriegenomer25,26,27 øke antallet fluorescerende og funksjonelle mikrobielle mutanter relatert til C. elegans naturlige mikrobiom. Fra vertssiden er mange fluorescerende reportere tilgjengelige for å utforske sammenhengen mellom cellesignalering og mikrobiomsammensetning. Evnen til å berike en vertspopulasjon eller mutant fra en mutagenisert populasjon (f.eks. EMS forward mutagenese)28 eller samlede ville stammer29, med spesifikke mikrobiomkoloniseringsfunksjoner, kan i stor grad fremme evnen til å koble vertsgener som regulerer mikrobiompåvirkningen. Videre kan utvelgelsen av populasjoner basert på verts- og/eller mikrobiomegenskaper også legge til rette for en kadre av omics-baserte profileringsmodaliteter. Denne tilnærmingen har stor fleksibilitet og lover å fremme forståelsen av molekylære mediatorer av vertsmikrobiom-interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd DP2DK116645 (til BSS), Dunn Foundation pilot award og NASA grant 80NSSC22K0250 (til BSS). Dette prosjektet ble også støttet av Cytometry and Cell Sorting Core ved Baylor College of Medicine med finansiering fra CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 og RR024574), og assistanse fra Joel M. Sederstrom, pluss et instrumenteringsstipend for LPS NIH-stipendet (S10 OD025251). Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
- Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).
- Bargmann, C. I.
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), Bethesda, Md. 3025-3039 (2020).
- Stiernagle, T.
- R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
- Wickham, H., et al. tidyverse. , (2019).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).
- Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
- Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877 (2018).
- Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
- Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).
