Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering af naturlige dræberceller fra menneskelige stamceller med udvidet potentiale

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64608
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3, 2,3
1Major in Molecular Biology and Biotechnology, School of Biological Sciences, The University of Hong Kong, 2School of Biomedical Sciences, The University of Hong Kong, 3Centre for Translational Stem Cell Biology

Summary

Denne protokol viser, hvordan man kan differentiere CD3−/CD45+CD56+ celler med mild cytotoksicitet fra humane ekspanderede potentielle stamceller (hEPSC'er) under både 3D- og 2D-dyrkningsbetingelser. Dette giver mulighed for rutinemæssig fænotypisk validering uden ødelæggelse af det komplekse mikromiljø.

Abstract

Differentieringen af naturlige dræberceller (NK) fra humane pluripotente stamceller giver mulighed for forskning i og fremstilling af cellulære produkter af klinisk kvalitet til immunterapi. Beskrevet her er en tofaset protokol, der bruger et serumfrit kommercielt medium og en cocktail af cytokiner (interleukin [IL]-3, IL-7, IL-15, stamcellefaktor [SCF] og FMS-lignende tyrosinkinase 3-ligand [Ftl3L]) til at differentiere humane ekspanderede potentielle stamceller (hEPSC'er) i celler, der besidder NK-celleegenskaber in vitro med både 3-dimensionel (3D) og 2-dimensionel (2D) kulturteknologi. Efter denne protokol genereres CD3-CD56+ eller CD45+CD56+ NK-celler konsekvent. Når de dyrkes sammen med tumormål i 3 timer, viser de differentierede produkter mild cytotoksicitet sammenlignet med en IL-2-uafhængig permanent cellelinje, NK92mi-celler. Protokollen bevarer kompleksiteten af differentieringsmikromiljøet ved generering af 3D-strukturer, hvilket letter undersøgelsen af de rumlige forhold mellem immunceller og deres nicher. I mellemtiden muliggør 2D-kultursystemet rutinemæssig fænotypisk validering af celledifferentiering uden at skade den sarte differentieringsniche.

Introduction

Sammenlignet med konventionelle pluripotente stamceller som humane embryonale stamceller (hESC'er) og humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) er humane ekspanderede potentielle stamceller (hEPSC'er) tættere på totipotenstilstanden, da de kan differentiere sig til både ekstraembryonale og embryonale linjer1. For eksempel kan hEPSC'er differentieres i trofoblaster1 og æggeblomme-sæklignende celler2. For at opnå den unikke styrke af hEPSC'er dyrkes en individuel blastomer i et medium, der indeholder flere små molekyler, der hæmmer afstamningsforpligtelsessignalering1, som kaldes EPSC-medium (EPSCM). Dyrkning af hESC'er og hiPSC'er i EPSCM udvider deres tidligere begrænsede styrke for at differentiere dem til trofoblastceller1.

Pluripotente stamceller er et værdifuldt forskningsværktøj til at eksperimentere med nye genetiske modifikationer. På grund af pluripotente stamcellers selvfornyelses- og differentieringskapacitet kan en transformeret klon af en pluripotent stamcelle producere differentierede cellulære produkter, der besidder den samme genetiske modifikation på samme sted. Zhu og Kaufman etablerede standarden for NK-celledifferentiering fra konventionelle pluripotente stamceller (hESC'er og hiPSC'er)3. For det første inducerede de hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) fra en embryoid krop afledt af pluripotente stamceller. Tilsætningen af stamcellefaktor (SCF), FMS-lignende tyrosinkinase 3-ligand (Ftl3L), interleukin (IL)-7, IL-15 og et tidligt supplement af IL-3 forspændte HSC'erne til at udvikle sig til naturlige dræberceller (NK). Derefter udvidede de NK-cellerne med kunstige antigenpræsenterende celler (aAPC'er), som præsenterer membranbundet IL-21, med det kontinuerlige tilskud af IL-2. Forskere har anvendt denne tilgang til immunterapi for at generere iPSC-afledte naturlige dræberceller udstyret med den kimære antigenreceptor (CAR-iNK)4.

Humane NK-celler defineres som CD3-CD56+ leukocytter i det perifere blod. De er effektorer mod virusinficerede celler og tumorceller5. Nogle hæmmende receptorer på NK-celler genkender molekyler, der udtrykkes allestedsnærværende i normale celler. Som et eksempel genkender NKG2A / CD94 heterodimer udtrykt på NK-celler MHC klasseI molekyler 5. I mellemtiden genkender de aktiverende receptorer på NK-celler stressinducerede ligander, som hvordan NKG2D genkender transformationsinduceret MHC klasse I polypeptidrelateret sekvens A (MICA/MICB)6. Nogle transformerede celler nedregulerer deres "selvligander" for at undslippe immunovervågning og opregulere afvigende ligander, hvilket udløser NK-cellerne til at udføre deres lytiske maskineri. NK-cellernes iboende antitumorevner har bragt opmærksomheden på denne immuncelletype.

Evnen til samtidig at give anledning til både embryonale og ekstraembryonale linjer kan gøre hEPSC'er til en mere trofast rekapitulation af den embryonale udviklingsniche end konventionelle pluripotente stamceller. Fra erfaring er det lettere at opretholde styrken af hEPSC'er end hiPSC'er. I denne undersøgelse blev der udviklet en protokol (figur 1) til bias hEPSC'er for at udvikle sig til hæmatopoietiske slægter og senere differentiere stamceller til naturlige dræberceller (NK) in vitro. I protokollen anvendes kommercielle medier for at undgå serumuoverensstemmelser, efterfulgt af trinvis tilsætning af cytokiner til biasdifferentiering i lymfoide slægter. Denne protokol har to systemer til at bevare det komplekse 3D-mikromiljø, mens den udleder CD3-CD56+/CD45+CD56+-celler, der fænotypisk og funktionelt ligner humane NK-celler.

Denne protokol kan være nyttig til at studere interaktionen mellem immunceller med deres differentieringsnicher og kan have potentiale til at rense cellulære produkter til immunterapeutiske anvendelser.

Protocol

Denne undersøgelse omfattede in vitro-forsøg ; Derfor er etisk godkendelse ikke anvendelig. De etablerede cellelinjer, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev opnået fra kommercielle kilder (se materialetabellen).

1. Generering af 3D-organoidstrukturer fra hEPSC'er

  1. Vedligehold hEPSC'er ved at dyrke dem med 1 ml EPSC-medium (12-brøndplade) på SNL-føderceller1.
    BEMÆRK: Kuppelformede kolonier observeres (figur 2A), hvis deres udvidede styrke forbliver.
  2. Udfør prædifferentiering af hEPSC'erne.
    1. Fjern hEPSC-mediet, og tilsæt 1 ml DFK-medium (DMEM / F12 + 10% serumerstatningsmedium, se materialetabellen). Der inkuberes i 2-3 dage ved 37 °C og 5% CO2. Udfør en medium ændring på den anden dag, hvis du fortsætter inkubationen i 3 dage.
      BEMÆRK: Under mikroskopet er de kuppelformede kolonier fladtrykte (figur 2B).
  3. Embryoidlegemerne kontrolleres ved hjælp af hængedråbeteknikken 7,8.
    1. Fjern DFK-mediet, og vask med 1 ml PBS én gang. Tilsæt 500 μL 0,05% trypsin, og inkuber pladen ved 37 °C og 5% CO2 i 3-7 minutter baseret på morfologien.
      BEMÆRK: hEPSC'erne skal kunne løsnes fra fødercellerne, når pladen er let forstyrret.
    2. Fjern trypsinet, og tilsæt 2 ml DFK-medium for at høste cellerne. Drej cellerne ned ved 300 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
    3. Supernatanten fjernes med en pipette. Der tilsættes 1 ml DFK-substrat og 1 μL Y27632 (se materialetabellen) for at ophvirvle cellerne igen ved at svirpe.
    4. Tæl antallet af celler i cellesuspensionen med et hæmocytometer9. Fortynd cellesuspensionen med DFK-medium og Y27632 (1.000x), så der er 4.000 celler/25 μL DFK-medium.
    5. Fyld hætten på en 10 cm petriskål med ca. 30-40 dråber 25 μL cellesuspension pr. hætte. Hæld noget PBS i den nederste skål for at forhindre fordampning af dråberne. Vend forsigtigt hætten og dæk fadet. Skålen inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 3 dage.

2. Mesoderm og hæmato-endotelmønster af embryoidlegemet (EB)

  1. Saml EB'er i dråben.
    1. Alle EB'erne fra dråben samles i et 15 ml rør ved hjælp af en 1 ml pipette og noget PBS. Pump lidt PBS ind i dråben, og sug derefter mediet, inklusive EB'erne, ud med pipetten.
      BEMÆRK: Dråber, der er mere gule, indikerer mere vellykket dannelse og vækst end lyserøde dråber.
    2. Centrifuger de opsamlede EB'er centrifugeres ved 100 x g i 1 min ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes med en pipette. Tilføj 1 ml medium A (fra et kommercielt tilgængeligt celledifferentieringssæt, se materialetabellen) for at overføre de indsamlede EB'er til en ikke-klæbende plade med 24 brønde. Mærk denne dag som Dag 0 (Figur 1).
      BEMÆRK: Normalt grupperes alle EB'er indsamlet fra en 10 cm skål og overføres til en brønd i en 24-brønds plade.
  2. Udfør mesoderm mønster af EB'erne.
    1. Pladen inkuberes i 3 dage ved 37 °C med 5% CO2. På dag 2 fjernes 500 μL medium A (fra sættet, trin 2.1.2), samtidig med at EB'erne undgås. Derefter tilsættes 500 μL frisk medium A.
  3. Udfør hæmatoendotelspecifikation af embryoidlegemet.
    1. 700 μL medium A fjernes fra brønden, og der tilsættes 700 μL medium B (fra sættet, trin 2.1.2). Kultur i 7 dage. Udfør en halv udskiftning af medium B på dag 5, dag 7 og dag 9.

3. NK-celledifferentiering

  1. Overfør de mønstrede EB'er til en luft-væske-grænseflade.
    1. Vip pladen let, så EB'erne samles i bunden. Brug en 1 ml pipette til at fjerne så meget af medium B som muligt, samtidig med at EB'erne undgås.
    2. Tag EB'erne op med en pipette ved at opsuge det resterende medium. Overfør dem til en transbrønd i en plade med 24 brønde (se materialetabellen).
      BEMÆRK: Begræns tallene til to til tre EB'er pr. transwell for optimal tæthed.
  2. Udfør lymfoid stamfaderudvidelse.
    1. Der tilsættes 500 μL NK-1-medium (kommercielt tilgængeligt lymfoidt ekspansionsmedium + 14 IE/ml IL-3, 4.500 IE/ml IL-15, 8.800 IE/ml IL-7, 26 IE/ml SCF og 12 IE/ml ftl3L, se materialetabellen) til transbrøndens nederste rum. Kultur i 14 dage, og udfør en medium skift hver anden dag.
  3. Høst og overfør cellerne på dag 7-10 til en belagt plade.
    1. For at belægge pladen fortyndes belægningsmaterialet (kommercielt tilgængeligt lymfoid differentieringsbelægningsmateriale, 100x, se materialetabellen) i PBS. Der tilsættes 1 ml fortyndet belægningsopløsning til hvert hul i en plade med 12 huller, og pladen inkuberes ved 4 °C natten over. Dæk pladens åbning med indpakningsfilm.
    2. Tilsæt 200 μL PBS i transbrønden, og pipette langsomt op og ned omkring fem til seks gange for at høste cellerne frigivet fra organoiderne. Undgå pipettering af organoiderne.
      BEMÆRK: Runde celler frigives kontinuerligt fra organoiderne (figur 2D).
    3. Overfør den høstede cellesuspension til et 2 ml rør, og drej cellerne ned ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes med en pipette, og der tilsættes 1 ml NK-1-substrat (trin 3.2.1) for at resuspendere cellerne ved pipettering.
    4. Fjern al belægningsopløsningen fra brønden, og vask hver brønd i en 12-brønds plade med 1 ml PBS to gange.
    5. Opdel de høstede celler i forholdet 1: 2. Cellesuspensionen overføres til en belagt plade med 12 huller (trin 3.3.1). Tilsæt 1 ml NK-1-medium, så hver brønd har 1,5 ml medium.
    6. For at udføre en medium ændring, lad cellerne sidde i 1-2 minutter for at lade cellerne synke til bunden. Opsug forsigtigt 750 μL medium ud. Den opsamlede supernatant centrifugeres ned ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    7. Det meste af supernatanten kasseres, og der resuspenderes i 750 μL NK-1-substrat med pipettering fem til seks gange. Tilsæt cellerne resuspenderet i det friske medium i den oprindelige brønd.
      BEMÆRK: Dette parallelle system kaldes 2D-systemet i figur 1. Følg mediumændringsplanen for brønden i organoiderne, som cellerne stammer fra.
  4. Udfør NK-cellemodning ved at følge nedenstående trin.
    1. Fjern det gamle medium i 3D-systemet, og tilsæt 500 μL NK-2 (kommercielt tilgængeligt NK-celledifferentieringsmedium + 4.500 IE / ml IL-15, 8.800 IE / ml IL-7, 26 IE / ml SCF og 12 IE / ml ftl3L, se materialetabellen) i transbrøndens nederste rum. Der inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 14 dage.
      BEMÆRK: Sørg for, at mediet rører bunden af transbrønden.
    2. Udfør en fuld medieændring på cellerne i 2D-systemet. Saml alle 1,5 ml celler fra en brønd, og centrifuger den ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Det meste af supernatanten fjernes med en pipette, og pelletpen resuspenderes med 1,5 ml NK-2-substrat (trin 3.4.1).
    3. Udfør en medieændring hver anden dag. Vip pladen på 3D-systemet let, og fjern alt det gamle medium uden for transwell. Der tilsættes 500 μL NK-2-medium uden for transbrønden.
    4. For at udføre en halv medium ændring på en brønd i en 12-brønds plade til 2D-systemet, lad cellerne sidde i 1-2 minutter for at lade cellerne synke til bunden. Der suges forsigtigt 750 μL af mediet ud.
    5. Den opsamlede supernatant centrifugeres ned ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at forhindre celletab. Det meste af supernatanten kasseres, og der resuspenderes i 750 μL NK-2-substrat ved pipettering fem til seks gange. Tilsæt cellerne resuspenderet i frisk medium i den oprindelige brønd.

4. Høstning af modne celler

  1. Høst cellerne dyrket i 2D-systemet.
    1. Høst cellerne ved pipettering op og ned i dag 38-45. Vask med 1 ml PBS to gange. Centrifuger cellesuspensionen ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    2. Supernatanten fjernes med en pipette, og den resuspenderes i den valgte buffer (dvs. PBS + 2% FBS for flowcytometri, se materialetabellen).
  2. Høst cellerne indlejret i organoiden.
    1. Mediet opsamles udefra i et 15 ml rør på dag 38-45. Organoid vaskes to gange ved at tilsætte 200 μL PBS inde i transbrønden og pipettere op og ned fem til seks gange. Overfør suspensionen til 15 ml røret.
    2. Der tilsættes 500 μL PBS i en brønd med en plade med 12 huller. Overfør organoiden fra transbrønden til brønden på 12-brøndpladen med tang.
    3. Skær organoiden 20 gange ved hjælp af en saks og tang. Skyl de resterende celler på tang og saks i brønden med PBS. Der opsamles så meget PBS som muligt, og det overføres til det 15 ml rør, der blev anvendt i trin 4.2.1, uden at opsuge organoidstrukturen.
    4. Der tilsættes 500 μL af dissociationsreagenset (se materialetabellen) i transbrønden for enzymatisk fordøjelse af organoiden. Der inkuberes med en kommerciel celleløsrivelsesopløsning (se materialetabellen) i 7-10 minutter ved 37 °C og 5% CO2. Reaktionen slukkes ved at tilsætte 1 ml PBS med 2% FBS, og opløsningen opsamles i et andet 15 ml rør. Vask brønden med 1 ml PBS med 2% FBS to gange.
      BEMÆRK: Bestem længden af inkubationen baseret på morfologien. Prøv at opnå det punkt, hvor enkeltceller begynder at blive frigivet fra membranen i 3D-strukturen.
    5. Tilsæt 1 ml PBS med 2% FBS, og pipette op og ned 8-10 gange. Saml alle løsningerne, herunder organoidstrukturerne. De overføres til det 15 ml rør, der blev anvendt i trin 4.2.3, med en cellesi.
    6. Begge glas centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres med en pipette. Cellepillen resuspenderes med den valgte buffer (trin 4.1.2).

Representative Results

Det blev antaget, at de nuværende in vitro differentieringsprodukter (IVD) ville have lignende overflademarkører og antitumorevner som humane NK-celler.

Den definerende markør for humane NK-celler blev tilgået for at teste, om differentieringsprodukterne fra 3D-kultursystemet gav celler, der fænotypisk lignede humane NK-celler. Ca. 15% af cellerne dissocieret fra 3D-kultursystemet fra to batcher induceret på forskellige tidspunkter (n = 2) var CD3-CD56+ (figur 3A). CD3 blev erstattet med CD45 (en pan-leukocytmarkør) i testpanelet på grund af fraværet af CD3 og vanskeligheden ved at inducere T-celler in vitro. Ca. 16% af cellerne dissocieret fra 3D-strukturen var CD45+CD56+ (figur 3B, n = 1), hvilket er på linje med procentdelene af CD3-CD56+ celler set i tidligere forsøg. Procentdelene af CD3-CD56+ celler i cellerne høstet fra 2D-kultursystemet varierede fra 30% til 6%, fra mere vellykkede induktioner (figur 3C, n = 3) til mindre vellykkede induktioner (figur 3D, n = 2). Funktionaliteten og fænotyperne af cellerne høstet fra 2D-kultursystemet blev valideret. I løbet af dag 18-kulturen fra 2D-systemet udtrykte ca. 12% af cellerne både ektopisk CD56 og CD107a efter 2 timer 50 ng / ml IL-18, 455 IE / ml IL-2 og 20 ng / ml anti-CD244 antistofstimulering (figur 4C, n = 1). Ca. 28% af de høstede celler var CD94 + CD159a + (figur 4B, n = 1). Den ektopiske ekspression af CD107a, en proteinforing på granulatmembranen, indikerer degranulering10, mens CD94 / NKG2A (CD159a) heterodimer er en anden definerende markør for NK-celler. Dette giver et eksempel på fænotypisk og funktionel validering af IVD-produkter.

IVD-produkternes funktionalitet blev testet ved deres cytotoksicitet mod humane erythroleukæmiceller-K562-celler. Omfattende ligandprofilering på K562-celler afslører deres nedregulerede større histokemiske kompleks I (MHC-I) og forholdsvis stærke NKG2D-ligandekspression (såsom ULBP-1, ULBP-2/5/6 og ULBP-3)11; således er K562-celler modtagelige for den lytiske aktivitet af NK-celler12. Både IVD-endepunktsprodukter og NK92mi-celler blev primet med 50 ng/ml IL-18, 455 IE/ml IL-2 og 20 ng/ml anti-CD244-antistoffer natten over. GFP + K562-cellerne blev cokultureret med enten høstede celler fra IVD- eller NK92mi-celler ved forskellige effektor-til-mål-forhold (E: T) i nærværelse af 50 ng / ml (IE ikke tilvejebragt) IL-18, 455 IE / ml IL-2 og 20 ng / ml anti-CD244-antistoffer i samme volumen H5100-medium i 3 timer. Udlæsningen af NK-celledrabsaktivitet var udtrykket af den døde cellemarkør på GFP + -undergrupper. K562-cellerne blev transduceret med en kommercielt tilgængelig kontrolvektor (se materialetabellen) for at udtrykke GFP konstitutivt, og effektiviteten af transduktionen var ca. 80% (supplerende figur 1A). Procentdelene af GFP-signal, der blev tilføjet, var proportionale med antallet af GFP + K562-celler, der blev tilføjet, hvilket tyder på specifik GFP-ekspression fra de transducerede K562-celler (supplerende figur 1B).

Procentdelen af døende målceller vist i figur 5 blev beregnet med følgende formel13:

Procentdel af døende celler = (FITC + DAPI + % af samkultur [f.eks . figur 5A]) - (FITC + DAPI + % af transducerede K562-celler)

Af alle tre vurderede E: T-forhold (0,1: 1, 0,33: 1, 1: 1) var procentdelene af døende GFP + -celler positivt korreleret med E: T-forholdene, når de blev dyrket sammen med IVD-produkter (figur 5B, hEPSC-NK) eller NK92mi-celler (figur 5B, NK92mi), hvilket indikerer den specifikke drab af tumormål. IVD-produkternes cytotoksicitet var imidlertid forholdsvis beskeden inden for den testede tidsramme (figur 5C).

Endelig blev den lymfoide stamcellegenerering sammenlignet mellem 3D- og 2D-kulturerne. Det blev konstateret, at 3D-kulturtilstanden genererede flere stamceller (55.000 celler) end 2D-kulturtilstanden (36.000 celler) (supplerende figur 2). Dette tyder på, at sammenhængen mellem vævsarkitektur og cellulære komponenter i 3D-kulturen understøttede dannelsen af lymfoide stamceller.

Figure 1
Figur 1: Skematisk diagram, der viser differentieringsstrategien for at differentiere NK-celler fra hEPSC'er . (A) Her vises tidslinjen for 3D-kultursystemerne, der beskriver kulturbetingelserne og korte nøgleord fra hvert trin. 3D-systemets luft-væske-grænseflade opretholdes under NK-celleinduktionen. (B) Her vises tidslinjen for 2D-kultursystemerne. De frigivne celler, der høstes fra dag 7-10 fra strukturer i 3D-systemet, podes på en belagt plade uden luft-væske-grænsefladen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Morfologi af cellerne observeret på forskellige differentieringsstadier. (A) Morfologien af hEPSC'er, når de vedligeholdes i EPSCM. HEPSC'erne danner kuppelformede kolonier. B) Morfologien af hEPSC'er efter prædifferentiering. De kuplede kolonier er fladtrykte. hEPSC'erne høstes og danner EB'er med hængende dråbeteknikken. EB'erne indsamles og dyrkes i medium A og derefter medium B. (C) Morfologien af en EB på dag 10. I løbet af denne periode begynder EB at udvide og blæse op og danne membranøse strukturer. (D) Morfologien af en cellefrigivende EB. Efter såning på transbrønden vokser EB og frigiver konstant runde celler til omgivelserne. Nogle af de frigivne celler opsamles og dyrkes på en 12-brønds plade belagt med lymfoide differentieringsbelægningsmaterialer. Cellepopulationerne er morfologisk heterogene og har tendens til at aggregere sammen. E) Morfologien af celler observeret ved endpoint af IVD. Små, cirkulære suspensionsceller (sort pil) observeres. Skalastænger: (A, B, E) = 100 μm; (C,D) = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative FACS-afbildninger af hEPSC-afledte produkter ved endepunktet. Celler inkuberes med fluoroskopkonjugerede antistoffer på is i 30 min. Prøverne farves med DAPI, inden de lægges i FACS-prøveinjektionsporten. Ufarvede celler bruges til at etablere den negative gating. (A) Repræsentativ FACS-plot på CD3- og CD56-ekspression i celler dissocieret fra 3D-kultursystemet fra to batcher (n = 2). (B) Repræsentativt FACS-plot på CD45- og CD56-ekspression i celler dissocieret fra 3D-kulturen (n = 1). C) Repræsentativ FACS-afbildning på CD3- og CD56-ekspression i celler høstet fra den coatede plade fra en vellykket induktion (n = 3). D) Repræsentativ FACS-afbildning på CD3- og CD56-ekspression fra den coatede plade, når induktionen er suboptimal (n = 2). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativt FACS-plot på hEPSC-afledte produkter under dag 18-kultur (n = 1). (A) FACS-plot på CD56- og CD107a-ekspression efter 2 timers stimulering med IL2-, IL-18- og anti-CD244-antistoffer. (B) FACS-plot på CD159a- og CD94-udtryk. Prøverne farves med DAPI, inden de lægges i FACS-prøveinjektionsporten. Ufarvede celler bruges til at etablere den negative gating. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Afbildning af procentdelene af døende celler mod forskellige E:T-forhold fra samkulturen af GFP+ K562-celler med enten IVD-endepunktsproduktet eller NK92mi-celler (n = 1). Ekspressionen af FITC+ DAPI+ celler blev vurderet med en celleanalysator, og dataanalysen blev udført med kompatibel software. A) Et repræsentativt FACS-plot, der viser gatingen af FITC + DAPI + delmængder fra samkulturen mellem IVD-produkter og K562-celler med et E:T-forhold på 1. (B) Individuelle plots fra samkultureksperimentet med GFP+ IVD-produkter (venstre) eller NK92mi-celler (højre) i 3 timer. Begge afspejler et positivt proportionalt forhold mellem procentdelen af døende celler og E:T-forholdet. C) Et plot, der viser dræberkurverne for IVD-produkter og NK92mi-celler i samme skala. IVD-produkterne viste mild cytotoksicitet sammenlignet med NK92mi-cellerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Funktionel analyse af NK-celler fra hEPSC'er. A) FACS-histogram af transducerede K562-celler. FITC+ K562-cellerne udtrykte GFP. B) FACS-histogrammer fra samkulturen af GFP+ K562-celler og IVD-slutpunktet ved tre E:T-forhold (n = 1). Procentdelene af FITC+ celler i samkulturen svarede til antallet af tilsatte transducerede K562 celler. Ganingsne blev etableret med utransducerede K562-celler. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Lymfoid stamfaderdifferentiering i 2D versus 3D kultur. Den nuværende organoidbaserede protokol blev brugt til at inducere lymfoide stamceller fra humane ekspanderede potentielle stamceller. To betingelser blev oprettet: (1) lymfoide forfædre blev holdt i kultur inden for organoiderne (3D), og (2) lymfoide forfædre blev isoleret og holdt på kulturskålen (2D). Efter 2 ugers yderligere kultur blev cellenumrene bestemt til at sammenligne 2D versus 3D-kulturen. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Der er et par afgørende trin for at sikre en vellykket differentiering af CD45+CD56+ celler fra hEPSC'er. Fordifferentieringen (trin 1.2) er afgørende, da EPSC-mediet indeholder inhibitorer af afstamningsforpligtelse1. Efter prædifferentiering flades de kuppelformede kolonier af hEPSC'er (figur 2B). Tilsætningen af Y27632, en rhokinasehæmmer (ROCKi), under dannelsen af EB'er fra hEPSC'er (trin 1.3) er uundværlig for hEPSC'ernes overlevelse efter dissociation. En anden vigtig overvejelse er antallet af EB'er, der er plantet på hver transwell. Da det er et lille system, er to til tre EB'er pr. transwell den optimale tæthed for at forhindre overforbrug af medierne. Luft-væske-grænsefladen opretholdes under hele forløbet af NK-celledifferentiering for 3D-systemet, hvilket menes at opretholde stromale cellers polaritet og understøtte udvidelsen af de AGM-afledte hæmatopoietiske forfædre14,15.

Som tidligere nævnt er tætheden af EB'er på transwell en afgørende faktor for vellykket differentiering. Nøgletegnet for dette er mediets farve 1 dag efter implantation af EB'er på transwellen. Hvis farven hurtigt bliver gul, indikerer dette enten forurening eller overbelægning. For at løse problemet skal en 1 ml pipette bruges til manuelt at opsamle ekstra EB'er og overføre dem til en anden transwell.

En væsentlig begrænsning af denne protokol er renheden af CD3−/CD45+ CD56+ celler i IVD-produkterne, som menes at være delvist ansvarlig for den ringere cytotoksicitet sammenlignet med rene NK92mi-celler. Et 3D-kultursystem blev anvendt til at inducere hæmatopoietiske forfædre via genereringen af en EB, der ligner de tre embryonale kimlag. Denne strategi efterligner udviklingen af blodlegemer i knoglemarvsmikromiljøet og fjerner dermed behovet for stromale celler til at understøtte differentieringen3. Uden et sorteringstrin til rensning af de hæmatopoietiske forfædre forventes IVD-produkternes renhed at blive reduceret. En strategi for at bevare den komplekse differentieringsniche og samtidig øge renheden af slutpunktsproduktet er at udvikle en ekspansionsmetode til de sorterede CD3-CD56+ IVD-produkter. For eksempel kan de sorterede CD3-CD56+ IVD-produkter dyrkes på kunstige antigenpræsenterende celler (aAPC'er), såsom bestrålede K562-celler konstrueret med membranbundet IL-21. Med forsyningen af IL-2 i kulturen kan denne metode opnå en 1.000 gange stigning i NK-cellenumre3.

En anden begrænsning er den begrænsede adgang til bona fide humane NK-celler som en positiv reference. NK92mi er den positive reference, der anvendes i coculture-assayet, men den er ikke præcis nok. NK92mi-celler er konstrueret fra NK92-celler, en permanent cellelinje, der udtrykker aktiverede NK-cellefænotyper16, til autonomt at producere IL-2 for at opfylde dyrkningskravene. NK92-celler viser overlegen drabsaktivitet mod K562-celler in vitro end humane primære NK-celler17. En mere retfærdig sammenligning af IVD-produkters tumordræbende kapacitet kunne opnås ved parallelt at analysere cytotoksiciteten af perifere NK-celler i blodet, men desværre mangler der adgang til blodbanker.

Denne kulturprotokol med to systemer sigter mod at generere CD3−/CD45+CD56+ celler fra hEPSC'er. Vurderingen af overflademarkørerne og cytotoksiciteten med FACS kan rutinemæssigt udføres på celler fra 2D-systemer uden at forstyrre differentieringsnichen. På trods af forskellene i procentdelene af CD3-CD56+ celler kan 3D- og 2D-systemerne udlede CD3-CD56+ celler med lignende variationer i CD56-ekspression (figur 3), og 2D-systemet afspejler eksistensen af lymfoide forfædre fra 3D-kulturtilstanden.

Betydningen af at bruge 3D-kultursystemet er, at det tillader brugen af profileringsanalyser i høj opløsning, såsom rumlig transkriptomik eller billeddannelse af massespektrometri, til at undersøge de rumlige relationer og celle-celle-interaktioner inden for den komplekse differentieringsniche.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Dr. Handi Cao, Sanxing GAO, David Xiang, Yiming Chao, Ritika Jogani, Owen Chan, Stephanie Cheung og Celine Chan for deres tekniske assistance og nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet af Platform Technology Fund. Figur 1 er oprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free Wako Chemicals 017-22231 For resuspending cytokines. 
ACCUMAX STEMCELL Technologies  07921
Anti-human-CD159a-PE BD 375104 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Anti-human-CD3-APC antibodies BD 555355 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) 
Anti-human-CD45-APC antibodies BD 555485 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS)
Anti-human-CD56-PE antibodies BD 555516 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS)
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies BD 335826 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Anti-human-CD94-APC  BD 559876 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Thermo Scientific 11772644
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience Thermo Scientific 16-5838-85
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts STEMCELL Technologies 3470
Dapi Solution, 1 mg/mL BD 564907 It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) 
DMEM CPOS-Bioreagent core 11965092
DMEM/F12 Thermo Scientific 11320033
FcX, human Biolengend 422302
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America CPOS-Bioreagent core 10270106
FlowJo v10.8.0 BD
Gibco  PBS (10x) pH 7.4 CPOS-Bioreagent core 70011044 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red
K562 cells  ATCC  CCL-243
Knockout Serum Replacement Thermo Scientific 10828-028
MyeloCult H5100 medium  STEMCELL Technologies 5150
NK92mi cells  ATCC  CRL-2408 Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL.
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate Thermo Scientific 150628 flat bottom
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate Thermo Scientific 142475
Nunc EasYDish Dishes Thermo Scientific 150460
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector  CELL BIOLABS LTV-400 It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2.
Polybrene  EMD Millipore TR-1003-G
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein R&D Systems 308-FK-005 It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL.
Recombinant Human IL-15 Protein R&D Systems 247-ILB-005 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. 
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein R&D Systems 9124-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. 
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. 
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug PeproTech 200-03 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. 
Recombinant Human IL-7 Protein R&D Systems 207-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. 
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. 
STEMdiff Hematopoietic Kit STEMCELL Technologies 5310 Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B
StemSpan lymphoid differentiation coating material STEMCELL Technologies 9950 It is resuspended in PBS (100x)
StemSpan NK cell differentiation medium  STEMCELL Technologies 9960 It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x)  into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. 
StemSpan lymphoid expansion medium  STEMCELL Technologies 9960 It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. 
StemSpan NK Cell Generation Kit STEMCELL Technologies 9960 Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. 
The BD LSRFortessa cell analyzer BD
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific 25300054
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254 working concentration: 10 µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nature Cell Biology. 21 (6), 687-699 (2019).
  2. Mackinlay, K. M. L., et al. An in vitro stem cell model of human epiblast and yolk sac interaction. eLife. 10, 63930 (2021).
  3. Zhu, H., Kaufman, D. S. An improved method to produce clinical-scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2048, 107-119 (2019).
  4. Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity. Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192 (2018).
  5. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nature Immunology. 9 (5), 503-510 (2008).
  6. Dhar, P., Wu, J. D. NKG2D and its ligands in cancer. Current Opinion in Immunology. 51, 55-61 (2018).
  7. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  8. Rungarunlert, S., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bioreactors. World Journal of Stem Cells. 1, 11-21 (2009).
  9. Counting cells using a hemocytometer. abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
  10. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294, 15-22 (2004).
  11. Tremblay-McLean, A., Coenraads, S., Kiani, Z., Dupuy, F. P., Bernard, N. F. Expression of ligands for activating natural killer cell receptors on cell lines commonly used to assess natural killer cell function. BMC Immunology. 20, 8 (2019).
  12. Inoue, T., Swain, A., Nakanishi, Y., Sugiyama, D. Multicolor analysis of cell surface marker of human leukemia cell lines using flow cytometry. Anticancer Research. 34 (8), 4539 (2014).
  13. Mhatre, S. Rapid flow cytometry based cytotoxicity assay for evaluation of NK cell function. Indian Journal of Experimental Biology. 52 (10), 983-988 (2014).
  14. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  15. Motazedian, A., et al. Multipotent RAG1+ progenitors emerge directly from haemogenic endothelium in human pluripotent stem cell-derived haematopoietic organoids. Nature Cell Biology. 22 (1), 60-73 (2020).
  16. Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
  17. Yan, Y., et al. Antileukemia activity of a natural killer cell line against human leukemias. Clinical Cancer Research. 4 (11), 2859-2868 (1998).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 191
Generering af naturlige dræberceller fra menneskelige stamceller med udvidet potentiale
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu Ching, P., Wang, C., Hang, S.,… More

Yu Ching, P., Wang, C., Hang, S., Liu, P., Sugimura, R. Generation of Natural Killer Cells from Human Expanded Potential Stem Cells. J. Vis. Exp. (191), e64608, doi:10.3791/64608 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter